Отриманi данi знаходяться у вiдповiдностi з результатами iнших дослiджень, в яких виявлено вiдмiнностi в чутливостi до ок-сидантiв Na+,K+-АТР-ази мозку та нирок, 3-iзоформи в сарколемi мiокарду тхора та 2-iзоформи, експресованої в клiтинах комах лiнiї Sf-9, щодо 1-iзоформи [Huang W. et al.,1994;Xie Z. et al., 1995; Болдырев А.А., 1995, 1996].

Проте в проведених дослiдах вперше продемонстровано вищу ок-сидантну чутливiсть SH-залежних iзоформ + (2 та 3) у порiвняннi з 1 в препаратах Na+,K+-АТР-ази сiрої речовини мозку в умовах диференцiацiї внеску окисного ушкодження бiлкового та лiпiдного компонентiв мембрани.

Можно зробити висновок, що окисна iнактивацiя Na+,K+-АТР-ази є комплексним процесом. Пiдсилення iнактивацiї ферменту при поширеннi окисного процесу i активацiї ПОЛ вказує на участь рiзних шляхiв окисного ушкодження Na+,K+-АТР-ази. Однак, специфiка окисного ефекту обумовлюється структурними особливостями саме бiлко-вих молекул iзоформ ферменту у вiдповiдностi з SH-залежнiстю їх функцiональної активностi i не зв'язана з iнтенсивнiстю ушкодження лiпiдного матриксу мембрани.

ЗАКЛЮЧЕННЯ

Таким чином, результати дослiджень вказують на iснування особливостей структурної органiзацiї бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,K+-АТР-ази в плазматичних мембранах клiтин кори головного мозку, якi обумовленi особливостями структурної органiзацiї їх пограничних лiпiдiв.

Пiдсумовуючи отриманi результати слiд вiдмiтити, що передумовою iснування вiдмiнностей лiпiдного анулюса iзоформ Na+,K+-АТР-ази є їх рiзна локалiзацiя в клiтинах нейронiв, а також в рiзних типах клiтин кори головного мозку [Sweadner K.J.,1989;1992]. Не виключена можливiсть iснування гетерогенностi лiпiдного оточення iзоформ в конкретнiй дiлянцi нейрональної мембрани. Припускається, що 1-iзоформа здiйснює регуляцiю загальної концентрацiї iонiв Na+ в цитоплазмi нейронiв, а 2- та 3-iзоформи — в обмеженому просторi мiж плазматичною мембраною та ретикулумом [Juhaszova M., Blaustein M.P., 1997; Владимирова Н.М. и др.,1998].

Iснування фiзико-хiмiчних особливостей лiпiдного оточення iзоформ може забезпечити специфiчну модуляцiю конформацiйної рухомостi чи iнших каталiтичних властивостей iзоформ або специфiку їх функцiональної стiйкостi при динамiчних змiнах в мембранi згiдно вiдомому механiзму в'язкотропної регуляцiї функцiонування iнтегральних мембранних ферментiв, а саме Na+,K+-АТР-ази [Дергунов А.Д. и др.,1984; Рost R.L.,Klodos I.,1996].

В той же час висока оксидантна чутливiсть спецiалiзованих iзоформ 2 та 3 може бути одним з факторiв, що визначає катастрофiчнiсть процесiв окисного стресу у розвитку нейрональних пато-логiй [Болдырев А.А.,Куклей М.Л.,1996].

Результати дослiджень свiдчать про iснування вiдмiнностей функцiональних порушень фундаментальної 1- та спецiалiзованих 2- та 3-iзоформ Na+,K+-АТР-ази при модифiкацiї лiпiдної фази мембрани чи окиснiй iнактивацiї, що може бути передумовою особливостей адаптивної стiйкостi iзоформ при певних фiзiологiчних та патологiчних станах органiзму.

ВИСНОВКИ

1. Виявленi вiдмiнностi в стiйкостi до мембранотропних впливiв in vitro iзоформ каталiтичної субодиницi мембранозв'язаної Na+,K+-АТР-ази мозку.

2. Для гiдрофобних бiлкiв -субодиницi Na+,K+-АТР-ази мозку та нирок (щур,бик,свиня) встановлено схожiсть електрофоретичних властивостей пiсля солюбiлiзацiї препаратiв в умовах термообробки (>700C) в присутностi DS-Na та 2-меркаптоетанолу. Для Na+,K+-АТР-ази сiрої речовини мозку виявлено бiльш високу стiйкiсть до термообробки (при 1000С) бiлкової зони + у порiвняннi з 1.

3. Виявлено таку послiдовнiсть в термочутливостi (при 500С) Na+,K+-АТР-ази з тканин мозку та нирок, яка вiдповiдає вмiсту +-форми в препаратах: довгастий мозок>сiра речовина (мозочок)>нирки. Для iзоформ Na+,K+-АТР-ази мозку виявлено бiльш високу термостабiльнiсть 1 у порiвняннi з +. Специфiка термоiнактивацiї iзоформ не залежить вiд рецепторного типу ферменту та його конформацiйного стану (Na+- чи K+-форми). Виявлено вiдмiнностi в термолабiльностi 1-iзоформи в препаратах ферменту з сiрою речовини мозку та нирок.

4. Вперше встановлено, що в препаратах мембранозв'язаної Na+,K+-АТР-ази з сiрої речовини мозку щура 1-iзоформа ферменту бiльш чутлива у порiвняннi з + до iнактивуючої дiї фосфолiпази А2 з отрути Naja naja oxiana.

5. Вперше встановлено, що в препаратах мiкросом з сiрої речовини i мозочка щура на вiдмiну вiд мембран з довгастого мозку 1-iзоформа Na+,K+-АТР-ази характеризується вищою у порiвняннi з + чутливiстю до iнактивацiї DS-Na. Показано, що необоротна iнактивацiя детергентом Na+,K+-АТР-ази в препаратах з кори головного мозку щура та бика супроводжується вилученням -cубодиниць з мембрани, бiльш ефективним для 1-iзоформи.

6. Встановлено, що пiдвищення iнактивуючого ефекту DS-Na (при збiльшеннi тривалостi обробки мiкросом детергентом, пiдвищеннi температури, кислотностi середовища, в присутностi MgCl2, в мiкросомах мозку молодих щурiв) супроводжується усуненням вiдмiнностей в стiйкостi iзоформ Na+,K+-АТР-ази мозку до детергенту лише в умовах термотропної модифiкацiї фiзичного стану лiпiдного матриксу (200С370С) та закисленнi середовища (рН 7,56,2).

7. Показано, що 1-iзоформа Na+,K+-АТР-ази мозку та нирок бика вiдноситься до глiкозидчутливого типу ферменту. В умовах частко-вої термоiнактивацiї та дiї DS-Na уявна спорiдненiсть до уабаiну iзоформ Na+,K+-АТР-ази кори головного мозку щура та бика не змiнюється. Помiрна iнактивацiя Na+,K+-АТР-ази мозку фосфолiпазою А2 супроводжується зниженням її чутливостi до уабаїну у порiвняннi з нативним ферментом в умовах iнгiбування в процесi АТР-фосфогiдролазного циклу. Цей ефект усувається обробкою препаратiв сироватковим альбумiном для вилучення вiльних жирних кислот та не виявляється при збiльшеннi тривалостi iнгiбування та пiсля попередньої iнкубацiї ферменту з уабаїном в присутностi АТР,Na+,Mg2+.

8. Вперше показано,що в умовах Fe2+/аскорбат-залежного пероксидного окислення лiпiдiв,яке супроводжується необоротною iнактивацiєю ферменту i окисленням SH-груп бiлкiв в препаратах мембранозв'язаної Nа+,К+-АТР-ази кори головного мозку щура, iзоформи ферменту + в бiльшiй мiрi у порiвняннi з 1 чутливi до окисного iнгiбування, що вiдповiдає виявленим вiдмiнностям в SH-залежностi їх ферментативної активностi.

9. Тiосечовина блокує утворення малонового дiальдегiду i сповiльнює iнгiбування ферменту в системi "Fe2+/аскорбат". Спе-цифiка чутливостi iзоформ до окислення не змiнюється i не залежить вiд накопичення малонового дiальдегiду. Одержанi данi свiдчать про можливiсть безпосереднього окисного ушкодження бiлкової молекули нейрональної Nа+,К+-АТР-ази у вiдповiдностi з iндивiдуальною оксидантною чутливiстю iзоформ.

10. Запропонована гiпотеза про iснування вiдмiнностей структурної органiзацiї бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ каталiтичної субодиницi Nа+,К+-АТР-ази мозку, обумовлених структурними особливостями лiпiдного оточення в нейрональнiй мембранi.

СПИСОК ОПУБЛIКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦIЇ

1. Капля А.А. (Монография). Структурная организация и функциональная роль изоферментов Na+,K+-ATP-азы.- Киев: Изд-во “Киевский университет”,1998.-162с.

2. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В., Горишняк В.П. Изоформы каталитической субъединицы Nа+,К+-АТР-азы мозга и их чувс-твительность к уабаину//Нейрохимия.-1989.-8,N2.-С.216-223.

3. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В., Горишняк В.П. Электрофоретическая гетерогенность каталитической субъединицы Na+,K+-ATP-азы, индуцируемая термообработкой//Докл.АН УССР.Сер.Б.-1989.-N6.-С.59-61.

4. Капля А.А., Кравцов А.В. Изоформы каталитической субъединицы Nа+,К+-АТР-азы в тканях животных//Укр.биохим.журн.-1990.-62, N3.-С.17-30.

5. Капля А.А.,Кравцов А.В. Термолабильность +-изоформы ката-литической субъединицы Nа+,К+-АТР-азы мозга//Укр.биохим.журн.-1990.-62,N4.- С.39-44.

6. Капля А.А., Кравцов А.В. Чувствительность Na+,K+-ATP-азы нейрональных мембран к уабаину//Укр.биохим.журн.-1992.-64,N4.-С.38-43.

7. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В. Термочувствительность изоферментов Nа+,К+-АТР-азы мозга и почек//Укр.биохим.журн.- 1994.-66,N6. - С.58-66.

8. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В. Чувствительность изоформ каталитической субъединицы Nа+,К+-АТРазы мозга крысы к Ds-Na// Биохимия.-1995.-60,N6.-С.970-975.

9. Капля А.А., Кравцова В.В., Кравцов А.В. Стабильность рецепторной функции изоферментов Na+,K+-ATP-aзы мозга в условиях модификации их ферментативной активности// Укр.биохим.журн.-1995.-67, N5.-С.43-48.

10. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В. Активность изоферментов Nа+,К+-АТР-азы коры головного мозга и их чувствительность к додецилсульфату натрия в постнатальном онтогенезе крыс//Укр. биохим.журн.- 1996.-68,N1.-С.32-39.

11. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В., Берус Н.В. Термоиндуцируемая трансформация белково-детергентных комплексов каталитических субъединиц Na+,K+-ATP-азы почек и мозга при электрофорезе в ПААГ//Укр.биохим.журн.-1996.-68,N2.- С.51-57.

12. Капля А.А., Кравцова В.В., Кравцов А.В. Влияние фосфолипазы А2 из яда Naja naja oxiana на активность изоферментов Nа+,К+- АТРазы мозга крысы//Биохимия.-1996.-61,N6.-С.998-1005.

13. Капля А.А.,Кравцова В.В., Кравцов А.В. Инактивация изоформ каталитической субъединицы Nа+,К+-АТР-азы мозга додецилсульфатом натрия//Биол.мембр.-1997.- 14,N1.- C.73-82.

14. Капля А.А., Кравцов А.В. Инактивация Na+,K+-АТР-азы мозга крыс додецилсульфатом натрия: влияние рН, ионов магния, температуры// Укр. биохим. журн.-1997.-69,N4.-C.3-8.

15. Капля А.А. Структурная организация изоферментов Na+,K+-ATP-азы в плазматической мембране//Укр.биохим.журн.-1997.--69, N5-6.-C.12-24.

16. Капля А.А. Физиологическая и адаптационная значимость изоферментов Na+,K+-ATP-азы//Укр.биохим.журн.-1998.-70, N3.-С.3-11.

17. Капля А.А. Чувствительность изоформ каталитической субъединицы Na+,K+-ATP-азы мозга крысы к пероксидной модификации мембран//Укр.биохим.журн.-1998.-70,N4.-C.118-122.

18. Капля А.А., Кравцов А.В. Молекулярные механизмы рецепции сердечных гликозидов Na+,K+-ATP-азой// Успехи совр. биол.-1999.-119, N1.- С.84-94.

19. Капля А.А., Кравцов А.В., Кравцова В.В., Горишняк В.П. Изоформы каталитической субъединицы Na+,K+-ATФазы в ткани мозга// Международный симпозиум по транспорту ионов.Тезисы докладов.- Тби-лиси,1989.-С.31.

20. Капля О.А., Кравцов О.В. Iзоформи каталiтичної субодиницi Na+,K+-ATP-ази:чутливiсть до протеолiзу, N-етилмалеiмiду,тер-моiнактивацiї,уабаїну// VI Укр.бiохiм.з'їзд. Тези доповiдей, част.I.- Київ, 1992.-С.76.

21. Капля А.А., Кравцов А.В. Мембранные свойства изоферментов Na+,K+-ATPазы мозга крысы: различия в чувствительности к фосфоли-пазе А2 и инактивации SDS// 3 Конференция биохимиков Узбекистана. Тезисы докладов.-Ташкент.-1996.-С.35.

22. Капля О.А., Кравцов О.В. Особливостi структурної органiзацiї бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ каталiтичної субо-диницi Na+,K+-ATPази// VII Український бiохiмiчний з'iзд.Тези доповiдей,част.I-Київ.-1997.-C.41.

23. Kaplya A.A., Kravtsov A.V. Membrane-dependent properties of brain Na+,K+-ATPase isoenzymes// 4th European conference on engineering and medicine.Book of abstracts.-Warsaw.-1997.-P.395.

24. Капля О.А., Кравцов О.В. Iнактивацiя iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,K+-ATP-ази мозку при мембранотропних впливах in vitro// II з'їзд українського бiофiзичного товариства.Тези доповiдей.-Харкiв.-1998.-С.105.

Капля О.А. Структурно-функцiональнi властивостi iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,K+-ATP-ази при мембранотропних впливах. – Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня доктора бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.04 – бiохiмiя. – Iнститут бiохiмiї iм.О.В.Палладiна НАН України,Київ,1999р.

Дисертацiю присвячено дослiдженню особливостей функцiональної стiйкостi iзоформ каталiтичної субодиницi Na+,K+-ATP-ази мозку до мембранотропних впливiв in vitro для з'ясування закономiрностей їх функцiональних порушень в плазматичнiй мембранi. Вперше встановлено, що 1-iзоформа мембранозв'язаної Na+,K+-ATP-ази сiрої речовини мозку (у порiвняннi з +) має вищу чутливiсть до iнактивацiї фосфолiпазою А2 з отрути Naja naja oxiana, iнактивацiї та солюбiлiзацiї DS-Na, термостабiльнiсть та стiйкiсть до окисного iнгiбування в системi "Fe2+/аскорбат. Запропонована гiпотеза про iснування вiдмiнностей структурної органiзацiї бiлково-лiпiдних комплексiв iзоформ Na+,K+-ATP-ази мозку, обумовлених структурними особливостями лiпiдного оточення в мембранi. Данi свiдчать,що нейрональна Na+,K+-ATP-аза є безпосередньою мiшенню оксидантної дiї, специфiчної до SH-залежних уабаїнчутливих iзоформ (+), навiть в умовах, якi не супроводжуються пероксидною деструкцiєю лiпiдiв.

Ключовi слова: Na+,K+-ATP-аза,iзоформи каталiтичної субодиницi, модифікація мембран.

Капля А.А. Структурно-функциональные свойства изоформ катали-тической субъединицы Na+,K+-ATP-азы при мембранотропных воздействиях. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины,Киев,1999г.

Диссертация посвящена исследованию особенностей функциональной устойчивости изоформ каталитической субъединицы Na+,K+-ATP-азы мозга к мембранотропным воздействиям in vitro для выяснения закономерностей их функциональных нарушений в плазматической мембране. Впервые установлено, что 1-изоформа мембраносвязанной Na+,K+-ATP-азы серого вещества мозга (по сравнению с +) обладает более высокой чувствительностью к инактивации фосфолипазой А2 из яда Naja naja oxiana, инактивации и солюбилизации Ds-Na, термостабильностью и устойчивостью к окислительному ингибированию в системе "Fe2+/аскорбат". Предложена гипотеза о существовании различий структурной организации белково-липидных комплексов изоформ Na+,K+-ATP-азы мозга,обусловленных структурными особенностями липидного окружения в мембране. Данные свидетельствуют,что нейрональная Na+,K+-ATP-аза является непосредственной мишенью оксидантного действия,специфичного к SH-зависимым уабаинчувствительным изоформам (+), даже в условиях, не сопровождающихся пероксидной деструкцией липидов.

Ключевые слова: Na+,K+-ATP-аза, изоформы каталитической субъединицы, модификация мембран.

Kaplya A.A. Structural and functional properties of Na+,K+-ATP-ase catalytic subunit isoforms under membrane-disturbing influences. – Manuscript.

Thesis for doctor's degree on speciality 03.00.04 – biochemistry. O.V.Palladin Biochemistry Institute of National Academy of Sciences of Ukraine,Kyiv,1999.

The dissertation is devoted to investigation of the functional persistence of the receptor types of brain Na+,K+-ATP-ase catalytic subunit isoforms under membrane-disturbing influences in vitro for elucidation of the peculiarities of their functional disorders in plasma membrane.

The differenses in the electrophoretic properties in SDS of the hydrophobic proteins of the Na+,K+-ATP-ase -subunit isoforms after thermal solubilization of the cerebral cortex preparations prove that isoforms differ in their protein-detergent interactions.

The different susceptibility to thermal inactivation at 50-550C of brain Na+,K+-ATP-ase isoforms (higher for +) and 1-isoform of brain and kidney (higher for brain) reflects the differences in their structural stability in membrane.

The higher sensitivity of 1-isoform of membrane-bound Na+,K+-ATP-ase from cerebral cortex (in comparison to +) to phospholipase A2 from Naja naja oxiana venom was ascertained revealing the peculiarities of the isoform lipid dependence. Na+,K+-ATP-ase partial inactivation is accompanied by decrease of their apparent affinity to ouabain. This phospholipase effect was abolished after treatment of the preparations by serum albumin to remove fatty acids or after incubation of the enzyme at the optimal conditions for inhibitor binding.

In contrast to enzyme preparations from medulla oblongata the higher sensitivity of the Na+,K+-ATP-ase 1-isoform to SDS inactivation accompanied by its, at least partial, removal from the membrane, was also found in preparations from cerebral cortex. The differences in the sensitivity to SDS was eliminated after extraction of microsomes with the detergent at 370C under conditions of termotropic phase transition of the membrane lipids. The interpretation of the results is based on the assumed structural differences of isoform protein-lipid complexes dependent on the differences in structural organization of the boundary lipids of the neuronal Na+,K+-ATP-ase catalytic subunit isoforms,thus determining the differences in the sensitivity of Na+,K+-ATP-ase isozymes in viscotropic regulation of their functional activity.

The lower oxidant sensitivity of the 1-isoform in "Fe2+/ascorbate" system was revealed. Thiourea, the hydroxyl radical scavenger, effectively blocked malonic dialdehyde formation and reduced the rate of the Na+,K+-ATP-ase inactivation. The relative isoform sensitivity to oxidation is not changed. It is concluded that Na+,K+-ATP-ase is the direct target of the oxidative membrane damage specific to SH-dependent ouabain-sensitive isoforms (+) even in absence of peroxide lipid destruction.

The differences of the functional disorders of the "house-keeping" 1-isoform and specialized 2- and 3-isoforms of the neuronal Na+,K+-ATP -ase at some brain diseases and their specific sensitivity to membrane-disturbing agents are supposed.

Key words: Na+,K+-ATP-ase, catalytic subunit isoforms, membrane perturbation.