Національна Академія Наук України

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Артеменко Ольга Анатоліївна

УДК 576.36:577.218+577.29

Проліферативна активність клітин кореневої меристеми гороху

(Pisum sativum L.) за умов кліностатування

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України

Науковий керівник: чл.-кор. НАН України,

доктор біологічних наук, професор,

Кордюм Єлизавета Львівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,

завідувач відділу клітинної біології та анатомії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Чугункова Тетяна Володимирівна,

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувач відділу генетичних основ гетерозису

доктор біологічних наук, професор,

Демків Орест Теодорович,

Інституту екології Карпат НАН України,

старший науковий співробітник відділу

екоморфогенезу рослин

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “20” березня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “7” лютого 2007 року

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

Актуальність теми. Вивчення особливостей проліферативного процесу і його регуляції в клітинах рослин становить не тільки теоретичний, але й практичний інтерес для біотехнології, медицини та сільського господарства. На основі експериментальних даних про суттєвий вплив мікрогравітації на клітинний метаболізм сформульоване положення про найбільшу чутливість до зміненої гравітації клітин, які знаходяться в активному фізіологічному стані та поділу [Kordyum E.L., 1997]. Однак питання стосовно клітинних та молекулярно-генетичних механізмів регуляції проліферації мало досліджені. У дослідах з різними видами вищих рослин спостерігаються зміни їх ростової реакції в умовах реальної мікрогравітації в космічному польоті та симульованої мікрогравітації (кліностатування, яке частково відтворює біологічні ефекти мікрогравітації). Відмічено як стимуляцію проліферативної активності, так і її пригнічення, або ж відсутність помітних змін [Kordyum E.L., 1997; Hensel W., 1980; Aarrouf J., 1999; Perbal G., 1987]. Показано збільшення тривалості клітинного циклу у ряду видів вищих рослин під впливом мікрогравітації [Aarrouf J., 1999; Perbal G., 1987; Driss-Ecole D., 1994], хоча S-, G2- та М- фази суттєво не змінюються. Тому, вивчення G1-фази є найбільш важливим для подальшого з’ясування ступеня гравічутливості клітинного циклу. Різнорідність та суперечливість літературних даних щодо впливу мікрогравітації та кліностатування на ріст та проліферацію клітин вказує на необхідність подальших досліджень цього питання. Актуальним також є вивчення молекулярних механізмів регуляції цих процесів, оскільки існуючі дані обмежені тільки результатами по мітотичній активності.

Принциповими регуляторами еукаріотичного клітинного циклу є циклін-залежні кінази та цикліни, які відповідають за основні події просування клітини по циклу. Роль цих білків в подіях клітинного циклу за умов мікрогравітації зовсім не вивчалась. Тому дослідження рівня експресії генів -циклінів, що відповідають за події пресинтетичної фази циклу, необхідне для визначення впливу кліностатування на клітинний цикл.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках фундаментальних науково-дослідних робіт відділу клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України: тема № 312 “Розробка та створення польотного обладнання для підготовки космічних біологічних і біотехнологічних експериментів та проведення наземних досліджень”; Грант Президії НАН України для молодих вчених 2003-2004 рр. „Дослідження гравічутливості рослинних меристем в умовах кліностатування”.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було з’ясування впливу кліностатування на процес проліферації та на експресію ? –циклінів в клітинах кореневої меристеми гороху (Pisum sativum L.). Для досягнення мети було поставлено наступні задачі:

Ё

Ё

Ё

Ё

Об’єкт дослідження – проліферативна активність клітин кореневої меристеми проростків гороху за умов кліностатування.

Предмет дослідження – проліферативний пул і події клітинного циклу в клітинах кореневої меристеми гороху в контролі та за умов повільного горизонтального кліностатування протягом першого клітинного циклу і в стаціонарному циклі.

Методи дослідження – цитологічні, цитофотометричний, цитофлюорометричний, молекулярно-біологічні (гібридизація in situ, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано зміни мітотичної активності в процесі індукції проростання насінин гороху за умов кліностатування. Встановлено декілька особливостей впливу кліностатування на процес індукції проліферації клітин у меристемі кореня гороху, які полягають в затримці процесу деконденсації хроматину протягом перших годин проростання, що свідчить про вплив досліджуваного чинника на вихід клітин меристеми зі стану спокою (G0/G1), та затримці переходу клітин до фази синтезу ДНК та початку мітозів в першому клітинному циклі. Це відбувається за рахунок подовження пресинтетичної фази, про що свідчить накопичення клітин з 2С ДНК. Вперше виявлено, що експресія генів ? - циклінів, яка визначалась за появою їх продуктів протягом першого клітинного циклу, в контролі і за умов кліностатування неоднакова і змінюється від повного виключення до активного збільшення. За умов кліностатування на ранніх стадіях росту кореня гороху показано присутність транскриптів генів ?3-цикліну в ядрах клітин меристеми, що перешкоджає переходу до наступних фаз циклу та вступу до мітозу. У рослин, підданих кліностатуванню, прокльовування насінин та вступ до мітозу відбуваються із затримкою на 3 год порівняно з контролем. Експерименти з меристемами зі стаціонарним мітотичним циклом, через 2 доби проростання, показали, що під впливом зміненої гравітації зазнає модифікації і період підготовки клітин до поділу.

Практичне значення одержаних результатів. Зміни в якісному та кількісному спектрі подій клітинного циклу при моделюванні біологічних ефектів дії мікрогравітації мають практичні наслідки при створенні замкненої автотрофної ланки системи життєзабезпечення в космічних апаратах та формуванні відповідних заходів для нормалізації циркадного ритму біологічних об’єктів, від якого в значній мірі залежить їх онтогенез в несприятливих умовах. Результати будуть використані в подальших дослідницьких роботах щодо вивчення механізмів регуляції клітинного циклу в галузі цитології, клітинної та молекулярної біології, а також по вивченню впливу зміненої гравітації на живі об’єкти.

Отримані дані можуть бути використані при розробці матеріалів лекцій по цитології, клітинній та молекулярній біології в вищих учбових закладах.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто були розроблені завдання досліджень, сплановані та проведені всі експерименти. Особистий внесок здобувача полягає також в обробці та інтерпретації результатів роботи, аналізі літератури, написанні наукових статей. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок та концепцію досліджень, основні ідеї роботи, структуру дисертаційної роботи, проведено вибір об’єктів.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися на засіданнях Вченої Ради Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (Київ, 2001, 2003 та 2006 рр.). Основні положення та результати роботи були оприлюднені на VII молодіжній конференції ботаніків (Санкт-Петербург, Росія, 2000), на XI з'їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001), на молодіжному науково-практичному семінарі з клітинної біології (Київ, 2001), на ІІІ Українській конференції по перспективним космічним дослідженням (Кацивелі, Крим, 2003), на ІV Українській конференції по перспективним космічним дослідженням (Понізовка, Крим, 2004), на 27-му Щорічному симпозіумі з гравітаційної фізіології (Кьольн, Німеччина, 2005), на VІ Українській конференції по космічним дослідженням (Євпаторія, 2006).

Публікації. Результати праці опубліковані у вигляді 5 статей у фахових вітчизняних та зарубіжних журналах, що входять до переліку ВАК України та 5 тез у матеріалах з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків та списку використаної літератури, який містить 150 найменування. Роботу викладено на 122 сторінках, результати наведено у 9 таблицях та 13 рисунках і фотографіях.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Об’єктом дослідження було обрано меристему коренів проростків гороху (Pisum sativum L.), сорт Інтенсивний. Для синхронізації вступу клітин до першого клітинного циклу, насіння гороху відбирали за морфологічними ознаками: розміром, формою та кольором насінин, до замочування і після набубнявіння у воді протягом 40 хвилин. Далі насiння пророщували на вологому фільтрувальному папері при 24+ 10 С у темряві, в стаціонарних умовах (контроль) та на кліностаті - 2 об/хв (дослід). За даними літератури [Гудков И.Н., 1985; Троян, 1998] розмір меристеми кореня до прокльовування коливається від 0,9 до 1,3 мм (майже весь зародковий корінь складається з меристеми), у період від прокльовування до довжини кореня від 1,2 до 1,5 см зона меристеми має середній розмір 1,5 + 0,04 мм від кінчика кореня.

Відомо, що клітини меристеми зародкового кореня гороху в сухому насінні заблоковані в G1-фазі і синхронно вступають в перший мітоз, і тому є зручною моделлю для вивчення G1 фази клітинного циклу. Досліджували клітини меристеми коренів гороху в процесі індукції проростання насінин до прокльовування (24 година проростання) та після прокльовування (30 година проростання), оскільки початок реплікації ДНК в клітинах меристеми кореня гороху через 30 години проростання насінин корелює з часом їх прокльовування, що є морфологічним критерієм початку S-фази [Троян, 1998].

Дослідження мітотичного індексу меристеми кореня проводили цитологічним методом на дводобових проростках гороху. Насіння пророщували 48 годин і відбирали з довжиною кореня від 15 до 20 мм, оскільки саме при такій довжині кореня відбувається пік мітотичної активності. Через кожні 3 години ( через 3, 6, 9 і т.д. годин) відбирали фракції контрольного та кліностатованого варіантів. Фіксацію корінців та фарбування ацетоорсеїном проводили за описаною загальноприйнятою методикою [Паушева, 1974]. Готові препарати проглядали в світловому мікроскопі CARL ZEISS по 1 тисячі клітин у 6-8 меристемах кожного варіанту. Всі досліди виконано у 5 біологічних повторностях. Дані обробляли статистично за допомогою порограми BIO Software, Р<0,05.

Для оцінки конформаційного стану хроматину клітин меристеми через кожні 3-4 год протягом процесу проростання насіння від 20 зародків відділяли зону меристеми, розмір якої до набубнявіння насінини складав 1 мм, а при прокльовуванні – 1,5 мм апікальної частини кореня. Застосовували флуоресцентний барвник акридиновий оранжевий (АО), який при певних умовах флуорохромування взаємодіє з ділянками в молекулі ДНК, незаблокованими білками, тобто вільними для транскрипції РНК-полімеразами. Інтенсивність флюоресценції ядер вимірювали при =530 нм. У кожному варіанті аналізували не менше 70 ядер.

Склад клітинної популяції в зародковій меристемі кореня визначали методом проточної цитофотометрії за інтенсивністю синтезу ДНК [Lee, 1996; Листопад, 2001], що дозволяє визначити відносну тривалість фаз клітинного циклу шляхом прямого виміру вмісту ДНК. Зразки відбирали через 40 хв, 18 год, 21 год, 24 год, 27 та 30 годин в контролі та за умов кліностатування. Готували препарати за описаною методикою [Романенко, 1991, Pagano, 1995]. Вимірювання проводили при =630 нм на лазерному проточному цитометрі FACStar plus фірми Becton Dickinson. У кожному варіанті аналізували в середньому біля 3 тисяч ядер.

Для отримання необхідної кількості зондів проводили трансформацію клітин E.coli плазмідною ДНК [Маниатис, 1984]. Плазміди (pJG8 та pRS1), які містили фрагменти генів ?1- ?3-циклінів були отримані з Інституту Біотехнології Кeмбріджского Університету від проф. Джима Мюррея.

Метод гібридизації in situ для визначення локалізації транскриптів генів циклінів був адаптований для даної рослини. Після встановленого в досліді часу у паростків відрізали корінці і фіксували в ФОС протягом 1,5 години. Заключали матеріал в парафін і отримували зрізи апексів коренів товщиною 7 мкм на мікротомі марки REICHERT. Після депарафінізації проводили гібридизацію з дігоксигенін (ДІГ)-міченими зондами циклінів ?1 та ?3 та детекцію Анти-ДІГ-Антитілами (фірми ROSHE). Гібридизацію, детекцію та фарбування проводили за описаною методикою [Schwarzacher, 1994]. Дослідження проводили у 5 повторностях для кожного варіанту. Результати аналізували за допомогою світлового мікроскопа AXIOSKOP (ZEISS) та задокументовували цифровою та фотокамерами. В якості маркера гібридизації проводили негативний контроль, де стадія детекції антитілами була виключена, решта процедур проводилась аналогічно експериментальному матеріалу.

Для визначення експресії генів ?1- та ?3- циклінів виділяли РНК тризольним методом за методикою виробника TRI REAGENT (Sigma, Німеччина). РТ-ПЛР проводили за стандартною методикою протоколу FERMENTAS (Литва). Вміст РНК та кДНК визначали спектрофотометрично.

ПЛР проводили на ампліфікаторі „Терцик” (Росія) з використанням специфічних праймерів довжиною 18-20 нуклеотидів, сконструйованих з використанням бази даних NCBI та IDT DNA (; ).

Циклін Cycd1

Forward 5’ GAT GCA TCC TGT GAC ACC AC -3’

Reverse 5’ AGC CAA CAC AGA GGG AAC AC -3’

Циклін Cycd3

Forward 5’ GAI AGA IAA GCC ITG GAT G – 3’

Reverse 5’CAC CAI AAG CTC CAT TCT – 3’

Ампліфікацію проводили при наступному режимі:

940С – 30”, 50-540С – 2’, 720C – 30” - 30 циклів; 720С – 5’; 100C – зберігання

Продукти ПЛР реакції візуалізували за допомогою горизонтального гель-електрофорезу в 1,7% агарозі при 45 В/199мА протягом 40 хв.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив гравітації на проліферативну активність вивчали на двох варіантах, відмінних за часовими параметрами: апікальній меристемі кореня дводобових проростків гороху (ростові зони сформовані), та меристемі зародкового кореня в процесі індукції проростання протягом пресинтетичної фази циклу, фази синтезу ДНК та початку мітозів. Перший варіант використовували для дослідження впливу кліностатування на інтенсивність поділу клітин після двох діб проростання насінин в стаціонарних умовах. Другий варіант – для дослідження впливу кліностатування на початок мітотичної активності, а також на тривалість періоду підготовки клітин до мітозу: швидкість виходу зі стану спокою, проходження по G1- і S-фазах, початок і хід мітотичної активності.

Дія кліностатування на мітотичну активність клітин кореневої меристеми дводобових проростків гороху. Метою даної частини роботи було визначення чутливості проліферативної системи рослин на дію кліностатування. Середня тривалість фази мітозу в клітинах меристеми гороху складає 3 години, тому через кожні три години дії повільного горизонтального кліностатування відбирали фракції контрольного та дослідного варіантів. За вихідну точку вважали час початку досліду (48 годин). На час початку досліду МІ у вихідній точці дорівнював 7,9 %. Результати підрахунку мітотичного індексу представлені на рис.1.

В контролі через 3 год з початку досліду мітотичний індекс зменшився у порівнянні з вихідною точкою, тоді як в досліді через 3 години кліностатування відбувається помітне його зменшення. Протягом всього експерименту за умов повільного горизонтального кліностатування спостерігається зменшення мітотичного індексу у порівнянні з контролем.

Динаміка мітотичної активності за умов кліностатування подібна до такої в контролі. Крива мітозів повторює всі піки та зниження контрольного варіанту, але з нижчими показниками. Після 12 годин експерименту, протягом наступних 2-х діб не спостерігається суттєвої різниці в мітотичному індексі контрольного та кліностатного варіантів, що свідчить про стабілізацію подій мітотичного циклу в клітинах кореневої меристеми проростків гороху за умов кліностатування.

Наступним етапом роботи було виявлення впливу кліностатування на кінетику вступу клітин у різні фази мітозу (табл. 1). В контролі кількість клітин в профазі та метафазі протягом всього експерименту зростає плавно, збільшуючись через кожні 3 години. За умов повільного горизонтального кліностатування відмічено дестабілізацію подій мітотичного циклу; через 3 години спостерігається різке зменшення клітин в профазі і метафазі у порівнянні з вихідною точкою та контролем. Найбільш чутливими до дії цього чинника виявилися анафаза та телофаза. Значне зниження кількості клітин майже на всіх фазах мітозу через 3 години після початку кліностатування вказує на чутливість проліферативної системи до відсутності сприйняття гравітаційного стимулу. Як в контрольному, так і в дослідному варіантах на 12 годину після початку кліностатування відмічено значну подібність параметрів розподілу клітин на різних фазах мітозу до параметрів вихідної точки, що вказує на значні адаптаційні можливості проліферативної системи. Хоча загальний рівень проліферації в дослідному варіанті декілька знижений у порівнянні з таким у контролі, через 12 годин експерименту спостерігається стабілізація подій мітотичного циклу, що проявляється у подібності розподілу фаз мітозу і може свідчити про початок адаптаційних процесів, які відбуваються в клітині у відповідь на дію несприятливих чинників

Цитофлуорометричне дослідження розподілу популяції клітин меристеми кореня дводобових проростків гороху. Результати цитофлуорометричного аналізу зв’язування йодистого пропідію ядрами клітин меристем наведено на рис. 2 у вигляді гістограм, що відображають розподіл ядер за інтенсивністю флуоресценції. У меристемах дводобових проростків переважна кількість клітин, майже 75%, зосереджена у вигляді другого піку і має середній рівень флюоресценції біля 400 умовних одиниць (у.о.), що відповідає клітинам з 4С вмістом ДНК. Такий розподіл вказує на перехід до мітозу основної популяції клітин меристеми гороху, що характерне для зрілого насіння багатьох видів рослин. Окрім того, у вигляді першого, меншого піку, присутня популяція клітин з рівнем інтенсивності флюоресценції до 200 у.о., тобто 2С клітин, що свідчить про несинхронність переходу клітин з однієї фази до іншої. Протягом екперименту, до 24 години включно, за умов кліностатування спостерігалося зменшення кількості ядер з 4С вмістом ДНК, а з 27 години і до кінця експерименту навпаки, було помічено її збільшення у порівнянні з контрольним варіантом. Проте, починаючи з 33 години відбуваються зміни в розподілі клітин за вмістом ДНК як в контролі, так і за умов кліностатування. Кількість клітин з 2С та 4С вмістом ДНК стає майже однаковою в обох варіантах, але у порівнянні з контролем кількість клітин з 4С ДНК за умов кліностатування більша. Така асинхронність популяції може свідчити про закінчення періоду високої мітотичної активності перших клітинних циклів і перехід до стаціонарного стану з вмістом клітин у стані спокою та тих, які активно діляться. Після 33 годин експерименту (це майже 4 доби росту проростків) відбувається стабілізація подій клітинного циклу; клітини виходять на так зване „плато”, пов’язане з особливостями метаболізму та росту рослини на цих строках як в контролі, так і за умов кліностатування. Очевидно, підвищення кількості клітин з 4С вмістом ДНК за умов кліностатування необхідне для подальшого синтезу білків клітинного циклу.

Оскільки отримані дані вказують на те, що відбуваються зміни в мітотичній активності, співвідношенні фаз мітозу та в довжині коренів дводобових проростків гороху між контрольним та кліностатним варіантами, подальші дослідження були спрямовані на вивчення динаміки мітотичної активності в процесі індукції першого клітинного циклу.

Вплив кліностатування на процес індукції мітотичної активності. Протягом всього дослідження було виявлено, що в умовах повільного горизонтального кліностатування прокльовування насінин гороху відбувається на 3 години пізніше, ніж в контролі, корінці більш покручені, часто апексом направлені догори. Внаслідок цього в контролі рівень прокльовування насінин через 30 годин проростання досяг 100%, в той час як в досліді лише 71%. Стовідсотковий рівень прокльовування за умов кліностатування спостерігався після 33 години досліду. Після обробки отриманих результатів виявилось, що в досліді початок мітотичної активності в меристемах коренів гороху спостерігається також пізніше, ніж в контролі.

Оскільки прокльовування насінин гороху за даними Троян [1998], корелює із часом початку синтезу ДНК, дослідження перших мітозів ми почали через 10 годин (тривалість S-фази 8 год + G2-фази 2 год), тобто на 40-й годині проростання (рис. 3). Далі спостерігалося хвилеподібне наростання мітотичної активності, що характерне для першого, частково синхронізованого мітотичного циклу систем з індукованою проліферацією. На 46-ій годині росту (через 6 годин після початку дослідження) показано збільшення мітотичної активності, яке досягло піку на 49-ій годині росту. Потім відбувається поступовий спад проліферативної активності до 58 години проростання насінин. Таке зниження активності не тривале, і вже на 61-у годину досліду мітотичний індекс збільшується до максимальної позначки – 13 %. Дослідження проліферації клітин кореневої меристеми гороху на більш пізніх етапах росту, через 72 та 96 годин, в контролі не виявило різких змін в ритмі мітотичного індексу.

Кінетика поділу клітин у дослідному варіанті загалом подібна до контролю. Проте через 40 годин кліностатування мітози в меристемі кореня гороху майже не спостерігалися; однак через 3 год (43 години росту за умов кліностатування) мітотичний індекс вже складав 3,7 %. Надалі відбувається його поступове зростання з піком на 52 годині досліду, і потім зниження протягом 6 годин (до 58 години кліностатування). Подальші дослідження на більш пізніх етапах росту (61, 72 та 96 години) показали, що за умов повільного горизонтального кліностатування в клітинах кореневої меристеми гороху зберігається тенденція до збільшення мітотичної активності у порівнянні з контролем.

В результаті проведених нами досліджень мітотичної активності клітин меристеми коренів гороху на дводобових проростках та в процесі індукції проростання, було показано, що в умовах зміненої сили тяжіння не відбувається різкого блокування мітотичної активності. Проте зберігається тенденція до збільшення мітотичного індексу в контролі та досліді, у порівнянні з вихідною точкою. У порівнянні з контролем МІ кліностатного варіанту у всіх випадках був нижчим. Визначення довжини коренів проростків гороху в умовах даного експерименту показало, що відбувається гальмування їх росту.

Отже, проаналізувавши отримані дані щодо динаміки проліферативної активності клітин кореневої меристеми гороху в умовах кліностатування, можна зробити висновок, що дія цього чинника має місце. Але мітоз – це кінцевий продукт процесів, що відбуваються в клітині протягом попередніх фаз клітинного циклу. Маркерами цих фаз можуть служити біосинтетичні процеси – синтез ДНК, РНК та білків. Для дослідження впливу зміненої сили тяжіння на події клітинного циклу ми вибрали два показники – структурний стан хроматину (фази G0-G1, G1) та синтез ДНК.

Цитофлуорометричне дослідження конформаційного стану хроматину та кінетики першого клітинного циклу при проростанні насіння гороху. Однією з ранніх подій, якій, як свідчать експериментальні дані [Троян, 1998], належить важлива роль в регуляції просування клітин по циклу і переходу до поділу, є зміна структурного стану хроматину, що забезпечує зростання його транскрипційної активності. У зв’язку з наведеним, метою даної роботи було дослідження конформаційного стану хроматину та кінетики першого клітинного циклу в меристемі кореня гороху, а також інтенсивності його росту в умовах кліностатування. У якості показників швидкості проходження клітинами першого мітотичного циклу використовували маркерні події циклу – вступ клітин меристеми у фазу синтезу ДНК та мітоз. На рис. 4 наведено результати дослідження зв’язування АО хроматином клітин меристем протягом перших 21 год проростання. Початкова точка відліку – це значення флюоресценції у меристемі кореня насіння, інкубованого впродовж 40 хв у воді при температурі 00С, коли стає можливим відокремлення зародка насінини від сім’ядолей. Очевидно, що це значення відбиває стан хроматину у сухому насінні, коли клітини знаходяться у спокої. У контрольному варіанті вже через 3 год після індукції проростання при 240С спостерігається підвищення зв’язування АО, що свідчить про деконденсацію хроматину, яке ще більше зростає на 6 год.

Результати цитофлуорометричного аналізу зв’язування йодистого пропідію ядрами клітин меристем наведено на рис. 5 у вигляді гістограм, що відображають розподіл ядер за інтенсивністю флуоресценції. У меристемах зародків насіння на початку проростання переважна кількість клітин, майже 90%, зосереджена у вигляді першого піку і має середній рівень флюоресценції біля 200 умовних одиниць (у.о.), що відповідає клітинам з 2С вмістом ДНК. Такий розподіл вказує на перехід до стану спокою основної популяції клітин меристеми гороху при дозріванні насіння із G1-фази мітотичного циклу, що характерне для зрілого насіння багатьох видів рослин. Окрім того, наявна невелика популяція клітин, біля 8%, з рівнем інтенсивності флюоресценції 380 у.о., тобто 4С клітин. Через 18 год проростання загальний розподіл ядер за кількістю ДНК у контрольному варіанті подібний до такого на початку проростання, але гістограма набуває більш компактного вигляду. Це може бути пояснено відновленням на ранніх етапах проростання структури ДНК, пошкодженої у процесі висихання насіння при дозріванні. В кліностатному варіанті на цю годину розподіл ядер подібний до вихідного варіанту, гістограма має один пік з середнім рівнем флуоресценції біля 200 у.о. і містить 82% клітин. На 21 год проростання на гістограмі контрольного насіння спостерігається розширення правого плеча піку G1 - клітин, що вказує на закінчення пререплікативного періоду першого клітинного циклу і початок синтезу ДНК. У меристемах насіння, що росло за умов кліностатування, цей процес ще не наступив, а розподіл ядер за інтенсивністю флюоресценції подібний до контролю на 18 год. В контролі кількість клітин з 2С вмістом ДНК складає 60%, а кількість клітин з проміжним вмістом 2С-4С ДНК –30%, тоді як за умов кліностатування відповідно 70% та 20% від загальної кількості клітин. Ще через 3 год (24 година проростання) в обох варіантах вигляд гістограм істотно змінюється, їх обрахунок виявив суттєві зміни в розподілі клітин між контрольним та кліностатним варіантами. Зменшення кількості G1-клітин в контролі спостерігається майже до 30%, при цьому значно, до 60%, зростає кількість клітин зі значеннями ДНК, проміжними між 2С і 4С, що відповідає клітинам у S-фазі. За умов кліностатування також спостерігається зменшення клітин в G1-фазі до 40%, та збільшення клітин в S-фазі до 50%. Ще більше виражена ця різниця у меристемах на 27 год проростання, коли популяція G1 – клітин у контролі зменшується до 20%, а за умов кліностатування залишається на рівні 40%. Такі дані свідчать про інтенсивний синхронний синтез ДНК в клітинах меристеми кореня протягом S - фази першого мітотичного циклу. У насінні, що проростало в умовах кліностатування, ця закономірність виражена слабше. Через 30 год експерименту картина розподілу ядер зовсім змінюється, демонструючи наявність гетерогенної популяції клітин з різною кількістю ДНК, у якій переважають значення, більші за 200 у.о., тобто характерні для клітин, що знаходяться в S - та G2 - фазах. В контролі пік накопичення клітин спостерігається біля середнього рівня флуоресценції 400 у.о., що свідчить про перехід основної маси клітин цієї популяції до G2 /М фаз. За умов кліностатування основна маса клітин знаходиться в проміжку рівня флуоресценції між 200 у.о та 400 у.о., що говорить про затримку клітин в S-фазі.

Базуючись на отриманих даних цитофотометрії та цитофлуорометрії, можна зробити висновок, що зміна сили тяжіння діє як фактор, який впливає на ранній процес зміни стану хроматину, і гальмує просування клітин по клітинному циклу. Ці дані пояснюють зменшення мітотичної активності клітин меристеми кореня як в процесі індукції проростання, так і при дії кліностатування на корені дводобових проростків. Зміни структурного стану хроматину, зокрема деконденсація, забезпечують збільшення його транскрипційної активності. Оскільки транскрипція геному здійснюється в G1-фазі дослідження експресії генів клітинного циклу саме на цьому рівні дозволить визначити механізми регуляції пресинтетичної фази циклу за умов кліностатування.

Принциповими регуляторами клітинного циклу є цикліни та циклін-залежні кінази, а транскрипційні та посттранскрипційні механізми відповідають за регуляцію рівня циклінів. Перший рівень регуляції – це транскрипція генів циклінів. Почавши експресуватися, цикліни також регулюються рівнем надлишку білку, тобто транскрипція гену певного цикліну припиняється при синтезі надмірної кількості даного білку [Kitazono, 2001]. Тому наступним етапом роботи було з’ясувати, чи змінюється експресія 1- та 3-циклінів в клітинах кореневої меристеми в умовах повільного горизонтального кліностатування і як вона відображається на процесах затримки прокльовування насіння та зниження проліферативного пулу. Дані щодо експресії генів ?-циклінів за умов кліностатування в меристемах коренів гороху були отримані вперше.

Визначення локалізації транскриптів методом гібридизації in situ. Дослідження на рівні експресії генів в процесі індукції проростання є найбільш актуальними для даного експерименту і надає можливість з’ясувати, чи впливає кліностатування на експресію генів і як це відображається на просуванні клітин по клітинному циклу та проліферативній активності клітин меристеми коренів гороху. Досліджували експресію генів 1- та 3-циклінів в клітинах кореневої меристеми протягом пресинтетичної фази циклу (24 та 30 годин). Різниці в експресії гену ?1-цикліну через 24 години проростання (до прокльовування насінин гороху), та після 30 годин проростання (коли насінини вже проклюнулися) між контрольним та дослідним варіантами не спостерігалось, про що свідчить наявність великої кількості транскриптів в обох варіантах. Дані щодо експресії ?3-цикліну в контролі на 24 та 30 годинах експерименту подібні, тобто не спостерігається накопчення транскриптів цього гену. Однак, на відміну від контролю, за умов кліностатування експресію ?3-цикліну добре видно (рис. 6, а, б), особливо після прокльовування насінин, що відповідає переходу клітин до фази синтезу ДНК. Накопичення транскриптів цього гену видно в ядрах клітин плероми, у більшості клітин периблеми та протодерми.

Визначення експресії генів ?1- та ?3-циклінів методом РТ-ПЛР. У вихідній точці спостерігається наявність обох типів ?- циклінів, хоча інтенсивність зафарбування (відповідно і кількість) ?3-цикліну майже вдвічі більша (рис. 7). В контролі, після 24 годин, рівень транскриптів ?1-цикліну значно збільшується і тримається на такому рівні до 30 годин включно. Експресія ?3-цикліну в цей час не спостерігається. Проте, за умов кліностатування відмічено наявність транскрипційної активності циклінів обох типів протягом всього експерименту, але з різною інтенсивністю. Експресія ?1-цикліну через 24 години не перевищує такої в контролі, однак на 30 годині досліду видиме значне її підвищення. Експресія ?3-цикліну була зафіксована вже через 24 години і значно збільшилась на 30 годину.

Дані щодо розподілу ядер клітин за інтенсивністю флуоресценції у пресинтетичній фазі корелюють з даними по виявленню транскриптів генів циклінів. У вихідній точці, коли більшість клітин має 2С вміст ДНК спостерігається експресія обох типів ?- циклінів, причому ?3-цикліну яскраво виражена. Відсутність транскриптів в контролі через 24 години експерименту свідчить про припинення або блокування синтезу ?3-циклінових субодиниць після виходу клітин зі стану спокою, тобто на початку циклу. На гістограмі контрольного варіанту на цій годині видиме накопичення клітин з 2С-4С вмістом ДНК, тоді як за умов кліностатування залишається майже половина клітин з 2С вмістом ДНК. Для подальшої важливої події клітини – вступу до фази синтезу ДНК – знову необхідний синтез цього білку, тому через 30 годин спостерігається підвищення транскрипційної активності його генів в обох варіантіх, особливо за умов кліностатування. Стосовно експресії ?1- цикліну, протягом всієї пресинтетичної фази відзначено наявність транскриптів як в контролі, так і за умов кліностатування, але їх кількість різна. Після виходу клітин зі стану спокою транскрипційна активність генів цього білку значно підвищується, на 30 годині особливо в кліностатному варіанті. Очевидно, експресія ?3- цикліну, яка з’являється в кліностатному варіанті вже на 24 годині, є відповіддю клітини на стресові умови і пов’язана з підвищенням роботи регуляторних механізмів. Таким чином, у відповідь на відсутність дії вектору гравітації рослина намагається забезпечити нормальне проходження клітинами клітинного циклу.

Можливо це пов’язано з необхідністю більшого проміжку часу для накопичення необхідної кількості білку і запуску певних регуляторних механізмів. Оскільки транскрипційна активність циклінів за умов кліностатування вища, затримка переходу клітин до фази синтезу ДНК, показана цитофлурометричними методами, може відбуватися за рахунок активності ЦКІ, які утримують зібрані циклін-ЦЗК комплекси в неактивному стані, або через неможливість початку транскрипції генів циклінів, які відповідають за перехід до фази синтезу ДНК, поки в клітині присутні транскрипти циклінів попередньої фази циклу (Kitazono, 2001).

Таким чином, дані отримані в представленій роботі можуть бути використані в подальших дослідницьких роботах щодо вивчення механізмів регуляції клітинного циклу та по вивченню впливу зміненої гравітації на живі об’єкти. Зазначені зміни подій клітинного циклу та проліферативної активності клітин кореневої меристеми проростків гороху за умов кліностатування можуть бути враховані і практично застосовані при створенні замкненої автотрофної ланки системи життєзабезпечення в космічних апаратах та формуванні відповідних заходів для нормалізації циркадного ритму біологічних об’єктів, від якого в значній мірі залежить їх онтогенез в несприятливих умовах.

Висновки

1. Встановлено вплив горизонтального кліностатування на проліферативну активність та події клітинного циклу в процесі індукції проростання насінин та в стаціонарній меристемі коренів 2-4-х добових проростків гороху.

2. В процесі індукції проростання за умов кліностатування виявлено затримку переходу клітин до фази синтезу ДНК і затримку початку мітозів в першому клітинному циклі. Це відбувається за рахунок подовження пресинтетичної фази, про що свідчить накопичення клітин з 2С ДНК. Показано зниження рівня деконденсації хроматину у порівнянні з контролем на початку першого клітинного циклу в процесі індукції проростання насінин.

3. Експресія генів ? - циклінів, яка визначалась за появою їх продуктів протягом першого клітинного циклу, в контролі і за умов кліностатування неоднакова і змінюється від повного виключення до активного збільшення.

4. Накопичення транскриптів гену ?1-цикліну за умов повільного горизонтального кліностатування відбувається подібно до контролю в G1 фазі, і продовжується під час переходу G1/S.

5. Присутність транскриптів гену ?3-цикліну в клітинах кореневої меристеми гороху при кліностатуванні свідчить про подовження G1 – G1/S фаз, в той час як в контролі відсутність транскриптів свідчить про перехід клітин повністю до S фази.

6. Зниження мітотичного індексу в стаціонарній меристемі клітин коренів гороху спостерігається протягом трьох діб повільного горизонтального кліностатування. Динаміка мітотичної активності та співвідношення клітин у фазах мітозу подібні до таких в контролі.

7. Отримані дані дозволяють пояснити та узгодити між собою суперечливі літературні дані щодо впливу мікрогравітації та кліностатування на проліферацію рослин і рекомендувати чітке визначення віку досліджуваних об’єктів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Артеменко О.А. Сучасні уявлення про регуляцію клітинного циклу у рослин. УБЖ, Київ, т. 58, №4, 2001, с. 415-421.

2. Артеменко О.А. Мітотична активність клітин кореневої меристеми паростків гороху в умовах кліностатування // Вісник Львівського Університету, вип..28, 2002,с.80-83.

3. Артеменко О.А., Троян В.М., Азарскова М.В. Вплив кліностатування на конформаційний стан хроматину та кінетику першого клітинного циклу при проростанні насіння гороху // УБЖ, Київ, №1, 2005, с.122-130.

4. O.A.Artemenko. Expression of ?1- and ?3-cyclins in root meristem cells of Pisum sativum L. by clinorotation. // Journal of Gravitational Physiology. Vol. 12, N 1, 2005, p. 201-202.

5. Артеменко О.А. Експресія генів ?1- та ?3-циклінів в кореневій меристемі Pisum sativum L. за умов кліностатування // Цитологія та генетика, т. 40, №2, 2006, с.36-41.

6. Артеменко О.А. Влияние клиностатирования на митотическую активность клеток корневой меристемы проростков гороха. Сборник тезисов VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, 15-19 мая 2000, с. 95-96.

7. Артеменко О.А Параметри першого клітинного циклу при зміні сили тяжіння. Збірка тез ХІ з’їзду Українського ботанічного товариства, Харкові, 25-27 вересня, 2001, с. 12-13.

8. Артеменко О.А. Вплив кліностатування на структурний стан хроматину та проліферацію клітин кореневої меристеми гороху // Сборник тезисов 2-й Украинской конференции по перспективным космическим исследованиям, Кацивели, Крым, 21- 26 сентября, 2002, с. 173.

9. Артеменко О.А, Троян В.М. Влияние микрогравитации на конформационное состояние хроматина и кинетику первого клеточного цикла при прорастании семян гороха (Pisum sativum L) // Сборник тезисов 3 Украинской конференции по перспективным космическим исследованиям, Кацивели, Крым, 14-22 сентября, 2003, с. 78.

10. Артеменко О.А. Вплив зміненої гравітації на проліферативну систему дводобових проростків гороху. // Сборник тезисов 6-й Украинской конференции по космическим исследованиям, Евпатория, Крым, 3-10 сентября, 2006, с. 185.

Анотація

Артеменко О.А. Проліферативна активність клітин кореневої меристеми гороху (Pisum sativum L.) за умов кліностатування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена вивченню особливостей проліферації та експресії одного з основних регуляторів клітинного циклу – ?-цикліну в клітинах кореневої меристеми проростків гороху (Pisum sativum L.) під впливом кліностатування. Вплив повільного горизонтального кліностатування