УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

ТЕРТИЧНА Ольга Василівна

УДК 579.26:631.461

НАУКОВО-МЕТОДИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ

БІОДЕГРАДАЦІЇ ПЕСТИЦИДІВ ҐРУНТОВИМИ МІКРООРГАНІЗМАМИ

03. 00. 16 - екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Дисертаційну роботу виконано в лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології Української академії аграрних наук, м. Київ

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Омельянець Таїсія Григорівна,

Інститут агроекології УААН, головний науковий співробітник лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник

Надкернична Олена Володимирівна

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, завідувач відділу біологічного азоту

кандидат біологічних наук, старший науковий

співробітник

Ногіна Таїсія Михайлівна

Інститут мікробіології та вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАНУ, старший нуковий співробітник відділу фізіології промислових мікроорганізмів

Провідна установа:

Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться “26” жовтня 2006 р. об 11 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: вул. Метрологічна, 12, м. Київ, 03143.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН за адресою: вул. Метрологічна, 12, м. Київ, 03143.

Автореферат розіслано “ ” вересня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Л.І. Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Необхідність застосування хімічних засобів захисту рослин для отримання високих врожаїв підтверджено світовою та вітчизняною практикою (Cramer, 1994; Сайко, 1999; Жеребко, 2004). Але широкомасштабна i недостатньо обґрунтована хімізація сільського господарства в минулому призвела до забруднення ґрунту пестицидами. Особливо гострою є проблема погіршення екологічного стану ґрунту в зонах розташування складів пестицидів, що втратили придатність або заборонені до використання. Нині в Україні зберігається понад 20 тис тонн цих небезпечних для довкілля та здоров’я людини ксенобіотиків (Drozda, 2001). Однак дані щодо специфіки формування мікробіоценозу ґрунту санітарно-захисних зон недіючих складів нині відсутні. Відкритим залишається питання, яким чином економічно виправдано та екологічно безпечно знешкодити ці токсичні сполуки.

Нині світовий асортимент пестицидів становить 12 тис препаратів, 40% від загального виробництва пестицидів складають гербіциди. Кількості, в яких хімічні засоби захисту рослин потрапляють у навколишнє середовище, значно перевищують здатність природи до самоочищення (Трахтенберг, 1998). Гербіциди, які вносять безпосередньо у ґрунт, є найбільш небезпечними для ґрунтової мікробіоти (Круглов, 1991). Невикористані пестициди, мігруючи трофічними ланцюгами, надходять в інші об’єкти біосфери.

Одним із шляхів вирішення проблеми очищення ґрунту від залишків пестицидів, є пошук ґрунтових мікроорганізмів, здатних до їх розкладу. Адже провідну роль у розкладі пестицидів, як і інших ксенобіотиків, відіграють мікроорганізми (Alexander, 1994, Bollag, 2000).

Ґрунт є одним із найбільших багатств країни. Від його стану залежить не тільки кількість і якість виробленої сільськогосподарської продукції, але й збереження біорізноманіття (Ріо-де-Жанейро, 1992). Ось чому біоремедіація ґрунту, розкладу, детоксикації пестицидів за допомогою природних мікроорганізмів є важливою для оздоровлення ґрунту й відновлення його родючості. Незважаючи на те, що питання біодеградації пестицидів ґрунтовими мікроорганізмами актуальні для України, залишаються мало дослідженими науково-методичні аспекти пошуку ґрунтових мікроорганізмів, здатних до розкладу пестицидів. Важливість вирішення цієї проблеми і зумовило вибір теми дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно з науково-технічною програмою УААН “Теоретично обґрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологобезпечного використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращання якості умов життя людини” (№ держреєстрації 0101U003298) згідно підпрограми “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем” (№ держреєстрації 0101U003296).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи був пошук мікроорганізмів, перспективних для біологічної деградації пестицидів у ґрунті.

Для виконання даної мети визначено наступні завдання:

-

-

-

-

-

-

Об’єктом дослідження були мікробний ценоз ґрунтів, забруднених пестицидами; пестициди: прометрин, атразин, дуал, примекстра, ГХЦГ, ДДТ; ґрунтові мікроорганізми різних родів.

Предметом дослідження були вплив пестицидів на ґрунтові мікроорганізми та мікробна деградація пестицидів.

Методи дослідження: інформаційно-бібліографічні, аналітичні (аналіз літератури, узагальнення результатів), мікробіологічні, хроматографічні, статистичні (оцінка вірогідності отриманих результатів, визначення кореляційних зв’язків).

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено чутливість бактерій роду Pseudomonas до гербіцидів прометрину, атразину, примекстри, дуалу. Уперше встановлено здатність штаму Pseudomonas fluorescens УКМ B-36 до деструкції гербіциду дуалу (отримано патент). Визначено особливості формування мікробного ценозу ґрунтів, забруднених персистентними пестицидами. Виділено мікроорганізми стійкі до токсичної дії пестицидів із ґрунту, забрудненого пестицидами. Уперше виділено штам Pseudomonas fluorescens 06 стійкий до високих концентрацій прометрину.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено метод визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів та видано методичні вказівки для його практичного застосування. Методику розглянуто і затверджено Вченою радою Інституту агроекології та біотехнології УААН (протокол № 5 від 27 травня 2005 р.). Запропоновано штам Pseudomonas fluorescens УКМ B-36, здатний до деградації гербіциду дуалу, як перспективний біоагент для створення біопрепарату. Із забрудненого пестицидами ґрунту виділено штам Pseudomonas fluorescens 06 стійкий до високих концентрацій прометрину.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто виконано весь обсяг експериментальної частини роботи, лабораторних досліджень, проведено аналіз результатів, їхнє узагальнення і статистичну обробку, розроблено методичні вказівки. Дослідження ступеня забруднення грунту пестицидами методами фізико-хімічного аналізу проведено в лабораторії моніторингу пестицидів відділу екотоксикології Інституту агроекології УААН. За участю наукового керівника дисертації доктора медичних наук, професора Т.Г. Омельянець інтерпретовано одержані дані та сформульовано основні положення дисертації, підготовлено до друку наукові статті.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації було представлено на 7-th International HCH and pesticides forum (Київ, 2003); науково-практичній конференції молодих вчених “Cтабілізація землекористування та сучасні агротехнології” (Київ-Чабани, 2003); Міжнародній конференції “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції “Екологічна безпека об’єктів господарської діяльності” (Миколаїв, 2004); Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004, роботу відзначено грамотою); Першій міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005); науково-практичній конференції “Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України” (Київ, 2005); П’ятій міжвузівській науково-практичній конференції аспірантів “Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи” (Вінниця, 2005); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників - учасників ІІІ конференції “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми”, присвяченій пам’яті академіка М.В. Рево (Чернігів, 2005); звітних сесіях Інституту агроекології УААН (2003-2005); на засіданні Комісії з гігієнічного нормування та методів контролю біологічних факторів Комітету з питань гігієнічного регламентування Міністерства охорони здоров’я України (протокол № 9 від 12 грудня 2005 р.); IV Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: харчування, екологія, демографія” (Харків, 2006), Міжнародній науково-практичній конференції “Екологія: проблеми адаптивно-ландшафтного землеробства” (Івано-Франківськ, 2006); VІІ з’їзді Українського Товариства ґрунтознавців і агрохіміків (Київ, 2006); Міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових робіт, серед них 4 статті у фахових наукових виданнях, 11 – в матеріалах конференцій, методичні вказівки, отримано патент.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступної частини, огляду літератури, опису об’єктів та методів дослідження, розділів викладення експериментальних результатів, аналізу й обговорення результатів дослідження, висновків, рекомендацій для впровадження, додатків. Перелік літературних джерел складається із 332 найменувань, з них 99 іноземною мовою. Роботу викладено на 149 сторінках комп’ютерного набору, ілюстровано 21 таблицею та 19 рисунками.

Подяки. Висловлюю щиру подяку науковому керівнику д.мед.н., професору Т.Г. Омельянець, зав. лабораторією екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології УААН, д.с.-г.н. О.В.  Шерстобоєвій, провідному н.с. відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, д.б.н., професору О.А.  Кіпріановій, зав. лабораторією моніторингу пестицидів Інституту агроекології УААН, к.с.-г.н. Г.Г. Андрієнко, зав. відділом екотоксикології Інституту агроекології УААН, к.х.н. Л.І. Моклячук за допомогу при виконанні роботи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. За даними аналізу результатів досліджень вітчизняних та іноземних авторів щодо впливу пестицидів на мікроорганізми ґрунту та вивчення здатності мікроорганізмів розкладати пестициди відмічено відсутність даних про формування мікробного ценозу ґрунту при високому рівні його забруднення пестицидами (у зонах розташування складів з непридатними для використання пестицидами). На основі аналітичного огляду наукової літератури обґрунтовано необхідність та перспективність проведення досліджень за темою дисертації.

Матеріали й методи досліджень. Досліджувались зразки ґрунту, відібрані на дослідному полі Інституту кормів УААН (м. Вінниця), тип ґрунту - сірий лісовий (грубопилуватий, середньосуглинковий, рН сольове = 5,2-5,4; гумус – 2%); у зоні розташування складу пестицидів (Хмельницька область), тип ґрунту - чорнозем вилугуваний (грубопилуватий, легкосуглинковий, рН сольове = 5,9; гумус – 3,6%); вивчення біодеградації гербіцидів проводили на чорноземі опідзоленому (грубопилуватому, легкосуглинковому, рН сольове = 4,7; гумус – 3,7%), відібраному у Сквирському районі Київської області.

Відбір зразків ґрунту та їх мікробіологічний аналіз проведено за загальноприйнятими методиками ґрунтової мікробіології (Звягинцев, 1993). Чисельність ґрунтових мікроорганізмів різних еколого-трофічних груп виначали методом висіву граничних розведень суспензії ґрунту на елективні поживні середовища: при визначенні загальної чисельності мікроорганізмів у зразках ґрунту – на середовище м'ясо-пептонний агар (МПА), спорових – на МПА з глюкозою, олігонітрофілів – на середовище Ешбі, педотрофів – на ґрунтовий агар, оліготрофів – на голодний агар, мікроміцетів – на середовище Чапека, нітрифікуючих мікроорганізмів – на середовище Виноградського, амоніфікаторів – на м'ясо-пептонний бульон (МПБ), бактерій групи кишкової палички – на середовище Ендо (Звягінцев, 1991, Теппер, 1987).

Об’єктами дослідження були як виділені нами із ґрунту культури мікроорганізмів, так і штами із Української колекції мікроорганізмів (УКМ) Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ та колекції культур Інституту агроекології УААН, що відносяться до родів Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Flavobacterium, Azotobacter, Xanthomonas; штам E. сoli отримано з колекції Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.Громашевського АМНУ.

При ідентифікації виділених культур мікроорганізмів враховували морфологію клітин та колоній, відношення до фарбування за Грамом, оксидазну активність бактерій за Ковачем, каталазну активність, здатність до ферментації вуглеводнів та високоатомних спиртів, здатність до ферментації глюкози на середовищі Хью-Лейсона, температурний тест та інші ознаки згідно загальноприйнятих методик (Берджі, 1997, Скворцова, 1992, Кіпріанова, 1990).

Чутливість мікроорганізмів до дії гербіцидів визначали за допомогою модифікованого нами методу дифузії в агар з використанням дисків з фільтрувального паперу, просякнутих розчинами гербіцидів.

Зміни чисельності бактерій при вивченні мікробіологічної деструкції гербіцидів у рідкому середовищі визначали за допомогою фотоколориметричного методу (Гергхардт, 1984). Динаміку чисельності бактерій впродовж терміну досліду визначали та розраховували згідно з калібрувальним графіком за формулою

N=0,00176+2,812 E, (1)

де N – чисельність КУО бактерій у розчині; E – оптична густина розчину.

Визначення кількості пестицидів у ґрунті проводили на базі лабораторії моніторингу пестицидів Інституту агроекології УААН у відповідності з офіційно діючими методичними вказівками (Клисенко, 1983). Ідентифікацію та кількісний аналіз ДДТ (ДДД, ДДЕ), ГХЦГ, дуалу із ґрунту проводили з використанням хроматографу „Кристалл-2000” методом газорідинної хроматографії. Для визначення динаміки деградації дуалу в рідкому середовищі використовували метод тонкошарової хроматографії.

Математична обробка отриманих результатів здійснена за загальноприйнятими методами математичної статистики (Доспехов, 1983; Лакин, 1990) та з використанням стандартних комп’ютерних програм для Microsoft Excel і Statistica 6.0.

Розробка методу визначення чутливості мікроорганізмів до токсичної дії гербіцидів. Визначення чутливості мікроорганізмів до токсичної дії пестицидів стало першим етапом для пошуку мікроорганізмів - потенційних деструкторів пестицидів. Для цього за основу був взятий метод дифузії в агаризоване середовище з використанням паперових дисків, який застосовують у медичній та ветеринарній мікробіології для визначення чутливості патогенних мікроорганізмів до антибіотиків. Замість антибіотиків використовували хімічні засоби захисту рослин, розраховували концентрації досліджуваних препаратів для просякування паперових дисків з урахуванням норм витрат при застосуванні пестицидів. Принцип методу полягає в пригніченні або обмеженні росту мікроорганізмів під впливом препарату, який дифундує в агаризоване середовище. Експериментально нами підібрано умови, від яких залежить ступінь дифузії пестицидів в агар: температура та час інкубування мікроорганізмів, кількість клітин бактерій для засіву на поверхню чашки Петрі. За розміром зони затримки росту досліджуваних культур навколо дисків з пестицидами розроблено критерії для оцінки ступеню чутливості мікроорганізмів до них.

Досліджувані штами умовно розподілено за трьома категоріями чутливості до токсичної дії пестициду: чутливі, середньочутливі, нечутливі. Запропонований метод оформлено у вигляді методичних вказівок.

Використання даного методу дало змогу охарактеризувати чутливість до дії гербіцидів гезагарду (1 мкг/мл), атразину (1 мкг/мл), дуалу (0,43 мкг/мл), примекстри (1,15 мкг/мл) 19 штамів ґрунтових мікроорганізмів, які належать до 6 родів: Azotobacter (2 штами), Bacillus (2 штами), Pseudomonas (7 штамів), Agrobacterium (4 штами), Flavobacterium (2 штами), Xantomonas (1 штам). Як свідчать отримані дані, досліджені пестициди по-різному впливають на ріст бактерій. Максимальна кількість нечутливих штамів (65%) відмічена до дії гезагарду (діюча речовина прометрин), мінімальна - до дії дуалу (21%). Здатність пригнічувати ріст бактерій зменшується в ряду таким чином: дуал > римекстра > атразин> гезагард. Ґрунтові мікроорганізми різних родів мапють різну чутливість до вивчених гербіцидів (рис. 1). Апробація методу дифузії в агар за допомогою дисків з фільтрувального паперу для визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів, дає підстави стверджувати, що запропонований метод можна використовувати для пошуку нечутливих до токсичної дії пестицидів мікроорганізмів як швидкий та економічний.

Пошук і відбір бактерій роду Pseudomonas, нечутливих до токсичної дії гербіцидів. Бактерії роду Pseudomonas широко розповсюджені у ґрунті. Різноманітність біосинтетичних реакцій, потужна ферментативна система, висока швидкість росту на простих за складом середовищах, адаптивна здатність та здатність до розкладання багатьох ксенобіотиків дозволяє розглядати цю групу мікроорганізмів як перспективний об’єкт для пошуку серед них деструкторів пестицидів. Досліджено чутливість до пестицидів 6 штамів, виділених нами із ґрунту, та 95 колекційних штамів бактерій роду Pseudomonas, які належать до 7 видів: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. aиrеofaciens, P. aurantiaca, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, P. mendocina. Інтерпретацію результатів проводили згідно з розробленими нами методичними вказівками ”Визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів методом дифузії в агар з використанням дисків з фільтрувального паперу”. Результати вивчення чутливості бактерій роду Pseudomonas до цих гербіцидів узагальнено на рис. 2. Дослідження показали, що представники цього роду неоднаково реагують на вплив гербіцидів. Це залежить від як від видової належності мікроорганізму, так і від індивідуальних особливостей самого штаму. Гербіциди по різному впливають на ріст цих бактерій. Для кожного препарату визначена різна кількість нечутливих штамів (рис. 2). Серед досліджених бактерій нечутливими до атразину виявились 48 штамів, до гезагарду – 82 штами, до дуалу – 69 і до примекстри – 51 штам.

Гезагард найменше пригнічує життєдіяльність бактерій роду Pseudomonas (82% – штамів, нечутливих до його дії). Найбільше пригнічує ріст цих бактерій атразин ( 48% нечутливих штамів).

Серед нечутливих до дії гербіцидів штамів було продовжено подальший пошук потенційних деструкторів цих ксенобіотиків.

Здатність нечутливих до дії гербіцидів штамів використовувати гербіциди як джерело живлення та енергії. Вивчено здатність нечутливих штамів бактерій роду Pseudomonas використовувати гербіциди для свого живлення в якості джерела біогенних елементів вуглецю та азоту на прикладі гербіциду дуалу (діюча речовина метолахлор - 2-метил-N-метоксіізопропіл-6-етілхлорацетанілін). Дуал внесено до „Переліку дозволених для використання в Україні пестицидів та агрохімікатів”, препарат широко використовують для обробки посівів традиційних для України культур: кукурудзи, цукрових буряків, соняшнику, гороху та ріпаку. На основі узагальнення отриманих даних встановлено, що із 101 досліджених штамів бактерій роду Pseudomonas лише 4 штами здатні використовувати дуал як джерело азоту, 5 - як джерело вуглецю, 2 - як джерело азоту і вуглецю. Із їх числа за інтенсивністю росту відібрані найбільш активні штами, які належать до видів: Р. fluorescens (штам Р. fluorescens УКМ В-36), Р. aиrantіaca (штам Р aиrantіaca УКМ В-83), Р. mendocina (штам Р. mendocina УКМ В-171), Р. aиrеofaciens (штам Р. aиrеofaciens УКМ В-109).

Склад середовища, в яке внесено гербіцид, значною мірою впливає на інтенсивність росту досліджуваних бактерій. Кількість штамів, які можуть рости при додаванні гербіциду до мінерального середовища Козера, в 1,3 рази менша, в порівнянні із середовищем Козера, в яке не вносили гербіцид. Додавання дуалу до органічного середовища МПА майже не впливало на ріст нечутливих бактерій.

Мікробна деградація пестицидів. Визначення потенційної здатності бактерій до деградації гербіцидів. Вивчення властивостей мікроорганізмів щодо біодеградації пестицидів проводили на прикладі гербіциду дуалу в рідкому мінеральному середовищі Козера. В якості потенційних деструкторів дуалу були взяті 4 штами бактерій роду Pseudomonas, здатних використовувати біогенні елементи азот та вуглець, що входять до складу діючої речовини дуалу - метолахлору як джерело живлення. Це Р. aиrantіaca УКМ В-83, Р .mendocina УКМ В-171, Р.fluorescens УКМ В-36, Р. aиrеofaciens УКМ В-109.

На рис. 3 наведено значення кількості досліджуваних бактерій через 1, 3, 5, 7 та 10 діб після їх посіву. Кількість бактерій розраховано за формулою (1), наведеною на стор. 6.

За отриманими даними досліджувані штами можна розташувати в порядку зменшення інтенсивності росту в присутності дуалу таким чином: Р. fluorescens УКМ В-36 Р. aиrantіaca УКМ В-83 Р. mendocina УКМ В-171 Р. aиrеofaciens УКМ В-109 (рис. 4).

Зміни вмісту дуалу в рідкому середовищі та кількості бактерій свідчать про те, що найактивніше в рідкому середовищі відбувається розклад гербіциду дуалу бактеріями Р. fluorescens УКМ В-36.

Рис. 3. Динаміка кількості бактерій роду Pseudomonas в досліджуваних розчинах, млн КУО

Рис. 4. Динаміка вмісту дуалу в рідкому мінеральному середовищі, мкг/мл

Отже, можна стверджувати, що в рідкому мінеральному середовищі вміст гербіциду зменшується, а кількість бактеріальних клітин збільшується. За отриманими даними штам Р. fluorescens УКМ В-36 можна розглядати як здатний до розкладу дуалу.

Вивчення біодеградації гербіциду дуалу в ґрунті. У результаті кількісного аналізу дуалу в ґрунті виявлено, що максимальну константу швидкості розпаду (К=0,131) відмічено при інтродукції штаму Р. fluorescens УКМ В-36 в нативний ґрунт (рис. 5). У стерильному ґрунті цей показник є мінімальним (К=0,022). Деструкційні властивості штаму яскраво проявляються при порівняні результатів розпаду дуалу в стерильному і нативному ґрунті. Так, при внесенні Р. fluorescens УКМ В-36 у нативний ґрунт через 30 діб розкладено 96% дуалу, тоді як у стерильному ґрунті без бактерій - тільки 57% . Цей факт підтверджує провідну роль ґрунтової мікробіоти при розкладанні гербіцидів у ґрунті.

Проведено також дослідження з оцінки приживлюваності штаму Р. fluorescens УКМ В-36 у стерильному ґрунті.

Рис. 5. Динаміка вмісту дуалу в ґрунті, мг/кг

Наведені на рис. 6 дані регресійного аналізу залежності зміни чисельності Р. fluorescens УКМ В-36 від терміну находження у ґрунті без дуалу описується рівнянням у=–0,0218х2+0,4046х+4,2186 (коефіцієнт апроксимації R2 = 0,83). У ґрунті з дуалом ця залежність описана рівнянням у=0,0645х20,7655х+7,6271 (коефіцієнт апроксимації R2 = 0,64). Отже, штам

Р. fluorescens УКМ В-36 краще приживлюється у ґрунті при внесенні дуалу.

Дані статистичної обробки результатів дослідження свідчать, що існує ймовірний кореляційний зв’язок між внесенням Р. fluorescens УКМ В-36 та кількістю пестициду в ґрунті на 30 добу експерименту (коефіцієнт кореляції r = -0,98 при р ? 0,05). Високий рівень кореляції підтверджує деструкційні властивості інтродукованого штаму щодо гербіциду дуалу в ґрунті.

Рис. 6. Залежність зміни кількості Р. fluorescens УКМ В-36 від терміну досліду в стерильному ґрунті (а – контроль, без внесення дуалу; б – дослід, при внесенні дуалу)

Це створює передумови для використання бактерій P. fluorescens УКМ В-36 як біоагента біопрепарату для очищення ґрунту від дуалу.

Штам P. fluorescens УКМ В-36 депоновано в Депозитарії Національної колекції мікроорганізмів.

Вплив абіотичних факторів на життєздатність P. fluoresceпs УКМ В-36. Встановлено, що при прогріванні до 500С мікроорганізми штаму P. fluoresceпs УКМ В-36 зберігають життєздатність впродовж 1 години, при температурі 600С ці мікроорганізми гинуть у перші 10 хв. При зберіганні в замороженому стані (–13 0С) бактерії залишались життєздатними впродовж 1 року (термін спостереження). При висушуванні в умовах кімнатної температури штам P. fluoresceпs УКМ В-36 також був життєздатним впродовж терміну спостереження (1 рік). При збереженні в холодильнику у висушеному стані зберігався близько 3-х років (термін спостереження). Отже, отримані результати свідчать, що штам P. fluorescens УКМ В-36 є стійким до дії вказаних абіотичних факторів. Це дає підстави прогнозувати здатність штаму виживати при внесенні у ґрунт за дії високих і низьких температур, при довготривалій відсутності вологи.

Вплив P. fluoresceпs УКМ В-36 на мікробіологічний та санітарно-епідемічний стан ґрунту. Встановлено, що внесення в ґрунт P. fluorescens УКМ В-36 незначно змінює загальну кількість мікроорганізмів та кількість спорових мікроорганізмів, проте чисельність мікроміцетів впродовж терміну спостереження зменшується, що можна пояснити антагоністичними властивостями інтродукованих бактерій (таблиця 1). Результати експерименту свідчать, що кількість амоніфікуючих та нітрифікуючих мікроорганізмів підвищується в ґрунті, в який внесено P. fluorescens УКМ В-36.

Таблиця 1.

Динаміка кількості ґрунтових мікроорганізмів при інтродукції

P. fluorescens УКМ В-36 ( lg КУО в 1г абсолютно сухого ґрунту)

Термін дослід-ження, діб | Загальна кількість мікроорганізмів | Кількість спорових мікроорганізмів | Кількість мікроскопічних грибів | Дослід-

ний ґрунт | Контроль-

ний ґрунт | Дослід-

ний ґрунт | Контроль-

ний ґрунт | Дослідний ґрунт | Контроль-

ний ґрунт | 1 | 6,30±0,07 | 6,07±0,1 | 5,01±0,14* | 4,98±0,19 | 3,69±0,01 | 3,49±0,01 | 3 | 6,19±0,01* | 6,08±0,01 | 4,02±0,21 | 4,85±0,18 | 3,73±0,01* | 3,49±0,01 | 5 | 6,17±0,07* | 6,07±0,03 | 5,11±0,16* | 4,85±0,17 | 2,29±0,01* | 3,31±0,01 | 7 | 6,19±0,01* | 6,07±0,01 | 4,75±0,13* | 4,75±0,10 | 2,91±0,01* | 3,88±0,01 | 10 | 6,24±0,03* | 6,08±0,02 | 4,24±0,31 | 4,23±0,16 | 2,04±0,03* | 3,03±0,01 | 20 | 6,18±0,08 | 6,06±0,03 | 3,15±0,25 * | 4,19±0,15 | 2,27±0,02* | 3,29±0,02 | 30 | 6,17±0,06* | 6,08±0,02 | 4,10±0,20 | 4,12±0,09 | 2,27±0,01 | 3,26±0,02 |

Примітка: *різниця вірогідна при р ? 0,05.

Цей факт підтверджує прискорення процесів перетворення органічних сполук при інтродукції бактерій штаму. Таким чином, отримані результати досліджень дозволяють стверджувати, що внесення бактерій P. fluorescens УКМ В-36 не погіршує стан ґрунтового мікробіоценозу.

При аналізі санітарно-показової мікрофлори (на прикладі E.coli) виявлено зниження титрів кишкової палички як у дослідному, так і контрольному ґрунтах. На початку експерименту титр E.coli становив 4 lg КУО, на 30-у добу зменшується до 2 lg КУО. Такі дані є свідченням того, що інтродукція штаму P. fluorescens УКМ В-36 не впливає негативно на санітарно-епідемічний стан ґрунту.

Оцінка впливу хлорорганічних пестицидів на мікробіоценоз ґрунту. В лабораторії моніторингу пестицидів відділу екотоксикології Інституту агроекології УААН проведено дослідження ґрунту на вміст стійких хлорорганічних пестицидів в межах впливу недіючого складу отрутохімікатів (Хмельницька обл.). Ізомери та метаболіти ДДТ та ізомери ГХЦГ виявлено в усіх зразках ґрунту, відібраних у межах санітарної зони складу, у концентраціях, що значно перевищують гранично допустимі рівні. Відмічено вертикальну міграцію пестицидів у ґрунті.

Для мікробіологічних досліджень відібрано зразки ґрунту на відстані 1 м від складу (вміст ДДТ становить 603,3 мкг/кг, що перевищує ГДК в 6 разів), зразки ґрунту перелогу (контроль) та зразки ґрунту перелогу, в який вносили ДДТ у кількості 10 ГДК. В результаті проведених нами досліджень встановлено, що загальна кількість мікроорганізмів у контролі незначно відрізняється від їхньої кількості в ґрунті біля складу. У зразку, в який внесено 10 ГДК ДДТ відбувається пригнічення загальної мікрофлори в 1,3 рази. Високі концентрації ДДТ не впливають на розвиток стрептоміцетів та мікроміцетів в обох варіантах порівняно з контрольним (таблиця 2).

Таблиця 2.

Чисельність різних еколого-трофічних груп мікроорганізмів у ґрунті з різним вмістом ДДТ

Варіант | Загальна чисельність мікроорганізмів,

млн КУО | Чисельність стрептоміцетів,

тис КУО | Чисельність мікроміцетів,

тис КУО | Переліг(контроль)

8,44±0,60 | 117,80±17,41 | 10,94±2,80 | Переліг+10 ГДК

ДДТ | 6,70±0,41 | 154,10±14,11 | 9,89±3,45 | 1м від складу

(6 ГДК ДДТ) | 8,39±0,38 | 147,96±16,15 | 7,10±3,90 |

Встановлено, що співвідношення спорових та неспорових бактерій у цих варіантах значно змінюється. Результати проведених досліджень свідчать, що спостерігається тенденція зменшення частки спорових бактерій у ряду зразків ґрунту: 58% (переліг)> 34% (переліг+ 10 ГДК ДДТ) > 15% (1 м від складу). При цьому частка неспорових форм бактерій, навпаки, збільшується: 28% (переліг) > 24% (переліг+10 ГДК ДДТ) > 65% (1м від складу). Таке співвідношення спорових та неспорових бактерій є свідченням того, що у ґрунті складу процес його самоочищення від ксенобіотиків органічної природи ще не завершився. Кількість бактерій роду Pseudomonas майже в 2 рази більша (10,4±0,6 млн. КУО) у ґрунті складу, ніж у ґрунті перелогу (4,5±0,3 млн. КУО) та у ґрунті, в який внесено 10 ГДК ДДТ (5,2±0,6 млн. КУО). Проведені мікробіологічні дослідження підтверджують стійкість бактерій роду Pseudomonas до токсичного впливу пестицидів в умовах довготривалої дії високих концентрацій хлорорганічних пестицидів.

Отже, реакція мікроорганізмів різних систематичних груп залежить від дози пестициду та часу його впливу на мікробіоценоз. При тривалому впливі широкого спектру пестицидів та їхніх метаболітів впродовж багатьох років у ґрунті санітарно-захисної зони складу хлорорганічних пестицидів формується специфічний мікробіоценоз. Специфіка його формування полягає в тому, що пестициди виявляють вибіркову дію на мікробіоту, при незначній зміні загальної чисельності мікроорганізмів змінюється співвідношення спорових та неспорових бактерій.

Особливості формування мікробіоценозу ґрунту, забрудненого персистентними гербіцидами. В лабораторії моніторингу пестицидів відділу екотоксикології Інституту агроекології УААН проведено аналіз ґрунту на місці колишнього розташування тимчасового сховища з пестицидами (м.Вінниця). Грунт досліджуваної ділянки забруднений гербіцидами: сим-триазинами (симазин, атразин, прометрин), а також похідними феноксикарбонової та бензойної кислот (2,4-Д, дикамба), які у попередні роки широко застосовувались у сільському господарстві. В контрольних зразках ґрунту перелогу гербіцидів не було виявлено в жодному горизонті. Встановлено нерівномірний розподіл гербіцидів за профілем ґрунту. Максимальна кількість персистентних гербіцидів виявлена в орному шарі ґрунту (0 – 20 см): симазину – 5,0 мг/кг, атразину – 0,4 мг/кг, прометрину – 0,8 мг/кг, 2,4-Д – 3,4 мг/кг, дикамби – 1,6 мг/кг, трефлану - 7,0 мг/кг. Згідно результатів проведених нами досліджень загальна чисельність мікроорганізмів у ґрунті, забрудненому гербіцидами, значно зменшується порівняно з контролем у горизонтах 0 – 20 та 20 – 40 см відповідно у 12,6 та 5,1 рази. Відмічено зменшення кількості мікроскопічних грибів у горизонті 0 – 20 см забрудненого ґрунту майже в 7 разів (3,20,4 тис. КУО/г) порівняно з контрольним (22,90,3 тис. КУО/г). Виявлено зменшення чисельності педотрофів порівняно з контролем у горизонтах 0 – 20, 20 – 40 см відповідно у 8,8 та 3,8 рази. Кількість оліготрофів у забрудненому ґрунті практично не змінюється порівняно з контрольним.

Отже, мікробний ценоз ґрунту, забруднений високими концентраціями персистентних пестицидів, здатний витримувати значне хімічне навантаження. Високі концентрації персистентних гербіцидів по-різному впливають на ґрунтову мікрофлору: життєздатність одних мікроорганізмів пригнічується, інших - не змінюється. Мікроорганізми, здатні до життєдіяльності в умовах довготривалого впливу високих концентрацій пестицидів у ґрунті, можна розглядати як стійкі до токсичної їх дії.

Виділення ґрунтових бактерій, стійких до високих концентрацій гербіцидів. Результати досліджень свідчать про те, що у ґрунті, забрудненому пестицидами впродовж десятиліть, є мікроорганізми стійкі до токсичної дії високих концентрацій персистентних пестицидів. Так, найбільшу частку стійких до прометрину мікроорганізмів виявлено у ґрунті сховища порівняно з контрольним. У горизонтах 0 – 20 та 20 – 40 см, де знаходиться максимальна кількість пестицидів, цей показник відповідно сягає 75 % та 56 %, що у 2,1 рази вище, ніж у контрольному ґрунті перелогу. Це пояснюється високою адаптивною здатністю мікроорганізмів до токсичної дії пестицидів. Серед таких мікроорганізмів у чисту культуру виділено бактерії, стійкі до 2, 5, 10 та 20 ГДК прометрину. За морфолого-культуральними та біохімічними ознаками виділені бактерії віднесено до родів: Bacillus, Micrococcus, Sarcina та Pseudomonas.

Використовуючи методику визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів, виділені із ґрунту сховища бактерії можна розташувати в порядку зменшення стійкості до прометрину таким чином: Pseudomonas > Bacillus > Micrococcus > Sarcina. Виділені із ґрунту, забрудненого гербіцидами, бактерії роду Pseudomonas виявились найбільш стійкими до прометрину в концентраціях 2, 5, 10, 20 ГДК. Серед них штам Pseudomonas fluorescens-06 можна розглядати як один із стійких до високих концентрацій гербіцидів і як деструктор прометрину.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі за результатами теоретичних узагальнень і експериментальних досліджень розроблено новий підхід до науково-методичних питань біодеградації пестицидів у ґрунті природними ґрунтовими мікроорганізмами. Проведене дослідження є складовою частиною роботи у накопиченні необхідних даних для вирішення важливої екологічної проблеми – очищення ґрунтів, забруднених пестицидами.

1. Запропоновано та обґрунтовано методичні підходи до пошуку мікроорганізмів – потенційних деструкторів пестицидів серед нечутливих та стійких до їх токсичної дії мікроорганізмів.

2. Для визначення чутливості мікроорганізмів до токсичної дії пестицидів запропоновано модифікований метод дифузії в агар. Показано, що ґрунтові бактерії родів Pseudomonas, Azotobacter, Bacillus, Agrobacterium, Flavobacterium, Xantomonas мають різну чутливість до токсичної дії гербіцидів гезагарду, атразину, дуалу і примекстри.

3. Вивчено вплив антропогенних чинників, якими є пестициди, на біосистеми різного рівня інтеграції: штами, види, роди ґрунтових мікроорганізмів, мікробіоценоз ґрунту.

4. Теоретично обґрунтовано і експериментально підтверджено доцільність проведення пошуку мікроорганізмів – деструкторів пестицидів серед ґрунтових бактерій роду Pseudomonas. Досліджено здатність нечутливих до токсичної дії дуалу штамів бактерій роду Pseudomonas використовувати цей гербіцид як джерело біогенних елементів (6% використовують дуал як джерело азоту, 7% як джерело вуглецю).

5. Вперше експериментально показана можливість біодеградації гербіциду дуалу штамом P. fluorescens УКМ B-36 в рідкому середовищі та в ґрунті. Внесення P. fluorescens УКМ B-36 прискорює процес розпаду дуалу в рідкому середовищі у 12 разів, в чорноземному ґрунті в 1,2 рази. Існує ймовірний кореляційний зв’язок між внесенням Р. fluorescens УКМ В-36 та кількістю пестициду в ґрунті (коефіцієнт кореляції r = -0,98 при р ? 0,05).

6. Встановлено, що внесення штаму-деструктора дуалу P. fluorescens УКМ B-36 у ґрунт не погіршує стан ґрунтового мікробіоценозу та не впливає негативно на його санітарно-епідемічний стан. Показано, що при незначній зміні загальної чисельності та чисельності спорових мікроорганізмів відбувається зменшення кількості мікроскопічних грибів. Кількість кишкової палички поступово зменшується. Штам Р. fluorescens УКМ В-36 стійкий до дії таких абіотичних факторів: температура (від –13 0С до 500С) та довготривала відсутність вологи не впливають на його життєздатність.

7. Показано, що у ґрунтах, забруднених пестицидами у кількостях, які перевищують ГДК, формується специфічний мікро біоценоз, склад якого залежить від типу пестицидів, їх концентрації у ґрунті, терміну впливу. Мікроорганізми, які зберігають життєздатність в умовах довготривалого впливу тих чи інших пестицидів, є стійкими до їх токсичної дії і можуть бути потенційно здатними до їх біодеградації.

8. Вперше з ґрунту, забрудненого персистентними гербіцидами, виділено бактерії, стійкі до високих концентрацій гербіциду прометрину. За культурально-морфологічними та фізіолого-біохімічними ознаками виділені в чистій культурі мікроорганізми віднесено до родів Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus та Sarcina. Найстійкішим до високих концентрацій прометрину є штам P. fluorescens-06, який можна використовувати для біодеградації цього гербіциду.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ДЛЯ ВПРОВАДЖЕННЯ

1. Метод для визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів з використанням дисків з фільтрувального паперу, який дозволяє швидко оцінити рівень чутливості мікроорганізмів різних родів до пестицидів та відібрати нечутливі до їх токсичної дії штами.

2. Штам P. fluorescens УКМ B-36 рекомендується як діючий чинник для створення на його основі біопрепарату для очищення ґрунту від дуалу.

3. Штам P. fluorescens-06 як здатний до розкладу гербіциду прометрину.

З метою поглиблення знань з проблеми біодеградації пестицидів ґрунтовими мікроорганізмами рекомендується: подальше вивчення процесів розкладу пестицидів мікроорганізмами різних таксономічних груп; проведення досліджень з розробки технологій отримання біопрепаратів для очищення ґрунту від пестицидів.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тертична О.В. Використання методу дифузії в агар для визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів // Агроекологічний журн. - 2004. - № 4. - С. 68-70.

2. Тертична О.В., Андрієнко Г.Г., Моклячук Л.І. Агроекологічна оцінка впливу високих концентрацій пестицидів на мікробний ценоз ґрунту. - Наукові праці Полтавської державної аграрної академії. - Том 4 (23). - Полтава, 2005. - С. 174-177 (Проведення експериментальної роботи, участь у написанні статті).

3. Андрієнко В.О., Моклячук Л.І., Андрієнко Г.Г., Тертична О.В., Городиська І.М. Оцінка впливу забруднення стійкими пестицидами на формування мікробіоценозу ґрунту // Науковий вісник Національного аграрного університету. - К., 2006. - Вип. 100. - С. 281-287 (Проведення мікробіологічних досліджень, аналіз результатів, участь у написанні статті).

4. Андрієнко В.О., Моклячук Л.І., Андрієнко Г.Г., Тертична О.В., Городиська І.М. Формування мікробіоценозу чорнозему опідзоленого в зоні забруднення стійкими пестицидами // Науковий збірник “Агрохімія і ґрунтознавство” – К., 2006. – С. 172- 174 (Проведення мікробіологічного аналізу ґрунту, узагальнення та інтерпретація результатів, формулювання висновків).

5. Пат. 14400 А Україна, МКИ С 12 N/20. Штам бактерій P. fluorescens УКМ В-36, який призначений для розкладу гербіциду дуалу / Тертична О.В., Омельянець Т.Г. - № 200510841; Заявл. 15. 11. 2005; Опубл. 15. 05. 2006, Бюл. № 5, 2006. - 3 с.

6. Тертична О.В. Визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів методом дифузії в агар з використанням дисків з фільтрувального паперу: Методичні вказівки / За ред. проф. Т.Г. Омельянець. - К.: Логос. - 2005. - 12 с.

7. Tertichnaya O. The state of the development in using microbiological remediation of pesticides polluted soils // 7-th International HCH and pesticides forum (Abstracts). - Kyiv, 7-10 June, 2003. - Р. 118.

8. Тертична О.В. Вплив прометрину на життєдіяльність різних груп мікроорганізмів // Cтабілізація землекористування та сучасні агротехнології. - Наук.-практ. конф. молодих вчених, Київ-Чабани, 24-26 лист. 2003 р. - Чабани, 2003. - С. 28-29.

9. Андриенко Г.Г., Моклячук Л.И., Тертична О.В. Влияние высоких концентраций персистентных гербицидов на микрофлору почвы в зоне расположения склада ядохимикатов // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Мат. межд. конф., Минск, 26-28 мая 2004 г. - Минск, 2004. - С. 377-378.

10. Тертична О.В., Пономаренко С.В, Чайковська В.В., Коваленко Т.М. Екологічні аспекти застосування мікробних біотехнологій в сільському господарстві // Екологічна безпека об’єктів господарської діяльності: Тези доповідей до Міжн. наук.-практ. конф., Миколаїв 3-5 черв. 2004 р. - Миколаїв, 2004. - С. 155-157.

11. Тертична О.В. Резистентність мікроорганізмів до пестицидів як селективний фактор для пошуку мікроорганізмів-деструкторів // Тези доповідей Х з’їзду Товариства мікробіологів України, Одеса, 15-17 верес. 2004 р. - Одеса, 2004. - С. 310.

12. Тертична О.В. Оцінка стійкості мікробних асоціацій різних типів ґрунтів України до гербіцидів // Молодь і поступ біології: Тези доповідей Першої міжн. конф. студентів та аспірантів, Львів, 11-14 квіт. 2005 р. - Львів: СПОЛОМ, 2005. - С. 98.

13. Омельянець Т.Г., Тертична О.В. Біодеградація пестицидів у ґрунті - важлива екологічна проблема // Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України (Перші марзеєвські читання): Зб. тез доповідей наук.-практ. конф., Київ, 21-22 квіт. 2005 р. - К., 2005. - С. 102-103.

14. Коваленко Т.М., Тертична О.В., Чайковська В.В. Екологічно безпечні елементи технології вирощування сільськогосподарських культур // Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи: Збірник матеріалів V міжвузівської наук.-практ. конф. аспірантів, Вінниця, 17-19 травня 2005 р. - Вінниця, 2005. - С. 46-47.

15. Чабанюк Я.В., Дем’янюк О.С., Шустерук Т.З., Тертична О.В. Вплив аграрного виробництва на мікробне різноманіття ґрунту // Наука і соціальні проблеми суспільства: харчування, екологія, демографія: Матеріали IV Міжнар. наук.-практ. конф., Харків, 23-24 травня 2006 р. - Харків, 2006. - Ч. 2. - С. 220-222.

16. Тертична О.В., Андрієнко Г.Г., Моклячук Л.І., Недашківська О.Ю., Андрієнко В.О. Пошук шляхів біоремедіації ґрунтів за допомогою мікроорганізмів // Екологія: проблеми адаптивно-ландшафтного землеробства: Матеріали Міжнар. наук.-практ. конф., Івано-Франківськ, 20-21 червня 2006 р., - Івано-Франківськ, 2006. - С. 192-193.

17. Тертична О.В. Вплив гербіцидів