ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

Большой Дмитро Валерійович

УДК 613.546.49

ГІГІЄНІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ОСОБЛИВОСТЕЙ ТОКСИКОКІНЕТИКИ, ТОКСИКОДИНАМІКИ І БІОТРАНСФОРМАЦІЇ МАЛИХ ДОЗ РТУТІ

14.02.01 – гігієна

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Українському науково-дослідному інституті медицини транспорту Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України

Шафран Леонід Мойсейович,
Український інститут медицини транспорту МОЗ України, перший заступник директора, завідувач відділом гігієни і токсикології

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Александрова Людмила Георгіївна, провідний науковий співробітник Інституту медицини праці АМН України.

Доктор біологічних наук, професор Томашевська Людмила Анатоліївна, завідуюча лабораторією токсикологічних досліджень Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзєєва АМН України.

Захист відбудеться “12” жовтня 2007 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.554.01 при Інституті медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75)

Автореферат розісланий “09” вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Степаненко А.В.

Актуальність теми. Умови життєдіяльності людства на нашій планеті на порозі нового тисячоліття характеризуються кризовими відношеннями між антропогенним та природним середовищем, високим ризиком для здоров’я нашого та наступних поколінь (Ю.И. Кундиев, 2002; Н.Г. Проданчук, 2003; А.М. Сердюк, 2003; Б.М. Штабский, М.Р. Гжегоцкий, 2003; Л.М. Шафран, 2005; А.М. Нагорна, 2006; L. Breslow, 2006; M. Nieuwenhuijsen е.а., 2006).

Мрія В.І. Вернадського (1927) про гармонічну ноосферу як втілення єдності людини і природи на основі можливостей колективного розуму ще далека від свого здійснення. Тому проблема збереження і підвищення потенціалу здоров’я населення була і залишається надзвичайно актуальною для світової спільноти, перш за все, для медичної науки і практики.

У найбільшій мірі вона пов’язана з високою хімічною небезпекою, яка обумовлена не тільки сотнями тисяч хімічних сполук, що синтезовані людством за останні десятиріччя (Ю.И. Кундиев, А.П. Яворовский, 1999; Ю.І. Кундієв, І.М. Трахтенберг, 2004), але й традиційними забруднювачами довкілля, серед яких важким металам, поряд з пестицидами, належить провідна роль (А.П. Авцын с соавт., 1991; Х. Зигель, А. Зигель., 1993; Д.Д. Зербіно, А.М. Сердюк, 1998; А.В. Скальный, 1999; А.М. Сердюк, Э.Н. Белицкая, Н.М. Паранько, Г.Г. Шматков, 2004). Серед останніх найбільш небезпечною є ртуть (И.М. Трахтенберг, 1964; M.I. Mikheev, 1996; Г.И. Сидорин, 2001; EPA, 1997; UNEP, 2002). Постійний кругообіг ртуті та її сполук у довкіллі обумовлений високою летючістю, стійкістю, здатністю розчинюватися у атмосферних опадах, а також високою сорбцією ґрунтом та твердими частками природних вод, звідки вона поступає у біологічні та аліментарні ланцюжки (Т.Г. Лапердина, 2000; R.A. Efroymson е.а., 2004; S.E. Lindberg, е.а., 2005; D. Hryhorczuk e.a., 2006).

Використання ртуті людством налічує багато століть. Завдяки комплексу своїх унікальних фізичних та хімічних властивостей ртуть є обов’язковим учасником багатьох виробничих процесів, компонентом великої кількості приладів та пристроїв. В ряді випадків її застосування значно полегшує або робить більш дешевим досягнення відповідних технічних та технологічних результатів. Тому не випадково, що незважаючи на заходи з обмеження використання ртуті, перелік небезпечних за цим показником виробництв залишається досить великим та багатогалузевим, а вимоги щодо повного виключення ртуті зі сфери життєдіяльності людини технологи та експлуатаційники вважаються передчасними (В.Л. Сусликов, 2000).

Практичним результатом зусиль вчених, міжнародних організацій, громадськості стала відсутність за останні роки гострих отруєнь у ряді країн світу, менш частими стали хронічні отруєння, а самі рівні знаходження ртуті у виробничому середовищі знизилися. Принципово змінилися не тільки джерела надходження ртуті в організм, але й діючі рівні (И.М. Трахтенберг, М.Н. Коршун, 1990). Сьогодні більшість з них відноситься практично до факторів малої інтенсивності. Проте, хоча термін “мікромеркуриалізм” був вперше введений в нашій країні І.М. Трахтенбергом ще 40 років тому і з того часу знайшов широке розповсюдження серед гігієністів і токсикологів, до сьогодні відсутнє його загальновизнане кількісне тлумачення.

Тому провідним напрямком наукових досліджень і практичної діяльності токсикологів і гігієністів в сфері ртутної безпеки стає боротьба не з меркуриалізмом (ртутними отруєннями), а з мікро- і ультрамікромеркуриалізмом, тобто ефектами небезпечної дії на організм малих доз та концентрацій ртуті, біологічна дія яких досі залишається темою гарячих наукових і громадських дискусій, а багато аспектів і завдань – не вирішеними. Експериментальній розробці проблеми мікромеркуриалізму, поглибленню наших знань з токсикології ртуті було присвячене виконання даної дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом науково-дослідних робіт: “Наукове обгрунтування, розробка і впровадження системи гігієнічної регламентації пересічення кордонів України транспортними засобами з харчовими вантажами та сільськогосподарською сировиною” (Державний реєстраційний № 0102U004162, термін виконання 2001-2003 рр.); “Обґрунтування і розробка методу диференційованого визначення вмісту органічної та неорганічної форм ртуті в біооб’єктах” (Державний реєстраційний № 0104U009944, термін виконання 2003-2005 рр.).

Мета роботи: вивчення особливостей токсикокінетики, токсикодинаміки і біотрансформації малих доз ртуті у різних біосистемах з використанням удосконалених та нових методів визначення різних форм ртуті для підвищення ефективності гігієнічної регламентації і профілактики інтоксикацій у сучасних виробничих та екологічних умовах.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

1. Визначити вміст ртуті у повітрі робочої зони, довкіллі, харчових продуктах та інших джерелах надходження ртуті в організм з урахуванням лімітуючих можливостей аналізу її різних форм, доз та концентрацій.

2. Дослідити токсикокінетику, шляхи і механізми транспорту, міжорганне розподілення ртуті, яка була введена в організм у вигляді різних сполук, в залежності від дози.

3. Провести дослідження вмісту різних форм ртуті у різних органах і тканинах організму, їх токсикодинаміку in vitro та in vivo, а також визначити вірогідні механізми токсичної дії різних форм цього ксенобіотику.

4. Обґрунтувати та розробити рекомендації з ідентифікації та кількісного аналізу різних форм ртуті у біосистемах з урахуванням особливостей їх фізико-хімічних і токсичних властивостей для цілей гігієнічної регламентації у природному, виробничому середовищі і у біологічних об’єктах, а також лікуванні і профілактиці інтоксикацій.

Об’єкт досліджень: гігієнічно значущі форми ртуті в організмі, токсична дія малих доз, хімічні та біологічні маркери, способи індикації.

Предмет досліджень: комплекс показників і параметрів, що характеризують токсичну дію ртуті на організм людини і тварин, а також фізико-хімічні властивості різних сполук цього металу.

Методи дослідження: Фізико-хімічні, гігієнічні, токсикологічні (гострий, підгострий, субхронічний експерименти, досліди in vivo на білих щурах та in vitro на розчинах білків, переживаючих відрізках тонкої кишки щурів, а також клінічні лабораторні дослідження експонованих ртуттю людей), біохімічні (визначення активності ферментів в крові, сечі, органах лабораторних тварин), математичні та статистичні (обробка результатів досліджень).

Наукова новизна і теоретичне значення роботи полягають у систематизації існуючих, обґрунтуванні і розробці нових методичних підходів щодо проведення комплексних лабораторних досліджень об’єктів довкілля, сировини і харчових продуктів, біологічних субстратів для визначення ступеню і еколого-гігієнічної значущості їх забруднення ртуттю з застосуванням сучасних фізико-хімічних методів і біомаркерів, урахуванням виявлених форм, доз і концентрацій, а також більш чітких та раціональних, способів інтерпретації одержаних результатів. Сформульовано положення щодо визначення поняття “мала доза” ртуті та її сполук у санітарно-гігієнічних дослідженнях. Встановлено кількісні закономірності та пов’язані з дозою особливості накопичення, розподілення, взаємоперетворення і виведення різних сполук і форм ртуті в організмі.

Практичне значення роботи:

· Проведено удосконалення аналітичної бази поточних лабораторних досліджень ртуті, її органічної та неорганічної форм і сполук в системі державного санітарно-епідеміологічного нагляду.

· На основі аналізу результатів лабораторних досліджень обґрунтована необхідність урахування різних форм ртуті у досліджених об’єктах в ході санітарно-епідеміологічної експертизи та здійснення санепіднагляду.

· Вивчено особливості токсичної дії різних форм ртуті за умови інтоксикації малими дозами як патогенетичної основи їх токсичної дії.

· Обґрунтовано і розроблено нові методичні підходи щодо кількісної оцінки різних форм ртуті у біооб’єктах.

· Показана роль металотіонеїнів в системі біологічного захисту і токсикогенезі ртутних інтоксикацій, а також доцільність використання цього показника за новим розробленим методом як чутливого біомаркера в експериментальних та клінічних дослідженнях.

Впровадження результатів роботи у практику.

1. Розроблено спосіб кількісного роздільного визначення органічної та неорганічної ртуті в атмосферному повітрі, воді та грунті, а також в біосубстратах та інших об’єктах біологічного походження, адаптований для масових поточних аналізів лабораторіями санепідслужби. Пріоритет розробленого способу визначення ртуті підтверджено патентом України № 4328 U від 17.1.2005.

2. Розроблено спосіб визначення металотіонеїну в біологічних об’єктах, який захищено патентом України № 60439 А від 15.10.2003.

3. Вдосконалено прилад “Юлія” — аналізатор ртуті;

4. Змінено методику пробопідготовки для методу визначення ртуті.

5. Підготовлено і затверджено наказом МОЗ України Методичні вказівки МВ 10.1-115-2005 „Визначення вмісту ртуті в об’єктах виробничого, навколишнього середовища і біологічних матеріалах”.

6. Матеріали дисертаційної роботи впроваджені в практику Інституту медицини праці АМН України, центральної науково-дослідної лабораторії Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Миколаївської обласної санепідстанції, що підтверджується відповідними актами впровадження.

Матеріали дослідження можуть бути використані для подальшого вдосконалення гігієнічних регламентів і норм важких металів (ВМ), при проведенні попереднього і поточного санепіднагляду та державної санепідекспертизи.

Особистий внесок пошукувача. Дисертантом самостійно визначені та сформульовані мета і задачі дослідження, розроблено план і проведені натурні санітарно-хімічні дослідження, експерименти in vitro i in vivo щодо визначення різних гігієнічно значущих форм ртуті у біооб’єктах, а також в крові та сечі працюючих і населення, що мають виробничо зумовлений та екологічний контакт з її сполуками; також самостійно проведено досліди щодо визначення особливостей токсикокінетики, токсикодинаміки, транспорту, накопичення, первинного та вторинного розподілення і біотрансформації різних сполук ртуті у клітинах, тканинах, органах та організмі в цілому; проведено математичну обробку і здійснено токсиколого-гігієнічний аналіз результатів досліджень, написано всі розділи дисертації, обґрунтовано і сформульовано висновки, а також основні положення документів впровадження результатів в практику.

Апробація результатів дисертаційної роботи. Основні результати та положення дисертаційної роботи були представлені на: Intern. Symp. “EUROTOX – 2001”, (Istanbul, Turkey, 2001); международн. конф. “Здоровье и окружающая середа”, посвященной 75-летию Белорусского НИИ санитарии и гигиены (Минск, Белоруссия, 2002); науковій конференції “Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків” (Чернівці, 2002); Intern. Ecologic Forum (St. Pertersburg, Russia, 2003), ІІ-му з’їзді токсикологів України (Київ, 2004); the 2-nd Asian Intern. Conf. on Ecotoxicology and Environmental Safety (Songkla, Thailand, 2004); Всеукраїнській науково-практичній конференції „Проблеми діагностики, профілактики та лікування екзогенних та ендогенних інтоксикацій”, (Чернівці, 2004); Третьей междисциплинарн. (медицина, биология, физика, радиоэлектроника, химия, биохимия, математика, информатика, педагогика) конф. c международн. участием (Петрозаводск, Россия, 2004); на 25-м Міжнародному симпозіумі “Промислова токсикологія 05” (Словаків, Братіслава, 2005); на II Международной конференции “Гомеостаз: физиология, патология, фармакология и клиника” (28-29 сентября 2005 г., Одесса); на VI Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини” (Київ, 2005); на Першому міжнародному конгресі “Медицина транспорту-2005” (Одеса, 2005); на Перших і Других Марзеєвських читаннях “Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України” (Київ, 2005 та 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 22 наукову роботу, з них 11 - у фахових виданнях, які входять до переліку ВАК України, і 11 – в інших журналах та матеріалах з’їздів, конференцій, симпозіумів.

Структура та об’єм дисертації. Робота складається із вступу, огляду літератури, розділу, в якому висвітлені об’єкти, контингенти, матеріали і методи досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, висновків, списка використаних джерел - 244 посилань. Дисертація викладена на 142 сторінках друкованого тексту, проілюстрована 39 таблицями і 35 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Програма досліджень містила в собі елементи системного підходу, які первинно виходять з уявлення про організм як дуже складну динамічну систему, регулювання життєдіяльності якої здійснюється завдяки двоєдиному інформаційно-енергетичному механізму, консолідованому у інтегральному клітинному метаболізмі (обмін речовин) і сукупності фізіологічних функцій (функціональній системі організму), як це видно на рис. 1

Основні блоки програми віддзеркалюють застосовані в роботі основні об’єкти, методичні підходи, а також комплексний характер проведених досліджень.

Згідно з розробленою програмою клініко-фізіологічні дослідження проводили серед робітників системи Міністерства транспорту і зв’язку України. Перша група (працівники Одеської телефонної мережі) багаторазово обстежена у плановому порядку в ході щорічних медичних оглядів (2004-2006 рр.). Друга і третя групи (робітники залізничного транспорту та моряки) були обстежені за санітарно-епідеміологічними та клінічними передумовами. Обстеженню підлягали особи чоловічої та жіночої статі, віком 19-65 років. У всіх обстежених відбирали зразки сечі, крові та волосся (вибірково) для визначення вмісту ВМ. Пробопідготовку проводили загальноприйнятими методами з урахуванням доповнень та змін, запропонованих нами в ході попередніх аналітичних досліджень.

Вміст токсичних і есенціальних ВМ (Ca, Cd, Cu, Fe, Pb, Zn) у досліджених об’єктах визначали атомно-абсорбційним методом на спектрофотометрі AAS-3 (фірми “Carl Zeiss” JENA) з модифікованою приставкою “Графіт-7”, спектрофотометрі “Сатурн-3-П1”, атомно-емісійним методом на атомному спектрометрі “ЭМАС-200 ДСС”, а вміст ртуті - методом холодної пари на аналізаторі ртуті “Юлія-2”, модернізованому співробітником Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України А.О. Кучером за нашими пропозиціями (в результаті модернізації чуттєвість приладу зросла на порядок, підвищилися надійність та відтворюваність вимірювань).

В ході проведення досліджень нами було запропоновано ряд змін у методах пробопідготовки, проведення аналізу, які детально розглядаються у розділі 4 і знайшли впровадження у Методичних вказівках МВ 10.1-115-2005 “Визначення вмісту ртуті в об’єктах виробничого середовища, у довкіллі та біологічних матеріалах”.

З багатьох існуючих різноманітних форм та сполук ртуті для поглибленого вивчення були вибрані дві органічні (етилмеркурхлорид СН3СН2HgCl і тімеросал C2H5HgSC6H4COONa) та чотири неорганічні (хлорид, нітрат, ацетат і фосфат) форми ртуті, що суттєво відрізняються за фізико-хімічними і термодинамічними властивостями.

Експериментальні дослідження in vivo проведено на статевозрілих безпородних щурах-самцях масою 180-200 г. Тварин утримували в стандартних умовах віварію з вільним доступом до їжі та води, які додатково досліджувались на вміст важких металів. В ході експерименту щурам піддослідних та контрольних груп проводили термометрію та зважування, а також загальний аналіз крові до початку та після закінчення відповідної серії дослідів. Токсикологічні дослідження включали гострі (одноразове введення), підгострі (3-5 введень) і субхронічні (30 введень) дослідження, в різних серіях яких тваринам перорально або внутришньочеревнево вводили водні розчини сполук ртуті у дозах 1/10, 1/100, 1/200, 1/1000, 1/10000 та 1/100000 ЛД50.

Об’єктами дослідження були кров (плазма або сироватка та клітинні елементи), тканини печінки, нирок, головного мозку, селезінки, серця, бедреної кістки та сеча тварин. Біохімічні дослідження охоплювали широкий спектр біомаркерів, що характеризують основні патогенетичні механізми зрушень клітинного метаболізму під час експозиції організму ртуттю у різних формах і сполуках. Дослідження проведені на гомогенатах органів за стандартною методикою, а також на субклітинних фракціях, які одержували методом диференційованого центрифугування у градієнті сахарози на рефрижераторній центрифузі “Eppendorf Centrifuge 5415 R”.

Тіоловий потенціал системи захисту оцінювали за вмістом окислених та відновлених тіолових груп (SH-груп та SS-зв’язків) в плазмі крові щурів за методом И.В.Веревкина и др. (1977). Стан процесів вільно-радикального окислювання, утворення активних форм кісню та розвитку оксидативного стресу визначали за інтенсивністю спонтанного накопичення низькомолекулярних продуктів ПОЛ, які реагують з тіобарбітуровою кислотою – ТБК-активні продукти в крові, гомогенатах тканин досліджуваних органів за методом И.Д. Стальной., Т.Г. Гаришвили (1977), а в ряді дослідів – ферментативного та неферментативного ПОЛ, а також рівню дієнових кон’югатів (ДК). Одночасно оцінювали реакцію глутатіонової антиоксидантної системи (ГАОС) за величинами активності ферментів: глутатіонпероксидази (ГП, 1.11.1.7) за методом В.А. Пахомовой и др. (1982), глутатіонредуктази (ГР, 1.6.4.2), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ, 1.1.1.49) за М.И. Прохоровою (1982). Крім того, у ряді досліджень визначали активність ключових ферментів клітинного метаболізму: кислої фосфатази (КФ, 3.1.3.2), лужної фосфатази (ЛФ, 3.1.3.1), сукцинатдегідрогенази (СДГ, 1.3.99.1) за Л.А. Даниловой (2003), супероксиддисмутази (СОД, 1.5.1.5) за методом N. Nishikimi е.а. (1992). Концентрацію білку визначали за допомогою реактиву Фоліна-Чіокальтеу за Р. Досон и др.. (1991).

Металотіонеїни (МТН) – низькомолекулярні транспортні білки, індуктивний синтез яких відбувається при введенні деяких важких металів, в тому числі ртуті. Індукція синтезу МТН може бути біомаркером металотоксикозу. Методика H.H. Dieter е.а. (1987) визначення металотіонеїнів в біологічних об’єктах була нами модернізована (патент України № 60439 А від 15.10.2003 р.).

Експеримент in vitro по вивченню впливу ВМ на епітелій переживаючого відрізку тонкої кишки білих щурів у живильному середовищі Хенкса проводили в дослідах з різними концентраціями ртуті у заповнюючому розчині (0,1 мг/л, 0,5 мг/л, 5,0 мг/л и 50,0 мг/л), для двох форм ртуті — неорганічної (сулема) і органічної (тімеросал), а також з різною за часом експозицією (15, 30, 45 хвилин, 1 і 2 години). Порівняльні дослідження проведені з розчином хлориду кадмію (0,5 мг/л). Після експозиції визначали вміст ВМ у внутрішньому, зовнішньому розчинах і стінці кишки, вміст вільних SH-груп, активність ПОЛ, антиоксидантних ферментів, а також число апоптозних клітин епітелію, число лейкоцитів у розчині з середовищем Хенкса.

Всі результати обробляли методами варіаційного та кореляційного аналізу з використанням програми Microsoft Excel (О. Кох, 1994; С.Н. Лапач и др., 2000; М.Ю. Антамонов, 2006).

Таким чином, комплекс застосованих методів дозволив поетапно виконати поставлені в роботі завдання. Кількісні показники виконаних досліджень підсумовані в табл. 1.

Таблиця 1

Кількісні показники проведених досліджень

Види досліджень | Кількість

Хіміко-аналітичні:

Визначення ртуті методом атомної абсорбції (методом холодної пари), аналізів | 9350

Визначення кадмію методом атомної абсорбції (з електротермічною атомізацією), аналізів | 1246

Проведено серій експериментальних досліджень:

Серії експериментальних досліджень in vivo | 14

Серії альтернативних експериментальних досліджень in vitro | 11

Використано лабораторних тварин | 480

Біохімічні дослідження:

Визначення активності ферментів, в тому числі антиоксидантних систем | 4892

Визначення вмісту продуктів ПОЛ в тканинах | 1246

Визначення вмісту МТН в тканинах | 1869

Визначення вмісту SH-груп в тканинах | 1246

Оптимізаційних аналітичних досліджень | 84

Фізіологічні дослідження:

Клініко-фізіологічні дослідження, групи людей | 5

Всього обстежено людей, в т.ч.: | 453

Працівники Одеської телефонної станції | 407

Працівники Одеської залізниці | 32

Екіпаж теплохода “Carmen” | 14

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведеними дослідженнями встановлено, що рівні забруднення Hg повітря робочої зони на обстежених транспортних об’єктах та атмосферного повітря у великому промисловому місті (Одеса), питної та морської води, донних відкладень у акваторії портів набагато нижчі за відповідні ГДК (у 5-10 разів).

Вміст ВМ у харчових продуктах в основному не перевищував МДР (по ртуті, як правило, не вище 0,5 МДР). Найбільш високі рівні ртуті і свинцю (від 0,5 до 1,0 ГДК) визначали у зерні, крупах, борошні (у 11,0 % проб), грибах – 11 і 25 % проб, відповідно. Такі рівні кадмію спостерігалися у більш ніж 30 % проб грибів та горіхів та 25 % проб сухофруктів. Незначне (до 2,5 разів) перевищення ГДК для ртуті у зерні відмічалося у 4,55 % проб, кадмію – у горіхах (2,53 % проб). За три роки моніторингових спостережень ситуація практично не змінилася. Цілком слушно, що рівні контамінації ВМ експонованого ними населення були невисокими. Так, концентрації ртуті в сечі 407 обстежених в плановому порядку робітників зв’язку коливалися від 0,1 до 35,1 мкг/л у чоловіків і від 0,1 до 141,1 мкг/л у жінок. Коефіцієнт кореляції між вмістом свинцю і ртуті в сечі в генеральній сукупності був незначним (r = 0,207). У осіб з відносно високим рівнем ВМ (CHg > 25 мкг/л) він зростав до r = 0,954.

Експериментальні дослідження показали, що введена в організм Hg швидко зв’язується з білками крові, перш за все – альбуміном. У дослідах in vitro з внесенням різних доз Hg2+ (від 0,1 до 100 мкг/мл) у водний розчин альбуміну вона практично повністю зв’язувалася з білком. Сорбційна ємність альбуміну по відношенню до іонів Hg2+ дуже висока: навіть при масовому співвідношенні Hg:БСА = 1:40, що відповідає 7 атомам ртуті на одну молекулу альбуміну, не спостерігається насичення біосубстрату. В надосадочній рідині після кип’ятіння кількість ртуті незначна (до 2 %) і практично не залежить від того, скільки її було внесено в систему спочатку, а визначається головним чином рівнем чистоти реактивів. Це підтверджує тезу, що внесена в пробу ртуть цілковито кількісно зв’язується з білком і під час денатурації осаджується разом з ним. Одержані дані мають значення для вивчення транспорту і токсикокінетики Hg, а також вирішення аналітичних задач пробопідготовки.

Після внутришлункового введення білим щурам HgCl2 в дозі 5 мг/кг із застосуванням розробленого нами методу роздільного визначення неорганічної і органічної форм ртуті встановлено прогресивне зростання її вмісту в гомогенатах головного мозку і печінки після експозиції від 2 до 48 годин з 0,054 ± 0,002 до 0,225 ± 0,005 мкг/г і з 8,216 ± 0,153 до 37,756 ± 0,671 мкг/г, відповідно. Одночасно зростає вміст органічної ртуті (з 0,054 ± 0,002 до 0,225 ± 0,005 мкг/г і з 8,216 ± 0,153 до 37,756 ± 0,671 мкг/г, відповідно). Тобто має місце біотрансформація (частіше за все – метилювання) неорганічної ртуті в органах-мішенях, що, безумовно, має токсикологічне значення. Одночасно протікає і зворотній процес, як було показано нами при введенні щурам 5 мг/кг C2H5HgCl в перерахунку на метал. Вміст органічної ртуті змінювався в гомогенаті головного мозку з 0,117 ± 0,003 до 2,739 ± 0,056 мкг/г і неорганічної – з 0,004 ± 0,001 до 1,91 ± 0,043 мкг/г, а в печінці – з 2,941 ± 0,056 до 25,574 ± 0,568 мкг/г органічної і з 0,189 ± 0,004 до 31,832 ± 0,529 мкг/г неорганічної ртуті, відповідно.

Вивчення кінетики зміни вмісту ртуті в різних органах при субхронічній експозиції показало, що практично з моменту введення Hg починається перша фаза міжорганного розподілення токсиканту у послідовності: кров - печінка > нирки > селезінка > головний мозок > серце > кістки. Вторинна фаза чітко просліджується з другого тижня досліду, носить дозозалежний характер і має послідовність: нирки > печінка > селезінка > головний мозок > серце > кістки > кров. На рис. 2 проілюстровано кінетику змін вмісту ртуті у субхронічному експерименті при введенні Hg (NO3)2 у дозах 0,1 мг/кг. Звертає на себе увагу складна залежність концентрації ртуті в крові від часу на відміну від монотонного підвищення вмісту металу в мозку і паренхіматозних органах. Ми припускаємо, що наявність максимуму на концентраційно-часовому графіку крові пов'язана з активізацією адаптаційних механізмів, що виявляється в посиленні зв’язування, транспорту і виведення ртуті з організму. В цьому плані токсикокінетика Hg хоча і однотипна з іншими ВМ, кількісно суттєво відрізняється навіть від найбільш близького за механізмами дії кадмію. При введенні щурам в дозах 0,1 мг/кг абсолютне накопичення ртуті в нирках на 30 добу досліду було в 6,7 рази вище, ніж кадмію, тоді як в печінці — лише в 3,0 рази вище.

Рис. 2. Залежність середнього вмісту ртуті в різних органах щурів після введення нітрату ртуті в дозі 0,1 мг/кг (по металу) щоденно (внутришлунково) від тривалості експозиції, мкг/г.

Формування системи транспорту, детоксикації і виведення Hg із організму відбувається на клітинному рівні. Одним з провідних механізмів клітинного токсикогенезу ртуті є оксидативний стрес, маркерами якого являються суттєві зміни інтенсивності процесів вільнорадикального окислення і активності антиоксидантних систем. Експозиція неорганічними сполуками ртуті призводила до активації переважно неферментативного ПОЛ у печинці, нирках, крові і головному мозку експериментальних тварин (на 20-90 %) з одночасним зниженням у 1,0-1,5 разів активності СОД, ГП. ГР, Г-6-ФДГ. Органічні форми призводили до активації як ферментативного, так і неферментативного ПОЛ (на 90-280 %) з більш вираженим пригніченням маркерних ферментів.

Оскільки функції клітинного метаболізму просторово розподілені (компартменталізовані) у різних субклітинних фракціях, в спеціальній серії досліджень вивчали дію малих доз ртуті (1/200 DL50 — 0,1 мг/кг) на функціональний стан маркерних ферментів мітохондрій (СДГ) і лізосом (КФ та ЛФ).

У виділених диференційованим центрифугуванням субклітинних фракціях печінки, нирок і мозку експонованих ртуттю (1/200 DL50) білих щурів спочатку визначали вміст ртуті (табл. 2.).

Таблиця 2.

Вміст ртуті у субклітинних фракціях білих щурів, мкг/г (n = 3; p < 0,05)

Орган | Субклітинна фракція | Група тварин, вміст Hg, мкг/г

Контроль | Дослід

Печінка | Ядра | 0,0755 ± 0,0034 | 2,304 ± 0,094

ЛЗС + РЕМ | 0,0120 ± 0,0005 | 24,843 ± 0,899

Мітохондрії | 0,0062 ± 0,0002 | 6,015 ± 0,225

Нирки | Ядра | 0,0694 ± 0,0027 | 1,811 ± 0,085

ЛЗС + РЕМ | 0,0155 ± 0,0007 | 35,623 ± 1,600

Мітохондрії | 0,0228 ± 0,0011 | 22,425 ± 0,727

Головний мозок | Ядра | < 0,01 | 0,027 ± 0,001

ЛЗС + РЕМ | < 0,01 | 0,253 ± 0,012

Мітохондрії | < 0,01 | 0,219 ± 0,010

У порівнянні з контролем рівень накопичення ртуті виріс у печінці у 30,3, у нирках – у 26,2, а в мозку – більш ніж у 2,7 рази. В мітохондріях рівень вмісту ртуті виріс у мозку не менш як на порядок, а в печінці і нирках – майже у 1000 разів. Але найбільший рівень зростання вмісту ртуті серед клітинних компартментів зафіксовано у лізосомальній фракції нирок – у 2300 разів. Слід вважати, що одержані результати не є випадковими, тому що: 1. фоновий вміст ртуті у компартментах клітин паренхіматозних органів білих щурів контрольної групи був надзвичайно низьким (нерідко, як у головному мозку, на грані чутливості методу); 2. в літературі є повідомлення про накопичення у клітинах епітелію проксимальних ниркових канальців краплин Hg у електронейтральній формі; 3. в проведених нами дослідженнях різко підвищувався також вміст Hg у МХ клітин нирок (майже у 1000 разів); 4. значно підвищувалась активність маркерних ферментів МХ і ЛЗС, що можливо лише при різкому підвищенні проникливості і деструкції відповідних клітинних органел.

В цьому плані представляло інтерес проаналізувати деякі особливості змінення активності ферментів у клітинних компартментах паренхіматозних органів експериментальних тварин. Виявлено наявність суттєвих розбіжностей у характері спостерігаємих змін активності ключових ферментів МХ і ЛЗС печінки і нирок експонованих ртуттю білих щурів (рис. 3).

Як у гомогенаті печінки, так і у клітинних фракціях найбільш виражені зміни мали місце в активності СДГ. Особливо чітко це просліджується у фракції МХ, де активність гідролаз (КФ і ЛФ) по відношенню до контролю практично зовсім не змінювалась. Проте, у гомогенаті і фракції ЛЗС активність маркерного лізосомального ензиму ЛФ суттєво підвищувалась (на 152 і 244 %, відповідно). У гомогенаті головного мозку експонованих ртуттю щурів активність СДГ знижувалася на 30, а ЛФ – на 81 %, тоді як активність КФ практично не зазнала змін.

Рис. 3. Зміни (% до контролю,) активності ферментів в гомогенаті і в клітинних фракціях тканин щурів (гостра експозиція HgCl2, 10 мг/кг, виведення з експерименту через 1 добу)

У фракції лізосом суттєвих змін зазнала лише активність ЛФ (маркерний ензим), тоді як у фракції МХ, що забезпечує енергетичні потреби ЦНС, спостерігалося підвищення активності СДГ і ЛФ (на 9 і 75 % по відношенню до контролю, відповідно), а також різке пригнічення активності КФ (на 53 %). Інакша картина спостерігалася у нирках. Як у гомогенаті, так і у досліджених субклітинних фракціях (МХ і ЛЗС) спостерігали суттєве, у відношенні до контролю, зниження активності всіх досліджених ключових ферментів енергетичного метаболізму та детоксикаційної функції. Причому, активність СДГ була пригнічена приблизно у 2 рази менше за рівень пригнічення лізосомальних ферментів КФ і ЛФ.

Одержані експериментальні дані поглиблюють наші уявлення про патогенетичні механізми токсичності малих доз ртуті. По-перше, це стосується енергозабезпечення провідних органів і систем при експозиції організму Hg. Як видно з наведених на рис. 3. даних, саме в печинці, де проходять найважливіші процеси детоксикації ксенобіотиків, активність СДГ зростала на 164 %. Енергетика гепатоцитів, очевидно, переходить на більш енергопродуктивний, другий вузловий пункт переносу електронів. По-друге, підвищується активність всіх флавопротеідів, що мають ферментативні властивості, до яких, поряд із суто мітохондріальними ензимами, такими, як СДГ та NADH-дегідрогеназа, належать також супероксиддісмутази (СОД). Сигнали для активації СОД можуть мати однакову природу при дії різних чинників. Але пул СОД у клітинах дуже лімітований. ВМ його не тільки швидко використовують, призводять до зниження активності ферменту, відсутність або пригнічення якого призводить до підвищення швидкості реокислення відновленого флавіну з продукцією пероксидів, головним чином, H2O2 (Ю.І. Губський, 2000). Тому оксидативний стрес тісно пов’язаний з недостатньою енергопродукцією саме мітохондріальної ланки забезпечення клітини АТФ та інших сполук з багатими енергією зв’язками (D. Wu, A.I. Cederbaum, 2005). В наших дослідах це ілюструється результатами визначення активності ферментів у мітохондріальній фракції, що мали виражену тенденцію до зниження, в тому числі СДГ — достовірно (р < 0,05). Хоча оксидативний стрес викликає відкриття пор і пошкодження мембран МХ, на рівні малих доз виходу СДГ та інших ферментів в цитозоль не спостерігається, що підтверджується достовірно зниженою активністю СДГ у надосадочній фракції (р < 0,05).

Серед найбільш чутливих до рівню забезпечення киснем і енергопродукції систем організму є ЦНС. Тому закономірно, що ферментативна активність більшості представників енергетичного пулу клітин, що забезпечують трофічні функції нейронів, була знижена. Саме за таких умов полегшується транспорт ртуті крізь гематоенцефалічний бар’єр, тим більше, що й іонізовані, і органічна (метильована) форми ртуті перетинають цей бар’єр у зв’язаних з тіоловими сполуками комплексах (N. Ballatori, 2002). Особливо важливу роль в цьому процесі відіграє цистеїн, який утворює з ртуттю досить тривкі кон’югати (C.C. Bridges, R.K. Zalups, 2005). Таке явище одержало назву “мімікрія важкого металу”, що є притаманним і для ртуті.

Оскільки функцію транспорту Hg в нирки цілеспрямовано здійснює МТН, це призводить не тільки до найбільш високого вмісту ртуті у всіх субклітинних фракціях нирок, але й до тотального зниження ферментативної активності в них, в середньому на 25-50 %. Тому й феномен нефротоксичності чітко просліджується у всіх серіях наших експериментальних досліджень, що узгоджується з даними літератури (А.И.Гоженко, 2004, 2006; І.М.Трахтенберг з співав., 2006).

Чутливість до ртуті епітелію проксимальних канальців нирок не є виключним феноменом, а представляє біологічну закономірність, характерну для впливу ряду ВМ, в тому числі, Cd (R.K.Zalups, S.Ahmad, 2003). Оскільки нефрон для звичайних токсикологічних досліджень є досить важко досяжним, для вивчення особливостей реалізаціїї клітинних механізмів токсичної дії малих доз ртуті як модель для досліджень in vitro було застосовано переживаючий відрізок порожньої кишки білих щурів у живильному середовищі Хенкса (Л.М.Шафран, 2006). На такий спосіб проводяться дослідження і в інших лабораторіях (С.П.Луговський, 2002). Між нирковим та інтестинальним епітелієм існує відносно близька аналогія за походженням, структурою і багатьма функціональними особливостями. Але в останньому випадку відслідити динаміку металотоксикопатії набагато легше.

Дослідження показали, що більша частина введеного в розчин ВМ (як ртуті, так і кадмію) поглинається з заповнюючого кишку розчину тканинами її стінки. У зовнішньому розчині Хенкса помітного зростання концентрації ВМ не зафіксовано.

Результати досліджень показують, що у всьому діапазоні експериментально перевірених концентрацій спостерігається монотонна залежність активності ГП, ГР, вмісту МДА, числа лейкоцитів и апоптозних клітин від концентрації агенту, що був введений в сегмент кишки. Активність КФ і ЛФ має екстремум, що простежується на певній концентрації для кожного ферменту (рис. 4).

Рис. 4. Залежність активності кислої та лужної фосфатази у тканинах стінки тонкої кишки від концентрації тімеросалу, експозиція 30 хв.

Річ може йти про прояв правила, згідно з яким великі дози токсиканту сприяють неспецифічній цитотоксичній дії з пригніченням лізосомальних ферментів, тоді як при низьких дозах відмічається специфічна дія ртуті, яка проявляється у переважно транзиторній активації ферментів. Наявність такого етапу токсичної дії малих доз ртуті, поряд з індивідуальними розбіжностями у чутливості організму до хімічної агресії, лежить в основі парадоксальної токсичності, а також розкриває часовий характер адаптації до отрут, гормезісу тощо (A. Boguszewska, K. Pasternak, 2004; Л.М. Шафран, 2004).

Процеси і механізми транспорту, біотрансформації в організмі і виведення ртуті тісно пов'язані з наявністю і рівнем специфічного транспортного білку МТН. У спеціальному експерименті на білих щурах було показано, що під впливом введеної Hg індуктивний синтез МТН суттєво зростає (табл. 3). Причому, індукція МТН виконує сигнальну роль в активації процесу виведення токсиканта з організму у гепато-ренальному циклі. У зв'язку з цим представляється вірогідним, що здатність тої або іншої сполуки ртуті викликати індукцію МТН значною мірою визначає токсикодинаміку цього токсиканта. Тому представляло інтерес вивчити співвідношення індукційних властивостей різних форм ртуті.

Таблиця 3

Вміст металотіонеіну в гомогенні печінки білих щурів після індукції його синтезу з експозицією 24 години

Об’єкт
дослідження | Група тварин, вміст МТН у нмоль/г тканини

І | ІІ | ІІІ | ІV

Печінка | 0,326 ± 0,024 | 0,405 ± 0,025* | 10,80 ± 0,92* | 0,371 ± 0,044

Нирки | 0,753 ± 0,041 | 1,094 ± 0,053* | 1,82 ± 0,11* | 1,256 ± 0,072*

Позначення груп: I – контроль, II – після введення фракції гомогенату печінки з нативним МТН, III – те ж саме з індукованим МТН, IV – після введення HgCl2; * p < 0,05

Для дослідження були взяті розчини етилмеркурхлориду, тимеросалу, хлориду, нітрату, фосфату і ацетату ртуті (II), які вводилися білим щурам внутришлунково щодня протягом 14 діб з розрахунку 0,1 мг/кг. По закінченні двох тижнів тварини виводилися із експерименту, у них відбирали кров і досліджували на вміст металотіонеїну. Результати дослідження представлено в табл. 4.

Таблиця 4

Вміст металотіонеїну в крові білих щурів після експозиції різними сполуками ртуті

Токсичний агент | Вміст МТН в крові, пмоль/мл

Етилмеркурхлорид | 17,4 ± 2,8

Тимеросал | 18,8 ± 3,1

Хлорид ртуті | 24,0 ± 4,0

Нітрат ртуті | 22,0 ± 3,2

Фосфат ртуті | 22,5 ± 0,7

Ацетат ртуті | 22,8 ± 4,0

Контрольна група | 4,9 ± 0,6

Представлені дані свідчать, що всі сполуки ртуті незалежно від хімічної форми викликають індукцію МТН. При цьому індуктивний ефект групи органічних сполук суттєво нижчий за неорганічні (p < 0,05). Відмінності між сполуками ртуті усередині обох груп недостовірні. Отримані дані підтверджують результати досліджень інших авторів (Zhi-Yong Huang e.a., 2004; J.H. Beattie е.а., 2005) щодо інформативності визначення рівнів МТН в крові і сечі як чутливих біомаркерів інтоксикації організму малими дозами ртуті.

Випадок виробничого контакту з ртуттю можна проілюструвати на прикладі 14 членів екіпажа італійського судна MSC “Carmen” (мешканці Одеси і Одеської області). За словами пацієнтів, на судні використовувалися несправні ртутні прилади. Витік металевої ртуті з цих приладів на підлогу суднових приміщень з недостатньою вентиляцією при високій денної температурі повітря в тропіках (30-40 °С) призвів після тритижневого періоду контакту до погіршення стану здоров'я членів екіпажу. Вони скаржилися на головний біль, металевий присмак, порушення сечовипускання. Вміст ртуті в крові і сечі більшості обстежених не перевищував фізіологічної норми (50/25 мкг/л і 25/10 мкг/л відповідно), проте був помітно вищий за середні значення у обстежених нами здорових неекспонованих осіб і складали для крові і сечі 11,2 ± 5,2 мкг/л і 4,1 ± 2,7 мкг/л, відповідно. Максимальна концентрація ртуті була знайдена у старшого механіка — 124,14 мкг/л в крові і 89,6 мкг/л — в сечі. У всіх членів екіпажа мала місце висока кореляція між вмістом ртуті в крові і сечі. У моряків, які звернулися до нас в перші 3 доби після повернення з рейсу, коефіцієнт кореляції між вмістом ртуті до крові і сечі складав 0,73 (p < 0,05). У всіх моряків спостерігалася виражена протеїнурія. Втрати білка з сечею складали 1,1-4,6 г/л. Вивчення вмісту ртуті в крові, сечі і волоссі моряків здійснювалося нами в період 4 місяців, протягом яких була виявлена