Отже, івін та потейтин не викликаючи повного нівелювання ефектів 2,4-Д можуть їх модифікувати, тоді як сумісний вплив сукцинату та УДХК з гербіцидом є більш ефективним для запобігання розвитку його негативного впливу.

Na+,К+-АТФазна активність ПМ клітин печінки щурів після субхронічного інтрагастрального введення досліджуваних речовин. Na+,К+-АТФаза і Mg2+,Са2+-АТФаза мають низку спільних рис: обидві є інтегральними іон-транспортуючими ферментами, мають багато гомологічних послідовностей в молекулі білка [Костюк та ін., 2001]. Тому, цікаво дослідити і порівняти характер змін Na+,К+- та Mg2+,Са2+-АТФазної активностей у відповідь на введення досліджуваних речовин.

В ПМ клітин печінки щурів контрольної групи Na+,К+-АТФазна активність становить 25,9 нмоль Фн/хвмг білка, а після субхронічного впливу на щурів 2,4-Д активність зростає на 46% (рис. 8). Схожість у характері відповіді мембранозв’язаних Mg2+,Ca2+- і Na+,К+-АТФази на субхронічне введення гербіциду можливо пов’язана з тим, що вони є частково гомологічними білками [Костюк та ін., 2001]. Але у молекулі Na+,К+-АТФази є ще один поліпептидний ланцюг, що формує в-субодиницю і звернутий С-кінцем в позаклітинне середовище [Кучеренко та ін., 2002], функцією якого є регуляція активності ферменту. Тому, взаємодія молекул 2,4-Д безпосередньо з ним, теж може бути причиною порушення Na+,К+-АТФазної активності. Аналогічну активацію Н+-АТФази ПМ дріжджів викликає 2-метил-4-хлорофеноксиоцтова кислота, при цьому не відбувається порушення рівня транскрипції мРНК гену, що кодує цей фермент [ et al., 2002]. Тому збільшення його активності не є результатом впливу 2-метил-4-хлорфеноксиоцтової кислоти на генотип клітини.

Рис. 8. Na+,К+-АТФазна активність ПМ клітин печінки щурів під впливом субхронічного інтрагастрального введення гербіциду 2,4-Д (2), івіну (3), 2,4-Д сумісно з івіном (4), потейтину (5), 2,4-Д сумісно з потейтином (6), сукцинату натрію (7), 2,4-Д із сукцинатом натрію (8), УДХК (9), 2,4-Д сумісно з УДХК (10), 1 – контрольна група.

* – р < 0,05 по відношенню до контролю

Під впливом івіну, потейтину та їх сумісного застосування з 2,4-Д відбувається пригнічення активності ферменту: під впливом івіну – на 29%, івіну сумісно з 2,4-Д – на 33%, потейтину – на 24% і потейтину сумісно з 2,4-Д – на 34% порівняно з контролем (рис.8). Очевидно, це зумовлено присутністю у всіх цих сполуках похідного N-оксид піридину – івіну, що проявляє мембранотропні властивості і вбудовується в гідрофобну зону мембрани, знижуючи її текучість [Бичко, Рибальченко, 2002]. На відміну від Mg2+,Ca2+-АТФази, Na+,К+-АТФаза зв’язує катіони по обидва боки мембрани [Лопина, 2001] і збільшення в’язкості ліпідного матриксу в присутності івіну знижує кількість “обертів” ферменту, що є причиною гальмування її активності. Для похідних піридину встановлена здатність інгібувати також Н+/К+-АТФазу ПМ епітеліальних клітин шлунку [Sung et al., 2001], яка за амінокислотним складом є гомологічним білком до Na+,К+-АТФази [Canfield, Levenson, 1998]. Крім однакового характеру впливу на Na+,К+-АТФазну активність івін та потейтин повністю нівелюють стимулюючий ефект 2,4-Д на активність ферменту.

Під впливом сукцинату натрію і його сумісного застосування з 2,4-Д відбувається підвищення Na+,К+-АТФазної активності порівняно з контрольними значеннями (на 29% і 27%, відповідно) (рис.8). Це, по-перше, може опосередковуватися через безпосередню взаємодію негативно заряджених молекул сукцинату з позаклітинними петлями чи в-субодиницею молекули Na+,К+-АТФази, внаслідок чого активується її робота. По-друге, Na+,К+-АТФазна активність може зростати в результаті інтенсифікації процесів енергоутворення в клітинах печінки після тривалого субхронічного введення сукцинату, що є метаболітом циклу Кребса [Кучеренко та ін., 2002]. Помітну активацію Na+,К+-АТФазної активності спричиняє і субхронічний вплив УДХК – активність зростає на 48%, а при сумісному застосуванні з гербіцидом 2,4-Д лише на 26% порівняно з активністю в контрольній групі (рис.8). Оскільки УДХК не викликає порушення текучості [Duerksen et al., 1996.], співвідношення холестерин/фосфоліпіди і відновлює Na+,К+-АТФазну активність ПМ гепатоцитів щурів з індукованим ССl4 цирозом [Nava-Ocampo et al., 1997], ймовірно зареєстрований нами ефект УДХК забезпечується не через пряму її взаємодію з білком АТФази чи ліпідним матриксом мембрани, а через регуляторні внутрішньоклітинні механізми. Зважаючи на те, що УДХК є гепатопротективною речовиною, підвищення Na+,К+-АТФазної активності може свідчити про інтенсифікацію процесів життєдіяльності клітини.

Таким чином, Mg2+,Ca2+-, екто- та Na+,К+-АТФазна активності чутливі до гербіциду 2,4-Д та регулятора росту рослин івіну, але проективні ефекти сукцинату натрію та УДХК більше виражені для Mg2+,Ca2+-АТФазної активності.

ВИСНОВКИ

2,4-Дихлорфеноксиоцтовоа кислота (2,4-Д) викликає загальний гепатотоксичний ефект після субхронічного інтрагастрального введення щурам, який проявляється у зростанні активностей аланінамінотрансферази, гамма-глутамілтрансферази, Mg2+,Ca2+-, Na+,K+- і екто-АТФазних активностей плазматичних мембран (ПМ) гепатоцитів та активації процесів ПОЛ. При сумісному застосуванні 2,4-Д з івіном, потейтином, сукцинатом натрію, урсодезоксихолевою кислотою (УДХК) ці ефекти знижуються, що свідчить про їх гепатопротективні властивості у відношенні до дії 2,4-Д.

Одним із проявів токсичності субхронічного впливу 2,4-Д є активація процесу ПОЛ і зниження активності СОД. При сумісному застосуванні 2,4-Д з потейтином вказані процеси залишаються на рівні контролю, що свідчить про більш виражені протективні властивості потейтину на відміну від івіну.

Сумісний субхронічний вплив УДХК і 2,4-Д нівелює ефекти гербіциду на ПОЛ, але активність СОД перевищує контрольні показники. Під впливом сумісного застосування 2,4-Д із сукцинатом натрію інтенсивність ПОЛ знижується, як і при його індивідуальному застосуванні, але активність СОД не змінюється.

Одним із біохімічних механізмів дії регуляторів росту рослин є їх вплив на Mg2+,Ca2+-АТФазну та екто-АТФазну активності ПМ гепатоцитів, на що вказує параболічний характер змін АТФазних активностей від концентрації ксенобіотиків, який більше виражений для Mg2+,Ca2+-АТФази. Івін і потейтин є менш активними по відношенню до мембранозв’язаних АТФаз, ніж гербіцид 2,4-Д: вони не викликають вірогідних змін обох АТФазних активностей ПМ гепатоцитів.

Встановлено, що після субхронічного впливу івін та потейтин проявляють різноспрямовану дію на АТФазні активності плазматичних мембран, що свідчить про їх мембранотропну дію. Ефект сумісного застосування гербіциду з івіном чи потейтином не відрізняється від індивідуального впливу кожної з досліджуваних речовин, але у всіх випадках спостерігається пригнічення Na+,K+-АТФазної активності.

Сукцинат натрію і УДХК, що мають різнонаправлений характер впливу на Mg2+,Са2+- і екто-АТФазну активність in vivo, пригнічують активуючі ефекти гербіциду, але підвищують Na+,K+-АТФазну активність, як при окремому, так і при сумісному застосуванні з 2,4-Д. Це свідчить, що сукцинат натрію і УДХК проявляють гепатопротективні властивості, частково відновлюючи АТФазні активності порушені гербіцидом.

При сумісному застосуванні 2,4-Д з івіном, потейтином та сукцинатом натрію in vitro зберігається параболічна концентраційна залежність Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ, абсолютні значення якої відрізняються від ефектів самого гербіциду. УДХК викликає повне нівелювання ефектів гербіциду на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Островська Г.В., Яблонська С.В., Філінська О.М. Рибальченко В.К., Бабіч Л.В. Гепатотоксичні ефекти тривалого інтрагастрального введення щурам 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну //Вісник КНУ. Пробл. регуляції фізіологічних функцій.– 2004. – Вип.9. – С.56-57. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено активність ферментів, проведено статистичну обробку).

Яблонська С.В., Бичко А.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Рибальченко В.К. Дослідження молекулярних механізмів впливу 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти на біліпідний матрикс штучних мембран і високо- та низькоаффінну Mg2+, Ca2+-АТФазну активність плазматичної мембрани гепатоцитів щурів in vitro // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збір. наук. праць. – Київ-Луганськ-Харків. – 2004. – Вип.10 (63). – С.42-48. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено активність мембранозв’язаних ферментів, проведено інтерпретацію даних).

Ostrovska G., Yablonska S., Rybalchenko T., Zelenyuk V., Filinska O., Rybalchenko V. The influence of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on the rathepatocyte plasma membrane Ca2+, Mg2+-ATPase activity in vivo and in vitro // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. Sec.DDD. Pharmacia. – Lublin (Poland): Wschod, 2004.– Vol.17. – №2. – P.325-327. (Здобувачем проаналізовано літературні джерела, досліджено активність мембранозв’язаних ферментів, підготовлено матеріали до друку).

Яблонська С.В., Островська Г.В., Філінська О.М. Рибальченко Т.В., Рибальченко В.К. // Вплив тривалого інтрагастрального введення щурам 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну на Mg2+,Ca2+-АТФану активність плазматичних мембран гепатоцитів // Вісник КНУ. Серія Біологія. – 2005. – Вип.42-43. – С.13-15. (Здобувачем узагальнені літературні дані, досліджено активність ферментів, проведено статистичну обробку та інтерпритацію даних).

Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.О. Вплив гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регуляторів росту рослин івіну і потейтину на перекисне окислення ліпідів та активність супероксиддисмутази гомогенату печінки щурів // Доповіді НАН України. – 2005. – №10. – С.185-187. (Здобувач визначила вміст продуктів ПОЛ та активність СОД, підготувала матеріали до друку).

Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Яблонська С.В., Філінська О.М. Дослідження механізмів сумісної дії гербіциду 2,4-Д і регулятора росту рослин івіну // ІІІ З’їзд українського біофізичного товариства (8-11 жовтня 2002) – Львів, 2002. – С.118.

Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.М., Філінська О.М. Порівняльний аналіз впливу гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти на дві форми Mg2+, Ca2+-АТФазної активності // Шевченківська весна. Сучасний стан науки: досягнення і перспективи розвитку: Матеріали ІІ Міжнар. науково-практичної конф. студентів, аспірантів і молодих вчених (13-14 травня 2004). – Київ, 2004. – С.39-41.

Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.О., Філінська О.М., Рибальченко В.К. Порівняння ефектів гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну на дві форми Mg2+, Ca2+-АТФазної активності плазматичної мембрани гепатоцитів щурів // ІІ З’їзд Токсикологів України (12-14 жовтня 2004). – Київ, 2004. – С.72-73.

Yablonska S., Ostrovska G., Rybalchenko T., Filinska O. Displaying of paradoxical toxicity by herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on high- and liwaffinity Mg2+,Са2+ - АTPase activity of the rat hepatocyte plasma membranes in vitro // 5th Parnas conference molecular mechanisms of cellular signaling (25-29 april 2005). – Kyiv, 2005. – Vol.77, №2. – P.151.

Яблонська С.В., Рибальченко Т.В., Бичко А.В., Філінська О.М., Гурняк О.М., ЗеленюкВ.О., Линчак О.В. Вплив похідних N-оксид піридину – регуляторів росту рослин івіну та потейтину на перекисне окислення ліпідів та активність супероксиддисмутази гомогенату печінки щірів //Молодь і поступ біології: Матеріали І Міжнародної конференції студентів та спірантів (11-14 квітня 2005).–Львів,2005.–С.11.

Yablonska S.V., Filinska O.M., Rybalchenko T.V., Ostrovska G.V., Synelnik T.B., Lozoviy V.P., Rybalchenko V.K. Influence of xenobiotics of a different nature on specific function of rat hepatocytes and stomach myocytes // Neuro-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes: 2nd International conference (October 5-7, 2005) – Kyiv, 2005. – P. 39.

Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.О., Філінська О.М. Особливості концентраційної залежності впливу гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти і його сумісного застосування із сукцинатом натрію на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність плазматичної мембрани гепатоцитів щурів // Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини: Матеріали VI міжнародної науково-практичної конференції (1-3 жовтня, 2005). – Київ, 2005. – С.53-54.

АНОТАЦІЇ

Яблонська С.В. Mg2+,Са2+-АТФазна активність плазматичної мембрани гепатоцитів при дії 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.

Дисертаційна робота присвячена вивченню Mg2+,Са2+-АТФазної активності плазматичних мембран (ПМ) гепатоцитів щурів під впливом гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) та регулятора росту рослин івіну (N-оксид-2,6-диметил-піридин) in vitro та після субхронічного інтрагастрального введення тваринам. Встановлено параболічний характер змін Mg2+,Са2+-АТФазної активності ПМ під впливом 2,4-Д в діапазоні концентрацій 10-9-10-4 М in vitro, тоді як івін не викликав значних змін ферментативної активності. Після субхронічного впливу як 2,4-Д, так і івін викликають порушення Mg2+,Са2+-АТФазної активності ПМ, що може бути зумовлено не лише їх безпосереднім впливом на мембранозв’язаний фермент, а і опосередковуватись через регуляторні механізми клітини. При сумісному застосуванні гербіциду з івіном в субхронічному експерименті ферментативна активність ПМ не відрізняється від норми, тоді як у дослідах in vitro в діапазоні концентрацій 10-9-10-4 М досліджуваних речовин спостерігається параболічна концентраційна залежність, що характерна для 2,4-Д. Речовини з протективними властивостями – сукцинат натрію і урсодезоксихолева кислота – проявляють різний характер впливу на Mg2+,Са2+-АТФазну активність ПМ, але пригнічують ефекти гербіциду після субхронічної дії та модифікують ефекти 2,4-Д in vitro. 2,4-Д та івін викликають також різноспрямовані зміни екто- та Na+,K+-АТФазної активностей ПМ.

Ключові слова: Mg2+,Са2+-АТФазна активність, плазматична мембрана, 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота, івін, сукцинат натрію, урсодезоксихолева кислота.

Яблонская С.В. Mg2+,Са2+-АТФазная активность плазматической мембраны гепатоцитов при действии 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и регулятора роста растений ивина – Рукопись.

Дисертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.

Дисертационная робота посвящена изучению Mg2+,Са2+-АТФазной активности плазматических мембран (ПМ) гепатоцитив крыс под воздействием гербицида 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и регулятора роста растений ивина (N-оксид-2,6-диметил-пиридин) in vitro, а также после субхронического интрагастрального введенния животным. Установлен выраженный параболический характер изменений Mg2+,Са2+-АТФазной активности ПМ под влиянием 2,4-Д в диапазоне концентраций 10-9-10-4 М in vitro. Одним из биохимических механизмов действия регулятора роста растений ивина является его влияние на Mg2+,Ca2+-АТФазную активность ПМ гепатоцитов, о чем свидетельствует параболическая зависимость изменений АТФазной активности от концентрации ксенобиотика. Ивин менее активен по отношению к мембраносвязанной АТФазе, чем гербицид 2,4-Д, поскольку не вызывает значительных изменений ферментативной активности гепатоцитов. При субхроническом введении как 2,4-Д, так и ивин вызывают нарушения Mg2+,Са2+-АТФазной активности ПМ, что может быть обусловлено не только их непосредственным воздействием на мембраносвязанный фермент, но и опосредоваться регуляторными механизмами клетки. При совместном использовании гербицида с ивином в субхроническом экперименте ферментативная активность ПМ не отличается от нормы, тогда как в исследованиях in vitro под воздействием исследуемых веществ в диапазоне концентраций 10-9-10-4 М наблюдается параболическая концентрационная зависимость эффектов, характерная для 2,4-Д. Это свидетельствует о модуляции ивином эффектов гербицида. Вещества с протективными свойствами – сукцинат натрия и урсодезоксихолиевая кислота (УДХК) – проявляют разный характер воздействия на Mg2+,Са2+-АТФазную активность, но угнетают активирующие эффекты гербицида при субхроническом введении крысам и модифицируют его эфекты in vitro. При совместном использовании 2,4-Д с ивином либо сукцинатом натрия in vitro сохраняется параболическая концентрационная зависимость Mg2+,Ca2+-АТФазной активности ПМ, абсолютные значенния которой отличаются от эффектов самого гербицида. УДХК вызывает полное нивелирование эффектов 2,4-Д на Mg2+,Ca2+-АТФазную активность ПМ. Таким образом, сукцинат натрия и УДХК проявляют гепатопротективные свойства, более выраженные для последней, и частично востанавливают АТФазную активность, нарушенную действием гербицида. 2,4-Д и ивин вызывают также разнонаправленные изменения экто- и Na+,K+-АТФазной активностей ПМ после субхронического воздействия. Эффекты гербицида 2,4-Д и регулятора роста растений ивина на экто-АТФазную активность ПМ менее выражены чем на Mg2+,Ca2+-АТФазную активность. Одним из проявлений токсичности субхронического влияния 2,4-Д является также активация процесса перекисного окисления липидов и снижение активности супероксиддисмутазы.

Ключевые слова: Mg2+,Са2+-АТФазная активность, плазматическая мембрана, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, ивин, сукцинат натрия, урсодезоксихолиевая кислота.

Yablonska S.V. Hepatocyte plasma membrane Mg2+,Ca2+-ATPase activity under the influence of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and plant growth regulator ivin.–A manuscript.

Dissertation for the candidate the biological science degree in specialty 03.00.04 – biochemistry. – Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2006.

The scientific paper is devoted to the studding of hepatocyte plasma membrane (PM) Mg2+,Ca2+-ATPase activity under the influence of herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and plant growth regulator ivin (N-oxide-2,6-dimethyl-pyridine) in vitro and after subchronic intragastric introducing for animals. Parabolic concentration changes of PM Mg2+,Ca2+-ATPase activity under the influence of 2,4-D in concentrations range 10-9-10-4 М were determined. Ivin not produces significant changes of enzyme activity. Both 2,4-D and ivin lid to the disturb of PM Mg2+,Ca2+-ATPase activity after subchronic introducing. Enzyme activity of PM was not distinguished from control under the combined using of herbicide and ivin. In vitro the influence of combination 2,4-D with ivin also has parabolic concentration dependence which is typical for 2,4-D only. It suggests that ivin modulates herbicide effect. Substances with protective characteristic – sodium succinate and ursodeoxycholic acid – inhibit activating influence of herbicide on Mg2+,Ca2+-ATPase activities under subchronic introducing for animals and modifying herbicide effect in vitro.

Key words: Mg2+,Ca2+-ATPase activity, plasma membrane, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, ivin, sodium succinate, ursodeoxycholic acid.