МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

КИЇВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ

ім. П.Л. ШУПИКА

Васюк Світлана Олександрівна

УДК 547.441/447+547.57/:615.07

ЗАСТОСУВАННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ МЕТОДІВ ДЛЯ АНАЛІЗУ ЯКОСТІ ФЕНОЛВМІЩУЮЧИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аналітичної хімії Запорізького державного медичного університету Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий консультант: доктор фармацевтичних наук, професор

Петренко Володимир Васильович, Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

Ветютнева Наталія Олександрівна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика, завідувачка кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, доцент

Лесик Роман Богданович, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, професор кафедри фармацевтичної, органічної та біоорганічної хімії

доктор хімічних наук, професор

Ткач Володимир Іванович, Український державний хіміко-технологічний університет, завідувач кафедри аналітичної хімії

Провідна установа: Національний фармацевтичний університет Міністерства охорони здоров’я України, кафедра аналітичної хімії, м. Харків

Захист відбудеться “_31__” березня_ 2006 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)

Автореферат розісланий “_27__” _лютого__ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Пилипчук Л.Б.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У теперішній час спостерігається збільшення асортименту лікарських засобів, які використовуються практичною медициною для профілактики та лікування різноманітних захворювань. Для ефективного та безпечного застосування препаратів необхідно підвищувати вимоги до якості лікарських засобів шляхом розробки нових, а також удосконалення та уніфікації існуючих методів фармацевтичного аналізу.

Більшість наукових досліджень у цьому напрямку базуються на розробці сучасних методик аналізу лікарських речовин, а також на пошуку нових шляхів при використанні вже відомих способів ідентифікації та кількісного визначення.

В останній час у фармацевтичному аналізі домінують фізико-хімічні методи, найбільш доступними та надійними з яких є методи хроматографічного та спектрофотометричного аналізу. Хроматографічні методи дозволяють провести якісне та кількісне визначення речовин в багатокомпонентних лікарських формах та біологічних рідинах без попереднього розділення компонентів. Однак, для деяких лікарських речовин, що містять фенольний гідроксил, не розроблено методик їх хроматографічного визначення. Серед методів спектрофотометричного аналізу високою вибірковістю, доступністю та простотою виконання характеризується спектрофотометрія у видимій області спектра. Загальною проблемою розвитку цього аналізу є пошук доступних, достатньо селективних, високочутливих реагентів, оскільки існуючий асортимент кольорореагентів не завжди може використовуватись у кількісному спектрофотометричному аналізі лікарських засобів. Більшість сполук, що містять фенольний гідроксил утворюють забарвлені продукти в реакціях з солями діазолю, а саме діазолем червоним 2Ж, діазолем червоним ЖЛ, діазолем рожевим О, діазолем яскраво-червоним К, діазолем яскраво-червоним 2Ж, діазолем синім С. Отже розробка простих у виконанні способів якісного та кількісного визначення лікарських речовин спектрофотометричними та хроматографічними методами є актуальною проблемою фармацевтичної науки і практики.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом наукових досліджень Запорізького державного медичного університету Міністерства охорони здоров’я України і є фрагментом комплексної теми “Застосування фізико-хімічних методів для аналізу якості лікарських засобів, похідних фенолу, пурину та ароматичних амінів” (№ державної реєстрації 0101U003299).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження є наукове обґрунтування та розробка високочутливих, простих у виконанні спектрофотометричних та хроматографічних методик якісного та кількісного аналізу лікарських речовин, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил, в тому числі на основі їх реакції з солями діазолю.

Для реалізації поставленої мети вирішувались такі задачі:

- розрахувати квантово-механічні показники (частковий заряд, довжину зв’язків тощо) реагентів та лікарських речовин, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил;

- визначити основні оптичні характеристики електронних спектрів поглинання (молярний показник поглинання, напівширина смуги поглинання, інтегральна інтенсивність, осциляторна сила переходу та матричний елемент переходу) досліджуваних лікарських речовин з метою встановлення нових аналітичних констант для лікарських речовин та продуктів реакції цих речовин з солями діазолю;

- встановити оптимальні умови кількісного утворення продуктів реакції солей діазолю з лікарськими речовинами, які містять фенольний гідроксил, та розрахувати аналітичні показники чутливості реакцій;

- виявити основні закономірності між будовою реагентів, їх фізико-хімічними, квантово-механічними показниками та аналітичними характеристиками реакцій;

- встановити коефіцієнти стехіометричних співвідношень “реагент – лікарська речовина, на основі квантово-механічних розрахунків визначити напрямок реакцій та встановити будову сполук, які утворюються в реакціях;

- обґрунтувати можливість застосування солей діазолю, як проявних реактивів, в тонкошаровій хроматографії для лікарських речовин, що містять фенольний гідроксил;

- встановити оптимальні умови проведення високоефективної рідинної хроматографії лікарських речовин, які містять фенольний гідроксил, для проведення порівняльної характеристики зі спектрофотометричними методиками.

Об’єкт дослідження. Лікарські речовини, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил.

Предмет дослідження. Спектрофотометричні та хроматографічні методи якісного та кількісного аналізу лікарських речовин, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил.

Методи дослідження. Для розробки нових методик якісного та кількісного аналізу лікарських речовин, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил, застосовано спектрофотометрію в ультрафіолетовій та видимій областях спектру, тонкошарову хроматографію (ТШХ), високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ). Встановлення складу продуктів реакції проводили спектрофотометричними методами: насичення, ізомолярних серій, відносного виходу. Чистоту виділених продуктів реакції визначали методом ТШХ, а будову - УФ- та ІЧ-спектрофотометрією, хромато-мас-спектрометрією. Для обробки мас-спектрів використовувалося програмне забезпечення “LabSolution v.2.02”, “LCMS PostRun”. Для розрахунків часткового заряду, довжини зв’язків та інших квантово-механічних показників використовували програмний пакет „CS ChemOffice v.8.0”. Побудову графіків та розрахунок параметрів лінійної залежності проводили з використанням програми „Sigma Plot v.8.0”. Обробку хроматограм, одержаних за методом ВЕРХ, проводили за допомогою програмного забезпечення Millenium 2.15”.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше науково обґрунтована та експериментально доказана можливість застосування деяких солей діазолю - діазолю червоного ЖЛ, діазолю яскраво-червоного К, діазолю яскраво-червоного 2Ж, діазолю червонного 2Ж, діазолю рожевого О, діазолю синього С - у фармацевтичному аналізі для якісного і кількісного визначення лікарських речовин, які містять фенольний гідроксил. Встановлені оптимальні умови перебігу реакції зазначених солей діазолю з лікарськими речовинами, розраховані аналітичні показники чутливості реакцій.

Виявлені основні закономірності між будовою реагентів, їх квантово-механічними, фізико-хімічними показниками та аналітичними характеристиками реакцій.

Визначені основні оптичні характеристики електронних спектрів поглинання лікарських речовин, що містять у своїй структурі фенольний гідроксил, в амфіпротних, протогенних та протофільних розчинниках, які можуть бути застосовані для ідентифікації досліджуваних речовин, а також для встановлення будови продуктів реакції з солями діазолю.

Визначені коефіцієнти стехіометричних співвідношень “реагент – лікарська речовина”, на основі квантово-механічних розрахунків визначено направленість реакцій досліджуваних лікарських речовин з солями діазолю та встановлена будова продуктів реакцій.

Обґрунтоване застосування солей діазолю як проявних реактивів в тонкошаровій хроматографії для лікарських речовин, що містять фенольний гідроксил. Вперше запропоновано діазоль рожевий О, як чутливий та доступний проявний реагент до зазначених вище лікарських речовин із застосуванням методу ТШХ.

Встановлені оптимальні умови проведення високоефективної рідинної хроматографії для етамзилату, кальцію добезилату та піридоксину гідрохлориду.

У результаті виконаних досліджень запропоновано 36 нових, високочутливих, простих у виконанні методик кількісного спектрофотометричного та хроматографічного визначення для 26 лікарських речовин, 86 лікарських засобів промислового виробництва (для кальцію добезилату вперше розроблені методики визначення із застосуванням спектрофотометрії у видимій області та високоефективної рідинної хроматографії) та 25 лікарських засобів екстемпорального виготовлення, що має важливе науково-практичне значення.

Наукова новизна одержаних результатів захищена 9 деклараційними патентами України.

Практичне значення одержаних результатів. Розширено асортимент аналітичних реагентів для кількісного спектрофотометричного аналізу і розроблено 36 спектрофотометричних та хроматографічних методик кількісного аналізу 27 лікарських субстанцій та 111 лікарських засобів промислового виробництва і екстемпорального виготовлення. За результатами досліджень Міністерством охорони здоров’я України для Державних інспекцій з контролю якості лікарських засобів видано інформаційні листи “Методика количественного определения тимола в “Пертуссине””(вип. 3, № 41-98), „Кількісне визначення мезатону в екстемпоральних лікарських формах” (вип. 1, № 19-2001). Методики наведені в них, впроваджені в практику роботи лабораторій Державних інспекцій з контролю якості лікарських засобів Запорізької (акт впровадження від 08.10.2002), Кіровоградської (акт впровадження від 08.02.2002), Дніпропетровської (акт впровадження від 17.10.2002), Житомирської (акт впровадження від 11.11.2003), Миколаївської (акт впровадження від 25.11.2003), Одеської (акт впровадження від 01.03.2004), Чернігівської (акт впровадження від 11.05.2005), Рівненської (акт впровадження від 20.06.2005) областей та м. Києва (акт впровадження від 2.09.2005).

Розроблені методики визначення тимолу в „Пертусині”, парацетамолу в таблетках парацетамолу по 0,2 г, суми флавоноїдів в перерахунку на рутин в настоянці кропиви собачої впроваджено на АТ „Галичфарм”, методика визначення мезатону в 1% розчині для ін’єкцій на - ДП „Дослідний завод ДП ДНЦЛЗ”, методики визначення суми флавоноїдів в перерахунку на рутин або кверцетин в настоянках календули, софори японської, кропиви собачої, траві звіробою, екстракті водяного перцю та тимолу у „Пертусині” та екстракті чебрецю - на ЗАТ Фармацевтична фабрика „Віола”, методики визначення суми флавоноїдів у перерахунку на рутин у настоянці календули та перерахунку на кверцетин у настоянці кропиви собачої - на ДКП „Фармацевтична фабрика” Чернігівської обласної державної адміністрації, методики кількісного визначення тимолу у „Пертусині” та суми флавоноїдів у настоянці календули - на ЗАТ „Ліки Кіровоградщини”, методики визначення суми флавоноїдів у настоянці календули та у настоянці кропиви собачої - на ДКП „Фармацевтична фабрика” Житомирської обласної державної адміністрації, методики визначення суми флавоноїдів у настоянці календули, настоянці пустирника та настоянці глоду - на фармацевтичній фабриці ОКП „Фармація” Дніпропетровської обласної державної адміністрації.

В роботу Науково-дослідного експертно-криміналістичного центру при УМВС України в Запорізькій області впроваджено методики виявлення морфіну і канабіноідів методом ТШХ із застосуванням діазолю рожевого О як проявного реактиву та спектрофотометричного кількісного визначення морфіну у соломі маку та опії, які використовуються при проведенні судово-хімічних експертиз наркотичних засобів.

Результати досліджень знайшли застосування в навчальному процесі при викладанні курсу фармацевтичної хімії на кафедрах фармацевтичних факультетів Запорізького державного медичного університету, Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Одеського державного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Івано-Франківського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського.

„Спосіб кількісного визначення піридоксину гідрохлориду” включено до галузевого реєстру нововведень МОЗ України за 2004 р. (реєстр. № 150/21/04), „Спосіб кількісного визначення кверцетину” (реєстр. № 39/21/05) та „Спосіб кількісного визначення кальцію добезилату” (реєстр. № 38/21/05) включені до галузевого реєстру нововведень МОЗ України за 2005 р.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Здобувачем самостійно вивчені, проаналізовані та узагальнені дані літератури з питань, що стосуються теми дисертації, визначені мета і задачі дослідження, виконана експериментальна частина дисертаційної роботи, проведена графічна, статистична обробка та узагальнення одержаних результатів, написані розділи дисертаційної роботи, сформульовані висновки та запропоновані практичні рекомендації. Усі відображені в дисертації висновки та положення наукової новизни одержані автором самостійно.

Дисертантом вивчені основні напрямки розвитку сучасного фармацевтичного аналізу. На цій основі встановлені оптимальні умови визначення лікарських речовин спектрофотометричними та хроматографічними методами. Встановлено взаємозв’язок між хімічною будовою лікарських речовин та реагентів і чутливістю реакцій.

У дисертації не були використані ідеї або розробки, що належать співавторам, разом з якими були опубліковані наукові праці.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались та обговорювались на XVIII Українській конференції з органічної хімії (м. Дніпропетровськ, 1998), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000), V Міжнародному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2001), міжобласній науково-практичній конференції „Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики” (м. Запоріжжя, 2003), I Міжнародному форумі „Аналитика и аналитики” (Воронеж, 2003), Міжнародній науковій конференції „Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (м. Запоріжжя, 2004), науково-практичній конференції молодих учених „Сучасні аспекти медицини і фармації - 2004 ” (м. Запоріжжя 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю „Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), науково-практичному семінарі „Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (Харків, 2004), VI Національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 2005).

Публікації. За результатами дисертаційних досліджень опубліковано 52 наукових роботи, у тому числі 24 статті, з яких 22 статті у наукових фахових виданнях (з них 8 одноосібних), 14 тез доповідей, отримано 9 деклараційних патентів на винаходи, видано 2 інформаційних листи, 3 нововведення внесено до реєстру галузевих нововведень за 2004 та 2005 рр.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (розділ 1), методологічних підходів і методів дослідження (розділ 2), експериментальної частини (розділи 3-5), загальних висновків, списку використаної літератури та додатків. Дисертація викладена на 430 сторінках друкованого тексту (обсяг основного тексту 273 сторінки), вміщує 55 таблиць, ілюстрована 138 рисунками та містить 18 додатків (48 стор.). Список використаної літератури включає 491 джерело, з яких 366 іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Методи аналізу лікарських речовин, які містять фенольний гідроксил (огляд літератури). Узагальнено літературні дані по використанню органічних аналітичних реагентів, в тому числі солей діазонію, в органічному та фармацевтичному аналізі, розглянуто спектрофотометричні (в УФ- та видимій областях спектру), хроматографічні (ТШХ та ВЕРХ) та офіцінальні методи визначення досліджуваних лікарських речовин, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил. Показано, що подальший пошук нових реагентів представляє як теоретичний, так і практичний інтерес і сприяє розвитку фармацевтичного аналізу.

Розділ 2. Уведення в експеримент. Об’єкти дослідження, реагенти, реактиви та загальні методи аналізу. Обґрунтовано вибір об’єктів, предмету та методів дослідження для реалізації поставлених задач. Проведено аналіз можливостей обраних методів та визначено доцільність їх застосування для виконання окремих етапів дисертаційної роботи.

Розділ 3. Застосування солей діазолю для розробки способів кількісного визначення лікарських речовин, які містять в своїй структурі фенольний гідроксил. Для підвищення специфічності УФ-спектрофотометрії були визначені основні оптичні характеристики електронних спектрів поглинання (величини напівширини ?1/2, інтегральної інтенсивності , осциляторної сили переходу f, матричного елемента переходу Мik) лікарських речовин, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил, в амфіпротних, протогенних та протофільних розчинниках, які можуть бути застосовані для ідентифікації досліджуваних речовин, а також встановлення будови продуктів реакції з солями діазолю.

Попередніми дослідженнями було встановлено, що комплексні солі арилдіазонію (солі діазолю) взаємодіють з лікарськими речовинами, які містять у своїй структурі фенольний гідроксил, з утворенням забарвлених в жовтий, оранжевий, червоний чи малиновий колір продуктів реакції. Для встановлення оптимальних умов утворення забарвлених сполук вивчали вплив природи розчинника, кількості реагенту, рН реакційної суміші та стійкість продукту реакції у часі.

Експериментально встановлено, що оптимальними умовами проведення реакції солей діазолю, а саме п-нітрофенілдіазонію борфториду (діазоль червоний 2Ж), 2-метокси-4-нітрофенілдіазонію нафталін-1,5-дисуль-фокислоти натрієвої солі (діазоль рожевий О), 2-метокси-5-нітрофенілдіазонію хлориду хлорцинкової солі (діазоль яскраво-червоний К), 2,5-дихлорфенілдіазонію хлориду хлорцинкової солі (діазоль яскраво-червоний 2Ж), 2-нітро-4-метилфенілдіазонію нафталін-1,5-дисульфокислоти натрієвої солі (діазоль червоний ЖЛ), 3,3ґ-диметокси-4,4ґ-дифенілдіазонію хлориду хлорцинкової солі (діазоль синій С), з лікарськими речовинами, які містять у своїй будові фенольний гідроксил, є водне або водно-етанольне середовище з рН 9-11, яке створюється додаванням 1% або 10% розчину натрію карбонату, температура 18-25оС.

Розраховані аналітичні показники чутливості реакцій для 27 лікарських речовин за реакціями з діазолем червоним 2Ж, діазолем червоним ЖЛ, діазолем рожевим О, діазолем яскраво-червоним К, діазолем яскраво-червоним 2Ж та діазолем синім С, які показують, що досліджувані реакції є високочутливими. В табл. 1 наведено межі виявлення лікарських речовин за реакціями з солями діазолю.

Таблиця 1

Межі виявлення лікарських речовин за реакціями з солями діазолю

Реагент | Сmin, мкг/мл | , мкг/мл

Діазоль червоний 2Ж0,136-3,680,722

Діазоль рожевий О0,075-2,521,01

Діазоль яскраво-червоний 2Ж0,487-6,921,72

Діазоль яскраво-червоний К0,139-4,731,75

Діазоль червоний ЖЛ0,361-3,96 | 1,95

Діазоль синій С0,139-3,061,41

Порівнюючи чутливість реакцій солей діазолю (табл. 1), видно, що діазоль яскраво-червоний 2Ж, який містить в якості замісників два атоми хлору, менш чутливий, ніж діазоль рожевий О та діазоль червоний 2Ж, які містять нітрогрупу, що є сильним електроноакцептором. п-Положення нітрогрупи в молекулах діазолю рожевого О та діазолю червоного 2Ж в порівнянні з м-положенням цього замісника в молекулі діазолю яскраво-червоного К та о-положенням в молекулі діазолю червоного ЖЛ також підвищує чутливість реакції. Меншу чутливість діазолю червоного ЖЛ, ніж інших солей діазолю з нітрогрупою, можна пояснити о-положенням діазо- і нітрогруп. При цьому відбувається поляризація семіполярного зв’язку у нітрогрупі і він стабілізує позитивний заряд діазогрупи на першому атомі азоту, в діазогрупі. Найбільш чутливим є діазоль червоний 2Ж, який в порівнянні з діазолем рожевим О та діазолем яскраво-червоним К не містить електронодонорну метоксигрупу. Діазоль синій С, який містить дві діазогрупи, є досить чутливим, але продукти реакцій часто дуже мало розчинні і випадають в осад.

Для встановлення залежності між чутливістю реакцій та квантово-механічними показниками реагентів були розраховані значення часткового заряду (±д) – розширений метод Хюккеля, довжина зв’язків () та торсіонне напруження (Torsion) у режимі ”Minimize Energy”.

Оскільки хромофором є діазогрупа, вона зумовлює поглинання за рахунок електронних переходів між нею та бензольним кільцем, а замісники сприяють або ускладнюють їх завдяки мезомерним та індуктивним ефектам. Ефекти замісників зберігаються також після фотометричної реакції, тому довжина зв’язку між діазогрупою та бензольним кільцем сумарно може характеризувати цей процес – чим довше зв’язок тим важче проходить перехід електронів, нижча його ймовірність при певній енергії кванту та навпаки. Підтвердження цьому знаходиться у кореляції чутливості фотометричної реакції та розрахованої довжини C–N зв’язку, табл. 2. Зокрема електронні переходи в діазогрупі (К2) та між нею і ядром арилдіазонію (К1),

призводять до змін довжини зв’язків в системі С-N-N що відображається в вигляді смуги поглинання в інфрачервоному спектрі при 2280-2240 см-1 (4,39-4,46 мкм), за рахунок цих валентних коливань. Отже, простежується залежність між інтенсивністю (Iпіку), довжиною С–N зв’язку і межею виявлення реакції, табл. 2.

Таблиця 2

Залежність межі виявлення реакції азосполучення від довжини С–N зв’язку і інтенсивності характеристичного ІЧ-піку

Показник | Діазоль: | Червоний 2Ж | Яскраво-червоний 2Ж | Рожевий О | Яскраво-червоний КЧервоний ЖЛ |

0,722 | 1,73 | 1,01 | 1,75 | 1,95 | lC-N | 1,591* –1,604 | 1,603 | 1,606 | 1,609 | 1,616 | Iпіку (?%)

2280 – 2240 см-1 | 35 | 30 | 17 | 8 | 7,8 | – одержано у режимі Molecular Dynamics.

Ця кореляція відбувається завдяки CN переходам (К1), а інтенсивність NN переходів (К2) відповідає за реакційні, електрофільні властивості діазогрупи. В ряду зменшення реакційної спроможності відбувається зріст різниці часткових потенціалів між атомами азоту у діазогрупі (), зріст сумарного потенціалу СNN ланцюга (?±д), та зменшення відносної густини сумарного заряду вздовж СNN ланцюга (lCNN), що видно з табл. 3. Ці зміни пояснюються мезомерними та індуктивними впливами замісників.

Таблиця 3

Розподіл електронної густини вздовж С–N–N ланцюгу та ефекти замісників

і вплив їх на електрону густину у першому положенні (С1)

Показник | Діазоль:

Червоний 2Ж | Рожевий О | Червоний ЖЛ | Яскраво-червоний КЯскраво-червоний 2Ж

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

0,9641 | 0,9736 | 0,9019 | 0,8940 | 0,8802

?±д | 0,9757 | 0,8959 | 0,9720 | 0,8815 | 0,3386

Продовження табл. 3

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

[?±д/lCNN]-1 | 2,73 | 2,98 | 2,76 | 3,03 | 7,88

Ефекти замісників і вплив їх на електрону густину у першому положенні

- М | + (v) | + (v) | + (v) | + (^) | -

+ М | - | + (^)+ (^)+ (^)+ (^^)

?(-М, +М) | v | v^ | v^ | ^^ | ^^

Однак, запропоновані показники не враховують стерео-потенційні впливи замісників. Це пояснює випад в ряду діазолю червоного ЖЛ – завдяки близькому розташуванню діазо- і нітрогруп. При цьому відбувається поляризація семіполярного зв’язку у нітрогрупі і він стабілізує позитивний заряд діазогрупи на першому атомі азоту, в діазогрупі:

Це підтверджують розрахунки в режимі Molecular Dynamics наведені в табл. 4.

Таблиця 4

Діазоль червоний ЖЛ і деякі його мезомерні форми

Показник | Діазоль червоний ЖЛ

ДдN1,N2 | 0,9019 | 1,065 | 1,305

?±д | 0,9720 | 0,9174 | 0,8457

[?±д/lCNN]-1 | 2,76 | 3,695 | 2,850

Цікавим є те, що неспівпадання мезомерних ефектів замісників на перше положення (С1) призводить до розширення або й до подвоєння характеристичного піку поглинання діазогрупи в ІЧ-спектрі (4,39-4,46 мкм) – діазоль червоний ЖЛ, та діазоль рожевий О.

Спектрофотометричними методами дослідження складу продуктів реакції (ізомолярних серій, насичення, відносного виходу) на прикладах реакцій діазолю червоного 2Ж з етамзилатом, діазолю рожевого О з мезатоном, діазолю яскраво-червоного К з парацетамолом, діазолю червоного ЖЛ з амоксициліном, діазолю яскраво-червоного 2Ж з кверцетином було встановлене еквімолярне співвідношення 1:1 реагуючих речовин.

Цими ж методами на прикладі реакції з тимолом доведено, що діазоль синій С реагує з лікарськими речовинами в співвідношенні 1:2, що пояснюється наявністю двох діазогруп.

Згідно встановленого співвідношення компонентів реакції „лікарська речовина – соль діазолю” та оптимальних умов, встановлених для субстанцій лікарських речовин, нами було проведено препаративний синтез, виділені та ідентифіковані забарвлені продукти реакцій. Для цих цілей реакцію азосполучення проводили поміж етамзилатом та діазолем червоним 2Ж, мезатоном та діазолем рожевим О, парацетамолом та діазолем яскраво-червоним К, метилсаліцилатом та діазолем червоним ЖЛ, рутином та діазолем яскраво-червоним 2Ж, натрію саліцилатом та діазолем синім С.

Індивідуальність отриманих сполук була підтверджена методом ТШХ.

З метою вивчення хімічної будови виділених продуктів були виміряні їх спектри поглинання в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній областях спектру.

Для вимірювання спектрів поглинання в УФ- та видимій областях готовили розчини продуктів реакції діазоль червоний 2Ж – етамзилат, діазоль рожевий О – мезатон, діазоль яскраво-червоний К – парацетамол, діазоль червоний ЖЛ – метилсаліцилат, діазоль синій С – натрію саліцилат, діазоль яскраво-червоний 2Ж – рутин в ДМФА, етанолі, воді, 0,1 М розчині натрію гідроксиду, гексані та діоксані. В деяких розчинниках, наприклад, воді, гексані, продукти були дуже мало розчинними, тому використовували їх насичені розчини.

В УФ-спектрах продукту реакції діазоль червоний 2Ж – етамзилат спостерігаються 3 смуги поглинання (табл. 5). Зіставляючи зі спектрами етамзилату та діазолю червоного 2Ж, можна відзначити, що поглинання в усіх розчинниках при 206-218 нм зумовлено ?>р* переходом бензольного кільця. Друга смуга при 272-288 нм досить інтенсивна і зумовлена n>р супряженням фенольного гідроксилу. Перетворення фенолу у відповідний фенолят-іон у протофільних розчинниках (ДМФА, 0,1 М розчин натрію

гідроксиду) призводить до батохромного зсуву. Третю смугу при 352-392 нм зумовлюють n>р* переходи у нітрогрупі та, можливо, ?>р* переходи азобензолу.

Таблиця 5

Максимуми смуг поглинання виділених продуктів реакцій лікарських речовин із солями діазолю

Продукт | РозчинникМаксимуми поглинання

Этамзилат-діазоль

червоний 2Ж | ДМФА

вода

етанол

0,1 М розчин NaOH

гексан

діоксан | -

-

206

220

218 | 282

278

276

278, 288

-

272, 276 | 390-392

-

378

-

352-354

368 | 575

-

-

495-500

-

- | Мезатон-діазоль рожевий О | ДМФА

вода

етанол

0,1 М розчин NaOH

гексан

діоксан | -

-

210

224

218

- | 268

-

254

274

-

264 | 376

370

368

-

312

364 | 534

-

450

446

-

- | Парацетамол-діазоль яскраво-червоний К | ДМФА

вода

етанол

0,1 М розчин NaOH

гексан

діоксан | -

-

-

216

228

- | 268

-

230-232

246

284-286

264 | 314

-

308

310

362

306 | 440

-

425

502

-

440 | Метилсаліци-лат-діазоль червоний ЖЛ | ДМФА

вода

етанол

0,1 М розчин NaOH

гексан

діоксан | -

-

226

224, 228

226

- | 268

280

-

282

258

266 | 354

-

352

-

350

356 | 460

-

-

452-455

-

- | Натрію саліцилат- діазоль

синій С | ДМФА

вода

етанол

0,1 М розчин NaOH

гексан

діоксан | -

204

214

220

224

- | 264, 268

-

258

284

288

264 | -

-

385

-

-

380 | 407

-

-

468

-

455 | Рутин-діазоль яскраво-червоний 2Ж | ДМФА

етанол

діоксан | -

216

- | 264

282-284

262 | -

-

364 | -

-

- |

УФ-спектр продукту реакції діазоль рожевий О – мезатон характеризується наявністю аналогічних смуг поглинання. Слід відзначити, що смуга поглинання 364-376 дуже інтенсивна. Це можна пояснити тим, що наявність метоксигрупи в м-положенні відносно нітрогрупи призводить до переносу заряду від донора на акцептор. В УФ-спектрах поглинання продукту реакції діазоль яскраво-червоний К – парацетамол третя смуга поглинання, при 306-314 нм, зсунута у порівнянні з попередніми речовинами у короткохвильову область, що пояснюється м-положенням нітрогрупи відносно азогрупи. В УФ-спектрах продукту реакції діазоль червоний ЖЛ – метилсаліцилат для третьої смуги поглинання (350-356 нм) у порівнянні з продуктами реакції діазоль червоний 2Ж – етамзилат та діазоль рожевий О – мезатон також спостерігається гіпсохромний зсув, що пояснюється о-положенням нітрогрупи відносно азогрупи. Для УФ-спектрів продукту реакції діазоль синій С – натрію саліцилат слід відмітити дуже інтенсивну смугу при 204-224 нм, яка зумовлена n>р* переходами карбонільної групи. Зі збільшенням полярності розчинника максимум смуги поглинання зміщується в короткохвильову область. Такий зсув викликаний зниженням енергії основного стану і підвищенням енергій збудженого. Так як продукт реакції діазоль яскраво-червоний 2Ж – рутин майже не розчинний, ми змогли одержати УФ-спектри його насичених розчинів в ДМФА, етанолі та діоксані. Зіставляючи зі спектрами рутину та діазолю яскраво-червоного 2Ж, можна відзначити, що перша смуга поглинання в етанолі при 216 нм зумовлена ?>р* переходом бензольного кільця. Інтенсивність цієї смуги може бути зумовлена накладанням на ?>р* перехід карбонільної групи, супряженої з кратним зв’язком. Друга смуга при 262-284 нм зумовлена n>р спряженням фенольного гідроксилу. Третя малоінтенсивна смуга в діоксані при 364 нм характерна для ?>р* переходу азобензолу.

Для ідентифікації отриманих продуктів реакції нами додатково була використана ІЧ-спектроскопія. В ІЧ-спектрах усіх продуктів реакції спостерігаються смуги, характерні для ароматичних сполук: інтенсивна смуга валентних коливань С-С циклу (1586-1598 см-1 ), яка з’являється лише тоді, коли бензольне кільце супряжене з ненасиченою групою або угрупуванням, яке має вільну пару електронів, смуги валентних коливань ароматичного С-Н (3000-3085 см-1), неплоскі деформаційні коливання С-С кільця (635-699 см-1) та неплоскі деформаційні коливання С-Н (825-856 см-1). Всі виділені продукти реакцій містять фенольний гідроксил, який проявляється О-Н 3386-3475 см-1 (широка смуга, яка зумовлена участю ОН-групи в утворенні водневого звязку), С-О (1234-1272 см-1), д О-Н (1163-1205 см-1). На ІЧ-спектрах всіх продуктів реакції спостерігається смуга поглинання при 1451-1496 см-1, яка характерна для несиметрично заміщених

азобензолів. ІЧ-спектри продуктів реакції діазоль червоний 2Ж – етамзилат, діазоль рожевий О – мезатон, діазоль яскраво-червоний К – парацетамол, діазоль червоний ЖЛ – метилсаліцилат мають по дві сильні смуги поглинання при 1518-1525 см-1 та 1343-1349 см-1 відповідні as NO2 та s NO2. За інтенсивною смугою при 1349 см-1 можна ідентифікувати первинні ароматичні нітросполуки. Смуги ? СNO (746-760 см-1) та СN (825-858 см-1) також підтверджують наявність нітрогрупи. В ІЧ-спектрі продукту реакції діазоль червоний 2Ж – етамзилат спостерігаються смуги, характерні для сульфогрупи: as SO2 (1163 см-1), s SO2 (1041 см-1), S-O (630-696 см-1). В спектрах продуктів діазоль рожевий О – мезатон, діазоль яскраво-червоний К – парацетамол, діазоль червоний ЖЛ – метилсаліцилат, діазоль синій С – натрію саліцилат видні смуги поглинання as СН3 (2938-2960 см-1), s СН3 у групі –ОСН3 (2830-2880 см-1), що підтверджує наявність метокси-групи. При вивченні ІЧ-спектру продукту реакції діазоль рожевий О – мезатон нами відмічені смуги д N-Н (ножичні) при 1586 см-1, С-N при 1281 см-1 вторинного аміну та С-О при 1081-1099 см-1 спирту. В ІЧ-спектрі продукту реакції діазоль яскраво-червоний К – парацетамол спостерігаються при 1668 см-1 С=О (сильна “I амідна смуга”), при 1590 см-1 д N-Н (“II амідна смуга”). Смугу середньої інтенсивності при 635 см-1, можливо, зумовлюють неплоскі віяльні коливання “III амідної смуги”. ІЧ-спектр продукту реакції діазоль червоний ЖЛ – метилсаліцилат має смугу при 1700 см-1 С=О складних естерів, а також дві смуги С-О: при 1288 см-1 смуга С-С(=О)-О та при 1135 см-1 смуга –О-С-С. В ІЧ-спектрі продукту реакції діазоль синій С – натрію саліцилат карбоксилат-аніон дає сильну смугу асиметричних валентних коливань при 1570 см-1 та більш слабку смугу симетричних валентних коливань при 1393 см-1. В ІЧ-спектрі продукту реакції діазоль яскраво-червоний 2Ж – рутин можна відмітити смугу С=О при 1654 см-1, дуже інтенсивну смугу при 668 см-1 характеристичну для з’вязку C-Cl, сильну смугу С-О при 997 см-1.

Для підтвердження будови виділених продуктів реакції були проведені хромато-мас-спектральні дослідження.

Мас-хроматограма продукту реакції діазоль червоний 2Ж – етамзилат

містить одиничний пік з часом утримання 7,060 хв. Маса протонованого молекулярного іону МН+ складає 339.

У зв’язку з тим, що у молекулі етамзилату спостерігається неузгоджена орієнтація замісників I та II роду, нами за допомогою програми CS ChemOffice 8.0 були розраховані за методом Хюкеля часткові заряди на атомах вуглецю в молекулі етамзилату та теплоти утворення продуктів азосполучення, які наведені в табл. 6.

Таблиця 6

Квантово-хімічні розрахунки величин зарядів етамзилату та теплот утворення продуктів його азосполучення

Номер атома вуглецю | Частковий заряд | Теплота утворення продукту азосполучення, ккал/моль

С3 | -0,026 | -129,943

С4 | -0,043 | -152,028

С6 | -0,012 | -103,710

Виходячи з отриманих даних можна припустити наступну будову продукту реакції:

Мас-хроматограма продукту реакції діазоль рожевий О - мезатон характеризується наявністю двох піків з часом утримування 5,127 та 6,855 хв (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограма продукту реакції діазоль рожевий О-мезатон

Позитивні іони обох речовин мають масу 317, а негативні - 315, що можна пояснити відривом NHCH3. Отримані дані свідчать, що при реакції діазолю рожевого О з мезатоном утворюються структурні ізомери. Це добре узгоджується з результатами ТШХ виділених продуктів реакції: в усіх системах розчинників на хроматограмах продукту реакції діазолю рожевий О - мезатон спостерігається дві плями. Для пояснення цього за допомогою програми CS ChemOffice 8.0 були розраховані часткові заряди на

атомах вуглецю в молекулі мезатону,

які розподілені наступним чином (Метод Хюкеля):

С2 - -0,142, С4 - -0,172, С5 - -0,018, С6 - -0,181.

Як видно із розрахунків, найбільша концентрація електронної густини знаходиться на шостому атомі вуглецю, а трохи менша на четвертому. На другому атомі вуглецю концентрація електронної густини менша, крім того реакція електрофільного заміщення в цьому положенні буде утруднена через стеричні перешкоди. В п’ятому положенні заміщення не проходить внаслідок низької концентрації електронної густини. Розраховані теплоти утворення продуктів азосполучення діазолю рожевого з мезатоном складають: за п-положенням мезатону -26,284 ккал/моль, за о-положенням -21,434 ккал/моль. Результати розрахунків показали, що суттєвої різниці між енергетичними параметрами обох продуктів не спостерігається. Таким чином, можна припустити, що заміщення проходить по четвертому та шостому положеннях, внаслідок чого утворюються такі продукти реакції:

Мас-хроматограми продуктів реакції діазоль яскраво-червоний К – парацетамол, діазоль червоний ЖЛ – метилсаліцилат та діазоль синій С – натрію саліцилату характеризуються наявністю одиничних піків. Маса молекулярних іонів цих продуктів співпадає з нашими розрахунками. Тобто, можна стверджувати, що азосполучення перебігає за о-положенням парацетамолу, п-положеннями метилсаліцилату та натрію саліцилату.

Мас-хроматограма продукту реакції діазоль яскраво-червоний 2Ж – рутин відзначається одиничним піком з часом утримання 10,247 хв. Молекулярна маса позитивного іону дорівнює 689, а негативного 687. За нашими розрахунками молекулярна маса продукту реакції діазоль яскраво-червоний 2Ж – рутин має дорівнювати 782. Це можна пояснити тим, що рутин, який входить до продукту реакції, є глікозидом і містить глюкозу та рамнозу. Низька леткість та низька термічна стійкість сахарів навіть при хімічній іонізації призводить до їх фрагментації. Ймовірно, при іонізації відбувається відрив двох фрагментів СН3О2, що характерно для ацеталів, якими є глікозиди. У звязку з тим, що реакційних центрів у молекулі рутину за якими може проходити азосполучення пять, а утворюється лише один продукт, як це видно з хроматограми, нами були розраховані часткові заряди на атомах вуглецю в молекулі рутину та теплоти утворення продуктів азосполучення, які наведені в табл. 7.

Таблиця 7

Квантово-механічні розрахунки величин зарядів рутину та теплот утворення продуктів його азосполучення

Номер атома вуглецю | Частковий заряд | Теплота утворення продукту азосполучення, ккал/моль

С6 | -0,207 | -344,783

С8 | -0,207 | -224,244

С2 | -0,401 | -297,116

С5 | -0,664 | -538,304

С6 | -0,053 | -439,677

Як видно з табл. 7, найбільша електронна густина знаходиться на С5 атомі вуглецю, азосполучення по цьому положенні також найбільш енергетично вигідно. Виходячи з цього продукт азосполучення діазолю яскраво-червоного 2Ж з рутином має наступну будову:

Розділ 4. Розробка способів кількісного визначення лікарських засобів із використанням солей діазолю. Отримані результати були покладені в основу розробки спектрофотометричних методик кількісного визначення досліджуваних лікарських речовин, які містять фенольний гідроксил, як в субстанції, так і в лікарських формах.

Попередньо були знайдені межі концентрацій лікарських речовин, в яких спостерігається підпорядкованість світлопоглинання закону Бера та розраховані величини питомих показників поглинання.

З метою виключення систематичної помилки, що може бути зумовлена умовами виконання досліду, та отримання більш точних результатів аналізу, кількісне визначення проводили методом стандарту. Розчини порівняння готовили із лікарських речовин, які відповідали вимогам діючої АНД.

Сутність розроблених методик кількісного визначення полягала в обробці досліджуваної проби кольорорегентом в присутності натрію карбонату при кімнатній температурі з наступним вимірюванням оптичної густини одержаних забарвлених розчинів.

Для всіх розроблених методик визначали валідаційні характеристики, що вимагаються ДФУ для методик кількісного визначення. Розроблені методики кількісного визначення специфічні, бо в умовах експерименту утворюють забарвлені сполуки лише ті речовини, що містять фенольний гідроксил. Крім того, згідно вимог ДФУ порівнювали результати аналізів, одержаних з використанням методики, що валідується, і методик, наведених в АНД. Результати, одержані за розробленими методиками, відповідають результатам за методиками АНД, що свідчить про специфічність та правильність розроблених методик. Наприклад, за розробленою методикою середній результат визначення тимолу складає 99,77%, а за методикою АНД (броматометричне титрування) - 99,79%, етамзилату 99,82% та 99,78% відповідно.

Для оцінки лінійності розроблених методик будували графіки залежності оптичної густини від наважок досліджуваних субстанцій. В усіх випадках одержана залежність описувалась рівнянням A = k ? C + b, для якого розраховувались значення k, b, а також коефіцієнту кореляції та стандартного відхилення. У табл. 8 наведені параметри, які характеризують лінійну залежність.

Таблиця 8

Параметри лінійності методик кількісного визначення

лікарських речовин

Лікарська речовина | Параметри лінійності | k | b | коефіцієнт кореляції | стандартне відхилення | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | За реакцією з діазолем рожевим О | Мезатон | 27,35 | -0,003042 | 0,99969 | 0,007478 | Тимол | 14,44 | -0,001198 | 0,99997 | 0,006255 | Серотоніну адипінат | 28,22 | -0,001578 | 0,99991 | 0,01038 | Хініофон | 6,808 | -0,003737 | 0,99930 | 0,01565 | Ізадрин | 36,94 | -0,01519 | 0,99989 | 0,002183 | За реакцією з діазолем червоним 2Ж | Піридоксину г/хл | 18,44 | 0,001395 | 0,99984 | 0,01187 | Дифезил | 31,62 | 0,002287 | 0,99965 | 0,009055 | Етамзилат | 34,33 | 0,005151 | 0,99920 | 0,009115 | Парацетамол | 17,45 | 0,005623 | 0,99992 | 0,005442 | Дофамін | 40,21 | 0,0009280 | 0,99976 | 0,008608 | Адреналіну г/т | 32,82 | 0,008754 | 0,99938 | 0,008609 | Норадреналіну г/т | 66,76 | -0,01020 | 0,99927 | 0,005565 | Метилсаліцилат | 23,66 | -0,002673 | 0,99978 | 0,006527 | Троксерутин | 21,50 | 0,008061 | 0,99981 | 0,004900 | Сальбутамол | 37,43 | 0,003381 | 0,99993 | 0,005681 | Амоксициліну тригідрат | 26,37 | 0,007078 | 0,99986 | 0,007336 | Кальцію добезилат | 33,23 | 0,0001717 | 0,99940 | 0,006936 | Фенол | 45,70 | 0,002761 | 0,99998 | 0,003111 | Синестрол | 38,00 | 0,006900 | 0,99981 | 0,007305 | Морфіну г/хл | 34,05 | 0,008118 | 0,99991 | 0,005301 | L-тироксин | 2,121 | -0,001365 | 0,99994 | 0,006717 | Ліводопа | 47,47 | 0,01263 | 0,99982 | 0,003206 | За реакцією з діазолем яскраво-червоним 2Ж | Рутин | 30,95 | -0,001708 | 0,99983 | 0,006793 |

Продовження табл. 8 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Кверцетин | 34,35 | 0,003368 | 0,99972 | 0,009006 | За