КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Яблонська Світлана Вікторівна
УДК 577.121: 577.352.334
Mg2+,Са2+-АТФазна АКТИВНІСТЬ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ ГЕПАТОЦИТІВ ПРИ ДІЇ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИОЦТОВОЇ КИСЛОТИ ТА РЕГУЛЯТОРА РОСТУ РОСЛИН ІВІНУ
03.00.04 - біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі цитофізіології НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Рибальченко Володимир Корнійович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач відділу цитофізіології НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Цудзевич Борис Олександрович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
старший науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету
доктор біологічних наук
Жмінько Петро Григорович,
Інститут екогігієни і токсикології
імені Л.І. Медведя МОЗ України,
завідувач відділу загальної токсикології
і медико-біологічних досліджень
Провідна установа: Чернівецький національний університет
імені Юрія Федьковича МОН України, м. Чернівці
Захист відбудеться „27” березня 2006 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.
З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м.Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий „27” лютого 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Проблеми, пов’язані з інтоксикацією організму людини і тварин ксенобіотиками, що використовуються в сільському господарстві – одне із важливих питань сучасної біохімії. Гербіциди на основі 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) застосовують для знищення широколистних бур’янів в посівах злакових рослин [Bradberry et al., 2000]. Потрапляючи в організм тварин і людини вони здатні проявляти канцерогенні, мутагенні та нейротоксичні ефекти [Bradberry et al., 2000]. Для підвищення врожайності культурних рослин використовуються регулятори росту, до яких належать похідні піридину – івін (N-оксид-2,6-диметил-піридину) та його молекулярний комплекс із сукцинатом – потейтин [Жмінько, 2005, Пономаренко, 1999]. Відомо, що івін при деяких формах застосування знижує токсичний вплив низки пестицидів на рослини і мікроорганізми грунту [Пономаренко, 1999]. На штучних бішарових [Бичко, Рибальченко, 2002] та моношарових [Островська, 2005] мембранах встановлено, що івін є мембраноактивною речовиною і здатний вбудовуватись в її ліпідний матрикс.
В процесі життєдіяльності людина може зазнавати одночасного впливу різних токсичних речовин, тому актуальним є дослідження сумісного впливу регуляторів росту і гербіциду на печінку та пошук речовин, які б захищали організм людини від ксенобіотиків. До речовин, що можуть проявляти протективний ефект, належать сукцинат натрію та урсодезоксихолева кислота (УДХК). Сукцинат є природним внутрішньоклітинним метаболітом з антиоксидантними властивостями [Алексеева, Петров, 2001], а УДХК – відомий гепатопротектор [Гурняк, 2005, Синельник та ін., 2002, Paumgartner, Beuers, 2003].
Однією з перших впливу пестицидів зазнає печінка, оскільки саме в ній здійснюються процеси їх детоксифікації [Pineiro-Carrero, Pineiro, 2004]. Ксенобіотики можуть спричиняти патологічні зміни, одним із проявів яких є порушення функціонування системи вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) [Артюхов, Наквасин, 2000]. Рівень ПОЛ тісно пов’язаний із активністю антиоксидантних ферментів і, зокрема, супероксиддисмутази (СОД) [Поберезкина, Осинская, 1989.]. На клітинному рівні першим негативного впливу токсичних речовин зазнає ліпідний матрикс плазматичної мембрани (ПМ) [Бичко, Рибальченко, 2002, Рибальченко, 2002] та її ферменти, зокрема Мg2+,Са2+- та Na+,K+-АТФази, що забезпечують підтримання іонного гомеостазу клітини. Безпосереднього впливу екзогенних речовин зазнають і мембранні екто-ферменти, активні центри яких орієнтовані в позаклітинне середовище, наприклад, екто-АТФаза. Тому, порушення активності цих ферментів під впливом 2,4-Д, івіну та потейтину може бути одним із первинних механізмів їх токсичної дії.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках державної наукової теми „Дослідження первинних процесів цитофізіологічних ефектів пестицидів як шкідливих факторів довкілля” (№ д/р 0102U001161) Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення АТФазних активностей плазматичних мембран клітин печінки щурів при токсичному впливі 2,4-Д, регуляторів росту рослин івіну і потейтину та протективних речовин (сукцинату натрію, УДХК).
Для досягнення цієї мети в роботі були поставлені такі задачі:
Дослідити гепатотоксичність гербіциду 2,4-Д та регулятора росту рослин івіну після субхронічного інтрагастрального введення за активністю ферментів гомогенату печінки – аланін амінотрансферази та гамма-глутамілтрансферази.
Вивчити вплив 2,4-Д, івіну, потейтину, сукцинату натрію, УДХК та їх сумісного застосування з гербіцидом на інтенсивність перекисного окислення ліпідів та активність супероксиддисмутази.
З’ясувати характер субхронічного впливу 2,4-Д, івіну, потейтину, речовин з протективними властивостями (сукцинату натрію, УДХК) та їх сумісного застосування з гербіцидом на Mg2+,Са2+-, Na+,K+- та екто-АТФазну активності ПМ клітин печінки щурів.
Дослідити Mg2+,Са2+-АТФазну активность ПМ клітин печінки щурів під впливом 2,4-Д, івіну, потейтину, сукцинату натрію, УДХК та їх сумісного застосування з гербіцидом в діапазоні концентрацій 10-9 – 10-4 М in vitro.
Об’єкт дослідження. АТФазні активності ПМ клітин печінки щурів під впливом 2,4-Д, івіну, потейтину, сукцинату натрію та урсодезоксихолевої кислоти.
Предмет дослідження. Встановлення характеру впливу 2,4-Д, івіну, потейтину, сукцинату натрію та урсодезоксихолевої кислоти на АТФазну активність ПМ клітин печінки щурів після субхронічного впливу та in vitro.
Методи дослідження. У роботі використовувалися методи виділення плазматичних мембран за допомогою ультрацентрифугування, біохімічні методи визначення активності ферментів, вмісту продуктів ПОЛ та статистичні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено мембранотропний механізм токсичності гербіциду 2,4-Д після субхронічного впливу, який проявляється у зростанні активностей аланінамінотрансферази, гамма-глутамілтрансферази, Mg2+,Ca2+-, Na+,K+- і екто-АТФазних активностей ПМ гепатоцитів та активації процесів ПОЛ. Вперше досліджено та проаналізовано вплив 2,4-Д на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ клітин печінки in vitro. Встановлено, що при сумісному застосуванні 2,4-Д з івіном, потейтином та сукцинатом натрію in vitro зберігається параболічна концентраційна залежність Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ, що характерна для 2,4-Д. Показано, що одним із біохімічних механізмів біологічної дії регуляторів росту рослин – похідних піридину є їх вплив на Mg2+,Ca2+- та екто-АТФазну активності ПМ гепатоцитів. Встановлено, що івін є менш активним по відношенню до мембранозв’язаних АТФаз, ніж гербіцид 2,4-Д. Досліджено ефективність речовин з протективними властивостями (сукцинату натрію та урсодезоксихолевої кислоти) при сумісному застосуванні з 2,4-Д на мембранні АТФази. З’ясовано, що урсодезоксихолева кислота є досить ефективною гепатопротективною речовиною відносно 2,4-Д, це дозволяє розширити можливості її використання при інтоксикації пестицидами.
Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень є важливими як у плані наукового обґрунтування можливостей оптимізації практичного використання 2,4-Д, регуляторів росту рослин івіну та потейтину в сільському господарстві, так і для профілактики токсичних уражень гербіцидом 2,4-Д організму людини і тварин. Отримані результати розширюють уявлення про молекулярні механізми токсичних ефектів пестицидів і можуть бути використані при розробці тестових методів дослідження їх гепатотоксичності. Дані стосовно гепатопротективної дії урсодезоксихолевої кислоти при ураженні печінки пестицидами розширюють відомості стосовно її захисних механізмів дії на мембрану клітини та можливості використання в клініці при хімічних інтоксикаціях та можуть бути застосовані при подальших розробках методів зниження токсичної дії ксенобіотиків.
Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, проведення експерименту та аналіз результатів дослідження виконані дисертантом особисто. Планування та розробка методичних підходів експериментальних досліджень проведені разом із науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів і молодих вчених “Шевченківська весна. Сучасний стан науки: досягнення і перспективи розвитку” (Київ, 2004), ІІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2004), ІІ з’їзді Токсикологів України (Київ, 2004), І Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ в біології” (Львів, 2005), 5-й Парнасівській конференції „Молекулярні механізми клітинної сигналізації” (Київ, 2005), 2-й Міжнародній конференції „Нейрогуморальні та клітинні механізми регуляції процесу травлення” (Київ, 2005), VI Міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини” (Київ, 2005).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових виданнях та 7 тез доповідей на конференціях і з’їздах.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, розділу із описом матеріалів і методів дослідження, розділу власних досліджень, узагальнення, висновків і списку використаних джерел, що налічує 237 робіт, 150 з яких – іноземних авторів. Робота ілюстрована 23 рисунками і 11 таблицями.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження субхронічних ефектів 2,4-Д, івіну, потейтину, сукцинату натрію, УДХК та їх сумісного застосування з гербіцидом проведені на 120 білих щурах-самцях лінії Вістар, середня маса яких становила 175 г. Досліджувані речовини вводились тваринам щоденно в об’ємі 1 мл інтрагастрально через зонд до годування протягом 4-х тижнів. Тварин було поділено на 10 груп: №1 – контрольна, яка отримувала 1 мл Н2О (дистильована) і дев’ять експериментальних: №2 – 2,4-Д (10 мг/кг маси), №3 – івін (50 мг/кг маси), №4 2,4-Д (10 мг/кг) та івін (50 мг/кг) одночасно, №5 – потейтин (50 мг/кг), №6 – 2,4-Д (10 мг/кг) та потейтин (50 мг/кг) одночасно, №7 – сукцинат натрію (5 мг/кг), №8 – 2,4-Д (10 мг/кг) та сукцинат натрію (5 мг/кг) одночасно, №9 – УДХК (2 мг/кг), №10 – 2,4-Д (10 мг/кг) та УДХК (2 мг/кг) одночасно. Після закінчення терміну затравок усіх тварин декапітували, печінку зберігали в рідкому азоті. Ефекти досліджуваних речовин in vitro в діапазоні концентрацій 10-9-10-4 М проведені на фракціях ПМ клітин печінки 60-ти інтактних щурів самців лінії Вістар.
Активність внутрішньоклітинних ферментів аланінамінотрансферази (АлАТ) та гамма-глутамілтрансферази (ГГТ) визначали з використанням стандартних наборів реагентів (DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Co. KG Німеччина). Вміст білка (тут і далі) визначали за методом Lowry et al. [1951] і розводили до концентрації білка 7-10 мг/мл. Активність АлАТ визначали за методом [Thomas, 1998] фотометрично, вимірюючи накопичення пірувату – продукту реакції переамінування L-аланіна при довжині хвилі 340 нм. Визначення активності ГГТ проводили за методом [Szasz, 1974] за кількістю продукту її реакції – 4-аміно-2-нітробензоату при 405 нм. Кількість продуктів ферментативних реакцій виражали в ммоль продукту/мг білкахв. Вміст малонового диальдегіду (МДА, нмоль/мг білка) визначали фотометрично (532 нм) у гомогенаті печінки за концентрацією забарвленого комплексу, що утворюється в результаті реакції МДА з двома молекулами тіобарбітурової кислоти [Артюхов, Наквасин, 2000]. Активність СОД визначали за здатністю ферменту інгібувати реакцію відновлення нітросинього тетразолія рибофлавіном (фотометрично при довжині хвилі 540 нм) у фракції, яку отримували центрифугуванням гомогенату протягом 30 хв при 8000 об/хв (5000g) [Артюхов,Наквасин, 2000]. Активність СОД виражали в умовних одиницях на мг білка (у.о./мг білка).
ПМ клітин печінки виділяли методом ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози [Song et al., 1969]. Чистоту препарату визначали за активністю маркерних ферментів як у вихідному гомогенаті, так і в отриманих мембранних фракціях: 5?-нуклеотидази (КФ 3.1.3.5) і глюкозо-6-фосфатази (КФ 3.1.3.9). У фракції ПМ визначали Mg2+,Са2+-АТФазну активність (КФ 3.6.1.38) у середовищі, що містить: 70 мМ КСl, 30 мкМ ЕГТА, 0,3 мМ АТФ, 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5, яку активували додаванням 10 мкМ СаСl2 [Lotersztain et al., 1981]. Екто-АТФазну активність (КФ 3.6.1.3) визначали в аналогічних умовах, але при відсутності ЕГТА у інкубаційному середовищі та присутності 300 мкМ СаСl2 для активації ферменту. Вміст ПМ в середовищі інкубації становив 20 мкг білка на 0,5 мл середовища інкубації. Nа+,K+-АТФазну активність (КФ 3.6.1.37) ПМ гепатоцитів визначали за різницею між загальною АТФазною активністю і активністю в присутності уабаїну (1·10-4 М). Вміст мембранного препарату в реакційній суміші становив 50 мкг білка на 0,5 мл середовища інкубації: 100 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЕДТА, 5 · 10-7 М SDS, 50 мМ Трис-НСl, 5 мМ АТФ, рН 7,4. Кількість неорганічного фосфату, що виділився в процесі ферментативної реакції, визначали за методом Rathbun, Betlach [1969]. Активність мембранозв’язаних ферментів виражали у нмоль Фн/хв мг білка.
Експериментальні дані обробляли методами варіаційної статистики [Плохинский, 1978], з використанням програм статистичного пакету аналізу даних в Microsoft Excel. Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерій Стьюдента (t).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Гепатотоксичні ефекти 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та івіну. Після субхронічного інтрагастрального введення піддослідним тваринам 2,4-Д активності АлАТ та ГГТ підвищуються на 120% і 100%, відповідно (табл.1). Підвищення активності АлАТ (маркеру синдрому цитолізу та некрозу гепатоцитів) в гомогенаті печінки під впливом 2,4-Д свідчить про ураження печінки та пошкодження морфологічної цілісності її клітин [Карпищенко, 2002]. Збільшення активності ГГТ свідчить про розвиток синдрому холестазу – сукупності явищ, пов’язаних із застоєм жовчі в печінці [Маршал, 1999]. Івін не викликає зміни активності ГГТ, але веде до збільшення активності АлАТ на 70% порівняно з контролем (табл.1). При сумісному застосуванні 2,4-Д з івіном активність ГГТ не відрізняється від показників контрольної групи, а активність АлАТ зростає лише на 56% (табл.1), що є нижчим, ніж при застосуванні кожного з них окремо.
Таблиця 1
Активність АлАТ і ГГТ під впливом субхронічного введення 2,4-Д, івіну та їх сумісного застосування, М±m, n=5
Група | АлАТ, ммоль продукту
мг білка · хв | ГГТ, ммоль продукту
мг білка · хв
Контроль | 14,73±2,5 | 0,269±0,025
2,4-Д | 32,93±8,1 | 0,531±0,152
Івін | 24,81±7,2 | 0,261±0,022
2,4-Д + івін | 23,00±4,3 | 0,260±0,029
Отже, субхронічний вплив гербіциду 2,4-Д викликає виражений гепатотоксичний ефект. Cтимулятор росту рослин івін справляє значно меншу токсичну дію на печінку. Сумісне застосування 2,4-Д та івіну викликає зниження гепатотоксичного ефекту 2,4-Д та може бути свідченням гепатопротективних властивостей івіну.
Вплив 2,4-Д, івіну, потейтину, сукцинату натрію, УДХК та їх сумісного застосування з гербіцидом на вміст малонового діальдегіду та активність СОД в печінці щурів. Субхронічний вплив 2,4-Д веде до збільшення вмісту МДА на 167% порівняно з контролем (табл.2), а під впливом івіну вміст МДА навпаки вдвічі знижується. Сумісне застосування 2,4-Д та івіну викликає зниження вмісту продукту ПОЛ у гомогенаті печінки на 44% порівняно з контролем, що наближено до ефекту івіну. Потейтин не викликає зміни вмісту МДА у гомогенаті печінки, так само не відбувається значних змін при сумісному його застосуванні з 2,4-Д. Активність СОД в печінці після субхронічного введення гербіциду знижується на 21%, івіну – на 9%, а під впливом їх сумісного застосування – на 12%, порівняно з контролем (табл.2). Проте, під впливом потейтину спостерігається тенденція до зростання активності СОД на 17%, а при його сумісному застосуванні з 2,4-Д активність не відрізняється від контрольної. Таким чином, 2,4-Д та івін справляють протилежні ефекти на ПОЛ. 2,4-Д викликає зниження активності СОД та двократне підвищення вмісту МДА в тканині печінки. Такі зміни можуть бути зумовлені здатністю продуктів окислення ліпідів викликати пригнічення активності СОД [Поберезкина, Осинская, 1989]. З іншого боку зниження активності СОД може бути безпосередньо зумовлене дією 2,4-Д і за принципом позитивного зворотного зв’язку може викликати збільшення вмісту продуктів ПОЛ. Івін, що є малотоксичною речовиною [Пономаренко, 1999], не викликає значних змін активності СОД і пригнічує інтенсивність ПОЛ, що може бути зумовлено здатністю івіну вбудовуватись в ліпідний матрикс мембрани і збільшувати її щільність [Бичко, Рибальченко, 2002, Островська, 2005], наслідком чого є зниження інтенсивності процесів, які в ній відбуваються. Під впливом сумісного застосування 2,4-Д та івіну відбувається зниження вмісту МДА, що свідчить про здатність івіну нівелювати ефекти 2,4-Д, можливо, через ущільнення мембранних структур. Активність СОД під впливом суміші 2,4-Д та івіну знижується менше (на 12%), ніж під впливом самого гербіциду. Потейтин викликає підвищення активності СОД, не змінюючи інтенсивність ПОЛ. Аналогічні зміни відбуваються і під впливом його суміші з 2,4-Д. Це свідчить про більш виражені протективні властивості потейтину у порівнянні з івіном, і може бути пов’язано з присутністю у складі потейтину сукцинату, для якого встановлені антиоксидантні та антитоксичні властивості [Олійник, 2001].
Таблиця 2
Вміст МДА та активність СОД в гомогенаті печінки під впливом субхронічного інтрагастрального введення щурам досліджуваних речовин, М±m
Група | Вміст МДА, нмоль/мг білка | Активність СОД, у.о./мг білка
Контроль, n=10 | 0,32±0,02 | 133,54±6,23
2,4-Д, n=10 | 0,69±0,04 * | 105,9±4,2 *
Івін, n=5 | 0,18±0,01 * | 121,4±2,9
2,4-Д + івін | 0,19±0,01 * | 117,2±5,6
Потейтин, n=5 | 0,35±0,02 | 156,1±7,7 *
2,4-Д + потейтин, n=5 | 0,38±0,02 | 144,8±8,3
Сукцинат Na, n=5 | 0,18±0,01 * | 157,9±6,6 *
2,4-Д+сукцинат Na, n=5 | 0,19±0,02 * | 126,8±6,6
УДХК, n=5 | 0,27±0,021 | 171,2±11,0 *
2,4-Д + УДХК, n=10 | 0,34±0,03 | 190,6±13,6 *
* – р < 0,05 по відношенню до контролю.
Сукцинат натрію після субхронічного впливу викликає двократне зниження вмісту МДА в гомогенаті печінки, що відбувається і при його сумісному застосуванні з 2,4-Д. Активність СОД в групі тварин, що отримувала сукцинат натрію зростає на 18%, а при сумісному введенні із 2,4-Д достовірно не відрізняється від контрольної групи. Двократне зниження вмісту МДА під впливом сукцинату ймовірно зумовлено стабілізацією мембрани, як наслідок взаємодії його негативно заряджених карбоксильних груп з позитивно зарядженими групами фосфоліпідів та білків на поверхні мембрани [Малюк та ін., 2005]. В результаті цього можуть утворюватися структури (молекулярні „скобки”), які додатково підсилюють взаємозв’язки мембранних компонентів, що може перешкоджати проникненню активних форм кисню в мембрану і активації процесів ПОЛ. Двократне зниження вмісту МДА під впливом 2,4-Д сумісно із сукцинатом свідчить про переважання ефектів останнього над ефектами гербіциду.
УДХК викликає незначне зниження вмісту МДА, тоді як при її сумісному застосуванні з 2,4-Д достовірних змін вмісту МДА не відбувається (табл.2). Активність СОД під впливом УДХК та її комбінації з 2,4-Д перевищує контрольний показник на 28 та 42%, відповідно. Зниження вмісту МДА до норми та підвищення активності СОД при сумісному застосуванні гербіциду і УДХК, порівняно з ефектами самої 2,4-Д, вказує на антитоксичні властивості УДХК. Крім того, підвищення активності СОД при сумісному застосуванні 2,4-Д з УДХК може свідчити про активацію захисних систем організму у відповідь на введення токсичної речовини.
Отже, івін та сукцинат при сумісному застосуванні з 2,4-Д не повністю нівелюють ефекти гербіциду, на відміну від потейтину, що може свідчити про його більш виражені протективні властивості. УДХК, що є нетоксичною сполукою і проявляє гепатопротективні властивості [Гурняк, 2005, Синельник та ін., 2002], в комбінації з 2,4-Д запобігає збільшенню вмісту МДА в печінці, порівняно з його окремим застосуванням, та викликає активацію СОД. Це, очевидно, вказує на інтенсифікацію захисних механізмів клітин печінки.
Мg2+,Са2+-АТФазна активність ПМ гепатоцитів щурів in vitro та після субхронічного інтрагастрального впливу досліджуваних речовин.
Гербіцид 2,4-Д. Встановлено, що Mg2+,Ca2+-АТФазна активність ПМ клітин печінки щурів контрольної групи становила 25,5±1,8 нмоль Фн/хвмг білка, а після субхронічного впливу гербіциду активність ферменту перевищує контрольний показник на 36% (рис.1).
Це може бути спричинено порушенням концентрації внутрішньоклітинного вільного Са2+ в гепатоцитах внаслідок послаблення бар’єрної функції ПМ, що зумовлено активацією ПОЛ (табл.2). Збільшення концентрації внутрішньоклітинного Са2+ є однією з причин активації Са2+-помпи. Зростання Mg2+,Ca2+-АТФазної активності внаслідок субхронічного впливу 2,4-Д є одним із проявів його токсичного впливу на субклітинному рівні і може бути як наслідком безпосереднього впливу 2,4-Д на молекулу ферменту, так і наслідком низки непрямих механізмів дії гербіциду на організм.
Для з’ясування цього ми вивчили його безпосередню дію на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ in vitro. Встановлена яскраво виражена параболічна залежність Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ клітин печінки інтактних щурів від концентрації 2,4-Д in vitro (рис. 3.). Так, у концентраціях 2,4-Д 10-9 і 10-4 М відмічається двократне пригнічення активності ферменту порівняно з активністю в контролі, яка складає 25,42,1 нмоль Фн/хвмг білка. При концентрації гербіциду 10-8 і 10-5 М активність ферменту пригнічується на 26% та 17%, відповідно. Концентрація 2,4-Д 10-7 М викликає підвищення активності ферменту на 15%. тоді як при мікромолярній – не спостерігається статистично достовірних змін. Явище параболічної залежності ефекту від концентрації певної речовини є проявом „парадоксальної токсичності” препарату [Криштопенко и др., 2001].
Природу параболічного характеру Mg2+,Ca2+-АТФазної активності під впливом різних концентрацій 2,4-Д можна пояснити його мембранотропною активністю [Бичко, Рибальченко, 2002; Oстровська, 2005]. В низьких концентраціях негативно заряджені молекули 2,4-Д адсорбуються на поверхні ліпідного матриксу. При концентрації гербіциду 10-6 М і вище процес взаємодії з мембраною активується, і молекули 2,4-Д вбудовуються в гідрофобну зону мембрани, що викликає дезорганізацію її ліпідів. Адсорбовані на поверхні мембрани від’ємно заряджені молекули гербіциду можуть безпосередньо впливати на молекулу ферменту, змінюючи просторову організацію його позамембранних доменів, що може викликати зміну аффінності ферменту до іонів Ca2+, і, в результаті – зміну його активності. Проникаючи при більших концентраціях в мембранний матрикс, гербіцид може сприяти розвитку другої фази пригнічення ферментативної активності як шляхом впливу на рівень текучості ліпідного матриксу, що є важливим для оптимуму дії ферменту [Артюхов, Наквасин, 2000], так і шляхом прямої взаємодії з внутрішньомембранними доменами ферменту.
Таким чином, одним із біохімічних механізмів дії 2,4-Д є його вплив на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ гепатоцитів, що проявляється у активації ферменту після субхронічного впливу та у різноспрямованих змінах активності ферменту ПМ інтактних тварин під впливом гербіциду в діапазоні концентрацій 10-9–10-4 М, що обумовлені різним характером взаємодії 2,4-Д з ПМ.
Регулятор росту рослин івін. Mg2+,Ca2+-АТФазна активність ПМ гепатоцитів внаслідок субхронічного впливу івіну перевищує показники активності у фракції ПМ контрольної групи тварин на 33% (рис.2, А). Таке порушення Mg2+,Ca2+-АТФазної активності може бути спричинено змінами у фізико-хімічному стані мембран внаслідок двократного пригнічення інтенсивності ПОЛ в ПМ (табл.2), а також порушення щільності мембрани в результаті вбудовування івіну в ліпідний матрикс ПМ [Бичко, Рибальченко, 2002]. Після субхронічного впливу івін не викликає помітного структурного пошкодження печінки, проте відбувається сплощення епітеліальних клітин судин, потовщення базальної мембрани, що є причиною зниження обміну речовин між гепатоцитами і кров’ю [Гурняк, 2005]. А це, в свою чергу, може зумовити порушення активності низки ферментів, в тому числі мембранозв’язаних.
Під впливом івіну in vitro не відбувається достовірних змін Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ (рис.2, А), це, очевидно, є наслідком недостатніх для чутливості ферменту змін у ліпідному матриксі ПМ, або Mg2+,Ca2+-АТФаза не є прямою мішенню дії івіну. Зважаючи на низку морфо-функціональних змін в печінці при субхронічному введенні цієї сполуки [Карпезо та ін., 2005], його ефект на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ реалізується або шляхом реорганізації матриксу мембрани після тривалого впливу in vivo, або шляхом порушення регуляторних процесів в клітині.
При сумісній дії in vivo 2,4-Д з івіном спостерігається зниження на 11% Mg2+,Ca2+-АТФазної активності порівняно з показниками контрольної групи (рис.2, Б), що, можливо, зумовлено нейтралізацією їх ефектів на рівні цілісного органу. Це підтверджується морфо-функціональними дослідженнями печінки: при одночасному введенні 2,4-Д та івіну переважає вплив останнього і запальні процеси виражені менше [Карпезо та ін., 2001]. Додавання до фракції ПМ гепатоцитів 2,4-Д сумісно з івіном викликає параболічний характер концентраційної залежності Mg2+,Ca2+-АТФазної активності (рис.2, Б), яка в контролі становить 27,41,5 нмоль Фн/хвмг білка. Ці зміни аналогічні тим, які спостерігаються під впливом лише 2,4-Д. Можливо, це зумовлено особливостями сумісної дії івіну і 2,4-Д на мембрану, що встановлені в дослідженнях на штучних біліпідних мембранах [Бичко, Рибальченко, 2002]. Так, за початкової модифікації івіном біліпідних мембран в концентрації 10-9–10-8 М гербіцид лише адсорбується на поверхні мембрани, але після обробки мембрани івіном у вищих концентраціях (10-7–10-5 М) гербіцид вбудовується всередину мембрани, що забезпечує прояв його мембранолітичних властивостей.
Рис. 2. Mg2+,Ca2+-АТФазна активність фракції ПМ клітин печінки щурів in vivo (субхронічне інтрагастральне введення, 1 – 2,4-Д, 2 – івін, 3 – 2,4-Д сумісно з івіном) та in vitro під впливом івіну (А) та івіну сумісно з 2,4-Д (Б), К – контроль.
* – р < 0,05 по відношенню до контролю
Отже, зміни Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ під впливом 2,4-Д та івіну є результатом їх сумісної дії на матрикс мембрани і свідчать про значний мембранотропний вплив суміші цих сполук. Параболічний характер концентраційної залежності є, очевидно, наслідком впливу гербіциду, а відсутність пригнічення ферментативної активності, яка спостерігається при окремому його застосуванні (рис.1), обумовлена дією івіну. Відсутність змін ферментативної активності під впливом їх сумісного субхронічного впливу може бути проявом протективних властивостей івіну, які реалізуютися лише на рівні цілісного організму.
Регулятор росту рослин потейтин. Потейтин – молекулярний комплекс івіну із сукцинатом – як при окремому, так і при сумісному застосуванні з 2,4-Д не викликає змін Mg2+,Ca2+-АТФазної активності (рис.3, А, Б). При дослідженні морфо-функціональних показників печінки встановлено, що потейтин викликає у печінці такі зміни що характерні для окремого впливу івіну та сукцинату, і в той же час такі, що притаманні лише потейтину [Карпезо та ін., 2004]. Це свідчить, що сукцинат натрію в складі потейтину не викликає повного нівелювання ефектів івіну. При одночасній дії гербіциду та потейтину на печінку зменшуються ефекти, притаманні дії кожного з пестицидів окремо, проте переважає вплив потейтину [Гурняк, 2005]. Зважаючи на невисоку токсичність потейтину [Пономаренко, 1999, Гурняк, 2005], відсутність порушень вмісту МДА (табл. 2), та Mg2+,Ca2+-АТФазної активності при сумісній субхронічній дії з гербіцидом, можна стверджувати, що потейтину притаманні певні протективні властивості.
Рис. 3. Mg2+,Ca2+-АТФазна активність фракції ПМ клітин печінки щурів in vivo (субхронічне інтрагастральне введення 1 – 2,4-Д, 2 – потейтин, 3 – 2,4-Д сумісно з потейтином) та in vitro під впливом потейтину (А) і потейтину сумісно з 2,4-Д (Б), К – контроль.
* – р < 0,05 по відношенню до контролю.
Під впливом потейтину в діапазоні концентрацій 10-9–10-4 М відбуваються мало виражені параболічні зміни Mg2+,Ca2+-АТФазної активності фракції ПМ порівняно з контрольними значеннями (27,71,4 нмоль Фн/хвмг білка (рис.3, А). Параболічна концентраційна залежність Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ виявлена і під впливом гербіциду сумісно з потейтином (рис.3, Б), проте вона менш виражена, ніж під впливом 2,4-Д як з івіном (рис.2, Б), так і при його індивідуальній дії (рис.1). Концентрації 2,4-Д та потейтину 10-9 М викликають зниження Mg2+,Ca2+-АТФазної активності на 29%, а при 10-4 М на 15% порівняно з контрольним значеннями (28,11,5 нмоль Фн/хвмг білка). Таким чином, потейтин, на відміну від івіну, нівелює ефект гербіциду на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ, можливо завдяки присутності в складі потейтину молекули бурштинової кислоти, для якої встановлені протективні властивості по відношенню до мембранозв’язаної Mg2+,Ca2+-АТФази еритроцитів [Олійник, 2001]. Нормалізація активності ферменту при сумісній дії регуляторів росту рослин та гербіциду 2,4-Д у порівнянні з їх індивідуальним впливом може бути обумовлена взаємодоповнюючим впливом цих агентів на структурний стан мембрани або білка-фермента, або певним екранування їх індивідуальних впливів на мембрану.
Отже, потейтин та івін проявляють певні протективні властивості на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ гепатоцитів, знижують ефекти гербіциду і ця властивість більш виражена для потейтину, що, очевидно, зумовлено наявністю в його складі молекули бурштинової кислоти.
Сукцинат натрію. Субхронічний вплив сукцинату натрію, що широко використовується при лікуванні низки захворювань [Алексеева та ін., 2001], не викликає змін Mg2+,Ca2+-АТФазної активності (рис.4, А), а при його сумісному застосуванні з 2,4-Д спостерігається лише тенденція до збільшення ферментативної активності на 16% порівняно з контрольними значеннями (рис.4, Б), що може служити доказом його протективних властивостей по відношенню до гербіциду.
Рис. 4. Mg2+,Ca2+-АТФазна активність фракції ПМ клітин печінки щурів in vivo (субхронічне інтрагастральне введення, 1 – 2,4-Д, 2 – сукцинат натрію, 3 – 2,4-Д сумісно із сукцинатом натрію) та in vitro під впливом сукцинату натрію (А) і сукцинату натрію сумісно з 2,4-Д (Б), К – контроль.
* – р < 0,05 по відношенню до контролю
Іn vitro Mg2+,Ca2+-АТФазна активність ПМ гепатоцитів (27,52,0 нмоль Фн/хвмг білка), під впливом сукцинату натрію в концентраціях 10-9–10-6 М достовірно не змінюється (рис.4, А). При вищих концентраціях сукцинату натрію спостерігається поступове зниження активності, а при 10-4 М відбувається майже двократне пригнічення Mg2+,Ca2+-АТФазної активності порівняно з контрольними значеннями. Прояв токсичних ефектів високих концентрацій сукцинату натрію підтверджується і цитологічними дослідженнями [Гурняк та ін., 2004].
Вплив сукцинату натрію сумісно з 2,4-Д in vitro має параболічну концентраційну залежність Mg2+,Ca2+-АТФазної активності, що характерно і для 2,4-Д (рис.1), проте вона менш виражена (рис.4, Б). Так, при концентраціях досліджуваних речовин 10-9 і 10-4 М не відбувається змін Mg2+,Ca2+-АТФазної активності, тоді як при 10-8 і 10-5 М досліджуваних речовин спостерігається збільшення ферментативної активності на 33% і 30%, відповідно. А під впливом 10-7 і 10-6 М сукцинату натрію і 2,4-Д активність ферменту перевищує контрольні значення на 50%. Отже, сукцинат натрію при сумісному застосуванні з 2,4-Д модулює його вплив на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність, але очевидним є прояв ефекту гербіциду, на що вказує характерна для нього параболічна концентраційна залежність. Таким чином, сукцинат натрію є сполукою, що певною мірою може нівелювати дію 2,4-Д і, очевидно, обумовлює протективні властивості потейтину.
Урсодезоксихолева кислота. Субхронічне введення УДХК піддослідним тваринам справляє помітний вплив на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ: під впливом самої УДХК активність ферменту перевищує контрольні показники на 71% (рис.5, А), а при сумісному застосуванні з 2,4-Д – на 25% (рис.5, Б).
В цитологічних дослідженнях встановлено, що УДХК не викликає порушень морфо-функціонального стану печінку, в той же час відбувається активація ядерного апарату [Гурняк, 2005]. УДХК не викликає суттєвих змін ПОЛ (табл.2), а при сумісному застосуванні з гербіцидом вміст МДА взагалі не відрізняється від контрольних показників. Відомо, що субхронічний вплив УДХК на тварин не спричиняє порушень мембранного матриксу [Duerksen et al., 1996] і співвідношення холестерин/фосфоліпіди в ПМ гепатоцитів [Nava-Ocampo et al., 1997]. Тому, можливо, що ефект УДХК на активність Mg2+,Ca2+-АТФази забезпечується не через пряму її взаємодію з білком чи ліпідним матриксом мембрани, а через певні регуляторні механізми, що реалізуються на генетичному рівні. Таке припущення підтверджується тим, що УДХК стимулює експресію каналікулярних білків-транспортерів жовчних кислот [Ficker et al., 2001]. Це узгоджується з дослідженнями в яких встановлено посилення процесів транспорту жовчних кислот у гепатоцитах щурів, яким тривалий час вводили УДХК [Синельник та ін., 2002].
Рис. 5. Mg2+,Ca2+-АТФазна активність фракції ПМ клітин печінки щурів in vivo (субхронічне інтрагастральне введення, 1 – 2,4-Д, 2 – УДХК, 3 – 2,4-Д сумісно з УДХК) та in vitro під впливом УДХК (А) і УДХК сумісно з 2,4-Д (Б), К – контроль.
* – р < 0,05 по відношенню до контролю
Після сумісного субхронічного введення УДХК з 2,4-Д активність збільшується на 25% порівняно з нормою, що менше ніж під впливом окремо УДХК і 2,4-Д. Аналогічні нормалізуючі ефекти УДХК на Na+,К+- і Са2+-АТФазну активності ПМ еритроцитів та гепатоцитів після хронічного впливу ССl4 зареєстровані і іншими авторами [Nava-Ocampo et al., 1997]. УДХК також помітно знижує токсичний вплив 2,4-Д на морфо-функціональні показники печінки [Гурняк, 2005], та запобігає порушенню процесів транспорту жовчних кислот [Синельник та ін., 2002].
Іn vitro Mg2+,Ca2+-АТФазна активність ПМ клітин печінки, яка в контролі становить 25,61,2 нмоль Фн/хвмг білка, достовірно не змінюється під впливом УДХК в діапазоні концентрацій: 10-9–10-4 М (рис.5, А). Отже ця сполука безпосередньо не впливає на мембранний фермент. Відсутність достовірних змін Mg2+,Ca2+-АТФазної активності під впливом сумісного застосування УДХК з гербіцидом 2,4-Д in vitro (рис. 5, Б) очевидно є проявом протективних властивостей УДХК при екрануванні токсичного ефекту гербіциду. Ймовірний механізм такої дії може обумовлюватись вбудовуванням стероїдного ядра молекули УДХК у фосфоліпідний матрикс мембрани і його стабілізації [Guldutuna et al., 1993], що підвищує стійкість ПМ до пошкоджуючої дії 2,4-Д.
Отже, ефекти гідрофільної УДХК in vitro та in vivo, очевидно, реалізуються не завдяки безпосередній взаємодії з мембранозв’язаним ферментом Mg2+,Ca2+-АТФазою, а через взаємодію з ліпідним матриксом мембрани чи шляхом впливу на генетичний апарат клітини, стимулюючи експресію білка-ферменту. Але в кінцевому результаті УДХК в достатній мірі нівелює ефекти 2,4-Д, що свідчить про її протективні властивості відносно цього ксенобіотика.
Екто-АТФазна активність ПМ клітин печінки щурів in vitro та після субхронічного інтрагастрального впливу досліджуваних речовин. У фракції ПМ клітин печінки екто-АТФазна активність складає 189,416,8 нмоль Фн/хвмг білка. Під впливом 2,4-Д та івіну, спостерігається параболічна концентраційна залежність екто-АТФазної активності (рис.6, А, Б), але ці зміни виражені значно менше, ніж для Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ (рис.1, 2, А).
Рис. 6. Екто-АТФазна активність фракції ПМ клітин печінки щурів під впливом гербіциду 2,4-Д (А) та івіну (Б) в діапазоні концентрацій 10-9 – 10-4 М
Під впливом 2,4-Д in vivo екто-АТФазна активність перевищує показники активності у фракції ПМ контрольної групи тварин (175,1±5,8 нмоль Фн/хвмг білка) на 26 % (рис.7). Виходячи із результатів дослідів активності екто-АТФази in vitro, можна думати, що активація екто-АТФази під впливом гербіциду зумовлена по-перше: безпосередньою дією адсорбованих на поверхні мембрани молекул 2,4-Д, по-друге: двократним зростанням інтенсивності ПОЛ (табл.2).
Можливим є і непрямий механізм стимуляції екто-АТФазної активності гербіцидом 2,4-Д. Встановлено, що гербіцид 2,4,5-трихлорфеноксиоцтова кислота стимулюють експресію мРНК екто-АТФази в багатьох тканинах, в тому числі і печінки, що веде до збільшення числа молекул цього ферменту в ПМ [Gao et al, 1993, Miranda et al, 1997]. Таким чином, екто-АТФазна активність є чутливою до впливу 2,4-Д після субхронічного впливу, проте її зміни виражені менше, ніж зміни активності Са2+-помпи ПМ.
Регулятор росту рослин івін не викликає змін активності ферменту, тоді як при сумісному його застосуванні з 2,4-Д відбувається певне пригнічення екто-АТФазної активності (на 23%), аналогічний характер впливу простежується і під впливом потейтину (рис.7). Відсутність змін екто-АТФазної активності під впливом субхронічного впливу івіну та потейтину, можливо зумовлена характером їх мембранотропної активності, що встановлена для івіну [Бичко, Рибальченко, 2002], і може бути аналогічною для потейтину. Очевидно, обидва похідні N-оксид піридину, не затримуючись на поверхні ліпідного матриксу мембрани, одразу інкорпоруються в неї, тим самим уникаючи контакту з молекулою екто-ферменту, і не спричиняють порушення її активності. Зміни екто-АТФазної активності під пливом івіну відсутні і в дослідах in vitro (рис.6, Б). Зниження екто-АТФазної активності під впливом сумісного застосування похідних піридину з гербіцидом 2,4-Д може бути зумовлено значними дестабілізаціями упаковки ліпідів мембрани внаслідок інкорпорації в неї і молекул івіну, і молекул 2,4-Д. Про це свідчать дослідження, що після обробки мембрани івіном в неї можуть проникати і негативно заряджені молекули 2,4-Д [Бичко, Рибальченко, 2002], викликаючи літичний ефект.
Рис. 7. Екто-АТФазна активність ПМ клітин печінки щурів під впливом субхронічного інтрагастрального введення гербіциду 2,4-Д (2), івіну (3), 2,4-Д сумісно з івіном (4), потейтину (5), 2,4-Д сумісно з потейтином (6), сукцинату натрію (7), 2,4-Д із сукцинатом натрію (8), УДХК (9), 2,4-Д сумісно з УДХК (10), 1 – контрольна група.
* – р < 0,05 по відношенню до контролю
Добре виражений ефект на активність екто-ферменту спричиняє сукцинат натрію – активність зростає на 44% (рис.7), тоді як при сумісному застосуванні з 2,4-Д активність ферменту не відрізняється від контрольних значень. Такий ефект сукцинату натрію на екто-АТФазну активність можна пояснити безпосередньою взаємодією його молекул, які несуть на собі негативний заряд, з позаклітинною частиною молекули екто-АТФази, де локалізований її активний сайт [Plesner, 1995]. Відсутність змін екто-АТФазної активності під впливом сумісного застосування сукцинату натрію з 2,4-Д, можливо, є проявом адитивності їх окремих впливів. Підтвердженням цього є здатність 2,4-Д пригнічувати [Palmeira et al., 1994], а сукцинат – підвищувати [Коваленко та ін., 2000] процеси енергоутворення в клітині, що веде до змін інтенсивності синтезу АТФ. Це, в кінцевому результаті, проявляється як нормалізація активності ферменту. Аналогічний характер вливу 2,4-Д та сукцинату натрію на роботу ферменту зумовлений також особливостями їх взаємодії з ПМ клітини: обидві речовини