НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООГРАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Баланда анатолій олексійович

УДК 577.336+57.08.088.5+542.95

СТИРИЛЦІАНІНИ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЇ ДЕТЕКЦІЇ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ ЗА ОДНО- ТА ДВОФОТОННОГО ЗБУДЖЕННЯ

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі комбінаторної хімії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник:

Доктор хімічних наук, професор

Ярмолюк Сергій Миколайович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу комбінаторної хімії

Офіційні опоненти: | Доктор хімічних наук

Смолій Олег Борисович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

старший науковий співробітник відділу хімії біоактивних азотвмісних гетероциклічних основ

Доктор хімічних наук

Качковський Олексій Дмитрович,

Інститут органічної хімії НАН України,

провідний науковий співробітник відділу кольору та будови органічних сполук

Провідна установа: | Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України,

м. Одеса, відділ медичної хімії

Захист дисертації відбудеться “23” лютого 2007 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий “23” січня 2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д. М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом досить широкого вжитку набули флуоресцентні барвники для детекції та візуалізації біологічних об’єктів. Використання ціанінів як флуоресцентних зондів дає змогу кількісно визначати нуклеїнові кислоти (НК) в гомогенних системах детекції, в присутності значного надлишку зонда. З цією метою застосовуються переважно монометинціаніни, рідше три- чи пентаметинціаніни, які на порядки збільшують квантовий вихід флуоресценції, зв’язуючись з НК.

Нині інтенсивно розвиваються технології визначення біологічних молекул, що базуються на двофотонному збудженні (ДФЗ) флуоресцентних барвників. ДФЗ має ряд значних переваг над традиційним однофотонним збудженням (ОФЗ). Зокрема, при використанні ДФЗ у тривимірній флуоресцентній мікроскопії досягається субмікронне розділення, збуджуюче випромінювання глибоко проникає в тканини, зменшується фоторуйнування біооб’єктів та отримуються більш контрастні трьохвимірні зображення порівняно з однофотонною мікроскопією.

Відомо, що стирилціанінові барвники підвищують інтенсивність флуоресценції, зв’язуючись з НК, та ефективно двофотонно збуджуються. Отже, розробка зондів на основі стирилціанінів для детекції та візуалізації НК за ДФЗ є актуальним завданням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетної теми “Синтез мезо-заміщених в поліметиновому ланцюгу триметинціанів та вивчення механізму їхньої взаємодії з нуклеїновими кислотами та білками” № 2.2.4.16 (2003–2007 рр.) (№ державної реєстрації 0103U000070), а також в рамках гранту міжнародного наукового фонду УНТЦ, реєстраційний номер U3104.

Мета роботи полягала в розробці синтетичних підходів до отримання нових стирилціанінових барвників, перспективних для детекції НК за одно- та двофотонного збудження.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

· розробити хімічні підходи до синтезу нових мономерних та димерних стирилціанінових барвників на основі різних азогетероциклів;

· дослідити спектрально-люмінесцентні характеристики синтезованих барвників у вільному стані та в присутності НК і БСА (сироваткового альбуміну бика);

· дослідити механізм зв’язування стирилціанінів з ДНК;

· вивчити можливість візуалізації клітинних компартментів методами флуоресцентної мікроскопії за допомогою отриманих стирилціанінів.

Об’єкт дослідження – стирилціанінові барвники та їх комплекси з НК.

Предмет дослідження – методи синтезу стирилціанінових барвників та їх спектрально-люмінесцентні властивості у присутності НК та БСА.

Методи дослідження – органічний синтез, ПМР–спектроскопія, електронна спектроскопія поглинання та випромінювання, хроматомас-спектрометричний аналіз, флуоресцентна мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше синтезовано стирилціаніни на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину та імідазо[1,2-a]піридину. Синтезовано ряд стирилціанінових барвників з ефекторними групами та димерних стирилціанінів на основі бензотіазолового та піридинового ядер.

Встановлено, що 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідино-стирилціаніни селективно взаємодіють з РНК та ефективно двофотонно збуджуються в комплексах барвник-РНК.

З’ясовано, що механізм зв’язування димерів з ДНК залежить як від природи гетероциклу барвника, так і від місця приєднання лінкеру до цього гетероциклу. Для деяких стирилціанінових барвників показано, що вони проникають в живі клітини та зв’язуються з внутрішньоклітинними органелами.

Практичне значення одержаних результатів. Уперше запропоновано димерні стирилціанінові барвники як високоефективні флуоресцентні зонди для детекції НК за одно- та двофотонного збудження. Виявлені залежності впливу довжини та природи лінкеру димерних ціанінів на їх взаємодію з біополімерами є важливими при дизайні нових чутливих зондів. Встановлено, що барвник Stp-3 може бути використаний для селективного визначення РНК, а димерний барвник DBos-13 є чутливим флуоресцентним зондом для детекції ДНК. Показано, що отримані стирилціаніни можуть бути застосовані у флуоресцентній мікроскопії для візуалізації НК всередині клітин.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані особисто здобувачем. Частина синтетичної роботи проведена у співпраці з к.х.н. Криворотенком Д.В. Частину спектральних досліджень проведено спільно з к.б.н. Ковальською В.Б., Волковою К.Д. та Токар В.П. Постановка задачі та обговорення результатів проведені з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на 8-ій Конференції з методів та застосування флуоресценції (Чехія, Прага, 2003), Конференції для молодих вчених, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, 2003), 5-ій Міжнародній конференції “Електронні процеси в органічних матеріалах” (Київ, 2004), 9-ій Міжнародній конференції з методів та застосування флуоресценції (Португалія, Лісабон, 2005), ХVІІ Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул та кристалів” (Берегове, 2005), 6-ій Міжнародній конференції молодих вчених з проблем оптики та високотехнологічних матеріалів (Київ, 2005), V Пражському симпозіумі з фотоіндукованих молекулярних процесів (Чехія, Прага, 2006), ХХІ Симпозіумі з фотохімії (Японія, Кіото, 2006), ІІІ Міжнародній конференції з молекулярної спектроскопії (Узбекистан, Самарканд, 2006), Міжнародному симпозіумі з передових технологій в органічній хімії (Судак, 2006), Міжнародній конференції для студентів-фізиків (Румунія, Бухарест, 2006), Міжнародній конференції “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2006), а також на наукових семінарах відділу комбінаторної хімії ІМБіГ НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей у наукових фахових журналах та 14 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та переліку використаних літературних джерел (160 найменувань). Дисертація викладена на 154 сторінках друкованого тексту і містить 18 таблиць, 19 схем та 46 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі йдеться про ціанінові барвники, що застосовуються для визначення НК. Показано, що переважно це монометинціаніни, рідше поліметинціаніни. Наведено переваги застосування двофотонного збудження барвників перед однофотонним у флуоресцентній спектроскопії та представлено стратегії дизайну молекул з великим перерізом двофотонного поглинання. Розглянуто методи модифікації ціанінових барвників для покращення їх властивостей як флуоресцентних зондів.

У другому розділі наведено методики синтезу стирилціанінових барвників та спектральних досліджень. Описано процедури приготування розчинів нуклеїнових кислот та барвників, а також умови проведення експериментальних досліджень.

У третьому розділі подано результати експериментальних досліджень та їх обговорення.

Стирилціаніни на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину та 5-оксо-1,2,3,5-тетрагідропіроло[2,1-b]хіназоліну

Щоб одержати ціанінові барвники, які були б перспективними для детекції нуклеїнових кислот за одно- та двофотонного збудження, нами були синтезовані стирилціаніни на основі різних азогетероциклів. Уперше були синтезовані стирилціаніни на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину та 5-оксо-1,2,3,5-тетрагідропіроло[2,1-b]хіназоліну.

Стирилціанінові барвники Stp-серії синтезовано згідно з наведеною нижче схемою. 4,6,7,8-Тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідин-4-oни були отримані взаємодією заміщених 2-амінотіофенів з 2-піролідіноном. Нагріваючи отриманий гетероцикл з надлишком йодистого метилу (у випадку Stp-5 йодистого етилу) в діоксані, ми одержали четвертинні солі. При кип’ятінні суміші відповідної четвертинної солі та п-диметиламінобензальдегіду у н-бутанолі в присутності піперидину були синтезовані стирилціанінові барвники. Барвник Sbp отримали за аналогічною схемою з етилантранілату.

Досліджено спектральні властивості барвників у вільному стані та в присутності біополімерів (табл. 1). Інтенсивність їх флуоресценції у вільному стані незначна, а в присутності НК суттєво зростає (до 131 разу). Для стирилціанінів на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину інтенсивність флуоресценції у присутності РНК до 8 разів більша, ніж у присутності ДНК. Для барвників з аліфатичними замісниками у 2 та 3 положеннях 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину спостерігається значно більша селективність до РНК, ніж для Stp-4 з ароматичним замісником у 3 положенні.

Стирилціанін Sbp на основі 5-оксо-1,2,3,5-тетрагідропіроло[2,1-b]хіназоліну, на відміну від барвників на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину, не виявляє селективності до РНК і має приблизно однакову інтенсивність флуоресценції у присутності ДНК та РНК (40.1 та 46.1 у.о. відповідно).

Барвник Stp-5, що містить об’ємний аліфатичний фрагмент, має високу здатність до агрегатоутворення, що виявляється в появі додаткових смуг у спектрі поглинання.

Отримано спектри флуоресценції барвників Stp-1, Stp-2, Stp-3 та Stp-5 у присутності РНК за двофотонного поглинання на 1064 нм з використанням YAG:Nd3+ 15 нс лазера (рис. 1). Для комплексів барвників з РНК були розраховані значення перерізу двофотонного поглинання (д), які виявились близькими до перерізу Rhodamine 6G в етанолі (5.5Ч10-50cm4s). Синтезовані стирилціаніни можуть бути використані як флуоресцентні зонди для детекції РНК за ДФЗ.

Таблиця 1

Спектральні характеристики стирилціанінових барвників Stp-серії

Назва | Структура | I0, у.о. | IДНК, у.о. | поглРНК, нм | збфРНК, нм | флРНК,

нм | IРНК, у.о.

Stp-1 | 2.2 | 44.4 | 477 | 544 | 587 | 235

Stp-2 | 2.9 | 52.4 | 480 | 542 | 588 | 234

Stp-3 | 2.4 | 31.5 | 481 | 545 | 589 | 250

Stp-4 | 2.3 | 61 | 488 | 547 | 593 | 142

Stp-5 | 1.3 | 37 | 396

415

449* | 544 | 588 | 170

Sbp | 2.0 | 40.1 | 488 | 548 | 596 | 46.1

Тут і нижче: I0 – інтенсивність флуоресценції барвника в буфері; IДНК – інтенсивність флуоресценції барвника в присутності ДНК; поглРНК – максимум поглинання барвника в присутності РНК; збфРНК – максимум збудження флуоресценції барвника в присутності РНК; флРНК – максимум випромінювання барвника в присутності РНК; IРНК – інтенсивність флуоресценції барвника в присутності РНК; у.о. – умовні одиниці, * – виявляється у вигляді плеча.

Стирилціаніни на основі імідазо[1,2-а]піридину

Уперше синтезовано серію стирилціанінів на основі 2-арилімідазо[1,2-а]піридину з різними замісниками в арильному кільці. Розроблено зручний варіант синтезу різноманітних імідазо[1,2-а]піридинів. Взаємодією 2-аміно-4-метилпіридину з фенацилбромідами у киплячому етанолі, у присутності соляної кислоти як каталізатора одержували 2-арилімідазо [1,2-а]піридини, які виділяли у вигляді слаборозчинних гідройодидів та переводили їх в основи за допомогою триетиламіну. Під час кип’ятіння отриманих гетероциклів з алкілуючим агентом (диетилсульфат чи гептилйодид) у діоксані отримували відповідні четвертинні солі, конденсацією яких з альдегідами в н-бутанолі з піперидином як каталізатором синтезували ряд стирилціанінів (рис. 2).

Досліджені спектральні властивості отриманих барвників у вільному стані, у присутності ДНК, РНК та БСА. Більшість барвників мають значну інтенсивність флуоресценції у вільному стані (до 365 у.о.). Зміна положень максимумів поглинання, збудження флуоресценції та емісії барвників при додаванні ДНК, РНК та БСА свідчить про зв’язування молекул барвників з відповідними біологічними молекулами. Для більшості стирилціанінів інтенсивність флуоресценції у присутності біологічних молекул залишається незмінною або зменшується (табл. 2).

Рис. 2. Структури імідазо[1,2-а]піридинових стирилціанінів

Таблиця 2

Спектральні характеристики імідазо[1,2-а]піридиностирилціанінів

Назва | погл, нм | фл, нм | I0, у.о. | IДНК, у.о. | IРНК, у.о. | IБСА, у.о.

SIP-1 | 393 | 578 | 352 | 327 | 312 | 308

SIP-2 | 392 | 575 | 255 | 245 | 240 | 270

SIP-3 | 392 | 577 | 281 | 286 | 243 | 268

SIP-4 | 394 | 576 | 414 | 420 | 323 | 312

SIP-5 | 401 | 582 | 319 | 164 | 69 | 244

SIP-6 | 390 | 572 | 305 | 301 | 273 | 348

SIP-7 | 394 | 576 | 365 | 274 | 294 | 379

SIP-8 | 416

454* | 596 | 19 | 25 | 22 | 510

SIP-9 | 402 | 577 | 336 | 184 | 111 | 238

SIP-10 | 398 | 574 | 260 | 143 | 111 | 397

SIP-11 | 362 | 476

555 | 36

11 | 67 | 56 | 37

18

SIP-12 | 394 | 570 | 316 | 263 | 372 | 496

погл _ максимум поглинання барвника; фл _ максимум випромінювання барвника; IБСА – інтенсивність флуоресценції барвника в присутності БСА.

Імідазо[1,2-а]піридиновий барвник SIP-8 виявив 27-кратне збільшення інтенсивності флуоресценції при додаванні БСА. Цей барвник, на відміну від інших, має N,N-дигексильний фрагмент, який, на нашу думку, сприяє його зв’язуванню з білком. Цей стирилціанін може бути використаний для гомогенної детекції БСА.

Стирилціанінові барвники з ефекторними групами

Синтезовано серію нових стирилціанінових барвників з алкіламонійними ефекторними групами, що поліпшують зв’язування з ДНК. При введенні ефекторних груп у молекулу барвника використано три різних способи. Ефекторна група вводилась на різних стадіях синтезу стирилціанінів: (1) у молекулу модифікованого барвника, (2) на стадії утворення четвертинної солі та (3) в ядро вихідного азогетероциклу.

Першим способом були одержані барвники Bos-5, Bos-6 та Bos-12. За наведеною нижче схемою отримані барвники з йодалкільними ніжками SI-3 та SI-4, взаємодією яких з розчином триметиламіну було синтезовано стирилціаніни Bos-5 та Bos-6 відповідно. Барвник Bos-12 (рис. 3) отримано, нагріванням SI-4 з надлишком N,N,N',N'-тетраметил-1,4-фенілендіаміну.

Другим способом отримували четвертинну сіль азогетероциклу з алкіламонійною ефекторною групою, а потім проводили реакцію конденсації з альдегідом. Нижче наведено схему синтезу стирилціаніну Fam. Барвники Boі, Bos-1 та Bos-3 одержані аналогічно, шляхом сплавлення відповідних азогетероциклів з бромідом 3-бромопропіл(триетил)амонію та гідрохлоридом 3-(диметиламіно)пропілхлориду й наступною конденсацією синтезованих солей з альдегідом в оцтовому ангідриді.

За третім способом ефекторні групи вводили у 6 положення бензотіазолового ядра. При взаємодії хлорацетильного похідного 6-аміно-2-метилбензотіазолу з триметиламіном було отримано сполуку з тетраалкіламонійним фрагментом у складі замісника, яку алкілували диметилсульфатом та проводили реакцію конденсації синтезованої солі з альдегідом з отриманням барвника Bsu-2.

Досліджено спектрально-люмінесцентні властивості синтезованих стирилціанінів у присутності НК та БСА. Щоб оцінити вплив ефекторних груп у складі стирилціанінів на ефективність утворення флуоресцентних комплексів з ДНК, спектральні характеристики синтезованих барвників порівнювали з материнськими моностириціанінами Sbt, F та Sil (рис. 3, табл. 3).

Рис. 3. Структури стирилціанінових барвників

Якщо ввести до молекули барвника ефекторну групу, то у вільному стані його спектральні властивості змінюються незначно, а в присутності НК спостерігаються суттєві зміни. Алкіламонійні ефекторні групи в складі бензотіазоло- та піридиностирилціанінів значно покращують взаємодію цих барвників з ДНК, але мало впливають на підвищення інтенсивності флуоресценції індолініностирилціаніну.

З’ясовано, що барвники з ефекторною групою в 3 положенні бензотіазольного ядра, мають більші значення підвищення інтенсивності флуоресценції, ніж барвники з ефекторною групою в 6 положенні бензотіазольного ядра стирилціаніну (див. табл. 3).

Для барвників Bos-серії у присутності ДНК отримано спектри флуоресценції за двофотонного збудження на 1064 нм. Інтенсивність флуоресценції комплексів барвник-ДНК того ж порядку, що й інтенсивність флуоресценції розчину Rhodamine 6G в етанолі за ДФЗ (рис. 4).

Tаблиця 3

Спектрально-люмінесцентні характеристики стирилціанінових барвників

Назва | I0, у.о. | погл, нм | збф, нм | фл,

нм | IДНК, у.о. | IДНК/I0 | IРНК, у.о. | IРНК/I0

F | 3.2 | 455 | 495 | 606 | 24 | 7.4 | 33.6 | 10.5

Fam | 6.7 | 486 | 506 | 607 | 486 | 73 | 407 | 61

Sil | 14 | 537 | 560 | 596 | 159 | 11.4 | 178 | 12.8

Boi | 22.6 | 563 | 577 | 602 | 417 | 18.5 | 145 | 6.4

Sbo | 41 | 490 | 530 | 565 | 304 | 7.4 | 568 | 14

Sbt | 20 | 520 | 520 | 600 | 448 | 22.2 | 503 | 25

Bos-1 | 20.9 | 560 | 567 | 606 | 1360 | 65 | 1350 | 64

Bos-3 | 17.3 | 551 | 555 | 598 | 1773 | 103 | 1332 | 77

Bos-5 | 21.4 | 554 | 566 | 607 | 2100 | 98 | 1636 | 76

Bos-6 | 23.8 | 548 | 560 | 605 | 1864 | 78 | 1314 | 55

Bos-12 | 23 | 545 | 562 | 606 | 985 | 43 | 689 | 30

Bsu-2 | 28.6 | 562

540* | 557 | 605 | 1009 | 35 | 1182 | 41

Димерні стирилціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції нуклеїнових кислот

Відомо, що димерні ціанінові барвники звичайно мають значно меншу інтенсивність власної флуоресценції, ніж відповідні мономери. За рахунок цього збільшується співвідношення інтенсивності флуоресценції барвника в присутності НК по відношенню до інтенсивності його флуоресценції у вільному стані. Для деяких димерних барвників константа зв’язування димеру з ДНК значно більша, ніж для мономерних ціанінів. Враховуючи це, ми синтезували серію димерних барвників з різноманітними лінкерами та з різними азогетероциклами. Щоб одержати барвники, лінкери яких відрізняються за хімічним складом та будовою, нами було використано відомі методи та запропоновано новий варіант синтезу димерних ціанінових барвників.

Перший використаний нами метод синтезу димерних барвників полягав в отриманні бісчетвертинних солей нагріванням азогетероциклів з відповідними бісалкілуючими реагентами з подальшою конденсацією солей з альдегідом. У такий спосіб було синтезовано димерні стирилціанінові барвники з аліфатичними лінкерами довжиною 2–10 атомів та з лінкерами, що містять у своєму складі атоми кисню чи ароматичний фрагмент.

Другий метод отримання димерних стирилціанінових барвників полягав в алкілуванні йодалкільними похідними барвників N,N,N',N'-тетраметилдіаміноалканів. Взаємодією стирилціанінів з йодалкільною ніжкою SI-3, SI-4 та SI-5 із N,N,N',N'-тетраметилдіаміноалканами були синтезовані димери з двома алкіламонійними групами в складі лінкерів довжиною 10 – 18 атомів.

Щоб отримати димери з лінкером, приєднаним у 6 положенні бензотіазольного ядра, ми використали 6-аміно-2-метилбензотіазол. Взаємодією хлорацетильного похідного 6-аміно-2-метилбензотіазолу з N,N,N',N'-тетраметилдіамінобутаном була синтезована бісчетвертинна сіль, з якої одержали димерний барвник DBsu-10.

З метою отримання димерних барвників з лінкерами різного складу ми запропонували новий варіант їх синтезу, який ґрунтується на реакції ацилювання хлорангідридами дикарбонових кислот амінопохідного азогетероциклу. 6-Аміно-2-метилбензотіазол ацилювали хлорангідридом нонандикарбонової кислоти. Подальшим алкілуванням утвореного продукту диметилсульфатом одержували бісчетвертинну сіль, конденсацією якої з двома еквівалентами п-диметиламінобензальдегіду був синтезований димер DBsu-11.

Нами вперше були проведені дослідження спектральних властивостей комплексів димерних стирилціанінових барвників з НК. Як видно з наведених у табл. 3 та 4 даних, зростання інтенсивності флуоресценції димерних барвників у присутності ДНК більше, ніж для мономерних стирилціанінових барвників. Синтезовані димери виявляють ДНК-селективність, тоді як для більшості мономерних ціанінів спостерігається слабка РНК-селективність.

Для димерних стирилціанінів досліджено вплив природи та довжини лінкеру на спектральні властивості барвників у вільному стані та в присутності біополімерів. Встановлено, що для 4-(п-диметиламіностирил)піридинових димерів при збільшенні довжини лінкеру від 2 до 6 атомів вуглецю значно зростає інтенсивність флуоресценції у присутності НК та ДНК-селективність. При подальшому збільшенні довжини лінкеру до 10 атомів зростання інтенсивності флуоресценції незначне. Димери Ds-4, Ds-5 та Ds-8, лінкери яких містять атоми кисню чи ароматичний фрагмент, мають значно меншу інтенсивність флуоресценції у присутності ДНК та ІДНК/І0 ніж димери з аліфатичним лінкером.

Інтенсивність власної флуоресценції бензотіазольних, бензоксазольних та індолінінових димерних стирилціанінів через процеси агрегації значно менша, ніж у відповідних мономерів. Процеси агрегатоутворення настільки сильні, що агрегаційні смуги спостерігаються не лише в буфері, а й в метанолі (рис. 5), але повністю руйнуються в розчині ДМФА. Ми вважаємо, що в цьому випадку мають місце внутрішньомолекулярні агрегати. Виявилось, що димерні стирилціаніни з аліфатичним лінкером утворюють досить міцні агрегати, які при додаванні НК руйнуються лише частково. Оскільки флуоресцентні комплекси з НК утворюють мономолекулярні форми барвників, то через це інтенсивність флуоресценції утворених комплексів невисока.

Щоб підвищити силу зв’язування барвника з ДНК та зменшити процеси агрегатоутворення, ми синтезували димерні стирилціаніни зі сперміновим лінкером DBos-10 _DBos-14, DBos-30 та DBsu-11. При взаємодії з ДНК димерів, лінкер яких містить алкіламонійні фрагменти, значна частина агрегатів руйнується з утворенням високофлуоресцентних комплексів барвник-ДНК (див. рис. 5, смуга ІІІ).

Tаблиця 4

Спектральні характеристики димерних стирилціанінових барвників

Назва | I0, у.о. | поглДНК, нм | збфДНК, нм | фл,

нм | IДНК, у.о. | IДНК/I0 | IРНК, у.о. | IРНК/I0 | IБСА, у.о.

F | 3.2 | 455 | 495 | 606 | 24 | 7.4 | 33.6 | 10.5 | 4.8

Dst-2 | 1.2 | 507 | 540 | 640 | 20 | 16.7 | 10 | 8.3 | 3

Dst-4 | 5.4 | 485 | 498 | 616 | 400 | 74 | 200 | 37 | 12

Dst-6 | 3.9 | 484 | 495 | 602 | 504 | 129 | 128 | 33 | 118

Dst-10 | 2.8 | 480 | 490 | 600 | 341 | 121 | 73 | 25 | 53.2

Ds-4 | 0.35 | 491 | 525 | 619 | 3.3 | 9.4 | 4.8 | 13.7 | 2.4

Ds-5 | 0.46 | 480 | 511 | 611 | 5 | 11 | 2.9 | 6.4 | 2

Ds-8 | 1.3 | 484 | 510 | 614 | 77.7 | 60 | 40.4 | 31 | 8.5

Dbt-5 | 3 | 506 | 550 | 606 | 74 | 24.6 | 21 | 7 | 15

Dbt-10 | 2.1 | 505 | 544 | 600 | 156 | 74 | 16 | 8 | 54

Dbo-10 | 3.9 | 478 | 520 | 563 | 207 | 53 | 33 | 8.4 | 116

Dil-10 | 5.3 | 515 | 550 | 600 | 267 | 50.7 | 40 | 7.6 | 71

DBos-10 | 2.7 | 557 | 567 | 608 | 1205 | 446 | 496 | 184 | 8.5

DBos-11 | 3.9 | 554 | 563 | 610 | 1469 | 377 | 445 | 114 | 5.9

DBos-12 | 5.2 | 538 | 565 | 607 | 342 | 66 | 335 | 64 | 2

DBos-13 | 1.2 | 554 | 561 | 605 | 1695 | 1413 | 307 | 256 | 9.7

DBos-14 | 3.5 | 556 | 562 | 606 | 1918 | 548 | 623 | 178 | 3.8

DBos-30 | 1.6 | 555

515* | 558 | 606 | 1360 | 850 | 389 | 243 | 7.5

DBsu-10 | 10 | 450

538 | 554 | 610 | 522 | 52 | 181 | 18 | 1.4

DBsu-11 | 1.5 | 451 | 548 | 593 | 63 | 42 | 27.3 | 18 | 1.8

Виявлено, що при зменшенні співвідношення кількості пар основ ДНК до кількості хромофорів барвника в електронних спектрах з’являються додаткові смуги поглинання, що відповідають агрегатам барвника за участю ДНК (див. рис. 5, смуга І). Показано, що димерні стирилціаніни, лінкер яких приєднаний до 3 положення ядра бензотіазолу, в присутності ДНК підвищують інтенсивність флуоресценції значно сильніше, ніж димери, лінкер яких приєднаний до 6 положення бензотіазолу.

Для барвників DBos-серії у комплексах з ДНК спостерігалась інтенсивна флуоресценція за двофотонного збудження на 1064 нм (див. рис. 4). Отримані значення перерізу двофотонного поглинання барвників у присутності ДНК є близькими до д Rhodamine 6G.

У присутності БСА підвищення інтенсивності флуоресценції димерних барвників значно менше, ніж у присутності ДНК (див. табл. 4).

Дослідження механізму зв’язування стирилціанінових барвників з ДНК

Відомо, що молекули барвників можуть взаємодіяти з ДНК за двома основними механізмами: шляхом вбудовування в малу борозенку та інтеркаляцією. Раніше було встановлено, що 4-(п-диметиламіностирил)піридиновий барвник зв’язується з ДНК за борозенковим механізмом. Ми вперше дослідили механізм зв’язування п-диметиламіностирилбензотіазолових барвників з ДНК.

Для піридинового димерного барвника Dst-6, як і для мономерного F, на кривих флуоресцентного титрування (рис. 6) спостерігається значна АТ-специфічність, що свідчить про борозенковий механізм взаємодії.

Рис. 6. Флуоресцентне титрування барвників полідезоксинуклеотидами та ДНК

Для димерного бензотіазолового DBos-13, як і для мономерного Sbt, спостерігається GC-специфічність, що вказує на інтеркаляційний механізм взаємодії. Димер DBsu-10, лінкер якого приєднаний до 6 положення бензотіазольного ядра, проявляє специфічність до АТ- послідовностей, що вказує на переважно борозенковий механізм взаємодії (див. рис. 6).

Відомо, що збільшення іонної сили розчину при додаванні електролітів помітно зменшує стабільність борозенкових комплексів, а інтеркаляційні комплекси є більш стійкими до збільшення іонної сили. Ми дослідили гасіння флуоресценції ДНК-комплексів барвників під впливом електроліту та аніонного гасника.

З графіків титрування барвників КІ та КCl у присутності ДНК та КІ за відсутності ДНК, побудованих у координатах Штерна-Фольмера: І0/І = 1 + Кг[KI] (рис. 7), були визначені константи гасіння флуоресценції барвників. Константа гасіння комплексу Dst-6-ДНК хлоридом калію дорівнює 14.1 М-1 і є близькою до константи барвника F (згідно з літературними даними 18.5 М-1), який взаємодіє за борозенковим механізмом. Гасіння Dst-6 у присутності ДНК йодид-іоном на порядок більше, ніж хлорид-іоном (Кг=203 М-1), що вказує на борозенковий механізм взаємодії барвника. Константи гасіння флуоресценції комплексу Sbt- ДНК хлорид-іоном та йодид-іоном мають близькі значення (11 та 20 М-1 відповідно), які менші за константи гасіння барвників, що взаємодіють за борозенковим механізмом.

Отримані результати, а саме: специфічність до полінуклеотидів за даними флуоресцентного титрування, стійкість ДНК-комплексів до збільшення іонної сили, екранування барвника в комплексі від дії гасника – йодид іона, свідчать на користь того, що переважним шляхом взаємодії барвників Dst-6 та DBsu-10 є борозенкова взаємодія, а Sbt та DBos-13 взаємодіють переважно шляхом інтеркаляції.

Використання стирилціанінових барвників для візуалізіції НК in vivo

Нами показано, що барвники Dbt-10, Bos-4, DBsu-10, Dst-6, Bos-12 і DBos-13 проникають у клітину та зв’язуються з нуклеїновими кислотами в складі ядра, ефективно підвищуючи інтенсивність флуоресценції. На рис. 8 подано трансмісійне та флуоресцентне зображення клітин культури гіпокампу, які дозволяють побачити розподіл стирилціаніну Bos-12 та димерного стирилціаніну DBos-13 всередині клітини. Найбільш яскраво флуоресціюючі компартменти за розташуванням відповідають розташуванню ядра на трансмісійному зображенні. Гетерогенність забарвлення ядра свідчить про проникнення барвника через ядерні пори. Ми вважаємо, що барвники цієї серії можна застосовувати для селективної візуалізації нуклеїнових кислот in vivo, наприклад, для визначення апоптичних клітин.

а б

Рис. 8. Трансмісійне та флуоресцентне зображення культури клітин гіпокампу низької щільності, пофарбованих DBos-13 (а) та Bos-12 (б) (час інкубації 135 хв, концентрація барвника 40 µМ). Довжина хвилі збудження 525 нм, 400

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено вирішення наукової задачі, що полягає в розробці флуоресцентних зондів на основі стирилціанінових барвників для детекції нуклеїнових кислот за одно- та двофотонного збудження.

2. Синтезовано понад 50 стирилціанінових барвників на основі різних азогетероциклів, серед яких стирилціаніни з алкіламонійними ефекторними групами та димерні барвники. Запропоновано новий варіант синтезу димерних ціанінових барвників з використанням реакції ацилювання хлорангідридами дикарбонових кислот амінопохідного гетероциклічної основи. Уперше синтезовано стирилціанінові барвники на основі імідазо[1,2-а]піридину та 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину.

3. Показано, що стирилціаніни на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину виявляють селективність до РНК та мають великі значення перерізу двофотонного поглинання в її присутності.

4. З'ясовано, що механізм зв'язування димерів залежить як від природи азогетероциклу барвника, так і від місця приєднання лінкеру до цього гетероциклу. Показано, що димерні стирилціаніни з позитивно зарядженими лінкерами підвищують інтенсивність флуоресценції в присутності ДНК до 1500 разів та демонструють інтенсивну емісію за двофотонного збудження.

5. Показано, що одержані стирилціаніни проникають в клітини та можуть бути використані у флуоресцентній мікроскопії для візуалізації НК. Запропоновано для практичного використання флуоресцентні барвники для визначення ДНК (DBos-13) та РНК (Stp-3) у розчині за одно- та двофотонного збудження.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Kovalska V.B., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Losytskyy M.Yu., Tokar V.P., Yarmoluk S.M. Fluorescent homodimer styrylcyanines: synthesis and spectral-luminiscent stidies in nucleic acids and protein complex // Dyes and Pigments. – 2005. – Vol.67. – P.47-54.

2. Kovalska V.B., Kocheshev I.O., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Yarmoluk S.M. Studies on the spectral-luminescent properties of the novel homodimer styryl dyes in complexes with DNA // J. Fluoresc. _ 2005. – Vol.15. – P.215-219.

3. Нізaмов Н.Н., Ісмаїлов З.Ф., Курталієв Е.Н., Нізамов Ш.Н., Хайдарова Ф.У., Ходжаєв Г., Кухаренко О.П., Баланда А.О., Ярмолюк С.М. Вивчення токсичності ряду ціанінових барвників, що застосовуються для детекції нуклеїнових кислот та білків // Ukrainica Bioorganica Acta. – 2005. – Том 3, №2. – С.35-38.

4. Kovalska V.B., Losytskyy M.Yu., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Tokar V.P., Yarmoluk S.M. Synthesis of novel fluorescent styryl dyes based on the imidazo[1,2-a]pyridinium chromophore and their spectral-fluorescent properties in the presence of nucleic acids and proteins // Dyes and Pigments. – 2006. – Vol.68. – P.39-45.

5. Баланда А.О., Волкова К.Д., Ковальська В.Б., Лосицький М.Ю., Лукашов С.С. та Ярмолюк С.М. Нові стирилціаніни та їх димери як флуоресцентні барвники для детекції нуклеїнових кислот: синтез та спектрально-люмінесцентні властивості // Ukrainica Bioorganica Acta. – 2006. – Том 4, №1. – С.17-29.

6. Tokar V.P., Losytskyy M.Yu., Kovalska V.B., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Prokopets V.M., Galak M.P., Dmytruk I.M., Yashchuk V.M. and Yarmoluk S.M. Fluorescence of Styryl Dyes-DNA Complexes Induced by Single- and Two-Photon Excitation // J. Fluoresc. – 2006. – Vol.16. _P.783-791.

7. Баланда А.О., Волкова К.Д., Ковальська В.Б., Лосицький М.Ю., Токар В.П., Прокопець В.М. та Ярмолюк С.М. Синтез та спектральні дослідження стирилціанінів на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину та 5-оксо-1,2,3,5-тетрагідропіроло[2,1-b]хіназоліну // Ukrainica Bioorganica Acta, www.bioorganica.org.ua. – 2006. – Том 4, №2. – С.10-16.

8. Kovalska V.B., Kocheshev I.O., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Schonenberger B. and Yarmoluk S.M. Studies on the spectral-luminescent properties of the dimer styryl dyes in presence of DNA // 8th Conference on Methods and Applications of Fluorescence. – Prague (Czech Republic), 2003. – P.166.

9. Kovalska V.B., Kryvorotenko D.V., Kocheshev I.O., Balanda A.O. and Yarmoluk S.M. Spectral-luminiscent properties of the dimer styryl dyes in the DNA presence // Conference for young scientists PhD students and students, Institute of Molecular Biology and Genetics. – Kyiv (Ukraine), 2003. – P.172.

10. Kovalska V.B., Tokar V.P., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O. and Yarmoluk S.M. Spectral-luminescent characterization of the homodimer styrylcyanines in nucleic aсids complexes // 5-th International Conference Electronic Processes in Organic Materials. – Kyiv (Ukraine), 2004. – P.87-88.

11. Kovalska V.B., Tokar V.P., Losytskyy M.Yu., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Prokopets V.M., Galak M.P. and Yarmoluk S.M. Design of benzothiazole homodimer styryls for fluorescent DNA detection upon TPE // 9th International Conference on Methods and Applications of Fluorescence. – Lisbon (Portugal), 2005. – P.94.

12. Tokar V.P., Prokopets V.M., Galak M.P., Yashchuk V.М., Kovalska V.B., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O. Two-photon excited fluorescence of styrylbased dyes at DNA presence // XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”. – Beregove (Ukraine), 2005. – P.27.

13. Losytskyy M.Yu., Kudrya V.Yu., Tokar V.P., Kovalska V.B., Balanda A.O., Kryvorotenko D.V., Galak M.P., Prokopets V.M., Dmytruk I.M., Yashchuk V.M., Yarmoluk S.M. Homodymer styryl dyes as two-photon excitation fluorescent probes for DNA detection // 6-th International Young Scientists Conference Problems of Optics and High Technology Materials Science SPO 2005. – Kyiv (Ukraine), 2005. – P.230.

14. Balanda A.O., Kovalska V.B., Tokar V.P., Losytskyy M.Yu., Kryvorotenko D.V., Galak M.P., Prokopets V.M., Yashchuk V.M. and Yarmoluk S.M. Synthesis of new benzothiazole homodimer styryl dyes for fluorescent DNA detection upon TPE // Vth Prague Workshop on PhotoInduced Molecular Process. – Prague (Czech Republic), 2005. – P.40.

15. Losytskyy M.Yu., Tokar V.P., Kovalska V.B., Kryvorotenko D.V., Balanda A.O., Yashchuk V.M., Prokopets V.M., Galak M.P. and Yarmoluk S.M. Homodimer styryl dyes for two-photon exited fluorescent detection of nucleic acids // XXIst IUPAC Symposium on Photochemistry. – Kyoto (Japan), 2006. – P.218.

16. Yashchuk V.M., Losytskyy M.Yu., Kudrya V.Yu., Tokar V.P., Gusak V.V., Prokopets V.M., Kovalska V.B., Balanda A.O., Kryvorotenko D.V., Yarmoluk S.M., Rahimov Sh.I. The High-effective two-photon excited luminescent styryl dyes for imaging and detection of nucleic acids // III Международная конференция по молекулярной спектроскопии. _ Самарканд (Узбекистан), 2006. – С.91-92.

17. Balanda A.O., Kovalska V.B., Volkova K.D. and Yarmoluk S.M. Synthesis and spectral-luminescent studies of dimer dyes based on p-(dimethylaminostyryl)pyridinium // International Symposium on Advanced Science in Organic Chemistry. – Sudak (Ukraine), 2006. – P.C-199.

18. Balanda A.O., Kovalska V.B., Losytskyy M.Yu., Volkova K.D., Tokar V.P., Prokopets V.M. and Yarmoluk S.M. Spectral-luminescent studies of novel 4-oxo-4,6,7,8-tetrahydropyrrolo[1,2-a]thieno[2,3-d]pyridinium styryl as TPE fluorescent dyes for nucleic acids detection // International Conference for Physics Students. – Bucharest (Romania), 2006. – P.14.

19. Volkova K.D., Kovalska V.B., Balanda A.O., Kryvorotenko D.V., Losytskyy M.Yu. and Yarmoluk S.M. Interaction of dimeric styryl dyes with dsDNA: spectral-luminescent studies // International Conference for Physics Students. – Bucharest (Romania), 2006. – P.14.

20. Balanda A.O., Kovalska V.B., Volkova K.D., Losytskyy M.Yu., Yarmoluk S.M. Syntesis and spectral-luminescent atudies of novel 4-oxo-4,6,7,8-tetrahydropyrrolo[1,2-a]thieno[2,3-d]pyridinium styryls as fluorescent dyes for biomolecules detection // International conference chemistry of nitrogen containing heterocycles. – Kharkiv (Ukraine), 2006. – P.254.

21. Balanda A.O., Kovalska V.B., Volkova K.D., Yarmoluk S.M. Synthesis and spectral-luminescent studies of dimeric styrylcyanine dyes // International conference chemistry of nitrogen containing heterocycles. – Kharkiv (Ukraine), 2006. – P.253.

АНОТАЦІЯ

Баланда А.О. Стирилціаніни для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот за одно- та двофотонного збудження. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2007.

З метою отримання флуоресцентних зондів для детекції нуклеїнових кислот (НК) за одно- та двофотонного збудження розроблено хімічні підходи до синтезу нових стирилціанінів з ефекторними групами та димерних барвників. Синтезовано та охарактеризовано понад 50 барвників, уперше синтезовано 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідино- та імідазо[1,2-а]піридиностирилціаніни. Виявлено, що стирилціанінові барвники на основі 4-оксо-4,6,7,8-тетрагідропіроло[1,2-a]тієно[2,3-d]піримідину виявляють селективність до РНК та мають великі значення перерізу двофотонного поглинання в її присутності. Вивчено вплив довжини та будови лінкеру димерних стирилціанінів на спектрально-люмінесцентні властивості їх комплексів з НК. Димерні стирилціаніни зі сперміновим лінкером у присутності НК значно підвищують інтенсивність флуоресценції та ефективно двофотонно збуджуються в комплексах з ДНК.

За допомогою спектрально-люмінесцентних методів вивчено механізм взаємодії 2-(п-диметиламіностирил)бензотіазолового барвника та його димерів з ДНК. Показано, що одержані стирилціаніни проникають в клітини та можуть бути використані у флуоресцентній мікроскопії для візуалізації НК. Ряд барвників запропоновано для практичного використання як флуоресцентні зонди для детекції НК за одно- та двофотонного збудження.

Ключові слова: стирилціаніни, флуоресцентні зонди, детекція нуклеїнових кислот, двофотонне збудження.

АННОТАЦИЯ

Баланда А.А. Стирилцианины для флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот при одно- и двуфотонном возбуждении. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. – Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2007.

С целью получения флуоресцентных зондов для детекции нуклеиновых кислот с большим сечением двуфотонного поглощения разработаны химические подходы к синтезу новых стирилцианинов с эффекторными группами, а также димерных красителей. При введении эффекторных групп в молекулу красителя использовано три разных способа, согласно которым эффекторная группа вводилась на разных стадиях синтеза стирилцианинов: в молекулу модифицированного красителя, на стадии получения четвертичной соли и в ядро исходного азогетероцикла. Предложен новый вариант синтеза димерных цианиновых красителей на основе реакции ацилирования хлорангидридами дикарбоновых кислот аминопроизводного гетероциклического основания. Получено и охарактеризовано более 50 красителей, среди которых впервые синтезированы стирилцианины на основе имидазо[1,2-а]пиридина и 4-оксо-4,6,7,8-тетрагидропироло[1,2-a]тиено[2,3-d]пиримидина.

Установлено, что стирилцианины на основе 4-оксо-4,6,7,8-тетрагидропироло[1,2-a]тиено[2,3-d]пиримидиния проявляют селективность к РНК и повышают интенсивность флуоресценции на два порядка в её присутствии. Показано, что введение алкиламмониевых эффекторных групп в молекулы стирилцианинов на основе бензотиазолового и пиридинового ядер значительно увеличивают интенсивность флуоресценции красителей в присутствии ДНК. 4-(п-Диметиламиностирил)бензотиазоловые красители, эффекторная группа которых присоединена в 3 положении, имеют большие значения повышения интенсивности флуоресценции в присутствии