ЗВІТ
Національний аграрний університет
АРНАУТА ОЛЕКСІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ
УДК 577.12.:615.387:591.543.42
ПОКАЗНИКИ МЕТАБОЛІЗМУ КЛІТИН КРОВІ ТА ЇХ ЗБЕРЕЖЕНІСТЬ ЗА УМОВ КОНСЕРВАЦІЇ ФАКТОРАМИ ШТУЧНОГО ГІПОБІОЗУ
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата
ветеринарних наук
Київ – 2007
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України
Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор, академік НАН України та УААН Мельничук Дмитро Олексійович, Національний аграрний університет, ректор
Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор
Головаха Володимир Іванович, Білоцерківський державний аграрний університет, професор кафедри терапії та клінічної діагностики
доктор біологічних наук, професор
Калачнюк Григорій Іванович, Львівська національна академія ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького, директор Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин, професор кафедри органічної та неорганічної хімії
Провідна установа – Харківська державна зооветеринарна академія Міністерства аграрної політики України, кафедра хімії і біохімії, с. Мала Данилівка, Дергачівський район
Захист відбудеться “02”березня 2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. № 65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, кімн. 41
Автореферат розісланий “31”січня 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Калінін І.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. З метою забезпечення практичних та наукових потреб установ медичного та біологічного профілів у донорській крові розроблено два принципово різних способи її зберігання: 1. Глибока кріоконсервація, це – спосіб заморожування в рідкому азоті до 196 0 С, який використовується при необхідності тривалого зберігання. 2. Спосіб короткотривалої консервації, який полягає у змішуванні отриманої крові з певним консервуючим середовищем та зберіганні за умов кімнатної температури або при температурі +42 0 С у холодильних установках.
Значний внесок у розвиток кріогенного зберігання біологічного матеріалу, в тому числі і донорської крові, зробили українські вчені – С.С. Лаврик (1975),
Н.С. Пушкарь (1975), А.М. Білоус (1982), Г.Т. Глухенькая (1983), В.І. Грищенко (1985), Н.І. Ларичева (1985), Г.І. Когут (1985), М.С. Волошина (1985) та ін.
На основі першого розробленого способу створені банки довготривалого зберігання крові, які є матеріалом фундаментальних досліджень кріобіологів, біотехнологів, біохіміків та ін. Але даний спосіб зберігання крові не є рентабельним та практичним для медичних закладів, у яких донорська кров та її препарати є засобами щоденного використання. Окрім того, що кріоконсервація є громіздким та дорогим способом зберігання донорської крові, значний відсоток формених елементів при цьому гине під час заморожування та розморожування, що значно знижує її терапевтичну цінність. Тому для клінічної медицини (особливо ветеринарної) пріоритетними були та залишаються нині саме способи короткотривалого зберігання донорської крові.
Разом із тим, ще не розроблені гемоконсерванти, які повністю відповідали б вимогам сучасної трансфузіології. Вищенаведене вказує на доцільність розробки нових та вдосконалення існуючих кровозберігаючих середовищ. На нашу думку, вирішення цього завдання можливе за рахунок включення до рецептури кровозберігаючих середовищ додаткових інгредієнтів, що здатні суттєво знижувати інтенсивність метаболічних процесів. Це дозволило б зменшити енергетичні витрати клітин та накопичення кінцевих продуктів обміну речовин. До таких інгредієнтів належать бікарбонати (НСО3-) та вуглекислий газ (СО2), роль яких у створенні гіпобіотичного стану вперше стали вивчати такі вітчизняні дослідники: М.Ф. Гулий (1968), Д.О. Мельничук (1974), С.П. Роговський (1995), С.Д. Мельничук (1995),
В.О. Михайловський (2000) та ін.
Збільшення концентрації вказаних речовин до певних величин мало б забезпечувати гальмування обмінних процесів у крові і перехід її формених елементів у стан штучного вуглекислотного гіпобіозу. Але біохімічне обґрунтування цих важливих науково-практичних питань на даний час відсутнє. Отже, вивчення впливу підвищених концентрацій основних форм вуглекислоти (НСО3- + СО2) як факторів кровозберігаючого середовища на метаболізм консервованої крові є актуальним і перспективним.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною тематичного плану науково-дослідних робіт кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції НАУ по темі: “Вивчення впливу різних форм вуглекислоти на розвиток стану штучного гіпобіозу та розробка технологій переведення організму тварин, тканин та клітин у стан штучного гіпобіозу”, номер держреєстрації 0103U005378, яка виконувалась у проблемній лабораторії “Біохімії гіпобіозу тварин”. Завідуючий лабораторією – доктор біологічних наук С. Д. Мельничук.
Мета і завдання досліджень. Основною метою дисертаційних досліджень було вивчення особливостей метаболізму та збереженості крові за умов консервування факторами штучного гіпобіозу, тобто, впливу комбінованої дії СО2 та НСО3– на інтенсивність обміну речовин у донорській крові та можливості використання її для зберігання з наступною трансфузією.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі основні завдання: –
вивчити зміни окремих показників інтенсивності енергетичного, азотного та електролітного обміну, стану кислотно-лужної рівноваги й активності окремих ензимів у консервованій крові биків і кролів за впливу комбінованого бікарбонат-вуглекислотного гіпобіозу; –
дослідити основні зміни у морфологічних характеристиках формених елементів крові в процесі її зберігання (гемоліз, кількість еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, співвідношення нормоцитів, сфероцитів та “тутових” клітин, кількість нежиттєздатних форм лейкоцитів тощо) за впливу комбінованого бікарбонат-вуглекислотного гіпобіозу;–
встановити технологічну придатність і фізіологічну ефективність використання запропонованого гемоконсервуючого середовища в умовах експериментальної трансфузії тваринам-реципієнтам консервованої донорської крові.
Об’єкт досліджень – вплив факторів штучного комбінованого вуглекислотного (СО2 + НСО3–) гіпобіозу на біохімічні і морфологічні показники крові, її технологічну придатність і біологічну ефективність застосування.
Предмет досліджень – біохімічні й морфологічні показники крові, консервованої стандартним середовищем “Глюгіцир” та новим модифікованим бікарбонат-вуглекислотним кровоконсервантом і їх технологічний ефект.
Методи досліджень – біохімічні, гематологічні, цитоморфологічні, спектральні, потенціометричні, колориметричні та математичні методи досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведено можливість зниження інтенсивності метаболічних процесів у формених елементах крові, за умов зберігання її в консервуючому середовищі, що містить підвищені концентрації основних форм вуглекислоти (НСО3–, рСО2). За результатами досліджень запропоновано новий рецепт кровозберігаючого середовища, який, порівняно з класичним глюкозо-цитратним гемоконсервантом “Глюгіцир” дає можливість значно подовжити термін якісного зберігання консервованої донорської крові.
Практичне значення одержаних результатів. Доведено, що застосовуючи бікарбонат-вуглекислотне середовище для консервування крові, можна значно знизити інтенсивність обмінних процесів у формених елементах крові і тим самим збільшити термін її якісного зберігання, порівняно з використанням глюгіциру.
Доведено, що трансфузія тваринам-реципієнтам консервованої крові з використанням бікарбонат-вуглекислотного розчину не має протипоказань.
Пріоритетність розробленого способу зберігання цільної донорської крові підтверджена патентом на винахід № 2003065431 “Бікарбонат-вуглекислотний розчин для консервування донорської крові”.
Особистий внесок здобувача полягає у відборі та аналізі даних літератури за темою дисертаційної роботи, обґрунтуванні напрямку досліджень, розробці методики, постановці і проведенні експериментальних досліджень, статистичній обробці одержаних результатів, оформленні дисертаційної роботи. Разом із співавторами підготував рукописи опублікованих статей у фахових виданнях.
Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на: Міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна медицина – 2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (Феодосія, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2006); 2-й, 3-й, 4-й, 5-й конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК НАУ (Київ, 2003, 2004, 2005, 2006).
Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладено в десяти публікаціях, у тому числі шість статей у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України, три матеріали конференцій та один патент.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів експериментальних досліджень, висновків, списку використаної літератури, який включає 211 найменувань, з них 98 іноземних. Робота викладена на 132 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 33 таблицями та 6 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Дослідження за темою дисертаційної роботи виконано на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції Національного аграрного університету. У досліді використовували кров бугаїв віком 10–12 місяців та кролів-самців масою 2,5–3 кг. Тварин утримували у стаціонарі та віварії Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції тваринництва на стандартному раціоні. Для відбору та переливання крові використовували одноразові системи. Кров відбирали в стерильні флакони з гемоконсервантом ємністю 250 мл, після чого їх вміщували у холодильну камеру для зберігання впродовж 30 діб при температурі +4 ± 2 0 С
Експериментальна робота була розподілена на такі основні етапи:
1. Розробка моделі вуглекислотного гіпобіозу крові на основі стандартного гемаконсерванту “Глюгіцир”. Оптимальний склад нового кровозберігаючого середовища підбирався шляхом дослідження впливу різних концентрацій натрію бікарбонату, натрію хлориду та різних значень рН на величину гемолізу консервованої крові.
Величину гемолізу розраховували за відсотковим співвідношенням концентрації вільного гемоглобіну до загального, методом Г. Дервіза, А. Воробйова
2. Дослідження вмісту субстратів гліколізу в плазмі крові. Концентрацію глюкози визначали на біохімічному аналізаторі крові “Microlab 200” (Нідерланди), кількість молочної кислоти – за методом Є. Васильєвої.
3. Дослідження концентрації неорганічного фосфору. Вміст неорганічного фосфору в плазмі крові проводили на біохімічному аналізаторі крові “Microlab 200” (Нідерланди).
4. Визначення концентрації іонів натрію, калію, кальцію, магнію в плазмі консервованої крові проводили спектрохімічним методом, використовуючи режим абсорбції в повітряно-ацетиленовому полум’ї на атомно-абсорбційному спектрофотометрі ААS – 30, фірми “Карл Цейс” (Німеччина).
5. Дослідження основних показників кислотно-лужної рівноваги проводили на аналізаторі газів крові “Radelkis” (Угорщина).
6. Дослідження активності аспартатамінотрансферази та аланінамінотрансфе-рази (АсАТ та АлАТ) проводили на біохімічному аналізаторі крові “Microlab 200” (Нідерланди).
7. Дослідження концентрації аміаку в консервованій крові проводили за методом А. Сілакової.
8. Визначення гематологічних показників консервованої крові. Визначення кількості еритроцитів і лейкоцитів проводили меланжерним методом, а тромбоцитів за методикою К. Зака; визначення морфологічних змін еритроцитів у препараті нативної краплі за методом Р. Родіни; дослідження життєздатності лейкоцитів за методом R. Schreck.
9. Визначення біохімічних показників крові тварин-реципієнтів (загального білка, сечовини, глюкози та активність АсАТ, АлАТ), у плазмі проводили на біохімічному аналізаторі крові “Microlab 200” (Нідерланди).
Відбір крові з наступною гемотрансфузією проводили за методом І. Западнюк. Кров у кролів після гемотрансфузії для біохімічних досліджень відбирали з вушної вени за методом І. Западнюк.
Отримані цифрові результати обробляли статистично на програмних мікрокалькуляторах та комп’ютерах з визначенням: М – середнього арифметичного значення; m – похибки середнього арифметичного значення; t – коефіцієнта вірогідності різниці між середнім арифметичним значенням двох варіаційних рядів, який оцінювали за критерієм вірогідності (р).
Результати досліджень та їх обговорення
Проведені дослідження показали, що включення до складу гемоконсерванту вуглекислотних компонентів NaHCO3 та CO2 істотно впливає на показники енергетичного обміну консервованої крові при її зберіганні. Зокрема, як наведено в табл. 1, концентрація глюкози в плазмі дослідної групи зразків консервованої крові биків на 30-у добу зберігання була в 4,2 раза більшою, ніж у контролі.
Таблиця 1
Вміст глюкози в плазмі консервованої крові биків при її зберігання за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, ммоль/л (М±m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 4,9
±0,18 | 4,6
±0,04 | 3,7
±0,13 | 3,1
±0,07 | 2,4
±0,02 | 1,4
±0,05 | 0,5
±0,09
Дослідна | 4,7
±0,07 | 4,6
±0,11 | 4,5
±0,05* | 4,1
±0,33* | 3,4
±0,09* | 2,9
±0,23* | 2,1
±0,08*
Примітка. Тут і далі в таблицях *р<0,05 порівняно з контролем.
Аналогічні зміни виявлені і в дослідженнях крові кролів. Було встановлено, що в дослідних зразках консервованої крові на кінець досліджень (30 доба) вміст глюкози був у 1,8 раза більшим, ніж у контролі (табл. 2).
Таблиця 2
Вміст глюкози в плазмі консервованої крові кролів при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, ммоль/л (М m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 8,88
0,14 | 8,14
0,15 | 7,38
0,12 | 6,04
0,16 | 5,40
0,12 | 3,48
0,11 | 2,58
0,23
Дослідна | 8,64
0,19 | 8,44
0,26 | 7,68
0,06 | 7,14
0,05* | 6,32
0,11* | 5,66
0,10* | 4,78
0,06*
Такі зміни, очевидно, пов’язані з тим, що висока концентрація вуглекислотних компонентів у дослідних зразках зумовила гальмування основного енергетичного процесу крові – гліколізу.
Разом з цим, дослідження динаміки вмісту молочної кислоти в плазмі консервованої крові биків та кролів виявили значно нижчий рівень лактату в дослідних зразках консервованої крові, порівняно з контролем. Зокрема, в плазмі дослідних зразків крові бугаїв концентрація лактату на 30-у добу зберігання була в 1,6 раза нижчою, порівняно з контролем, і відповідно, в 2,1 раза в плазмі крові кролів (табл. 3). Такі зміни є демонстративними, бо як відомо з літературних джерел, показником інтенсивності гліколітичного процесу в консервованій крові є швидкість накопичення в плазмі молочної кислоти – кінцевого продукту гліколізу. Отримані результати вказують на гальмування гліколізу саме у зразках крові, консервованої дослідним середовищем.
Таблиця 3
Концентрація молочної кислоти в плазмі консервованої крові биків у процесі її зберігання за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, ммоль/л (М±m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 1,29
±0,007 | 1,49
±0,184 | 1,85
±0,007 | 2,68
±0,005 | 3,17
±0,007 | 4,41
±0,184 | 5,11
±0,003
Дослідна | 1,33
±0,268 | 1,54
±0,044 | 1,62
±0,001* | 1,73
±0,234* | 1,82
±0,082* | 2,69
±0,007* | 3,15
±0,017*
Оскільки в умовах in vitro молочна кислота не піддається перетворенням, то її накопичення в плазмі консервованої крові є негативним фактором, який знижує життєдіяльність клітин крові. Тому менша кількість лактату в плазмі крові, консервованої бікарбонат-вуглекислотним консервантом слід розцінювати як одну з переваг використання вуглекислотних компонентів у складі кровоконсервуючих середовищ.
Таблиця 4
Концентрація молочної кислоти в плазмі консервованої крові кролів при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, ммоль/л (М m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 5,26
0,13 | 5,56
0,08 | 6,38
0,11 | 9,68
0,07 | 11,0
0,10 | 15,04
0,09 | 21,68
0,06
Дослідна | 5,44
0,06 | 5,55
0,14 | 6,0
0,10* | 6,66
0,10* | 7,36
0,04* | 8,22
0,09* | 10,28
0,16*
Враховуючи те, що значне зростання концентрації молочної кислоти впливає на метаболічні процеси консервованої крові, то використання явища штучного вуглекислотного гіпобіозу є позитивним фактором у підвищенні ефективності традиційного консервування крові.
Правильність зробленого висновку підтверджується також і результатами досліджень вмісту неорганічного фосфору в плазмі консервованої крові биків. З даних таблиці видно, що в крові, консервованої середовищем, до складу якого включено вуглекислотні компоненти, концентрація неорганічного фосфору на 30-у добу досліджень в 1,8 раза нижча, ніж у контролі (табл. 5).
Більш низький рівень неорганічного фосфору в плазмі дослідних зразків характеризується як об’єктивний показник того, що розпад таких речовин як аденозинтрифосфорна, аденозиндифосфорна, 2,3-дифосфогліциринова кислоти в даній експериментальній системі гальмується, а відповідно формені елементи і, в першу чергу, еритроцити такої крові зберігають більшу потенційну життєздатність.
Таблиця 5
Рівень неорганічного фосфору в плазмі консервованої крові биків при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, ммоль/л (М±m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 1,65
±0,032 | 1,97
±0,012 | 3,18
±0,030 | 4,29
±0,040 | 5,39
±0,035 | 6,41
±0,010 | 7,71
±0,020
Дослідна | 1,66
±0,012 | 1,73
±0,010* | 1,92
±0,020* | 2,35
±0,020* | 3,19
±0,020* | 3,84
±0,020* | 4,29
±0,015*
Тому менш інтенсивне збільшення кількості неорганічного фосфору в плазмі дослідних зразків крові, консервованих бікарбонат-вуглекислотним середовищем, є показником дії факторів вуглекислотного гіпобіозу (NaHCO3 та CO2), які створюють більш сприятливі умови для збереження фосфорорганічних сполук.
Важливою ланкою в метаболізмі клітин крові є підтримка певного градієнта концентрації електролітів між плазмою крові та її форменими елементами. Встановлено, що в крові, яка консервувалась бікарбонат-вуглекислотним середовищем порівняно із стандартною методикою (консервування крові глюгіциром), перерозподіл калію, натрію, кальцію та магнію між плазмою та форменими елементами відбувається по-різному. Зокрема, рівень калію в плазмі крові дослідної групи на 30-у добу досліджень був на 18,2 % нижчим, ніж у контролі, тоді як натрію, навпаки, на 14,6 % вищим.
Відомо, що 98 % калію крові міститься в еритроцитах і лише близько 2 % у плазмі, а натрій має, в основному, позаклітинну локалізацію. Тому менш інтенсивне накопичення в плазмі дослідних зразків калію і сталі величини натрію свідчать про стабільність клітинних мембран формених елементів. У свою чергу, було встановлено, що вміст натрію в плазмі зразків крові, консервованої дослідним середовищем, знизився на 7,5 %, тоді як у контрольних – на 22,9 %.
Аналіз даних за кальцієм та магнієм показав кращу мембранну стабільність дослідних зразків. Зокрема, вміст кальцію в плазмі дослідних зразків консервованої крові на 30-у добу досліджень був на 15,9 % вищим порівняно з контролем, а рівень магнію – меншим на 19,7 % (табл. 6). При цьому потрібно зазначити, що кальцій має переважно позаклітинну, а магній внутрішньоклітинну локалізацію.
Отже, результати досліджень електролітного балансу консервованої крові показали, що очевидно, застосовуючи високі концентрації НСО3– та рСО2 у складі кровоконсерванту, можна домогтися стабільності градієнту концентрації електролітів між плазмою та форменими елементами упродовж більш тривалого часу порівняно з контролем.
Таблиця 6
Зміна катіонного складу досліджуваних зразків консервованої крові биків при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, ммоль/л (М±m, n=5)
Катіони | Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Калій | Контрольна | 3,12
±0,042 | 3,48
±0,021 | 3,76
±0,005 | 4,82
±0,007 | 4,88
±0,012 | 5,28
±0,009 | 5,63
±0,008
Дослідна | 3,11
±0,037 | 3,19
±0,003* | 3,56
±0,012* | 4,06
±0,010* | 4,22
±0,035* | 4,42
±0,004* | 4,61
±0,015*
Натрій | Контрольна | 123,2
±0,010 | 122,2
±0,007 | 113,1
±0,002 | 109,5
±0,019 | 103,0
±0,003 | 99,9
±0,012 | 94,8
±0,007
Дослідна | 120,2
±0,008 | 120,1
±0,005 | 118,3
±0,016* | 118,4
±0,090* | 115,1
±0,014* | 114,2
±0,008* | 111,0
±0,021*
Кальцій | Контрольна | 1,53
±0,021 | 1,51
±0,013 | 1,47
±0,013 | 1,44
±0,013 | 1,38
±0,018 | 1,24
±0,009 | 1,17
±0,014
Дослідна | 1,57
±0,014 | 1,57
±0,019* | 1,53
±0,014* | 1,51
±0,016* | 1,48
±0,007* | 1,43
±0,008* | 1,39
±0,007*
Магній | Контрольна | 0,63
±0,003 | 0,66
±0,030 | 0,71
±0,009 | 0.91
±0,003 | 0,97
±0,010 | 1,05
±0,007 | 1,12
±0,002
Дослідна | 0,62±
0,003 | 0,62
±0,007 | 0,64
±0,003* | 0,70
±0,030 | 0,78
±0,001* | 0,86
±0,011* | 0,90
±0,005*
Відомо, що електролітний обмін біологічних рідин організму тісно пов’язаний із кислотно-лужним станом.
Результати досліджень показників кислотно-лужного стану крові, консервованої дослідним та контрольним середовищами, наведено в табл. 7.
Встановлено, що величина рН дослідних зразків (7,36 ± 0,005) у день відбору крові суттєво відрізняється від контролю (6,63 ± 0,006), що пояснюється введенням до складу консервуючого розчину натрію бікарбонату. При цьому величина рН зразків консервованої крові дослідної групи була більш стабільною порівняно з контролем, що свідчить про більшу буферну ємність дослідного середовища. Крім того, значно менша продукція лактату в дослідних зразках крові запобігає різкому зниженню величини рН.
У ході досліджень було зафіксовано динамічне зростання рСО2 як у контрольних, так і в дослідних зразках крові. Значна різниця у вихідних даних пояснюється особливостями складу досліджуваного консерванту.
Парціальний тиск кисню теж динамічно зростав, особливо в дослідних зразках, що, в свою чергу, пояснюється прямою залежністю між спорідненістю О2 та СО2 до гемоглобіну. За даних умов при стрімкому зростанні в крові концентрації вуглекислого газу гемоглобін втрачає спорідненість до кисню, концентрація якого за умов зберігання крові в ізольованих, герметично закритих флаконах буде динамічно зростати.
На фоні динамічного збільшення рСО2 та рО2 кількість бікарбонату поступово знижувалась (табл. 7).
Таблиця 7
Показники кислотно-лужного стану консервованої крові биків при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, (М±m, n=5)
Показник | Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
рН | Контрольна | 6,63
±0,006 | 6,61
±0,004 | 6,53
±0,005 | 6,46
±0,01 | 6,42
±0,004 | 6,40
±0,007 | 6,34
±0,009
Дослідна | 7,36
±0,005* | 7,35
±0,005* | 7,32
±0,008* | 7,29
±0,009* | 7,26
±0,004* | 7,21
±0,002* | 7,16
±0,01*
рСО2
мм. рт. ст. | Контрольна | 39,5
±0,45 | 41,2
±0,65 | 45,4
±0,21 | 49,7
±0,95 | 55,8
±1,02 | 63,1
±0,65 | 71,7
±0,74
Дослідна | 81,2
±0,56* | 87,4
±0,45* | 93,3
±0,39* | 98,8
±0,95* | 105,1
±0,89* | 112,3
±0,76* | 117,9
±0,83*
рО2
мм. рт. ст. | Контрольна | 39,4
1,65 | 41,1
1,58 | 48,9
0,91 | 54,2
0,97 | 61,1
1,40 | 65,4
0,58 | 71,9
1,07
Дослідна | 74,2
1,64* | 76,8
0,42* | 80,3
0,86* | 85,1
1,73* | 91,2
0,54* | 101,1
1,59* | 134,1
1,41*
НСО3–ммоль/л | Контрольна | 21,6
±0,95 | 20,8
±0,84 | 19,9
±0,68 | 18,1
±0,78 | 16,4
±0,45 | 15,6
±0,65 | 13,1
±0,87
Дослідна | 40,8
±1,09* | 37,5
±1,21* | 33,3
±0,89* | 29,2
±0,98* | 26,5
±1,21* | 22,8
±1,03* | 17,2
±1,14*
Встановлено, що вуглекислотні компоненти дослідного гемоконсерванту позитивно впливають на ферментативну активність плазми консервованої крові. Зокрема, відомо, що такі ферменти як аспартатамінотрансфераза (АсАТ) та аланінамінотрансфераза (АлАТ) локалізуються в рідкій частині клітин крові. Тому у випадку пошкодження їх структури, вони легко потрапляють у плазму, де їх можна виявити. При цьому, еритроцити містять значно більше даних ферментів ніж плазма, відповідно, гемолізована кров має в 10 разів вищу активність АлАТ і в три рази АсАТ, ніж плазма, (Щеклик Е, 1966). Ця особливість використовується для тестування збереженості клітин крові.
Активність АсАТ упродовж 30 діб у плазмі дослідних зразків консервованої крові зросла лише на 16,9 %, тоді як у плазмі, контрольних зразків – на
34,4 %, що вказує на кращу збереженість клітин крові консервованої дослідним середовищем (табл. 8).
Таблиця 8
Активність АсАТ у плазмі консервованої крові биків у процесі її зберігання за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, нкат/л (М±m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 1016
±16,84 | 1033
±4,26 | 1083
±4,23 | 1233
±4,26 | 1299
±12,58 | 1350
±4,71 | 1366
±12,42
Дослідна | 1006
±6,51 | 1004
±4,15* | 1017
±25,06* | 1066
±20,84* | 1100
±4,56* | 1133
±21,05* | 1176
±6,81*
Встановлено, що активність АлАТ у плазмі дослідних зразків крові зростає менш інтенсивно, ніж у контрольних (табл. 9). Зокрема, збільшення активності АлАТ у плазмі дослідних зразків крові відбулося на 23,1 %, тоді як у контролі – на 59,9 %.
Таблиця 9
Активність АлАТ у плазмі консервованої крові биків при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, нкат/л (М±m, n=5)
Групи зразків крові | Термін зберігання, діб
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30
Контрольна | 416
±4,31 | 436
±6,96 | 466
±4,21 | 529
±6,81 | 599
±8,47 | 616
±16,84 | 665
±4,36
Дослідна | 433
±16,79 | 434
±9,27 | 450
±4,26* | 483
±25,06 | 519
±6,71* | 533
±8,52* | 543
±17,54*
Для детальної характеристики стану еритроцитів консервованої крові в процесі її зберігання велике значення має визначення їх форми в препараті нативної краплі. При цьому підраховується кількість нормоцитів, сфероцитів та “тутових” клітин.
Дані, наведені у рис. 1, демонструють динаміку кількості нормоцитів у дослідній та контрольній групах. При цьому, було виявлено значно кращу збереженість нормоцитів у період з 5-ї по 22-у добу.
Рис. 1. Динаміка зміни кількості нормоцитів у препараті нативної краплі консервованої крові биків при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, %o (М ± m, n = 5)
Встановлено (рис. 2), що з перших діб зберігання серед нормоцитів з’являються клітини, які мають форму “тутових” ягід. У дослідних зразках крові кількість таких клітин за період зберігання динамічно зростала. На тридцяту добу зберігання середній показник їх кількості був максимальним і становив
794 %o. У свою чергу в контрольній групі кількість “тутових” клітин досягла максимального значення на 16-у добу (821 %o), посля чого стала знижуватись і на 30-у добу становила 613 %o.
Рис. 2. Динаміка наростання кількості “тутових” клітин у препараті нативної краплі консервованої крові при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, %o (М ± m, n=5)
З функціональної точки зору важливим є те, що “тутові” клітини є оберненою формою змін еритроцитів. Після надходження в кров’яне русло реципієнта ці клітини не лише відновлюють свій первинний вигляд, але й фізичні властивості
На 30-у добу кількість “тутових” клітин у контрольній групі зменшується за рахунок наростання кількості сфероцитів.
Зростання кількості сфероцитів (рис. 3) у дослідній групі зразків крові відбувалось значно повільніше і станом на тридцяту добу була майже вдвічі меншою порівняно з контролем.
Відомо, що зміна форми еритроцита із дископодібної спочатку на шиповидну (“тутові” клітини), а потім у сферичну (так звані “сфероцити”) завжди відбувається паралельно із зниженням їх осмотичної резистентності. Крім того, приживаність таких клітин в організмі реципієнта різко знижується.
Рис. 3. Динаміка наростання кількості сфероцитів у препараті нативної краплі консервованої крові при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного
гіпобіозу, %o (М ± m, n=5)
Отже, нами встановлено, що в дослідних зразках консервованої крові станом на 30-у добу домінують “тутові” клітини, тоді як у контролі – сфероцити, що значно знижує біологічну якість такої крові.
Проведені нами дослідження форм еритроцитів у препараті нативної краплі вказують, що при зберіганні цільної крові тварин у бікарбонат-вуглекислотному середовищі формені елементи зазнають значно менших структурних змін порівняно з кров’ю, яка консервується стандартним глюкозо-цитратним консервантом “Глюгіцир”.
Відомо, що різко виражена гіпоксія, яка розвивається на фоні штучної крововтрати, викликає у всіх органах і тканинах значні порушення обміну речовин. Зокрема, при гострій крововтраті, порушується діяльність центральної нервової системи, розвивається гепаторенальний синдром тощо. Переливання донорської крові в таких випадках сприяє поліпшенню загального стану тварини, який можна контролювати за показниками вмісту загального білка, сечовини, активності АсАТ та АлАТ тощо.
Значна крововтрата призводить до вираженої гіпопротеїнемії, що, очевидно, пов’язано з пригніченням білоксинтезуючої функції печінки внаслідок порушення через неї кровотоку. Адже відомо, що навіть помірна крововтрата (20 мл/кг маси) зменшує кровоток через печінку до 40 % від вихідного значення Y. Sugawara (1993).
Встановлено, що вміст загального білка в плазмі крові кролів як дослідної, так і контрольної групи після гострої крововтрати істотно знижується (табл. 10). Після переливання тваринам-реципієнтам консервованої дослідним середовищем крові рівень його фактично стабілізується порівняно з контролем. Цей факт можна віднести на рахунок того, що кров, консервована бікарбонат-вуглекислотним консервантом, краще сприяє відновленню білок-синтезуючої функції печінки.
Зниження рівня сечовини в плазмі крові, яке спостерігалось у тварин після крововтрати, очевидно, пов’язано з порушенням кровоциркуляції в печінці та зниженням артеріального тиску.
Після гемотрансфузії рівень цього показника зростає. Однак у кролів, яким переливали консервовану бікарбонат-вуглекислотним середовищем кров, її концентрація була вірогідно нижчою, порівняно з контролем і становила
17,1±0,08 ммоль/л, що, очевидно, пов’язано з відновленням детоксикуючої функції печінки і видільної нирок (табл. 10).
Таблиця 10
Вміст загального білка та сечовини в плазмі крові кролів до крововтрати, після крововтрати та після переливання крові консервованої бікарбонат-вуглекислотним середовищем (А) та глюгіциром (Б), (М±m, n=5)
Стан тварини | Показник
Загальний білок, г/л | Сечовина, ммоль/л
А | Б | А | Б
До крововтрати | 68,7±0,02 | 69,1±0,18 | 16,6±0,02 | 16,5±0,06
Після крововтрати (0,5 год) | 46,4±0,68 | 47,2±1,43 | 14,3±0,09 | 14,5±0,12
Після переливання крові (6,0 год) | 61,2±1,30* | 56,9±1,85 | 17,1±0,08* | 18,3±0,18
Переливання консервованої бікарбонат-вуглекислотним середовищем крові сприяє поліпшенню клітинної і мембранної структур гепатоцитів, на що вказує активність АлАТ та АсАТ.
Встановлено, що у дослідних тварин після гемотрансфузії активність АлАТ порівняно з початком досліду практично не змінилась, тоді як у тварин, яким переливали консервовану глюгіциром кров, вона підвищилась на 39,5 % (табл. 11).
Аналогічні зміни було встановлено й при дослідженні активності АсАТ
(табл. 11).
Таблиця 11
Активність АлАТ та АсАТ у плазмі крові кролів до крововтрати, після крововтрати та після переливання крові, консервованої бікарбонат-вуглекислотним середовищем (А) та глюгіциром (Б), нкат/л (М±m, n=5)
Стан тварини | Показник
АлАТ | АсАТ
А | Б | А | Б
До крововтрати | 2071±4,73 | 2055±18,6 | 983±7,10 | 971±4,73
Після крововтрати (0,5 год) | 2022±9,18 | 2006±16,2 | 905±11,5 | 922±18,3
Після переливання крові (6,0 год) | 2161±25,4* | 2866±14,1 | 1027±30,2* | 1108±18,5
Наведені у цьому розділі результати досліджень концентрації загального білка, сечовини та активності АлАТ і АсАТ у плазмі тварин-реципієнтів свідчить про те, що переливання крові, консервованої бікарбонат-вуглекислотним середовищем, сприяє стабілізації біохімічних показників та зумовлює швидкий терапевтичний ефект у тварин, компенсаторні можливості організму яких значною мірою порушені крововтратою. Застосування консервованої аутокрові запобігає виникненню ускладнень, пов’язаних з переливанням крові, унеможливлює зараження реципієнта різними інвазійними та інфекційними захворюваннями.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у дослідженні впливу факторів штучного гіпобіозу на особливості показників метаболізму у донорській крові та її збереженість. Встановлено можливість зниження інтенсивності метаболічних процесів у формених елементах крові шляхом підвищення у середовищі консервування концентрації основних форм вуглекислоти (НСО3– і рСО2), що дозволяє рекомендувати новий склад гемоконсерванту для збільшення терміну якісного кровозберігання.
1. У плазмі крові, консервованої бікарбонат-вуглекислотним середовищем, на 30-у добу зберігання, вміст глюкози знижується, а лактату підвищується повільніше, ніж у контролі, відповідно у 4,2 і 1,6 раза у биків та 1,8 і 2,0 раза у кролів, що свідчить про зниження інтенсивності реакцій гліколізу.
2. Використання бікарбонат-вуглекислотного консерванту дозволяє пролонгувати стабільність концентрації іонів калію, натрію, магнію та кальцію у плазмі консервованої крові від 3- до 5-и діб, порівняно із стандартним середовищем (Глюгіцир).
3. За умов консервування крові факторами штучного гіпобіозу упродовж
30-добового зберігання активність амінотрансфераз у плазмі крові залишається нижчою, ніж при консервуванні глюгіциром, а саме: аланінамінотрансферази на 18 % та аспартатамінотрансферази на 14 %, що свідчить про кращу збереженість формених елементів у бікарбонат-вуглекислотному консерванті.
4. У консервованій бікарбонат-вуглекислотним середовищем крові на 30-у добу зберігання чисельність “тутових” клітин, які здатні до відновлення своїх функцій, залишається вищою у 2,0 раза, ніж при консервуванні стандартним середовищем.
5. Результати проведених експериментальних досліджень покладено в основу розробки нового складу середовища для консервування крові, що захищено відповідним патентом (Пат. 65175 Україна, №2003065431).
6. Термін якісного зберігання консервованої крові за умов комбінованого вуглекислотного гіпобіозу може бути подовжений на 7–8 діб.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНІХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Зміна концентрації катіонів калію консервованої крові при зберіганні за умов штучного гіпобіозу // Збірник наукових праць Кримського державного агротехнологічного університету. – 2003. – № 79. – С. 117–122. (Здобувач провів відбір проб та підготовив їх для подальших досліджень).
2. Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Вплив вуглекислотного середовища на збереженість еритроцитів у консервованій крові тварин // Науковий вісник Національного аграрного університету. – 2004. – № 75. – С. 163–165. (Здобувач відібрав матеріал та провів визначення виживаності еритроцитів за умов досліду, проаналізував результати).
3. Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Морфологія еритроцитів у різних консервуючих середовищах // Матеріали науково-практичної конференції. Міжвідомчий тематичний науковий збірник “Ветеринарна медицина” 84, Харків.: 2004. – С. 489–492. (Здобувач поставив дослід, дослідив морфологію еритроцитів за умов експерименту, проаналізував результати та підготовив публікацію).
4. Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Вплив бікарбонат-вуглекислотного середовища на концентрацію загального та вільного гемоглобіну консервованої крові тварин // Науковий вісник Національного аграрного університету. – 2004. – № 78. – С. 134–136. (Здобувач провів експеримент, зробив статистичну обробку отриманих результатів і їх аналіз).
5. Мельничук С.Д., Жулай В.Є., Арнаута О.В. Вплив способу зберігання крові на активність деяких трансаміназ та збереженість еритроцитів // Вісник Дніпропетровського державного аграрного університету. – 2005. – № 2. – С. 58–60. (Здобувач провів біохімічні дослідження та інтерпретацію їх результатів).
6. Пат. 65175 Україна, А 61 К 31/01. Бікарбонат-вуглекислотний розчин для консервування донорської крові. Пат. 65175 Україна, А 61 К 31/01 / Мельничук С.Д., Арнаута О.В., Мельничук Д.О. (Україна); – №2003065431; Заявл. 11.06.03; Опубл. 15.06.05, Бюл. № 6. – 3 с.
7. Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Інтенсивність енергетичного обміну в клітинах консервованої крові кролів при її зберіганні за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – 2006. – Т. 8. –
№ 2 (29), Ч. 2. – С. 111–113. (Здобувач особисто брав участь у проведенні дослідів та оформленні статті).
8. Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Вплив гіперкапнії на ферментативну активність консервованої крові тварин при зберіганні // Матеріали II конференції професорсько-викладаіцького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК. 3–4 березня 2003. –
С. 98–99.
9. Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Особливості обміну неорганічного фосфору в консервованій крові під час зберігання за умов вуглекислотного гіпобіозу // Матеріали конференції професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК. –
3–4 березня 2005. – С. 52–53.
10. Мельничук С.Д., Арнаута О.В. Рівень енергетичного обміну в клітинах консервованої крові кролів за стану штучного вуглекислотного гіпобіозу // Матеріали конференції професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції тваринництва. 5–6 квітня 2006. – С. 79–80.
Арнаута О. В. Показники метаболізму клітин крові та їх збереженість за умов консервації факторами штучного гіпобіозу. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Національний аграрний університет, Київ, 2007.
У дисертаційній роботі висвітлено результати дослідження особливостей змін ряду важливих біохімічних та гематологічних показників крові тварин (биків та кролів) за умов її консервування в середовищі з високими концентраціями NaHCO3 та СО2 та в стандартному глюкозо-цитратному середовищі – “Глюгіцир”. Проведено трансфузії консервованої крові тваринам-реципієнтам. Встановлено, що зберігаючи кров за умов штучного вуглекислотного гіпобіозу, інтенсивність гліколізу, основного метаболічного циклу клітин крові, істотно знижується, що виявляється в меншому використанні глюкози і відповідно меншій продукції лактату порівняно з контрольними зразками крові; дослідні зразки крові характеризуються більш сталим градієнтом концентрації електролітів між плазмою крові та її форменими елементами; показники кислотно-лужного стану зазнали значних змін, що пов’язано з особливістю складу дослідного середовища; активність АлАТ і АсАТ у плазмі дослідних зразків консервованої крові значно менша ніж у контролі. За умов штучного вуглекислотного гіпобіозу спостерігається не лише краща збереженість формених елементів, а й стабільність їх морфофункціонального статусу, що
врешті-решт трансформується у значно кращий терапевтичний ефект трансфузій такої крові тваринам-реципієнтам.
Все це демонструє суттєвий вплив досліджуваних факторів консервування донорської крові на її метаболізм і як кінцевий результат – збільшення терміну якісного зберігання донорської крові тварин на 6–7 діб, порівняно з консервуванням стандартним глюкозо-цитратним середовищем “Глюгіцир”.
Отримані результати можуть бути рекомендовані для впровадження нового бікарбонат-вуглекислотного кровоконсервуючого середовища у ветеринарну практику, особливо, щодо сфери обслуговування дрібних тварин. Також результати дисертації можуть бути використані для розробки нових та модифікації вже існуючих кровоконсервуючих середовищ шляхом включення до їх складу вуглекислотних компонентів.
Ключові слова: кров, штучний вуглекислотний гіпобіоз, метаболізм, вуглекислота, формені елементи, електроліти, ферментативна активність, переливання крові, донор, реципієнт.
Арнаута А. В. Показатели метаболизма клеток крови и их сохранность при условии консервирования факторами искусственного гипобиоза. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Национальный аграрный университет, Киев, 2007.
Робота посвящена изучению влияния высоких концентраций NaHCO3 и СО2 на биохимические и морфологические показатели консервированной крови. В диссертации приведено биохимическое обобщение и получены новые данные о влиянии факторов искусственного гипобиоза на особенности метаболизма и сохранность донорской крови. Полученные результаты указывают на реальную возможность снижения интенсивности метаболических процессов в форменных элементах крови при условии сохранения в консервирующей среде, которая содержит повышенные концентрации основных форм углекислоты (NaHCO3 и СО2), что позволило разработать и рекомендовать внедрение в практику нового состава гемосохранной среды для продления периода кровосохранения.
При изучении некоторых биохимических показателей было установлено, что в опытных образцах крови, консервируемых новым раствором, содержание глюкозы снижается в 1,5 раза медленнее, чем в контроле, при этом концентрация молочной кислоты значительно возрастает, что указывает на торможение гликолиза. Использование нового гемоконсерванта, по сравнению со стандартным, позволяет продлить стабильность
