НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Алексєєва Людмила Іванівна

УДК: 576.324:612.111

ДИНАМІКА ЗМІНИ ЩІЛЬНОСТІ РОЗПОДІЛУ ЕРИТРОЦИТІВ ЗА ІНДЕКСОМ СФЕРИЧНОСТІ В ГІПЕРТОНІЧНИХ РОЗЧИНАХ ХЛОРИДУ НАТРІЮ

03.00.19-кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України.

Науковий керівник:

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Гордієнко Ольга Іванівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Ліннік Тамара Павлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу кріопротекторів, м. Харків

доктор біологічних наук, професор Кнігавко Володимир Гілярієвич, Харківський державний медичний універсітет МОЗ України, завідувач кафедрою біофізики, інформатики та медичної апаратури.

Провідна установа:

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, кафедра фізіології людини та тварин, м. Харків

Захист відбудеться “16” жовтня 2007 р. о “13-30” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розіслано “13” вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення причин і механізмів сенсибілізації або підвищення резистентності клітин до охолодження є одною з центральних проблем кріобіології. Вивчення дії висококонцентрованих розчинів на клітини є складовою частиною цієї проблеми. Вплив гіпертонії в кріобіологічних процесах проявляється в різних аспектах. По перше, як гіпертонічний лізис, тобто лізис клітин, який відбувається безпосередньо в гіпертонічному розчині за ізотермічних умов. По друге, як постгіпертонічний лізис, який виникає при вміщенні клітин в ізотонічне або гіпотонічне середовище після їх експозиції в гіпертонічному розчині. По третє, як гіпертонічний кріогемоліз – при охолодженні клітин після експозиції в гіпер-тонічному розчині (Белоус А.М. и др., 1987). У певних умовах кріоконсер-вування всі ці чинники можуть суттєво вплинути на його результат. У зв’язку з цим дослідження процесів, що відбуваються в клітинах під впливом гіпертонії, є актуальним, як з теоретичної, так і з прикладної точки зору.

Суттєву роль у розвитку кріопошкоджень під впливом різних чинників, зокрема і гіпертонії, відіграє тривалість їх впливу на клітини. Ще в ранніх кріобіологічних роботах було показано, що ступінь пошкодження клітин зростає зі збільшенням тривалості їх контакту з гіпертонічним розчином електролітів (Lovelock J.E., 1953). Існування залежності рівня пошкодження клітин від тривалості впливу на них різних несприятливих чинників і наявність зв’язку між ступенем пошкодження клітини і характерним часом проникання молекул води і розчинених речовин крізь клітинні мембрани є підґрунтям двохфакторної теорії кріопошкодження (Mazur P., 1970, Mazur P. Et al., 1979). Рівень гіпертонічного кріогемолізу пов’язаний з часом попередньої експозиції еритроцитів у гіпертонічному середовищі (Шпако-ва Н.М., Бондаренко В.А., 1992, Коваленко С.Е., 1999). Наприклад, показана можливість (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994) здійснення латерального перерозподілу мембранних компонентів за деформації плазматичних мембран в процесі зневоднення клітин гіпертонічним середовищем. Вказаний ефект залежить від часу контакту клітин з гіпертонічним середовищем, оскільки перерозподіл мембранних компонентів під впливом деформації відбувається за порівняно великий проміжок часу (близько 10 хвилин). Температура гіпертонічного середовища і час експозиції клітин в ньому взаємно впливають на результат гіпертонічного кріогемолізу. Розбіжності між даними різних авторів, що вказують різну тривалість ізотермічної експозиції, при якій спостерігається максимальна чутливість до наступного охолодження або зменшення цієї чутливості, обумовлені, скоріше за все, різними значеннями температури гіпертонічного розчину, в якому клітини знаходились впродовж попередньої експозиції.

Численні чинники кріопошкодження приводять до зміни форми еритроцитів. Одним з основних механізмів пошкодження еритроцитів є колоїдно-осмотичний гемоліз, тобто процес, при якому первісне порушення іонного балансу приводить до набрякання клітин і розриву їх мембран. Таким чином, колоїдно-осмотичний гемоліз безпосередньо пов’язаний зі зміною форми еритроцита (Белоус А.М. и др., 1989).

Геометричні параметри еритроцитів мають важливе фізіологічне значення. Це обумовлено в першу чергу тим, що для здійснення їх основної функції (доставки кисню в органи та тканини) еритроцити мають проходити крізь вузькі капіляри в циркуляційному руслі. Здатність еритроцитів суттєво деформуватись без пошкодження мембран тісно пов’язана з їх специфічною формою. Відомо, що еритроцити в популяції характеризуються розкидом різних параметрів, в тому числі і геометричних (Леонова В.Г., 1987). Неоднорідність популяції еритроцитів обумовлена не тільки випадковими причинами – вона є суттєвою динамічною характеристикою стану системи крові в цілому. Важливу інформацію містить саме її неоднорідність і розподіл клітин по їх властивостям. Визначення геометричних параметрів еритроцитів само по собі є дуже важкою експериментальною задачею. Встановити ж загальну картину розподілу геометричних параметрів в популяції клітин ще важче через необхідність здійснення вимірювань на великій кількості клітин. Тому розробка нових, більш простих і економічних підходів до розв’язання цієї задачі є надзвичайно актуальною і корисною для вивчення стану популяції еритроцитів до і після впливу чинників кріоконсервування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана за плановою темою Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України “Експериментальне вивчення і кількісне моделювання процесів, що відбуваються в мембранах клітин при кріоконсервуванні біологічних об’єктів”, затвердженої Бюро ВМББЕіКФ Президії НАН України від 30.01.2001 г. (2001-2005 рр.), № держреєстрації 0100U003479.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначення розподілу клітин за індексом сферичності в популяціях еритроцитів людини в нормі, при ендокринній патології, впливі хлорпромазину і гіпертонічних розчинів хлориду натрію.

Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження. Популяції еритроцитів крові людини в нормі, при ендокринній патології, під впливом гіпертонічних розчинів хлориду натрію і хлорпромазину.

Предмет дослідження. Щільність розподілу еритроцитів крові дорослих донорів та пуповинної крові за індексом сферичності, перевірка адекватності розробленого методу визначення розподілу еритроцитів за індексом сферичності, проникність мембран еритроцитів для іонів калію.

Методи дослідження. Щільність розподілу еритроцитів в популяції визначали за алгоритмом, розробленим на підставі фізико-математичної моделі гемолізу в гіпотонічних розчинах не проникаючої в клітину речовини.

Експериментальні криві осмотичної крихкості еритроцитів отримували шляхом реєстрації частки клітин, що збереглися, в низці гіпотонічних розчинів методом малокутового розсіяння світла.

Концентрацію калію у позаклітинному середовищі реєстрували потенціометричним методом за допомогою високоспецифічного калієвого електрода.

Форму клітин контролювали за допомогою світлового мікроскопа МБІ_У, оснащеного фотоприставкою для фотографічної реєстрації досліджуваних зразків.

Наукова новизна отриманих результатів. Розробленим на підставі фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу оригінальним методом (Гордієнко Є.О. та ін., 2002) отримані щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності в популяціях донорської та пуповинної крові. Досліджена часова залежність впливу гіпертонічних концентрацій хлориду натрію на еритроцити людини. Показано, що стан популяції еритроцитів людини після гіпертонічного впливу складним чином залежить від часу впливу. Різке зменшення частки клітин з малим індексом сферичності при поверненні їх в ізотонічне середовище після перших 30-90 секунд експозиції в помірно гіпертонічному середовищі (0,4 М NaCl) корелює з підвищенням резистентності як до наступного гіпертонічного кріогемолізу, так і до гіпертонічного лізису. Показано, що часові характеристики зміни чутливості еритроцитів до наступних впливів, а також характерні часи, при яких спостерігається зростання частки клітин з малим індексом сферичності співпадає з часом латерального перерозподілу мембранних компонентів в деформованій плазматичній мембрані.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблений оригінальний метод визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності може бути використаний в кріобіологічних дослідженнях для оцінки впливу різних кріопошкоджуючих та кріозахисних чинників на популяцію еритроцитів. Метод дозволяє отримати не тільки середнє значення індексу сферичності клітин в досліджуваній популяції, але і весь спектр розподілу цієї характеристики в ній. Розподіл еритроцитів за індексом сферичності може слугувати інформативним тестом при підборі зразків крові для кріоконсервування і дозволить завчасно вибраковувати непридатні для низькотемпературного консервування зразки, забезпечуючи суттєвий економічний ефект.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено огляд літератури за темою дисертаційної роботи, отримано експериментальні ре-зультати, проведено їх статистичну обробку і аналіз. Разом з науковим керів-ником інтерпретовано результати і сформульовано висновки. В опубліко-ваних спільно із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004), ІІ Всеукраїнській конференції “Актуальні питання теоретичної і прикладної фізики і біофізики” (Севастополь, 2006), ХХІІ науковій конференції країн СНД “Дисперсні системи” (Одеса, 2006), IV з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, з них 4 статті у фахових наукових виданнях, 1 деклараційний патент України на винахід, 5 тез доповідей на наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 142 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, 4 розділів, підсумку, висновків і списку використаної літератури, що включає 139 джерел (на 13 стор.). Робота містить 66 рисунків та 4 таблиці .

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проведені на еритроцитах крові дорослих здорових донорів і людей з ендокринною патологією (гіпо- та гіпертиреоз), яку отримували на Харківській обласній станції переливання крові і в клініці при Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данилевського АМНУ, а також на еритроцитах пуповинної крові людини, яку одержували у пологових відділеннях Харківських клінік. Як консервант в усіх випадках використовували консервуючий розчин “Глюгіцир”.

Щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності. Основні експериментальні результати були отримані методом малокутового розсіювання світла суспензією еритроцитів. У вимірювальну кювету приладу, що містить 3 мл розчину хлориду натрію з концентрацією в діапазоні від 0,15 до 0,05 моль/л , додавали відповідну кількість (однакову в кожній серії) еритроцитів. За даними малокутового розсіювання та калібрувальною кривою визначали відсоток збережених клітин в гіпотонічних розчинах непроникаючої речовини (NaCl) і отримували криві осмотичної крихкості. Криві розподілу еритроцитів за індексом сферичності визначали з експериментальних кривих осмотичної крихкості на підставі фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу в розчині непроникаючої речовини (Гордієнко Є.О. та ін., 2000). Індексом сферичності еритроцита P називається відношення максимально можливого при заданій площі S0 об’єму клітини Vm до реального значення її об’єму V0: Р==.

Для того, щоб клітина з початковим індексом сферичності Р0 стала сферичною в гіпотонічному розчині і гемолізувала необхідно, щоб значення осмотичного тиску позаклітинного розчину задовольняло нерівності Р0<б+ (б – об’ємна частка осмотично неактивних речовин в еритроциті). Таким чином, визначаючи кількість клітин, які гемолізували при осмотичному тиску позаклітинного розчину , ми тим самим визначаємо кількість клітин, вихідний індекс сферичності яких був меншим вказаного значення. Тобто отримуємо функцію розподілу еритроцитів у вихідній суспензії за індексом сферичності =np(Рx). Шукана щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності визначається диференціюванням останньої за х.

Визначення концентрації іонів калію в позаклітинному середовищі. Для вимірювання концентрації іонів калію в позаклітинному середовищі безпосередньо в клітинній суспензії використовували високоспецифічний калієвий електрод, виготовлений на основі пластифікованої мембрани, що містить валіноміцин. Електрод калібрували в серії розчинів хлориду калію з концентраціями від 5 до 20 мМ на фізіологічному розчині. Калібрування здійснювали безпосередньо перед вимірюванням та повторювали після експерименту.

Визначення потоку витоку калію і коефіцієнтів пасивної проникності еритроцитів для іонів калію в гіпертонічних середовищах. Потік іонів калію розраховуємо виходячи з виразу (Nkout - чис-ло молей калію в позаклітинному середовищі, N – число еритроцитів у зраз-ку. В той же час (nkout – концентрація калію в поза-клітинному середовищі, Vс - об’єм суспензії, V0 – початковий об’єм клітини)

Отже, враховуючи, що NV(0)/Vc=H – гематокрит суспензії еритроцитів, V(0)/V0=y - відносний об’єм клітини, .

Потік калію з клітини є . Враховуючи, що об’єм еритроцита V090·10-12 см3, площа поверхні еритроцита S140·10-8 см2, nkin(0)=0,15Моль/л=0,15·10-3 Моль/см3 і гематокрит в наших експериментах Н=0,1, отримуємо вираз для визначення коефіцієнта пасивної проникності еритроцитів для іонів калію

.

Візуальний контроль форми еритроцитів. Форму еритроцитів контролювали за допомогою світлового мікроскопа МБІ-15У, оснащеного фотоприставкою для фотографічної реєстрації досліджуваних зразків. Реакцію клітин на введення амфіфільної речовини оцінювали у мікрозразку краплі крові, яку вміщували між двома покривними скельцями у вигляді рівномірно розподіленого тонкого шару. При цьому еритроцити знаходились у зваженому стані, що дозволяло спостерігати форму клітин за їх різної орієнтації у зразку. Для морфологічної оцінки особливостей форми еритроцитів застосовували загальноприйняту класифікацію (M. Bessis , 1973)

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Експериментальне визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності в популяціях крові людини. Для оцінки можливостей розробленого метода було досліджено розподіл еритроцитів за індексом сферичності в популяціях крові здорових дорослих донорів, хворих з ендокринною патологією та пуповинної крові людини.

Показано, що розподіл еритроцитів в популяціях здорових дорослих донорів за індексом сферичності має вигляд, близький до гаусового і характеризується гладким перебігом кривої з одним максимумом (рис.1).

Рис. 1. Щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності в популяціях здорових дорослих донорів (усереднена крива)

Максимальну питому вагу мають клітини з індексом сферичності в інтервалі від 1.38 до 1.58. Одержані чисельні значення індексів сферичності центрів розподілів відповідають відомим з літератури величинам об'єму та площі поверхні мембран еритроцитів.

Виявлено, що характерною рисою розподілу еритроцитів за індексом сферичності для груп хворих з ендокринною патологією є бі- та тримодальний вигляд кривих, як при гіпер-, так і при гіпотиреозі. У випадку гіпертиреозу серед клітин з нестандартним індексом сферичності більшу питому вагу (біля 25%) мають клітини з меншим індексом сферичності в діапазоні 1,07-1,22, і тільки 10% клітин мали індекс сферичності в діапазоні 1,73-1,9 (рис.2).

У випадку гіпотиреозу криві частіше мають тримодальний вигляд (рис.3) з більшою питомою вагою (біля 30%) сплощених клітин в діапазоні індексів сферичності 1,65-2,46, ніж близьких до сферичних (біля 3%) в діапазоні 1,015-1,3. До того ж індекс сферичності сплощених клітин значно перевищує індекс сферичності молодих дискоїдних клітин в контрольних зразках (рис.1), в яких дуже незначний відсоток клітин перевищував значення 1,9.

Рис.2. Щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності у хворих на гіпертиреоз

Індивідуальні криві розподілу еритроцитів пуповинної крові за індек-сом сферичності мають, як правило, полімодальний характер і є сумою нор-мальних розподілів кількох субпопуляцій. Значну питому вагу мають еритро-цити, близькі до сферичних (з індексом сферичності 1.05-1.25): від 11.5% до 18%, порівняно з 4% в середньому для здорових дорослих донорів. В той же час відсоток сплощених клітин з індексом сферичності в діапазоні 1.6-2.3 (~14%) також значно перевищує такий для здорових дорослих донорів (~8%).

Рис. 3. Щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності у хворих на гіпотиреоз

Вплив хлорпромазину на розподіл еритроцитів донорської крові людини за індексом сферичності. Для спрямованої зміни форми ерит-роцитів з метою оцінки адекватності та чутливості розробленого методу виз-начення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності викорис-товували катіонну амфіфільну речовину – хлорпромазин. Максимальною концентрацією хлорпромазину при заданому гематокриті 30% , при якій біль-шість клітин у суспензії перетворювались у сфероцити або сферостомато-цити, однак гемоліз ще був відсутній, виявилася концентрація 1 мМ. Міні-мальна досліджувана концентрація ХП, при якій форма еритроцитів помітно не змінювалася, була 0,125 мМ. Проміжні форми еритроцитів і щільності їх розподілу за індексом сферичності досліджували також при концентраціях ХП 0,25, 0,5 і 0,75 мМ.

Рис. 4. Щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності в нативному стані (1) і після додавання в суспензію хлорпромазину в концентрації 0,125 мМ (2) і 0,25 мМ (3)

Візуальний контроль форми еритроцитів за допомогою світлового мікроскопа показав, що при концентрації ХП 0,125 мМ форма основної маси еритроцитів практично не змінюється, однак спостерігаються поодинокі еритроцити з однією згладженою лункою – початкова стадія переходу до форми стоматоцита, а також поодинокі стоматоцити-I. При збільшенні концентрації ХП до 0,25 мМ кількість стоматоцитів-I збільшується і з'являються стоматоцити-II. Зміна складу популяції відбивається на щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності. На рис.4 представлені щільності розподілу еритроцитів у контролі і при введенні низьких концентрацій ХП.

Еритроцити різних донорів неоднаково реагували на додавання малих концентрацій хлорпромазину в суспензію. Так, у випадку донора, представленого на рис.4а, спостерігається зсув кривої щільності розподілу в цілому в сторону збільшення індексу сферичності (сплощення клітин) при додаванні 0,125 мМ хлорпромазину і зворотний зсув кривої при збільшенні концентрації хлорпромазину до 0,25 мМ. Додатковий максимум в інтервалі малих індексів сферичності на кривих іншого донора (рис. 4б) переміщується в сторону збільшення індексів сферичності при додаванні як 0,125 мМ, так 0,25 мМ хлорпромазину. При цьому зсув збільшується зі збільшенням концентрації амфіфілу. Проте, можна стверджувати, що вбудовування амфіфільних молекул у мембрани еритроцитів у концентраціях, набагато менших за літичні, приводить, як правило, до сплощення частини клітин, тобто до збільшення їхньої площі поверхні.

При збільшенні концентрації хлорпромазину в середовищі до 0,5-1,0 мМ реакція клітин стає односпрямованою. За даними мікроскопії популяції складаються зі стоматоцитів-II,Ш, сферостоматоцитів і сфероцитів. При концентрації 0,5 мМ 43% клітин мають індекс сферичності, близький до одиниці (1,0-1,07) – сфероцити і сферостоматоцити. Відсоток таких клітин росте зі збільшенням концентрації хлорпромазину і при концентрації 0,75 мМ складає 82%, а за максимальної сублітичної концентрації 1,0 мМ уже 97% клітин є сфероцитами. Отримані криві щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності (рис.5) і розраховані по них частки клітин у різних інтервалах індексів сферичності добре узгоджуються з мікроскопічною картиною відповідних популяцій.

Таким чином, проведене дослідження показало, що криві щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності адекватно відображають склад популяції еритроцитів за поверхнево-об’ємним відношенням. Вбудовування молекул ХП в мембрани еритроцитів приводить спочатку до сплощення деякої частки клітин, тобто до збільшення площі їх поверхні. Той факт, що сплощуються саме більш сферифіковані клітини в популяції, вказує на можливість збільшення резистентності популяції еритроцитів в цілому до гіпотонічного гемолізу за рахунок цього ефекту.

Рис. 5. Щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності при введенні в суспензію хлорпромазину в кінцевій концентрації 0,5 мМ (1), 0,75 мМ (2) и 1,0 мМ (3)

Вплив часу експозиції еритроцитів в гіпертонічних розчинах хлориду натрію на щільність їх розподілу за індексом сферичності і витік калію. Вплив гіпертонії на клітини проявляється в кріобіологічних процесах у різних аспектах: гіпертонічний лізис (лізис клітин безпосередньо в гіпертонічному розчині в ізотермічних умовах), постгіпертонічний лізис (при вміщенні клітин у ізотонічне чи гіпотонічне середовище після експозиції в гіпертонічному розчині) і гіпертонічний кріогемоліз (при охолодженні клітин після експозиції в гіпертонічному розчині). У певних умовах ці чинники можуть істотно вплинути на результат кріоконсервування. Тому дослідження процесів, що відбуваються в клітинах під впливом гіпертонії, залишається актуальним як для теоретичної, так і для прикладної кріобіології. Аналіз літератури показує, що як явище постгіпертонічного лізису, так і гіпертонічний кріогемоліз проявляють часові особливості і характеризуються максимальною виразністю за часів експозиції 5-10 хвилин. Показано, що експозиція еритроцитів в помірно гіпертонічних розчинах (0,4-0,45 М NaCl) приводить до підвищення їх стійкості до гіпертонічного лізису (в 3-4 М розчинах NaCl) та гіпертонічного кріогемолізу. Проте, при дослідженні цього феномену було приділено недостатньо уваги дослідженню часової залежності цього явища. В нашій роботі був досліджений вплив часу експозиції еритроцитів людини в гіпертонічних розчинах хлористого натрію (0,4; 0,8; 1,2; 2,0 моль/л) від 30 секунд до 30 хвилин на щільність їх розподілу за індексом сферичності в популяції і на витік іонів калію з клітин.

Дослідження пасивного витоку іонів калію з еритроцитів, вміщених у гіпертонічний розчин, показало, що у 0,4 М розчині хлориду натрію концентрація іонів калію в позаклітинному середовищі практично не змінюється після 30-хвилинної експозиції, складаючи 0,075 мМ. Це відповідає при використовуваному в експерименті гематокриті 10% виходу 0,5% внутрішньоклітинного калію. При вміщенні еритроцитів у 0,8 М розчин хлористого натрію їх проникність для іонів калію збільшується більш, ніж у 4 рази. Вміст позаклітинного калію при витримці в цьому розчині стає помітним вже в перші десять хвилин експозиції. Через 30 хвилин експозиції з клітин виходить близько 17% внутрішньоклітинного калію. Подальше збільшення концентрації хлористого натрію в позаклітинному середовищі приводить до істотного росту проникності для іонів калію: у 30 разів у 1,2 М і більш ніж у 300 разів у 2 М розчині хлористого натрію. Витік калію стає суттєвим чинником, що визначає стан еритроцитів у таких середовищах уже на перших хвилинах експозиції. Криві росту концентрації позаклітинного калію виходять на насичення вже до 30-ї хвилини в 1,2 М і до 10-ї хвилини в 2 М розчині хлористого натрію. Рівень позаклітинного калію при цьому відповідає виходу 34% внутрішньоклітинного калію в 1,2 М та 70% внутрішньоклітинного калію в 2 М розчині хлористого натрію (рис.6).

Рис. 6. Витік калію з еритроцитів (в % від внутрішньоклітинного) при експозиції еритроцитів в гіпертонічних розчинах хлориду натрію.

Експозиція в помірно гіпертонічних розчинах, яка не викликає значного витоку іонів калію з клітин, не приводить до зсуву максимуму розподілу еритроцитів за індексом сферичності у фізіологічному розчині після експозиції в гіпертонічних розчинах хлористого натрію. Проте, форма кривих щільності розподілу змінюється в залежності від часу експозиції клітин у гіпертонічних розчинах, особливо в області малих індексів сферичності (рис. 7, 8). Вже в перші 30-60 секунд експозиції істотно зменшується кількість клітин у діапазоні індексів сферичності 1,0-1,3 (рис. ). Суттєві зміни кривих щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності спостерігаються також при збільшенні тривалості експозиції до 3-10 хвилин. За цих часів експозиції в області малих індексів сферичності (1,0-1,3) з'являються додаткові максимуми щільності розподілу, тобто збільшується число клітин з меншими індексами сферичності (рис.8). При подальшому збільшенні часу експозиції до 20-30 хвилин щільність клітин у цьому інтервалі індексів сферичності знову зменшується і стабілізується на деякому визначеному для кожного донора рівні.

Рис. 7. Залежність частки еритроцитів (%) в діапазоні індексів сферичності 1,0-1,3 від часу попередньої експозиції в гіпертонічних розчинах хлориду натрію.

Аналогічна залежність частки клітин у діапазоні індексів сферичності 1,0-1,3 від часу експозиції спостерігається після витримки в 0,8 М розчині хлористого натрію (рис. 7). Максимуми в цьому випадку є меншими за абсолютною величиною, але відповідають тим же часам експозиції (3-10 хвилин). Як і у випадку експозиції в 0,4 М розчині NaCl, на кривих щільності розподілу за індексом сферичності з'являються додаткові максимуми за часів експозиції 3-10 хвилин, що зникають при 20-хвилинній експозиції.

Рис. 8. Щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності після експозиції в 0,4 М розчині хлориду натрію.

Збільшення концентрації хлористого натрію в середовищі експозиції до 1,2 М приводить до якісно інших результатів. Хоча на кривих залежності частки клітин у діапазоні індексів сферичності 1,0-1,3 від часу експозиції все ще спостерігаються особливості за часів експозиції 3-10 хвилин, подальше збільшення часу експозиції в цьому розчині приводить до істотного росту щільності клітин в області малих індексів сферичності (рис. 7). Додаткові максимуми, які з'являються в області малих індексів сферичності, вже не зникають при збільшенні часу експозиції до 30 хвилин.

Експозиція еритроцитів у 2 М розчині хлористого натрію, що викликає значний витік калію з клітин, приводить також і до швидкого росту частки сферичних клітин при наступному вміщенні їх у ізотонічне середовище. Уже через 30 секунд експозиції щільність розподілу клітин за індексом сферичності істотно відрізняється від контрольного (рис. 9). Частка клітин у діапазоні індексів сферичності 1,0-1,3 складає велику частину популяції еритроцитів: 58% через 30 секунд і 70% через 90 секунд експозиції. При збільшенні часу експозиції частка сферичних клітин (Р=1) росте і досягає 90% уже при 10-хвилинній експозиції (рис. 10).

Рис. 9. Щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності у нативній популяції та після 30-секундної експозиції в 2 М розчині хлориду натрію.

Рис. 10. Залежність частки сферичних еритроцитів від часу попередньої експозиції в 2 М розчині хлориду натрію.

Таким чином, дослідження впливу гіпертонії на розподіл еритроцитів за індексом сферичності показало, що стан популяції еритроцитів після гіпертонічного впливу залежить як від ступеня гіпертонії, так і складним чином від часу впливу. Звертає на себе увагу різке зменшення кількості клітин з малим індексом сферичності після перших 30-90 секунд експозиції в 0,4 і 0,8 М NaCl (рис. 7, 8).

У зв'язку з високою проникністю мембран еритроцитів для води одним з основних чинників, що впливають на них у перші секунди експозиції в гіпертонічному середовищі, є зневоднювання клітин і пов'язана з цим деформація клітинної мембрани, а також підвищення іонної сили як позаклітинного, так і внутрішньоклітинного середовища. Відомо, що важливу роль у підтримці форми еритроцитів грає білковий каркас, розташований на цитоплазматичній поверхні їх мембран. У літературі є численні дані про взаємозв'язок форми еритроцитів і взаємодію цитоскелета з мембраною за допомогою контактів цитоскелета з білком смуги 3 через анкирин (білок 2.1) і білок 4.1. Існують також більш слабкі взаємодії між спектрином і фосфоліпідами мембрани, що стабілізують ліпідний бішар і підтримують його асиметрію. Припускають, що збільшення резистентності еритроцитів до ГЛ (у 4 М NaCl) після нетривалої (до 2 хвилин) попередньої інкубації в розчинах хлористого натрію з концентрацією 0,4-0,45 моль/л пов'язано зі змінами взаємодії цитоскелета з мембраною. Проведені численні дослідження з впливу різних речовин, що модифікують взаємодію цитоскелета з мембраною, на гіпертонічну і холодову чутливість еритроцитів показали обґрунтованість такого пояснення. Таким чином, різке зменшення частки клітин з малим індексом сферичності при поверненні їх у ізотонічне середовище після перших 30-90 секунд експозиції в 0,4 М NaCl, отримане в нашому експерименті, корелює як з підвищенням резистентності до наступного гіпертонічного лізису, так і до гіпертонічного кріогемолізу.

Часові характеристики підвищення чутливості клітин до наступних критичних впливів (3-10 хвилин інкубації), а також характерні часи, при яких спостерігається ріст частки клітин з малим індексом сферичності, після інкубації в гіпертонічних розчинах відповідають часовим характеристикам явища перерозподілу мембранних компонентів у деформованій плазматичній мембрані.

Очевидно, що збільшення частки еритроцитів з малим індексом сферичності при експозиції в 0,4 і 0,8 М розчині хлористого натрію в часовому інтервалі 3-10 хвилин не пов'язано з витоком калію з клітин. У 0,4 М NaCl витік калію практично не спостерігається аж до 30-ї хвилини експозиції. При експозиції ж у 0,8 М NaCl, хоча витік калію стає помітним, він є постійним в перші 30 хвилин експозиції і міг би привести тільки до монотонного росту кількості клітин з малим індексом сферичності. Результати ж, отримані методом визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності, свідчать про особливості стану клітин при експозиції 3-10 хвилин, що зникають при подальшому збільшенні часу експозиції до 20-30 хвилин у 0,4 М та 0,8 М NaCl. При експозиції еритроцитів у 1,2 М і, особливо, в 2,0 М розчині хлористого натрію суттєвий витік внутрішньоклітинного калію стає основним чинником, що впливає на розподіл еритроцитів за індексом сферичності при наступному вміщенні їх у ізотонічне середовище.

ВИСНОВКИ

Наразі механізми пошкодження еритроцитів при їх охолодженні і заморожуванні, пов’язані з прямою і опосередкованою дією на них гіпертонічного середовища, остаточно не з’ясовані, що пов’язано , зокрема, з відсутністю чутливих, інформативних тестів щодо впливу фізичних і хімічних зовнішніх чинників на стан гетерогенної популяції клітин. Отже, з’ясування цих механізмів і розробка нових методів оцінки стану популяції клітин залишаються актуальними.

1. Розподіл клітин за індексом сферичності в популяціях еритроцитів крові здорових дорослих донорів близький до гауссового з максимумом при значеннях індексу сферичності 1,48, тоді як розподіл популяції еритроцитів в пуповинній крові є полімодальним: спостерігається суттєве збільшення питомої ваги клітин з малим індексом сферичності (11-18%) та клітин з великим індексом сферичності (14%) у порівнянні з часткою таких клітин у дорослих донорів (4% и 8% відповідно)

2. При гіпертиреозі суттєво зростає частка клітин с аномально малим індексом сферичності (1.07-1,22) - 25%, тоді як при гіпотиреозі 30% клітин мають підвищене в порівнянні з нормою значення індексу сферичності (1,65-2,46).

3. Додавання хлорпромазину в антигемолітичних концентраціях приводить до сплощення деякої частки клітин за рахунок збільшення їх площі поверхні, що є передумовою збільшення стійкості еритроцитів до постгіпертонічного лізису.

4. При експозиції еритроцитів в гіпертонічних середовищах стан еритроцитів змінюється в залежності від часу експозиції і ступеня гіпертонічності середовища, а саме в середовищах з помірною гіпертонією (0,4М и 0,8М NaCl) в перші 30-90 секунд експозиції зменшується кількість клітин в діапазоні малих індексів сферичності (Р=1,0-1,3), при збільшенні тривалості експозиції до 3-10 хвилин число клітин з малим індексом сферичності збільшується, що є причиною збільшення чутливості клітин до наступного охолодження.

5. Збільшення частки еритроцитів з малим індексом сферичності при експозиції в 0,4М і 0,8М розчинах хлориду натрію в часовому інтервалі 3-10 хвилин не пов’язано з витоком іонів калію з клітин, а при експозиції в 1,2М і 2М розчинах хлориду натрію суттєвий витік внутрішньоклітинного калію стає основним чинником, який впливає на розподіл еритроцитів за індексом сферичності при наступному їх вміщенні в ізотонічне середовище.

6. Розроблений метод визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності є адекватним методом для оцінки стану популяції еритроцитів людини.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гордієнко О.І., Македонська В.О., Коваленко І.Ф., Алексєєва Л.І. Щільність імовірності розподілу клітин за індексом сферичності в популяціях еритроцитів хворих на гіпо- та гіпертиреоз // Вісн. Харк. ун-ту.- 2001.- Вип. 528.- С. 67-70.

2. Гордієнко О.І., Гордієнко Є.О., Алексєєва Л.І., Коваленко І.Ф. Оцінка стану популяції еритроцитів людини по їх розподілу за індексом сферичності // Доповіді НАНУ.- 2002.- №10.- С. 172-177.

3. Алексєєва Л.І., Коваленко С.Є., Холодний В.С., Гордієнко О.І. Витік калію і щільність розподілу за індексом сферичності в популяціях еритроцитів при експозиції в гіпертонічних розчинах хлориду натрію // Пробл. криобиол.- 2005.- №2.- С. 159-172.

4. Коваленко С.Є., Алексєєва Л.І., Кулєшова Л.Г., Коваленко І.Ф., Холодний В.С., Гордієнко Є.О., Гордієнко О.І. Можливі механізми антигемолітичної дії хлорпромазину // Пробл. криобиол.- 2006.- Т. 16, №2.-С. 137-146.

5. Гордієнко О.І., Кулєшова Л.Г, Коваленко С.Є., Алексєєва Л.І., Міщенко А.Г. Метод визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності // Тези допов. I Укр.наук.конф. “Проблеми біологічної і медичної фізики”.- Харків, 2004.- С.101.

6. Алексеева Л.И., Македонская В.А., Гордиенко О.И. Плотность распределения эритроцитов по индексу сферичности у больных гипо- и гипертиреозом // Тез. докл. II Всеукр. конф. “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики”.- Севастополь, 2006.-С. 95-97.

7. Алексеева Л.И., Коваленко С.Е., Гордиенко О.И. Возможные механизмы антигемолитического действия хлорпромазина // Тез.докл. II Всеукр. конф. “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики”.– Севастополь, 2006.– С. 98-100.

8. Алексєєва Л.І., Коваленко С.Є., Македонська В.О., Гордієнко О.І. Розподіл еритроцитів за індексом сферичності як діагностична характеристика стану червоної крові людини // Тезисы докл. ХХІІ научн. конф. стран СНГ “Дисперсные системы”.– Одесса, 2006.- C. 28-31.

9. Алексєєва Л.В., Коваленко С.Є., Гордієнко О.І., Гордієнко Є.О. Вплив часу експозиції в гіпертонічних розчинах хлориду натрію на стан еритроцитів людини//Тези доповідей ІУ з’їзду Українського біофізичного товариства, Донецьк, 2006, С.34-35.

10. Пат. 47910А (Україна) МПК7 G01N33/49. Спосіб визначення щільності ймовірності розподілу еритроцитів за індексом сферичності / Є.О. Гордієнко, О.І. Гордієнко, Ю.Є. Гордієнко, І.Ф. Коваленко, Л.І. Алексєєва. Заявлено Надрук. 2002.- Бюл. №7

АНОТАЦІЇ

Алексєєва Л.І. Динаміка зміни щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності в гіпертонічних розчинах хлориду натрію – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007.

Дисертація присвячена апробації нового оригінального методу визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності та використання його в кріобіологічних дослідженнях. Показано, що характеристика, яку дозволяє отримувати розроблений метод, є чутливим, інформативним показником для кількісної оцінки стану популяції еритроцитів. Одержані чисельні значення індексів сферичності центрів розподілів в популяціях еритроцитів здорових дорослих донорів відповідають відомим з літератури величинам об'єму та площі поверхні цих клітин. При спрямованій зміні форми еритроцитів хлорпромазином криві щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності адекватно відображають склад популяції за поверхнево-об’ємним відношенням. При експозиції еритроцитів в гіпертонічних середовищах стан клітин змінюється в залежності від часу експозиції і ступеня гіпертонічності середовища. В середовищах з помірною гіпертонією (0,4 і 0,8 М NaCl) в перші 30-90 секунд експозиції зменшується кількість клітин в діапазоні малих індексів сферичності (Р=1,0_,3). При збільшенні тривалості експозиції до 3-10 хвилин число клітин з малим індексом сферичності збільшується, що є причиною підвищення чутливості клітин до наступного охолодження. Збільшення частки еритроцитів з малим індексом сферичності при експозиції в 0,4 і 0,8М розчинах хлориду натрію в часовому інтервалі 3-10 хвилин на пов’язано з витоком іонів калію з клітин. При експозиції в 1,2 і 2М розчинах хлориду натрію суттєвий витік внутрішньоклітинного калію стає основним чинником, який впливає на розподіл еритроцитів за індексом сферичності при наступному їх вміщенні в ізотонічне середовище.

Алексеева Л.И. Динамика изменения плотности распределения эритроцитов по индексу сферичности в гипертонических растворах хлорида натрия – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2007.

Диссертация посвящена апробации нового оригинального метода определения плотности распределения эритроцитов по индексу сферичности и использованию его в криобиологических исследованиях для оценки влияния различных криоповреждающих и криозащитных факторов на популяцию эритроцитов. Показано, что получаемая разработанным методом характеристика является чувствительным, информативным показателем для количественной оценки состояния популяции эритроцитов, что позволит заблаговременно выбраковывать непригодные для низкотемпературного консервирования образцы. Полученные численные значения индексов сферичности центров распределения в популяциях эритроцитов здоровых взрослых доноров соответствуют известным из литературы величинам объема и площади поверхности этих клеток. Распределение гетерогенной популяции эритроцитов в пуповинной крови является полимодальным с более широким разбросом определяемого параметра. В нашем исследовании было оценено состояние популяции эритроцитов человека при гипо- и гипертиреозе путем определения плотности распределения эритроцитов в крови больных по индексу сферичности. Исследование состояния популяции эритроцитов у больных с эндокринной патологией показало, что характерной чертой распределения эритроцитов по индексу сферичности был би- и три модальный вид кривых как при гипо-, так и при гипертиреозе. При гипертиреозе существенно возрастает доля