НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

Задорожна Марина Борисівна

УДК 577.151.4

роль -2-антиплазміну

на різних етапах фібринолітичного процесу

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

ВОЛКОВ Георгій Леонідович,

завідувач відділу структури та функції білка

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Козлов Едуард Андрійович,

старший науковий співробітник лабораторії біосинтезу білка

Інституту молекулярної біології і генетики НАН України;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ЛІСНЯК Іван Олексійович,

провідний науковий співробітник відділу клітинної фотобіології та фотомодуляції пухлинного росту

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН Украіни.

Провідна установа – Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

МОЗ України, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ.

Захист відбудеться „22” травня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий „20” квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми дисертації. Система фібринолізу підтримує рідкий стан крові та відповідає за розчинення тромбів і відкладень фібрину в кров’яному руслі та поза його межами. Протягом останніх років накопичилося багато відомостей щодо участі окремих компонентів системи фібринолізу в регуляції розвитку тканин та органів, загоєнні ран, в запальних та алергійних процесах, інвазії та метастазуванні пухлин.

Фібринолітична система багатокомпонентна, вона включає проферменти, ферменти, активатори та інгібітори. На даний час досить добре вивчена структура білків системи фібринолізу, їх фізико-хімічні властивості, досліджені окремі механізми регуляції фібринолітичного процесу. Ключовим ферментом системи фібринолізу є плазмін. В плазмі крові він циркулює у вигляді неактивного попередника – плазміногену. Його фізіологічними активаторами є високоспецифічні серинові протеїнази – тканинний активатор та урокіназа, які шляхом гідролізу пептидного зв’язку Arg561-Val562 перетворюють профермент на плазмін.

За фізіологічних умов фібриноліз є процесом, що ретельно регулюється. У контролі за активацією проферменту важливу роль відіграють активатори плазміногену, їх інгібітори, поверхня фібринового згустку або клітин. Фібрин, що є субстратом плазміну, регулює власну деградацію через локалізацію процесу активації на своїй поверхні. Завдяки наявності високоафінних взаємодій між білками відбувається сорбція плазміногену та тканинного активатора на поверхні фібрину, що прискорює процес активації. Плазмін, який утворюється на фібрині, захищений від швидкої інактивації б-2-антиплазміном, що дозволяє ферменту руйнувати згусток в багатому на інгібітори оточенні. Плазмін, що вивільняється у кровоток під час гідролізу фібринового згустку, інактивується природними інгібіторами – б-2-антиплазміном та б-2-макроглобуліном. Порушення існуючої динамічної рівноваги між протеолітичними ферментами та інгібіторами може привести до розвитку патофізіологічних процесів. Надлишкове утворення плазміну приводить до руйнування білків системи зсідання крові та розвитку неконтрольованих кровотеч.

Високоспецифічним інгібітором плазміну є б-2-антиплазмін. Він швидко та необоротно інактивує фермент у розчині, захищаючи білки плазми від протеолізу. Під час полімеризації близько 20 % усієї кількості інгібітора за участю активованого фактора ХІІІ ковалентно включається в згусток. Вважається, що іммобілізація інгібітора запобігає передчасному руйнуванню фібринового згустку.

На даний час залишається невідомим вплив -2-антиплазміну на взаємодію тканинного активатора з фібрином, на процес утворення плазміну на поверхні фібрину за активації плазміногену тканинним активатором. Остаточно не з’ясована кількість та локалізація ділянок зв’язування інгібітора на молекулах плазміну та фібрину. Дані щодо впливу -2-антиплазміну на взаємодію плазміногену з фібрином суперечливі. Виходячи з концентрації проферменту та інгібітора в плазмі та Кd взаємодії цих білків, розраховано, що 30 % -2-антиплазміну в системі циркуляції знаходиться в комплексі з плазміногеном. Тому, з одного боку, ковалентна іммобілізація -2-антиплазміну опосередковано збільшує кількість плазміногену, що сорбується на фібрині. З другого, інгібітор може перешкоджати проферменту зв’язуватися з фібрином.

З’ясування особливостей взаємодії плазміногену, тканинного активатора, фібрину та -2-антиплазміну дозволить уточнити молекулярні механізми, що лежать в основі регуляції процесу гідролізу фібринових згустків. Отримана інформація сприятиме вирішенню задач практичної медицини, дасть змогу розробити нові методи діагностики та лікування захворювань, пов’язаних з патологічним тромбоутворенням.

Зв’язок теми дослідження з планом основних наукових робіт. Роботу виконано у відділі структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України протягом 2001-2005 рр. Дисертаційна робота безпосередньо пов’язана з плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: “Вивчення молекулярних механізмів регуляції проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в нормі та при патології” (державна реєстрація № 0101U000103, 2001-2003 рр) і „Вивчення механізмів регуляції та взаємодії компонентів системи зсідання крові та фібринолізу з судинно-тромбоцитарною ланкою системи гемостазу” (державна реєстрація № 0104U003276, 2004-2008 рр).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначити роль б-2-антиплазміну на різних етапах фібринолітичного процесу, вивчити особливості взаємодії інгібітора з плазмін(оген)ом, фібрин(оген)ом та тканинним активатором плазміногену.

Відповідно до основної мети вирішувались наступні задачі:

- дослідження ролі окремих кринглів та серин-протеїназного домену молекули плазмін(оген)у в інгібуванні ферменту б-2-антиплазміном;

- з’ясування можливості взаємодії інгібітора з фібрин(оген)ом за відсутності активованого фактора ХІІІ;

- вивчення впливу б-2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині;

- дослідження впливу інгібітора на зв’язування тканинного активатора плазміногену з фібрином;

- розроблення нового спосібу виділення високоочищеного б-2-антиплазміну.

Об’єкт дослідження. Об’єктом дослідження є фібринолітичний процес.

Предмет дослідження. б-2-Антиплазмін і його роль у руйнуванні фібринових згустків.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті проведених досліджень з’ясовано, що в процесі інгібування плазміну б-2-антиплазміном відбувається багатоцентрова взаємодія ферменту та інгібітора. В утворенні комплексу б-2-антиплазміну з плазмін(оген)ом крім кринглів 1-3 приймають участь лізинзв’язувальні ділянки кринглів 4 та 5 і додаткова ділянка в серин-протеїназному домені, відмінна від активного центру. Дослідження кінетики гідролізу специфічного хромогенного субстрату S2251 плазміном та його функціонально активними похідними міні- та мікро-плазміном за присутності б-2-антиплазміну показало, що кринглові домени контролюють швидкість реакції між ферментом та інгібітором, але не є необхідними для процесу інгібування. Розраховано константи швидкості комплексоутворення б-2-антиплазміну з плазміном та його похідними.

Вперше показано, що б-2-антиплазмін взаємодіє з фібрин(оген)ом за відсутності ХІІІ фактора. Інгібітор проявляє спорідненість до фібриногену, дезАА-, дезААВВфібрину, Х- та D-фрагментам фібриногену, D-димеру фібрину, але не зв’язується з Е-фрагментом. Ділянки зв’язування б-2-антиплазміну на фібрині розташовано в D-доменах.

Вперше установлено, що б-2-антиплазмін інгібує процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині, DDE-комплексі та D-димері. За фізіологічних співвідношень досліджуваних білків швидкість активації на фібрині у присутності інгібітора знижується на порядок. Збільшення концентрації тканинного активатора прискорює активацію плазміногену на фібрині, але не впливає на гальмуючий ефект б-2-антиплазміну. За присутності інгібітора спостерігається збільшення часу лізису фібринового згустку плазміном, що утворився при активації Glu-плазміногену тканинним активатором.

Показано, що б-2-антиплазмін значною мірою не впливає на взаємодію тканинного активатора з фібрином. Інгібітор утворює комплекс з тканинним активатором без зміни його амідолітичної активності. Гальмування б-2-антиплазміном утворення плазміну на поверхні фібрину можна пояснити створенням стеричних перешкод для взаємодії тканинного активатора та Glu-плазміногену або конформаційними змінами в молекулі тканинного активатора при його взаємодії з б-2-антиплазміном.

Розроблено новий спосіб виділення б-2-антиплазміну з високою інгібіторною активністю, що базується на високій спорідненості інгібітора до ІІ афіннохроматографічної форми плазміногену.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані експериментальні результати свідчать, що багатоцентрова взаємодія б-2-антиплазміну з плазміном забезпечує специфічність та ефективність дії інгібітора. Показано, що б-2-антиплазмін за відсутності фактора ХІІІ зв’язується з фібрином в місцях локалізації активаторного комплексу. Установлено, що б-2-антиплазмін є регулятором фібринолітичного процесу. Він пригнічує руйнування фібринового згустку, впливаючи на швидкість активації плазміногену тканинним активатором на фібрині.

Запропоновано новий спосіб одержання б-2-антиплазміну, що дозволяє в один етап з плазми, виснаженої на плазміноген, одержати інгібітор без домішок гістидинбагатого білка. На основі теоретичних даних та експериментальних робіт одержано патент України № 53146 Бюл. №1 від 15.01.2003. Пригнічення на різних рівнях гіперактивації плазміногену за допомогою б-2-антиплазміну може стати одним з підходів для розробки нових видів терапії захворювань, що супроводжуються значними кровотечами.

Особистий внесок здобувача. Представлена дисертаційна робота є завершеним дослідженням, що виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених та узагальнених протягом 2001 – 2005 років. Здобувачем самостійно одержано більшу частину необхідних для досліджень білкових препаратів: плазміноген і плазмін та їх фрагменти, фібриноген, фібрин, б-2-антиплазмін. Автор дисертації особисто проводила експериментальні дослідження по вивченню впливу б-2-антиплазміну на швидкість гідролізу фібринових згустків, а також вивчала зв’язування мічених біотином білків з фібрин(огено)м, його фрагментами, тканинним активатором. Одержання фрагментів фібрин(оген)у було проведено разом зі с.н.с. відділу структури та функції білка д.б.н. Платоновою Т.М. Вивчення кінетики інгібування плазміну та його похідних б-2-антиплазміном, дослідження взаємодії інгібітора з плазміногеном і його фрагментами, впливу б-2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині, фрагментах фібрин(оген)у було проведено здобувачем спільно зі с.н.с. відділу структури та функції білка к.б.н. Гриненко Т.В. Спосіб виділення високоочищеного б-2-антиплазміну з плазми крові людини розроблено разом з м.н.с. відділу структури та функції білка к.б.н. Юсовою О.І. Аналіз отриманих результатів, обговорення та інтерпретацію проведено спільно з науковим керівником та с.н.с. відділу структури та функції білка к.б.н. Гриненко Т.В. Друковані праці підготовлено за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Основні результати та окремі положення дисертаційної роботи було викладено на конкурсі молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, 2002 р.), VIIІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.); 7 Пущинській школі-конференції молодих вчених „Біологія – наука XXI століття” (Пущино, 2003 р.), Всеукраїнській конференції молодих вчених „Актуальні питання сучасного природознавства” (Сімферополь, 2003 р.), міжнародній конференції ”Plasma product biotechnology meeting 2003” (Курасао, Нідерландські Антили, 2003 р.), науково-практичній конференції „Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005р.), на засіданнях відділу структури та функції білка та наукових семінарах Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Матеріали досліджень було представлено на конкурсі молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України на здобуття стипендії імені видатних вчених-біохіміків, де роботу відзначено премією ім. В.О. Беліцера у 2002 та 2004 роках.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 4 статті в фахових виданнях, 1 патент та 5 тез доповідей у збірках наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 4 підрозділи), експериментальної частини (3 розділи), висновків та списку літературних джерел (180 найменувань). Робота представлена на 120 сторінках, містить 32 рисунки та 2 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасні уявлення про структуру та функціональні властивості фібрин(оген)у, плазмін(оген)у, тканинного активатора плазміногену та б-2-антиплазміну, особливості взаємодії основних білків фібринолітичної системи. Наведено дані про методи виділення б-2-антиплазміну з плазми крові людини, різні форми інгібітора, реакцію його ковалентного включення в фібриновий згусток за участю активованого фактора ХІІІ, розглянуто механізм реакції з плазміном.

Матеріали та методи досліджень. Glu-плазміноген людини виділяли з плазми крові донорів на лізин-сефарозі 4В (Deutch, Mertz, 1970).

Фрагменти плазміногену – крингл 1-3, крингл 4, міні-плазміноген та мікро-плазміноген отримували гідролізом Глу-плазміногену еластазою (Sottrup-Jensen et al., 1978) та плазміном ( відповідно.

Плазмін, міні- та мікро-плазмін одержували за активації Глу-плазміногену, міні- та мікро-плазміногену урокіназою, що була іммобілізована на сефарозі 4В (Norman et al., 1985).

Фібриноген виділяли з оксалатної плазми крові бика методом фракційного висолювання сульфатом натрію (Варецька та ін., 1961).

ДезAABB- та дезААфібрин одержували, обробляючи фібриноген тромбіном (Pozdnjakova et al., 1979) та анцистроном (Соловьев, Угарова, 1993) відповідно. Для інактивації фактора XIII та видалення плазміногену процедуру проводили за присутності пара-хлормеркурійбензоату натрію (п-ХМБ) та 6-аміногексанової кислоти (6-АГК).

D-, Е-, Х-фрагменти фібриногену, D-димер та DDЕ-комплекс одержували з плазмінового гідролізату фібриногену (Платонова, Лукинова, Медведь, 1993; Белицер и др., 1972).

Ho1-DSK одержували шляхом бромціанового розщеплення фібриногену (Blomback et al., 1968).

Активність плазміну і потенційну – плазміногену визначали за здатністю гідролізувати казеїн (Robbins, Summaria, 1979) або специфічний хромогенний субстрат S2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-нітроаніліну гідрохлорид).

Інгібіторну активність б-2-антиплазміну визначали за здатністю гальмувати амідолітичну активність плазміну.

Біотинілювання білків здійснювали із застосуванням сукцинімідобіотину (Gilting et al., 1987).

Кінетику інгібування плазміну та його похідних, активацію Glu-плазміногену тканинним активатором вивчали з використанням специфічного хромогенного субстрату плазміну S2251.

Взаємодію білків досліджували за допомогою авідин-біотинової реакції.

Швидкість лізису фібринових згустків вивчали за допомогою турбідиметричного аналізу.

Електрофорез у поліакриламідному гелі проводили за присутності ДС-Na для перевірки гомогенності отриманих білків (Laemli, 1970) та в системі сечовина/оцтова кислота за низьких значень рН – для визначення форми одержаного плазміногена (Panyim, Chalkley, 1969).

Математичну обробку результатів досліджень виконували за допомогою пакету ORIGIN 6.1. До роботи включено результати експериментів, допустима похибка яких не перевищувала 6 відсотків (р < 0,06). Криві, що представлені на рисунках, є типовими для серії повторних дослідів (щонайменше три в кожній серії).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Спосіб одержання б-2-антиплазміну без домішок гістидинбагатого білка. Різні способи виділення б-2-антиплазміну (б-2-АР) базуються на його здатності з високою спорідненістю взаємодіяти з лізинзв’язувальними ділянками в N-кінцевій частині молекули плазміногену (Пг). Подібна здатність властива також фібриногену та гістидинбагатому білку. Одержання препаратів б-2-АР без домішок цих білків потребує додаткових трудомістких етапів очистки. Особливо це стосується гістидинбагатого білка, який має дуже близьку до б-2-АР молекулярну масу – 68 кДа.

Встановлено, що б-2-АР та гістидинбагатий білок з високою афінністю взаємодіють з кринлами 1-3 (К 1-3) молекули плазміногену, разом з тим, інгібітор виявляє більш високу спорідненість до ІІ афіннохроматографічної форми проферменту (Hayes, Castellino, 1979). Ці дані дозволили запропонувати новий спосіб виділення б-2-АР без домішок гістидинбагатого білка послідовною хроматографією плазми крові на лізин-, К 1-3 (І форма)- та К 1-3 (ІІ форма)-сефарозі.

Для синтезу афінних сорбентів одержували Пг з фракції III2,3 по Кону плазми крові людини на лізин-сефарозі. Крингли 1-3 виділяли з еластазного гідролізату плазміногену гель-фільтрацією на Superdex G-75 та наступною хроматографією на лізин-сефарозі. I и II форми К 1-3 розділяли методом афінної хроматографії на конканавалін А-сефарозі. Обидві форми взаємодіють з іммобілізованим лектином за участю лізинзв’язувальних ділянок, а форма I, додатково, – завдяки вуглеводному розпізнаванню (Arias et al., 1989). Іммобілізацію кринглів на активованій бромціаном сефарозі проводили за стандартною методикою (March et al., 1974)

Плазму, з якої попередньо видаляли Пг афінною хроматографією на лізин-сефарозі, наносили на дві послідовно з’єднані колонки: К (I форма)-сефароза и К 1-3 (II форма)-сефароза, врівноважені 0,04 М натрій фосфатним буфером, рН 7,0. Неспецифічно сорбовані білки відмивали робочим буфером, що містив 0,5 М хлорид натрію. Елюцію специфічно сорбованих білків з кожної з колонок проводили 0,05 М 6-АГК в робочому буфері. Білкові фракції аналізували електрофоретично (рис. 1) та за інгібіторною активністю. Інгібіторна активність виявлялась тільки в фракціях, які елюювали з К 1-3 (ІІ форма)-сефарози, і складала 90 % за еквімолярного співвідношення з плазміном. На електрофореграмі зона даного білка відповідала б-2-АР з молекулярною масою 70 кДа. Одержані препарати б-2-АР і гістидинбагатого білка не містили домішок один одного, а високомолекулярні домішки видаляли гель-фільтрацією з використанням суперози 

Таким чином, даний спосіб дозволяє без застосування додаткових методів очистки одержати б-2-антиплазмін з високою інгібіторною активністю без домішок гістидинбагатого білка.

Особливості взаємодії б-2-антиплазміну з плазмін(оген)ом. В останні роки з’явилися дані про те, що селективність та ефективність дії інгібіторів серинових протеїназ забезпечується багатоцентровою взаємодією їх з ферментами. Наприклад, взаємодія тканинного активатора з його інгібітором РАІ-1 відбувається по трьох ділянках: кринглу 2, активному центру та ділянці, що вміщує 7 амінокислотних залишків і розташована поблизу активного центру (Madison et al., 1989; Chmielewska et al., 1988). Для визначення ролі кринглів та серин-протеїназного домену молекули плазміну в інгібуванні б-2-АР використовували функціонально активні похідні плазмін(оген)у: міні- та мікро-плазмін(оген) та крингли 1-3 і 4.

Досліджували кінетику реакції гідролізу специфічного хромогенного субстрату S2251 плазміном, міні- та мікро-плазміном (рис. 2). Показано, що б-2-АР у всіх випадках зменшує швидкість реакції. За еквімолярного співвідношення з інгібітором активність плазміну, міні- та мікро-плазміну зменшується на 97%, 88% та 85% відповідно. Максимальна величина інгібування плазміну спостерігається за 1-2 хв. від початку реакції, міні-плазміну за 5-10 хв. та мікро-плазміну – за 10-15 хв. Отримані дані щодо кінетики інгібування дозволили розрахувати константи швидкості комплексоутворення б-2-АР з плазміном, міні-плазміном та мікро-плазміном, які дорівнюють 1,4·106; 1,7·105 та 6,2·104 М-1с-1 відповідно. У присутності 0,01 М 6-АГК, за якої відбувається насичення всіх лізинів’язувальних ділянок або 0,1 М аргініну, що проявляє найбільшу спорідненість до лізинів’язувальної ділянки кринглу 5, швидкість комплексоутворення б-2-АР з плазміном або міні-плазміном уповільнюється і набуває сумірних значень до швидкості реакції з мікро-плазміном.

Зроблено висновок, що домени некаталітичної частини молекули плазміну не є необхідними для процесу інгібування, але контролюють швидкість реакції між ферментом та інгібітором.

З використанням авідин-біотинової реакції досліджували взаємодію б-2-АР з плазміном та його фрагментами (рис. 3). Величина зв’язування інгібітора з плазміном, активний центр якого попередньо інгібували діізопропілфторфосфатом, була найвищою. Якщо її прийняти за 100%, то зв’язування з міні-плазміногеном складає приблизно 36%, а з мікро-плазміногеном – близько 20%. Слід відмітити, що 6-АГК та аргінін зменшують величину зв’язування інгібітора з плазміном та міні-плазміногеном відповідно до значень, отриманих при використанні мікро-плазміногену. 6-АГК не впливає на взаємодію б-2-АР з мікро-плазміногеном (рис. , А). Ці дані вказують на існування в серин-протеїназному домені ділянки взаємодії, відмінної від активного центру. Інгібітор при всіх досліджуваних концентраціях в значно більшій кількості зв’язується з кринглами 1-3 у порівнянні з кринглом 4 та міні-плазміногеном (рис. 3, Б). Кількість б-2-АР, адсорбованого на різних фрагментах плазмін(оген)у зменшується у послідовності: плазмін, крингли 1-3, крингл 4, міні-плазміноген, мікро-плазміноген.

Таким чином, в процесі інгібування відбувається багатоцентрова взаємодія плазміну з б-2-антиплазміном. Крім кринглів 1-3, в утворенні комплексу приймають участь лізинзв’язувальні ділянки кринглів 4 та 5 та додаткова ділянка каталітичного домену, відмінна від активного центру.

Дослідження зв’язування б-2-антиплазміну з фібрин(оген)ом та їх фрагментами. Відомо, що ряд білків плазми, наприклад, б-2-АР, фібронектин, тромбоспондин та ін. в процесі зсідання крові за участю фібринстабілізуючого фактора ковалентно включаються в згусток. Дані білки приєднуються до б-ланцюгів молекул фібрину і разом з міжмолекулярною прошивкою фібрину по б- та г-ланцюгам сприяють збільшенню стійкості згустку до дії плазміну та репаративним процесам в місцях пошкодження судин і тканин. Показано, що фібронектин з високою афінністю може нековалентно зв’язуватися з фібрином. Ми припустили можливість існування ділянок зв’язування б-2-АР на молекулі фібрину без участі фактора XIII.

Для з’ясування можливості взаємодії б-2-АР з фібрином за відсутності фактора ХІІІ одержували препарати фібрин-мономера з фібриногену, який попередньо пропускали через колонку з п-ХМБ-сефарозою для видалення фактора ХІІІ, або за присутності цього реагенту та 6-АГК для інгібування активованого фактора ХІІІ та виснаження на плазміноген, відповідно. Повноту видалення фактора ХІІІ контролювали за допомогою електрофорезу у присутності ДС-Na та в-меркаптетанолу.

За допомогою авідин-біотинової реакції показано, що інгібітор адсорбується на фібринових плівках, утворених з дезАА- та дезААВВ фібрину. Розраховані значення Кd взаємодії б-2-АР з дезАА- та дезААВВфібрином свідчать про високу спорідненість інгібітора до фібрину (табл. 1).

Дані про те, що б-2-АР з високою спорідненістю взаємодіє з Glu-Пг (Wiman et al, 1979) порушує багато питань стосовно взаємодії цих білків з фібрином. Інгібітор може перешкоджати взаємодії Пг з фібрином, конкуруючи за лізинзв’язувальні ділянки, і в такий спосіб сповільнювати швидкість гідролізу фібрину. Але експериментально було показано, що б-2-АР в незначній мірі впливає на зв’язування Glu-Пг з фібрином (Rakoczi te al, 1979). З іншого боку, б-2-АР, іммобілізований на фібрині активованим фактором ХІІІ, може зв’язувати Пг, тим самим підвищуючи його концентрацію на фібрині. Щоб перевірити цю можливість, досліджували зв’язування міченого біотином б-2-АР в межах концентрацій від 15 до 300 нМ за присутності відповідної еквімолярної кількості небіотинільованого Glu-Пг з дезААВВфібрином. Glu-Пг не змінює величину зв’язування б-2-АР.

Отже, ні б-2-антиплазмін, ні Glu-плазміноген значною мірою не впливають на взаємодію одне одного з фібрином. Зроблено висновок, що інгібітор і профермент мають різні ділянки зв’язування на фібрині.

Крім фібринових плівок біотинільований б-2-АР зв’язується також з іммобілізованими на полістирольній поверхні мікропланшетів фібриногеном, виснаженим на плазміноген та фактор ХІІІ, і Х2-фрагментом фібриногену. У Х2-фрагменті відсутні бС-домени, в яких розташовані місця ковалентного зв’язування б-2-АР активованим фактором ХІІІ. Тому ці дані також вказують на можливість незалежної від активованого фактора ХІІІ взаємодії інгібітора з фібрин(оген)ом.

Для локалізації ділянок зв’язування б-2-АР на молекулі фібрин(оген)у досліджували взаємодію інгібітора з D- та Е-фрагментами і D-димером. б-2-АР проявляє спорідненість до D-фрагмента і D-димеру, але не зв’язується з Е-фрагментом. Константа дисоціації, яка характеризує комплексоутворення інгібітора з D-димером, вдвічі менша за величину, одержану за використання D-фрагмента, і збігається зі значеннями Кd взаємодії б-2-АР з дезАА- та дезААВВфібрином (табл. 1). Ці дані дозволяють зробити висновок, що ділянки зв’язування б-2-АР незалежні від активованого фактора ХІІІ на фібрин(оген)і розташовані в D-доменах, можливо, в зоні D-D-контактів.

Таблиця 1

Константи дисоціації взаємодії біотинільованих б-2-антиплазміну та Glu-плазміногену з дезАА-, дезААВВфібриновими плівками та іммобілізованими фрагментами фібрин(оген)у

Фібрин/фрагменти | Значення Кd, нМ

ДезААфібрин | 69,0 ± 1,0

ДезААВВфібрин | 68,6 ± 5,3

D-фрагмент | 119,0 ± 21,0

Е-фрагмент | Не зв’язується

D-димер | 65,0 ± 4,0

Вплив б-2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині. Зв’язування б-2-АР з фібрином в місцях локалізації активаторного комплексу дозволило припустити, що інгібітор може впливати на утворення плазміну. В якості стимуляторів процесу активації ми використовували дезААВВфібрин, плазмінові фрагменти фібрину – DDE-комплекс і D-димер та бромціановий фрагмент фібриногену Ho1-DSK. Всі зазначені фрагменти проявляють ефекторні властивості та здатні зв’язувати Пг та (або) тканинний активатор.

Криві, що відображають кінетику активації Glu-Пг за використання фібрину та фрагментів фібрин(оген)у, мають типову S-образну форму з лаг-періодом, що характеризується незначним збільшенням поглинання. Використовуючи кінетичні криві активації проферменту тканинним активатором на різних фрагментах фібрин(оген)у за відсутності та у присутності б-2-АР, було розраховано швидкість цього процесу (рис. 4). Підтверджено, що фібрин та DDE-комплекс є ефективними стимуляторами процесу активації. За використання D-димеру та Ho1-DSK фрагмента спостерігається збільшення лаг-періоду та зменшення швидкості процесу активації. б-2-АР значною мірою знижує швидкість активації на фібрині, DDE-комплексі та D-димері, і не впливає на процес активації за присутності Ho1-DSK фрагмента.

Порівняння Кd взаємодії б-2-АР з D- та D-D-фрагментами фібрин(оген)у, що дорівнюють 119 та 65 нМ, відповідно, та відсутність ефекту б-2-АР на процес активації Пг тканинним активатором на Ho1-DSK свідчать на користь зробленого нами раніше припущення про локалізацію ділянок зв’язування б-2-АР в області D-D-контакту.

Отже, б-2-антиплазмін, адсорбований на фібрині в місцях, де відбувається активація Glu-плазміногену тканинним активатором, інгібує цей процес.

На наступному етапі вивчали вплив б-2-АР на активацію Пг за різних концентрацій тканинного активатора (рис. 5). При використанні від 5 до 50 МО активатора/мл швидкість реакції прямо пропорційна концентрації тканинного активатора. В усіх випадках б-2-АР гальмує процес активації. Навіть за використання 50 МО/мл активатора, що більш ніж на порядок перевищує його фізіологічну концентрацію, б-2-АР гальмує швидкість реакції в 35 разів.

Наведені дані були отримані на модельних системах з використанням очищених білків. Можливо, за фізіологічних умов компоненти плазми змінюють ефект б-2-АР на процес активації. Для перевірки цього в реакційне середовище замість Пг додавали еуглобулінову фракцію, що містила таку ж кількість проферменту, яку використовували в попередніх експериментах. Відомо, що до складу еуглобулінової фракції крім Пг входять його активатори, фібриноген та ряд факторів зсідання крові.

Швидкість процесу активації за використання еуглобулінової фракції прямо пропорційна концентрації внесеного тканинного активатора. В контрольних дослідах у середовище реакції, яке містило еуглобулінову фракцію без додавання тканинного активатора та фібрину з часом спостерігали появу амідолітичної активності, що свідчить про активацію деякої кількості Пг активаторами еуглобулінової фракції. б-2-АР знижував швидкість активації за різної кількості тканинного активатора до величини, отриманої за використання тільки еуглобулінової фракції.

Далі досліджували вплив б-2-АР на швидкість гідролізу дезААВВфібрину плазміном, що утворюється за активації Glu-Пг тканинним активатором. Час напівлізису згустка за відсутності інгібітора дорівнював 9 хв. Якщо утворення і руйнування фібринового згустка проводили у присутності б-2-АР, час напівлізису подовжувався в 6 разів.

Представлені дані дозволяють зробити висновок, що б-2-антиплазмін інгібує процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині і внаслідок цього лізис фібринових згустків.

Вивчення механізму інгібування б-2-антиплазміном активації плазміногену тканинним активатором на фібрині. Ефект б-2-АР на процес активації можна було б пояснити впливом інгібітора на взаємодію Пг або тканинного активатора з фібрином. Але інгібітор не більше, ніж на 10-20 % знижує кількість Glu-Пг, зв’язаного з фібрином, і не впливає на дисоціацію комплексу Пг-фібрин (Moroi, 1977; Rakoczi te al, 1979).

Для перевірки можливості б-2-АР знижувати зв’язування тканинного активатора з фібрином досліджували адсорбцію біотинільованого тканинного активатора на дезААВВфібринових плівках за відсутності та у присутності інгібітора. Кd взаємодії тканинного активатора з фібрином складає 140 нМ. Аналогічні величини було отримано за допомогою методу імуноферментного аналізу при вивченні зв’язування тканинного активатора з бромціановим фрагментом фібриногену Ho1-DSK (Bosma et al, 1988), а також при дослідженні кінетики активації Пг на фібринових плівках дволанцюговим тканинним активатором (Hoylaerts et al, 1982). У присутності б-2-АР, що використовували в концентраціях, при яких відбувається насичення ділянок зв’язування інгібітора на фібрині, величина зв’язування тканинного активатора з фібрином зменшується на 20 %. Таке зниження спостерігали за еквімолярного співвідношення б-2-АР до тканинного активатора, воно залишається на цьому рівні навіть за 10-разового збільшення концентрації інгібітора. Таким чином, інгібітор значною мірою не перешкоджає зв’язуванню з фібрином ні плазміногену, ні тканинного активатора.

Ми показали, що біотинільований б-2-АР взаємодіє з тканинним активатором, іммобілізованим на полістирольній поверхні планшетів для імуно-ферментного аналізу (рис. 6, А). Взаємодія інгібітора з тканинним активатором не супроводжується зниженням амідолітичної активності ферменту. б-2-АР не змінює швидкість звільнення п-нітроаналіну з специфічного хромогенного субстрату тканинного активатора Chromozym-t-PA (N-метилсульфоніл-D-Phe-Gly-Arg-p-нітроанілід). Тобто, утворення комплексу б-2-АР-тканинний активатор відбувається без блокування активного центру ферменту.

Відомо, що структура тканинного активатора представлена декількома модулями: фінгер-доменом, EGF-доменом, двома крингловими та серин-протеїназним доменами. Фінгер- та другий крингловий домени опосередковують зв’язування тканинного активатора з нативним та частково гідролізованим фібрином. EGF-домен відповідає за рецептор-опосередковані взаємодії, необхідні для росту та диференціації клітин, або виконує роль спейсера між доменами, що підтримує їх специфічну взаємну орієнтацію і забезпечує функціонування молекули. Лізинів’язувальні ділянки кринглових доменів плазміногену приймають участь у взаємодії з фібрином та б-2-АР. За використання 6-аміногексанової кислоти у межах концентрацій 10-6-10-2 М величина зв’язування тканинного активатора з інгібітором знижується на 20-35 % (рис. 6, Б). Отже, у взаємодії б-2-АР з тканинним активатором крім лізинзв’язувальної ділянки кринглу 2 приймають участь інші структури. Можна припустити, що взаємодія б-2-АР з EGF-доменом змінює конформацію тканинного активатора і внаслідок цього здатність активувати плазміноген суттєво зменшується.

Потужне гальмування б-2-антиплазміном процесу утворення плазміну на поверхні фібрину можна пояснити створенням інгібітором стеричних перешкод для активації Glu-плазміногену тканинним активатором або зниженням здатності активувати плазміноген внаслідок утворення комплексу тканинного активатора з б-2-антиплазміном.

ВИСНОВКИ

1. б-2-Антиплазмін є високоспецифічним інгібітором плазміну, який захищає білки плазми від неспецифічного протеолізу і запобігає передчасному руйнуванню фібринового згустка. В роботі представлено результати вивчення взаємодії інгібітора з різними компонентами системи фібринолізу та гальмування б-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині.

2. Встановлено багатоцентрову взаємодію плазміну з б-2-антиплазміном за участі кринглів 1-3, 4 та 5 та додаткової ділянки серин-протеїназного домену молекули ферменту.

3. Кринглові домени молекули плазміну контролюють швидкість реакції між ферментом та інгібітором, але не є необхідними для процесу інгібування плазміну б-2-антиплазміном.

4. Вперше показано, що б-2-антиплазмін взаємодіє з фібрин(оген)ом без участі активованого фактора ХІІІ. Інгібітор проявляє високу спорідненість до дезАА- (Кd 69,0 нМ), дезААВВфібрину (Кd 68,6 нМ), D-фрагменту фібриногену (Кd 119,0 нМ), D-димеру фібрину (Кd 65,0 нМ), але не сорбується на Е-фрагменті.

5. Виявлено, що б-2-антиплазмін інгібує активацію Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині та його фрагментах: D-димері та DDE-комплексі та не впливає на активацію проферменту на фрагменті фібриногену Ho 1-DSK.

6. Інгібування б-2-антиплазміном процесу активації пояснюється створенням стеричних перешкод для взаємодії Glu-плазміногену з тканинним активатором або конформаційними змінами в молекулі тканинного активатора плазміногену при взаємодії з б-2-антиплазміном.

7. Розроблено спосіб одержання б-2-антиплазміну з високою інгібіторною активністю без домішок гістидинбагатого білка.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гриненко Т.В., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Макогоненко Є.М. Особливості взаємодії 2-антиплазміну з плазміногеном/плазміном // Укр.біохім.журн. – 2002. – 74, №6. – С.83–90.

2. Задорожна М.Б., Гриненко Т.В., Юсова О.І., Волков Г.Л. Зв’язування б-2-антиплазміну з фібриногеном/фібрином та їхніми фрагментами без участі фактора ХІІІ // Укр.біохім.журн. – 2004. – 76, №5. – С.71–77.

3. Задорожная М.Б., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Использование кринглов 1-3 молекулы плазминогена для разделения гистидин-богатого белка и альфа-2-антиплазмина // Буковинський медичний вісник. – 2005. – 9, № 2. с. 99–100.

4. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Платонова Т.М., Волков Г.Л. інгібування б-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині, DDE-комплексі та D-димері // Укр.біохім.журн. – 2005. – 75, №5. – С.45–51.

5. Пат. UA 53146 C2. Спосіб виділення високоочищеного А2-антиплазміну з плазми крові людини: Пат. UA 53146 C2 Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Волков Г.Л.; Заявл. 22.03.2002; Опубл. 15.01.2003, Бюл.№1.

6. Задорожна М.Б. Багатоцентрова взаємодія 2-антиплазміну з плазміногеном/плазміном // Тез. доп. конференції-конкурсу робіт молодих вчених. – Укр. біохім. журн. – 2002 – 74, № 4. – с. 156.

7. Задорожна М.Б., Гриненко Т.В., Юсова О.І. Дослідження кінетики інгібування 2-антиплазміном плазміну та його похідних // Тез. доп. VIII Українського біохімічного з‘їзду. – Укр. біохім. журн. – 2002. – 74, № 4б (додаток 2). – с. 31.

8. Задорожная М.Б., Юсова Е.И., Гриненко Т.В. Локализация участков связывания 2-плазмина независимых от фактора ХIII на полимерном фибрине // Тез. докл. 7 школы-конференции молодых ученых „Биология – наука ХХІ века”. – Пущино, 2003. – с. 331–332.

9. Задорожна М.Б., Юсова О.І., Гриненко Т.В. Роль 2-антиплазміну в молекулярному механізмі фібринолізу // Тез. доп. Всеукр. конференции молодых ученых „Актуальные проблемы современного естествознания”. – Симферополь, 2003. – с. 38.

10. Grinenko T.V., Volkov G.L., Havriliuk O.S., Yusova O.I., Zadorozhnaya M.B. Triple affinity columns package for one step high purification of the alpha-2-plasmin inhibitor and histidine-rich glycoprotein directly from human plasma // Plasma product biotechnology meeting 2003. – Curacao, 2003. – p. 703.

АНОТАЦІЯ

Задорожна М.Б. Роль -2-антиплазміну на різних етапах фібринолітичного процесу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Київ, 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню регуляторної ролі -2-антиплазміну – основного інгібітору плазміну – на різних етапах фібринолітичного процесу.

Виявлено, що в утворенні комплексу плазміну з -2-антиплазміном приймають участь лізинзв’язувальні ділянки кринглів 1-3, 4, 5 та ділянка серин-протеїназного домену молекули ферменту, відмінної від активного центру. Багатоцентрова взаємодія плазміну з -2-антиплазміном забезпечує специфічність та ефективність дії інгібітора. Результати вивчення кінетики інгібування -2-антиплазміном амідолітичної активності плазміну, міні- та мікро-плазміну показали, що кринглові домени молекули ферменту не є необхідними для процесу інгібування, але контролюють швидкість реакції між плазміном та -2-антиплазміном.

Вперше показано, що -2-антиплазмін взаємодіє з фібрин(оген)ом за відсутності активованого фактора ХІІІ. Ділянки зв’язування розташовані в D-доменах молекули фібрин(оген)у в зоні D-D-контакту.

Встановлено інгібуючий вплив -2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині і, як наслідок, на лізис фібринових згустків.

Показано, що -2-антиплазмін утворює комплекс з тканинним активатором плазміногену за участі лізинзв’язувальної ділянки кринглу 2 молекули активатора. Комплексоутворення не супроводжується зміною амідолітичної активності тканинного активатора. Інгібітор не впливає на взаємодію тканинного активатора плазміногену з фібрином.

Запропоновано дві моделі, що пояснюють інгібуючий вплив б-2-антиплазміну на процес активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині.

Розроблено новий спосіб одержання б-2-антиплазміну, що дозволяє в один етап з плазми крові людини, виснаженої на плазміноген, виділити інгібітор без домішок гістидинбагатого білка.

Ключові слова: б-2-антиплазмін, плазміноген, плазмін, фібрин, тканинний активатор плазміногену, процес активації.

АННОТАЦИЯ

Задорожная М.Б. Роль б-2-антиплазмина на различных этапах фибринолитического процесса. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины. Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию регуляторной роли б-2-антиплазмина – основного ингибитора плазмина – на различных этапах фибринолитического процесса.

Установлено, что в образовании комплекса плазмина с б-2-антиплазмином участвуют лизинсвязывающие участки кринглов 1-3, 4, 5 и область в серин-протеиназном домене молекулы фермента. Многоцентровое взаимодействие обеспечивает специфичность и эффективность действия ингибитора. С использованием специфического хромогенного субстрата плазмина S2251 исследована кинетика ингибирования б-2-антиплазмином амидолитической активности плазмина и его функционально активных производных: мини- и микро-плазмина. Полученные результаты свидетельствуют, что крингловые домены молекулы плазмина не являются необходимыми для процесса ингибирования, но контролируют скорость реакции фермента с ингибитором.

Впервые показано, что б-2-антиплазмин без участия активированного фактора ХІІІ взаимодействует с фибрин(оген)ом. Исследование проводилось с использованием принципа иммуно-ферментного анализа и меченных биотином белков. Ингибитор выявляет сродство к фибриногену, дезАА-, дезААВВфибрину, D- и Х-фрагментам фибриногена, D-димеру фибрина, но не связывается с Е-фрагментом.

Изучение влияния б-2-антиплазмина на процесс активации Glu-плазминогена тканевым активатором на фибрине и фрагментах фибрин(оген)а показало, что ингибитор снижает скорость активации на фибрине, DDЕ-комплекске, D-димере и не влияет – на бромциановом фрагменте фибриногена Ho1-DSK. На основании полученных данных и величин констант диссоциации взаимодействия ингибитора с дезААВВфибрином (68,6 нМ), D-фрагментом (119,0 нМ) и D-димером (65,0 нМ) сделан вывод о локализации участков связывания ингибитора в D-домене молекулы фибрина в зоне D-D-контакта.С использованием метода турбидиметрии показано увеличение в присутствии б-2-антиплазмина времени полулизиса фибринового сгустка плазмином, образующимся при активации Glu-плазминогена тканевым активатором.

Показано, что образование комплекса б-2-антиплазмина с тканевым активатором плазминогена опосредовано лизинсвязывающим участком крингла 2 молекулы активатора и не сопровождается блокированием активного центра фермента. Ингибитор незначительно снижает величину связывания тканевого активатора с фибрином.

Таким образом, б-2-антиплазмин, связываясь с фибрином, ингибирует процес активации Glu-плазминогена тканевым активатором и последующий лизис фибринового сгустка.

Эффект б-2-антиплазмина на процесс активации можно объяснить созданием стерических препятствий для взаимодействия профермента и его активатора или конформационными изменениями в молекуле тканевого активатора при образовании его комплекса с б-2-антиплазмином, приводящими к снижению способности активировать плазминоген.

Предложен новый способ выделения б-2-антиплазмина из плазмы крови человека. Использование двух форм кринглов 1-3 молекулы плазминогена позволяет без дополнительных этапов очистки получить высокоактивный ингибитор без примеси близкого по молекулярному весу гистидинбогатого белка.

Ключевые слова: б-2-антиплазмин, плазминоген, плазмин, фибрин, тканевой активатор плазминогена, процесс активации.

SUMMARY

Zadorozhna M.B. Role of б-2-antiplasmin in different stage of fibrinolytic process. – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – Biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2006.

The thesis describes the investigation of the role of б-2-antiplasmin – main inhibitor of plasmin – in different stage of fibrinolysis. Participation of kringles 1-3, 4 and 5 lysine-binding sites and region of serine-proteinase domain different from active site in complex plasmin-б-2-antiplasmin formation was demonstrated. The multisites interaction between plasmin and б-2-antiplasmin provides for the specificity and efficiency of the inhibitor action. Study of inhibition plasmin, mini- and micro-plasmin amidolytic activity by б-2-antiplasmin showed that kringle domains are not necessary for the inhibition, but control the rate of reaction between enzyme and inhibitor.

б-2-antiplasmin interacts with fibrin(ogen) without actived factor XIII. Binding sites of the inhibitor are localized in D-domain molecule fibrin(ogen) in D-D contact zone. It was established that б-2-antiplasmin inhibits of