МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

БЕРКАЛО НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА

УДК: 615.454.1:616-001.4:615.28

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ МОЖЛИВОСТІ

ВИКОРИСТАННЯ НОВОЇ КОМБІНОВАНОЇ МАЗІ

ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ТРОМБОФЛЕБІТУ

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на базі Центральної науково-дослідної лабораторії Національного фармацевтичного університету МОЗ України

Науковий консультант: доктор фармацевтичних наук, заслужений діяч

науки і техніки України, професор

ЯКОВЛЄВА Лариса Василівна,

Національний фармацевтичний університет,

завідувачка Центральної науково-дослідної

лабораторії, завідувачка кафедри фармакоекономіки

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

ДРОГОВОЗ СВІТЛАНА МЕФОДІЇВНА,

Національний фармацевтичний університет,

Зав. кафедрою фармакології

доктор медичних наук,

СЕРЕДИНСЬКА Наталія Миколаївна

ДУ “Інститут фармакології та токсикології АМН України“,

Головний науковий співробітник відділу фармакології

серцево-судинних засобів

Захист відбудеться ”20“ грудня 2007 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01. при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера,4). Автореферат розісланий “19”листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук., професор Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розповсюдження хвороб вен серед осіб працездатного віку сягає 40–50%, та збільшується до 80–90% у старших вікових групах (Золоту- хін І.О., 2007; Wu O., Robertson L., 2005). Проте переважна більшість осіб, які мають венозні захворювання, зокрема, тромбофлебіти, не отримують належного лікування, особливо на початкових стадіях захворювання (Мішалов В.Г., 2002). У 95–97 % хворих на тромбофлебіт ураження розвивається у басейні поверхневих вен нижніх кінцівок (Кириєнко О.І, 2000). Висока частота виникнення венозних захворювань, тяжкий хронічний перебіг, розвиток небезпечних ускладнень (Blan A., 2006; Nicolaides A.N., 2005; Allegra G., 2001; Бурлєєва О.П., 2005; Сенчук А.Я., 2003) свідчать про актуальність та високу соціальну значущість фармакотерапії захворювань вен нижніх кінцівок, у тому числі тромбофлебітів.

Комплексний підхід до лікування тромбофлебітів поверхневих вен передбачає застосування лікарських засобів як системної, так і місцевої дії (Кириєнко О.І., Матюшенко О.А., 2006). Сучасний фармацевтичний ринок України багатий на різноманітні м’які лікарські форми (МЛФ), призначені для лікування венозних захворювань (Радзіховський А., 2004; Листопад А., 1999). Проте, 93% вітчизняних та 79% імпортних мазей та гелів, містять лише один чи два діючі компоненти та діють здебільшого на якусь одну чи дві ланки патогенезу захворювання. Навіть ті препарати, які містять декілька компонентів (гель “Аесцин“, гель “Долобене”, мазь “Веногепанол”) мають ряд суттєвих недоліків, зокрема діють не на всі ланки патогенезу та не усувають усі симптоми венозних захворювань. Вузька спрямованість більшості МЛФ стає причиною призначення одночасно декількох топічних засобів. Наприклад, поширеною є наступна схема використання МЛФ: по черзі наносять мазь з гепарином та мазь з НПЗЗ (Кириєнко О.І., 2002). У випадку приєднання інфекції долучають мазі з протимікробними компонентами (Фесенко В.П., 1995; Савельєв В.Ф., 2001). Підвищена ламкість капілярів та набряк диктують необхідність призначення венопротективних МЛФ (Харкевич Д.А, 2004; Сафранков Н.А., 2002). Такі рекомендації лікарів спричинюють незручності для пацієнтів, призводять до зменшення комплаєнтності лікування, внаслідок чого значно знижується його ефективність. Крім того, внаслідок нанесення мазей шарами одна на одну зменшується їх біодоступність, що також стає причиною зниження ефективності терапії.

У зв'язку з цим актуальною та необхідною є розробка комплексного препарату для місцевого застосування, який максимально охоплює різні ланки патогенезу захворювання. Такий препарат повинен мати антитромботичну, протизапальну, венотонізуючу, протимікробну та антиоксидантну дію, що дозволить уникнути одночасного призначення декількох засобів та прискорити одужання пацієнта. З метою створення високоефективного та безпечного засобу для зовнішнього застосування вченими НФаУ разом зі співробітниками ЗАТ “ФФ “Дарниця” була розроблена нова комбінована мазь “Веногепар”, до складу якої введено гепарину натрієву сіль, кислоту мефенамову, троксерутин, мірамістин та диметилсульфоксид (ДМСО).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету “Фармакологічні дослідження біологічно-активних речовин і лікарських засобів синтетичного і природного походження, їх застосування в медичній практиці (№ Державної реєстрації 0103U000478).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – експериментально обґрунтувати перспективність клінічного застосування мазі „Веногепар” для лікування тромбофлебітів поверхневих вен.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Провести скринінгові дослідження за протизапальною, венотонічною і антикоагуляційною дією з метою визначення оптимального складу мазі.

2. Встановити протизапальну дію мазі “Веногепар” на моделях карагенінового, зимозанового та гістамінового набряків.

3. Дослідити антитромботичні властивості на моделі тромбозу у кролів, викликаного одночасним введенням розчину Люголю та накладанням лігатури.

4. Встановити антимікробну активність мазі “Веногепар” в умовах in vitro.

5. Дослідити протимікробну дію препарату на мишах на моделі гнійної рани, викликаної сумішшю стафілококу та синєгнійної палички та протигрибкову дію на моделі кандидозної рани.

6. Вивчити гостру токсичність та дерматотоксичну дію мазі “Веногепар”.

Об'єкт дослідження. Фармакологічна активність та токсичність комплексної мазі, призначеної для лікування тромбофлебітів поверхневих вен.

Предмет дослідження. Нова комбінована мазь „Веногепар”, призначена для лікування тромбофлебітів поверхневих вен.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи використовували фармакологічні, біохімічні, фізико-хімічні, фізичні, токсикологічні, мікробіологічні, гематологічні, гістологічні методи дослідження та методи математичної статистики.

Наукова новизна. Уперше проведений повний комплекс фармакологічних досліджень нової оригінальної комбінованої мазі, призначеної для лікування тромбофлебітів, яка принципово відрізняється від існуючих на сучасному фармацевтичному ринку засобів тим, що дозволяє регулювати більшість етіопатогенетичних механізмів розвитку та клінічних проявів захворювання. Встановлено виражені антитромботичні, венотонічні, антиексудативні, антимікробні та протигрибкові властивості мазі, що обумовили терапевтичну ефективність препарату при тромбофлебітах поверхневих вен. Доведено, що мазь „Веногепар” є відносно нешкідливою речовиною, не виявляє дерматотоксичної дії. Зазначені властивості підтверджують доцільність використання мазі „Веногепар” для лікування тромбофлебітів поверхневих вен. Наукова новизна підтверджена патентом № 72670 від 15.03.05 на склад та фармакологічну активність мазі “Веногепар”, офіц. бюлетень “Промислова власність”, № 2.

Практичне значення роботи. Мазь „Веногепар” пройшла повний комплекс доклінічних досліджень як засіб для патогенетичного лікування патологій венозної системи, зокрема тромбофлебітів. В промислове виробництво препарат впроваджується на ЗАТ “Фармацевтична фірма “Дарниця”, м. Київ (Акт впровадження у виробництво на ЗАТ “ФФ “Дарниця” від 18.01.07).

Особистий внесок здобувача. Робота виконана на базі ЦНДЛ НФаУ. Разом з науковим керівником визначені мета і завдання дослідження, розроблені методичні підходи до фармакологічного вивчення препарату. Особисто проведені: патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, їх статистична обробка й аналіз результатів, зроблені необхідні висновки. Електронно-мікроскопічні дослідження проведені на базі НДІЗІНХ (м. Харків).

Апробація роботи. Результати роботи викладені та обговорені на: Всеукраїнській науково-практичній конференції „Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002р.), Українській науково-практичній конференції „М'які лікарські засоби в сучасній медицині та фармації” (Харків, 2002р.), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003р.), Науково-практичній конференції „Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині” (Київ, 2003р.), Першій українській конференції „Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування” (Київ, 2004р.), VІ національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 2005р.), Міжнародній науково-практичній конференції, “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок”, (Харків, 2006 р.), VI Всеукраїнській науково-практичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (Харків, 2007 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених “Актуальні питання створення нових лікарських засобів” (Харків, 2007 р.), наукових семінарах ЦНДЛ НФаУ (2002–2007 р.р.), на сумісному засіданні ЦНДЛ та кафедр біологічного циклу НФаУ (2007 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт: 6 статей, з них – 5 статей у провідних фахових журналах; 8 тез доповідей та 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 170 сторінках машинописного тексту, включає 26 таблиць та 29 ілюстрацій. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, трьох глав власних досліджень, розділу „аналіз і узагальнення результатів дослідження”, загальних висновків і списку використаних джерел, який містить 207 найменувань, з яких 87 – іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Першочерговим завданням експериментальних досліджень стало визначення оптимальної концентрації діючих речовин та вибір мазевої основи, для чого були проведені скринінгові дослідження. В умовах фармакологічного скринінгу (табл. 1) були вивчені мазі, що містили у 100 г мефенамової кислоти 1,0, троксерутину 2,0, мірамістину 0,5, диметилсульфоксиду 3,0 та відрізнялися вмістом гепарину (5 або 10 тис. ОД) та мазевою основою (поліетиленоксидна (ПЕО) або проксанолова основа).

Таблиця 1

Склад мазей (на 100г), запропонованих для скринінгових досліджень

(вибір основи та вмісту гепарину)

№

композиції | Гепарин,

ОД | Троксе-рутин, г | Мефенамова кислота, г | Міра-містин, г | ДМСО, г | Основа

Мазь №1 | 5000 | 2,0 | 1,0 | 0,5 | 3,0 | проксанолова

Мазь №2 | 10000 | 2,0 | 1,0 | 0,5 | 3,0 | проксанолова

Мазь №3 | 5000 | 2,0 | 1,0 | 0,5 | 3,0 | ПЕО

Мазь №4 | 10000 | 2,0 | 1,0 | 0,5 | 3,0 | ПЕО

Основними патофізіологічними проявами тромбофлебіту є запалення, набряк та тромбоутворення, – ось чому скринінгові дослідження фармакологічної активності мазі було проведено:–

на моделі термічного запалення лапи у мишей (Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації), 2001; Мохорт М.А. та ін., 1992),

– на моделі транссудативного набряку хвоста у щурів, викликаного накладанням оклюзії, що призводить до гальмування венозного відтоку при збереженні прохідності артеріальних судин та до зниження кровообігу у хвості на 2/3 (Nordman S., Dumont T., 1984; Лакіза О.Д. та ін., 1998) та вивчено вплив на реологічні властивості крові інтактних кролів методом коагулографії.

У результаті скринінгових досліджень була обрана мазь №2, яка і стала об’єктом подальшого фармакологічного дослідження. Мазь має наступне співвідношення компонентів (на 100г мазі):

Гепарин натрій 10 000 ОД

Кислота мефенамова 1,0 г

Троксерутин 2 г

Мірамістин 0,5 г

Диметилсульфоксид 3,0 г

Основа (проксанол-268 21,0-25,0 г, пропіленгліколь 30,0-32,0 г, ПЕО-400 30,0-32,0 г, ПЕО-1500 4,0-6,0 г, вода очищена 3,0-5,0 г).

Наявність запального процесу при захворюваннях вен (Scmid-Schцnbein G., Takase S., 2001; Савельев В.Ф., 2001) спрямувала подальші фармакологічні дослідження на вивчення протизапальної активності обраної композиції. Поглиблене вивчення протизапальної активності проводили на моделях запалення з різними механізмами розвитку: карагенінового, зимозанового та гістамінового (Стефанов О.В., 2001).

Враховуючи те, що мазь “Веногепар” – комплексний препарат та не має на ринку повного аналога за хімічним складом, представляло інтерес паралельно дослідити протизапальну активність декількох препаратів, що обрані як препарати порівняння за хімічним складом і фармакологічною дією.

На моделях карагенінового та зимозанового набряків як препарати порівняння використовували гель диклофенаку натрію виробництва “Фармацевтична компанія “Здоров’я” (м. Харків) та мазь “Мефенат” (“Фармак”, м. Київ), що містить мефенаміну натрієву сіль та вінілін.

На моделі гістамінового набряку як препарати порівняння було обрано гель диклофенаку натрію та гель “Феністил” (діюча речовина – диметиндену малеат) – місцеводіючий антигістамінний засіб виробництва фармацевтичної фірми Novartis (Швейцарія).

Антиексудативну дію мазі оцінювали за ступенем зменшення набряку, визначаючи різницю в об’ємі між набряклою лапою та її вихідним об’ємом (Стефанов О.В., 2001).

Враховуючи склад діючих компонентів мазі “Веногепар” та показання до застосування, необхідною умовою дослідження специфічної фармакологічної активності стало вивчення ефективності препарату на моделі експериментального тромбофлебіту у кролів, викликаного накладанням лігатури та введенням хімічного подразника – розчину Люголя – у просвіт вени (Малоштан Л.М, 2001). Як препарати порівняння на моделі експериментального тромбофлебіту у кролів використовували засоби для лікування тромбофлебітів поверхневих вен, які є аналогами за показаннями до застосування: гепаринову мазь виробництва фармацевтичної фірми “Нижфарм” (Росія) та гель “Аесцин”, який містить диетиламіну саліцилат, аесцин та гепарин, виробництва фармацевтичної фірми “Polfa” (Польща).

Оцінку розвитку патології та лікувальної дії препаратів проводили на основі таких показників: довжина тромбу в мм та площа запалення у мм2 (вимірювання довжини тромбів та площі запалення проводили один раз на 2 доби протягом 10 діб). Гематологічні та біохімічні показники досліджували за загальноприйнятими методиками, зокрема клінічний аналіз крові (кількість лейкоцитів, еритроцитів, гемоглобіну, ШОЕ), показники системи згортання крові (час згортання крові, протромбіновий індекс, вміст фібриногену; реологічні властивості крові методом коагулографії). Біохімічні показники, що дозволяють оцінити активність перекисного окиснення ліпідів, обмін білка та холестерину вивчали у динаміці: на початку експерименту, на 3-ю та 10-у добу. Критерієм інтенсивності процесів ПОЛ і стану АОС обраний рівень наступних показників сироватки крові: відновленого глутатіону та ТБК-активних продуктів. Вплив на білковосинтетичні процеси визначали за рівнем загального білка (за реакцією з розчином двохвалентної міді фотоколориметричним методом) та сечовини (за реакцією з диацетилмонооксимом) у сироватці крові, використовуючи набори реактивів фірми "Lachema" (Чехія). Стан ліпідного обміну характеризували за рівнем у сироватці крові холестерину за реакцією Лібермана-Бурхардта, в-ліпопротеїдів – за реакцією з гепариновим реактивом, використовуючи набори реактивів фірми “Lachema”, а також за вмістом фосфоліпідів, які визначали за допомогою набору реактивів фірми “Sentinel CH“ (Італія) ензимним колориметричним методом Триндера. Для більш детальної оцінки інтенсивності патологічного процесу в судинній стінці вени та оточуючих її тканинах та його корекції за допомогою мазі “Веногепар” та препаратів порівняння проводили гістологічні дослідження морфоструктури тканини вени уніфікованими методами світлової мікроскопії (Автандилов Г.Г., 1980, Волкова О.В., 1982).

У пацієнтів з хронічною венозною недостатністю (ХВН) при її прогресуванні розвиваються трофічні венозні виразки, які легко інфікуються. У зв’язку з цим лікування ХВН у такій важкій фазі вимагає використання препаратів різнонаправленої дії, спрямованих як на ліквідацію проявів ХВН, так і на попередження інфікування.

За даними Савельєва В.Ф. з тканин, що оточують виразку, висівають різноманітну мікрофлору, яка при попаданні в рану значно уповільнює процес загоєння трофічних виразок та стає причиною виникнення нових виразок. Тому для профілактики вторинної контамінації трофічних венозних виразок зону навколо останньої рекомендовано обробляти місцевими протимікробними засобами. У зв’язку з цим до складу мазі “Веногепар” було введено протимікробний та протигрибковий засіб мірамістин, що обумовило необхідність вивчення антимікробної активності препарату in vitro та in vivo (Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран, 1989; Ляпунов Н.А., 1993).

Антимікробну активність мазі “Веногепар” in vitro вивчали загальноприйнятим у мікробіологічній практиці методом дифузії в агар. Як препарат порівняння обрано мірамістинову мазь (ЗАТ “ФФ “Дарниця”), яка містить 0,5% мірамістину та має широкий спектр протимікробної та протигрибкової дії.

Вивчення in vivo протигрибкової активності нового засобу здійснювали на моделі експериментальної кандидозної інфекції на білих мишах. Вплив мазі “Веногепар” та препарату порівняння – мазі мірамістинової – на перебіг кандидозної інфекції контролювали за допомогою клінічних критеріїв (терміни і характер некрозу, поява грануляції та ін.), мікробіологічних і мікроскопічних досліджень (висів вмісту експериментальних ран на щільне і рідке середовища Сабуро з додаванням пеніциліну з метою пригнічення супутньої бактеріальної мікрофлори та виділення чистих культур Candida albicans і визначення кількості мікроорганізмів у тканині).

Для вивчення антибактеріальних властивостей препарату “Веногепар” в експериментах in vivo була використана експериментальна модель місцевої гнійної інфекції, викликаної сумішшю стафілококу та синєгнійної палички. На фармацевтичному ринку України немає близьких до мазі “Веногепар” препаратів-аналогів за повним складом, тому препаратами порівняння для даного дослідження було обрано сучасні антимікробні засоби: мазь мірамістинову (ЗАТ “ФФ“Дарниця”), яка є частковим аналогом за складом, та комбінований засіб – мазь “Нітацид” (ЗАТ “ФФ“Дарниця”), що містить антимікробний компонент стрептоцид та компонент з протизапальною дією амінітрозол, і є аналогом за фармакологічними властивостями. Ефективність лікування оцінювали на підставі кількісної динаміки мікроорганізмів у рані та загибелі тварин у випадку генералізації процесу. Посів ранового відокремлюваного проводили на м'ясо-пептонний агар, середовище Чистовича (для ідентифікації стафілококів) і ЦПА (агар для ідентифікації синьогнійних паличок, що містить цетримід і панкреатичний гідролізат желатину). З метою підтвердження лікувальної дії препаратів на клітинному рівні проводили дослідження ультраструктури клітин гнійної рани за допомогою електронної мікроскопії.

Поряд з фармакологічною активністю важливою властивістю нових лікарських засобів є їх нешкідливість, що обумовило наступний етап фармакологічного дослідження мазі „Веногепар” – вивчення токсичних властивостей препарату. Вивчали гостру токсичність при нашкірному та внутрішньошлунковому введенні, алергізувальну, місцевоподразнювальну дію. Проводили вивчення дерматотоксичності мазі при тривалому застосуванні (3 місяці – на щурах, 4 місяці – на кролях) (Стефанов О.В., 2001).

Досліди проводили на мишах, щурах і кролях, вирощених у розпліднику віварію ЦНДЛ НФАУ. Тварин утримували у стандартних умовах згідно з санітарно-гігієнічними нормами (Стефанов О.В., 2001). Робота з тваринами проводилась відповідно до принципів Європейської конвенції з захисту лабораторних тварин з дотриманням норм GLP (Ляпунов Н.А, 1998). Усі отримані результати обробляли за спеціальною програмою Statistica 5,0 for Windows на РК Pentium 2000. Статистична обробка результатів проведених досліджень здійснена за допомогою параметричних методів аналізу за допомогою коефіцієнта Стьюдента (t) з поправкою Банфероні та непараметричними методами аналізу з використанням коефіцієнту Вілкоксона-Манна-Уїтні (w) (Стентон Г., 1999, Зосимов А.М., 2005).

Результати досліджень та їх обговорення. Комплекс проведених скринінгових досліджень дозволив визначити оптимальний склад нової комбінованої мазі. На моделі термічного запалення лапи у мишей встановлено, що усі композиції достовірно зменшували масу набряклої лапи, їх протизапальна активність становила 28-35%. Достовірних відмінностей між мазями за рівнем протизапальної дії не виявлено. На моделі транссудативного набряку хвоста у щурів, спричиненого уповільненням венозного кровотоку, найбільш виражену протинабрякову дію проявила мазь №2, яка містить 10000 ОД гепарину та виготовлена на проксаноловій основі. Вивчення антикоагуляційної дії мазей методом коагулографії дозволило визначити склад мазі, який чинить найбільший позитивний вплив на реологічні властивості крові. Найбільш виражену антитромботичну дію має мазь №2. Результати проведених експериментів показали, що збільшення концентрації гепарину у мазі на проксаноловій основі значно підвищує фармакологічну ефективність препарату. Мазі на проксаноловій основі виявляють більш виражений антикоагуляційний ефект, ніж мазі на ПЕО-основі. Останні не виявляють достовірних антикоагуляційних властивостей. Це можна пояснити особливостями хімічної структури гепарину та поліетиленоксидної основи: дегідратаційні властивості ПЕО-основи зумовлюють відщеплення гідроксильної групи гепарину, внаслідок чого зменшуються його антикоагуляційні властивості, та, відповідно, і антикоагуляційні властивості мазей (Загорій Г.В., 2003).

Таким чином, у результаті проведених скринінгових досліджень за протизапальною, венотонічною та антикоагуляційною дією було обрано мазь № 2, яка одержала назву “Веногепар” та стала об’єктом подальшого фармакологічного вивчення.

Наступним етапом роботи стало дослідження фармакологічної активності мазі “Веногепар”.

Запальний процес та проксимальна венозна обструкція разом з підвищенням венозного тиску є причиною гіперчутливості, болю, набряків у хворих з гострим венозним тромбозом (Шиффман Ф. Дж., 2000, Coleridge Smith P.D., 2001). Виключна роль запального процесу у розвитку венозних патологій спрямувала наші дослідження на поглиблене вивчення протизапальної дії мазі „Веногепар”.

На моделі карагенінового набряку мазь “Веногепар” проявила виражені антиексудативні властивості, про що свідчить достовірне зменшення об’єму лапи тварин протягом усього експерименту (середня активність 49 %) (рис.1). Результати дослідження дозволяють припустити, що діючі речовини нового препарату інгібують активність гістаміну, серотоніну та кінінів, оскільки препарат виявляє високу активність на 1-ій та 2-ій годинах експерименту (57 % та 71% відповідно).

Рис. 1 Протизапальна активність (%) мазі „Веногепар” на моделі карагенінового набряку.

Примітка. * – відхилення достовірне по відношенню до мазі „Веногепар”, р<0,05.

Можна передбачити, що у механізмі протизапальної дії мазі “Веногепар” важливим механізмом є пригнічення синтезу простагландинів, оскільки активність на 3-ій, 4-ій та 5-ій годинах (період виділення простагландинів) була високою та становила 61 %, 49 % та 39 % відповідно.

Отримані нами результати підтверджують дані літератури про значно слабшу протизапальну дію мефенамової кислоти у порівнянні з диклофенаком натрію (Яковлєва Л.В., 1991; Насонов Є.Л., 1999). Привертає увагу той факт, що мазь “Веногепар”, до складу якої входить мефенамова кислота, виявляє достовірно більш виразний протизапальний ефект, ніж мазь “Мефенат”. Пояснюємо це тим, що новий препарат, крім мефенамової кислоти, містить декілька компонентів з протизапальною дією: диметилсульфоксид, троксерутин та гепарин, які підсилюють прояв протизапальної дії мефенамової кислоти (Компендіум, 2006; Кириєнко О.І., Матюшенко О.А., 2006).

З огляду на виключну роль лейкотрієнів у розвитку венозних захворювань (Савельєв В.Ф., 2001), нами була вивчена здатність мазі “Веногепар” впливати на розвиток зимозанового набряку, в механізмі розвитку якого протягом перших двох годин задіяні переважно лейкотрієни. В результаті проведеного дослідження встановлені виражені антиексудативні властивості мазі “Веногепар”. Препарат достовірно пригнічує розвиток набряку протягом усього експерименту (середня протизапальна активність 42 %) та перевищує активність препаратів порівняння мазі “Мефенат” (середня активність 28 %) та гелю диклофенаку натрію (середня активність 21 %) (рис.2). Динаміка активності препаратів порівняння повязана з їх здатністю пригнічувати простагландини, і виявляється на третю годину досліду.

Рис. 2 Протизапальна активність мазі „Веногепар” на моделі зимозанового набряку.

Примітка. * – відхилення достовірне по відношенню до мазі „Веногепар”, р<0,05.

Отже, у механізмі протизапальної дії мазі “Веногепар” присутній пригнічуючий вплив на синтез та вивільнення лейкотрієнів, що пояснюємо наявністю троксерутину у її складі, оскільки флавоноїди здатні інгібувати синтез лейкотрієнів (Яковлєва Л.В., Цубанова Н.А., 2002; Чекман І.С., 2000).

Дослідження протизапальної активності на моделі карагенінового набряку виявили здатність мазі “Веногепар” впливати на медіатори перших двох годин запалення. Тому ми вважали за доцільне встановити здатність нового препарату впливати на синтез та вивільнення гістаміну.

На моделі гістамінового набряку нами встановлено, що новий препарат достовірно пригнічує (середня активність склала 57 %) розвиток набряку протягом усього експерименту на рівні антигістамінного засобу – гелю “Феністил” (середня активність – 57 %) (рис. 3).

Рис. 3 Антиексудативна активність (%) мазі „Веногепар” на моделі гістамінового набряку.

Примітка. * – відхилення достовірне по відношенню до мазі „Веногепар”, р<0,05.

З джерел літератури відома антигістамінна та дія мефенамової кислоти, гепарину та диметилсульфоксиду (Компендіум, 2006; Лекарственные препараты Украины, 1999). Мефенамова кислота перешкоджає утворенню та вивільненню з тканинних депо медіаторів запалення (гістаміну, кініну та ін.) (Лекарственные препараты Украины, 1999; Компендіум, 2006). Гепарин проявляє пряму антигістамінну дію (Машковский М.Д., 1994). Механізм антигістамінної дії ДМСО полягає у пригніченні антитілоутворювальної функції плазматичних клітин, а також у антагонізмі до гістаміну та ацетилхоліну (Сейфула Р.Д., 1990).

Таким чином, у результаті проведених досліджень встановлені виражені антиексудативні властивості мазі “Веногепар”, обумовлені сумацією протизапальних властивостей трьох компонентів мазі. У механізмі протизапальної дії мазі “Веногепар” провідним є пригнічення синтезу та вивільнення простагландинів, лейкотрієнів та гістаміну.

Розвиток запалення при тромбофлебітах супроводжується порушенням структури венозної стінки та підвищенням її проникності, що призводить до розвитку набряку, венозного застою, больового синдрому, а у подальшому – до порушення системи згортання крові та тромбозу (Becker F., 2006; Сєров В.В., Пауков В.С., 1995; Лакіза О.Д. та ін., 1998; Ферстрате М., Фермилен Ж., 1986). Одним з найбільш розповсюджених тромботичних станів є поверхневий тромбофлебіт. У зв’язку з цим,

для вивчення специфічної фармакологічної активності мазі “Веногепар”, ми використали модель комбінованого тромбофлебіту, яка дозволяє отримати порушення кровотоку внаслідок стазу і запалення венозної стінки, що характерно для більшості тромботичних станів у людини (Малоштан Л.М., 2001; Anderson F.A., 2003).

Про розвиток експериментального тромбофлебіту свідчили сукупність патологічних змін у групі контрольної патології: тромбоутворення, запалення, набряк та крововиливи (рис.4-5). Аналіз динаміки клінічної картини крові тварин групи контрольної патології підтвердив розвиток запального процесу, який характеризувався достовірним підвищенням кількості лейкоцитів та ШОЕ у крові експериментальних тварин. Розвиток гіперкоагуляції встановлено біохімічними дослідженнями та підтверджено даними коагулографії. У групі контрольної патології за допомогою біохімічних досліджень встановлена дезорганізація системи ПОЛ-АОС, порушення ліпідного та білкового обмінів. Вищеописану картину доповнюють дані гістологічних досліджень – ін’єкція розчину Люголя та короткочасне накладання лігатури викликає у зовнішній вені вуха кролів розповсюджений тромбоз, руйнування стінки вени, екстраваскулярні запальні та гранулематозні процеси.

Мазь “Веногепа р” виявила продуктивний вплив на усі патогенетичні механізми та клінічні прояви тромбофлебіту (рис. 4-5).

Рис. 4 Антитромботична активність Рис. 5 Протизапальна активність (%; за динамікою лізису тромбу) (%; за зменшенням запального проце-

су навколо тромбованої вени)

Примітки: 1. * – відхилення достовірне щодо 2-ї доби досліду, р<0,05;

2. ** – відхилення достовірне щодо показників групи контрольної патології, р<0,05;

3. *** – відхилення достовірне щодо показників групи тварин, яких лікували маззю “Веногепар” р<0,05.

Мазь “Веногепар” у коротші строки, ніж препарати порівняння достовірно зменшувала розміри тромбу на 29 %, а також запалення, набряк і крововиливи на 84 %). Більш виразну ефективність нового препарату у порівнянні з референтними пояснюємо фармакологічною дією складових компонентів препаратів. Так, гепарин – єдиний компонент у складі гепаринової мазі з протизапальною дією. Протизапальна дія гелю “Аесцин” забезпечується диетиламіну саліцилатом, аесцином та гепарином, а протизапальна дія мазі “Веногепар” забезпечується наявністю у її складі мефенамової кислоти, диметилсульфоксиду, троксерутину та гепарину. Механізмами протизапальної дії гепарину є пригнічення активності гіалуронідази та деяких медіаторів запалення (Машковский М.Д., 1994). Троксерутин зменшує застійні явища у венах та паравенозних тканинах, знижує проникливість судин та ламкість капілярів за рахунок стабілізації гіалуронової кислоти, покращує периферичний кровообіг, мікроциркуляцію та трофіку тканин (Харкевич Д.А., 2004). Важливу роль у прояві протизапальної дії мазі “Веногепар” відіграє диметилсульфоксид, який підвищує біодоступність та потенціює фармакологічну дію компонентів препарату.

У дослідженнях, спрямованих на вивчення системи згортання крові, встановлена виражена антикоагуляційна дія мазі “Веногепар”. На фоні лікування новим препаратом відбувалося збільшення часу згортання крові, часу рекальцифікації та протромбінового часу. Слід зауважити, що антикоагуляційна дія мазі забезпечується не лише наявністю гепарину, а й введенням до складу препарату мефенамової кислоти та диметилсульфоксиду. Одним з механізмів дії мефенамової кислоти є пригнічення синтезу тромбоксану А2, – важливого фактора активації тромбоцитів, гальмуючи, таким чином, першу стадію процесу коагуляції (Вознесенський А.Г., 2001; David H. Collier, 2006). У результаті цього знижується агрегація тромбоцитів та розвивається помірно виражена гіпокоагуляція. Диметилсульфоксид чинить фібринолітичну дію (Звєрєв В.М., 1982; Машковский М.Д., 1994).

На тлі гострого тромбофлебіту поверхневих вен у організмі хворих накопичуються ендотоксини, або речовини, що провокують утворення в організмі ендотоксичних субстанцій (ТБК-активні продукти, азотисті сполуки). Ендотоксини можуть призводити до додаткової активації реакцій тромбоутворення та інгібування фібринолітичних процесів (Суховій М.В., 2003).

Одним з патогенетичних механізмів, який супроводжує різноманітні захворювання є процес ліпопероксидації. При інтенсифікації процесів ПОЛ порушується структура та функції мембранного апарату клітин різних органів та тканин (Чекман І.С., 2000, Цубанова Н.А., 2004).

Розвиток патології супроводжувався вираженими змінами системи ПОЛ-АОС: зменшенням рівня ТБК-активних продуктів на фоні достовірного зменшення кількості фосфоліпідів у сироватці крові як основних субстратів ПОЛ та активацією системи глутатіону, направленої на захист від ушкоджуючої дії продуктів ПОЛ (рис. 6-7). Нормалізацію процесів ПОЛ та білковосинтетичних процесів під дією мазі “Веногепар” слід розглядати як наслідок комплексної дії компонентів мазі. Перш за все, антиоксидантні властивості виявляє троксерутин. Флавоноїди мають два меха нізми дії: інактивують вільні радикали та утворюють стабільні комплекси з металами (залізом, міддю, кобальтом, цинком, молібденом, алюмінієм), виключаючи їх каталітичну дію у процесах ПОЛ (Казимирко В.К., 2004).

Рис. 6 Рівень ТБК-активних продуктів у печінці Рис. 7 Рівень ВГ у печінці дослідних тварин на 10-й день експерименту кролів на 10-й день експерименту

Примітки: 1. * - відхилення вірогідне щодо показників інтактного контролю, р<0,05;

2. **- відхилення вірогідне щодо показників групи контрольної патології, р<0,05

Антиоксидантні властивості встановлені й для диметилсульфоксиду. Механізм антиоксидантної дії ДМСО пов’язаний з інактивацією гідроксильних радикалів та відновленням метаболічних процесів у зоні запалення (Ткачова О.В., 2003, Сейфула Р.Д., 1990, Звєрєв В.М., 1982).

При переважанні катаболічних процесів над анаболічними з боку серцево-судинної системи виникають брадикардія, гіпотензія, уповільнення швидкості кровотоку. Відомо також, що патології венозної системи здатні спровокувати захворювання печінки, що може призвести, зокрема, до порушення білково-синтетичної та дезінтоксикаційної функцій печінки (Цубанова Н.А., 2004). Зв’язок між порушеннями з боку венозної системи та метаболізмом білків спонукав нас провести визначення деяких показників білкового обміну на моделі тромбофлебіту.

Процес тромбоутворення у групі контрольної патології супроводжувався порушенням білковосинтетичних процесів, про що свідчить достовірне зменшення рівня загального білка та підвищення рівня сечовини у сироватці крові по відношенню до інтактного контролю. Ці зміни характеризують перевагу катаболічних процесів над анаболічними та вказують на розвиток ендогенної інтоксикації внаслідок вираженого запального процесу та некрозу тканин, що прилягають до ділянки ураженої вени. Мазь „Веногепар” нормалізує рівень загального білка та сечовини у сироватці крові до рівня інтактного контролю.

З огляду на важливу роль атерогенезу у розвитку серцево-судинних захворювань (Andrew C. Nicholson, 1998), проводили аналіз показників холестеринового обміну як важливого чинника венозного тромбоутворення, що показало здатність мазі “Веногепар” та препаратів порівняння достовірно зменшувати кількість холестерину у сироватці крові. Одержані результати підтверджують дані літератури про гіпохолестеринемічну дію гепарину (Машковський М.Д., 1997). Відома також гіполіпідемічна дія антиоксидантів, зокрема біофлавоноїдів (Яковлєва Л.В., 2001; Чекман І.С., 2000).

Гістоморфологічні дослідження тканин зовнішньої вени вуха показали, що у тварин групи контрольної патології (рис. 8) вена закупорена щільним тромбом (а), стінка вени зруйнована (б), її залишки щільно зпаяні з різко набряклими, гомогенізованими волокнами власне шкіри (в). |

Рис. 8

Контрольна патологія | Рис.9

Мазь“Веногепар” | Рис. 10

Гель “Аесцин” | Рис.11

Гепаринова мазь

Мазь “Веногепар” за рахунок комплексного складу чинить виражену лікувальну дію (рис. 9): вена прохідна для току крові (а), стінка вени не зруйнована (б), в оточуючих тканинах відсутні явища крововиливу та плазмодіапедезу (в). У групах тварин, лікованих гелем “Аесцин” (рис. 10) та маззю гепариновою (рис. 11) просвіт вени закупорений тромбом (а), стінка вени пошкоджена (б), в оточуючих тканинах – запальна клітинна реакція та незначна деструкція колагенового матриксу (в).

Таким чином, на моделі експериментального тромбофлебіту встановлено, що мазь “Веногепар” чинить позитивний вплив на всі клінічні прояви тромбофлебіту: тромбоз, запалення, набряк, нормалізує стан системи ПОЛ-АОС, нормалізує показники білкового та ліпідного обмінів.

У клінічних випадках, коли тромбоз супроводжується приєднанням інфекційного компоненту, наприклад, утворенням трофічних венозних виразок, розвитком варикозної екземи, дерматитів, фолікулітів, фурункульозів, крім антитромботичних, венопротекторних та протизапальних, необхідно долучати протимікробні засоби.

У зв’язку з цим до складу мазі “Веногепар” було введено протимікробний та протигрибковий засіб мірамістин, що обумовило необхідність вивчення антимікробної активності нового препарату в умовах in vitro.

В дослідженнях in vitro встановлено високий рівень антимікробної активності мазі “Веногепар” у відношенні до збудників гнійно-запальних процесів, що значно перевищує активність препарату порівняння мазі мірамістинової. Найбільш високу чутливість до нового препарату виявляють культури Staphylococcus aureus (34,03 – 34,4 мм) , Pseudomonas aeruginosa (26,73 – 28,72 мм) і Сandida albicans (27,97). Той факт, що мірамістинова мазь поступається досліджуваному препарату за рівнем протимікробної дії обумовлений сумацією протимікробних властивостей мірамістину, мефенамової кислоти та диметилсульфоксиду, що було встановлено Загорієм Г.В. на етапі розробки технології препарату (Загорій Г.В., 2004).

На моделі експериментальної кандидозної інфекції на мишах встановлено, що мазь “Веногепар” та препарат порівняння мірамістинова мазь є високоефективними при лікуванні гнійних ран. Це виявлялося в зниженні вмісту мікроорганізмів у рані, низькою летальністю тварин у порівнянні з групою контрольної патології. Проте, новий препарат сприяв більш ефективному зниженню мікробного навантаження в осередку кандидозного ураження починаючи з 4-го дня лікування. Сумарна ефективність мазі “Веногепар” практично не відрізнялася від ефективності мазі мірамістинової.

При лікуванні експериментальної гнійної рани, викликаної сумішшю мікроорганізмів (золотистим стафілококом та синєгнійною паличкою), мазь “Веногепар” проявила виражений антибактеріальний ефект, встановлений мікробіологічними дослідженнями. За термінами звільнення гнійних ран від стафілококів не виявлено відмінностей між досліджуваним препаратом “Веногепар” і препаратами порівняння – мазями мірамістиновою та “Нітацид”. Проте мазь “Веногепар” більш ефективна, ніж мазь мірамістинова по відношенню до паличок синьо-зеленого гною – відсутність росту мікроорганізму встановлено на 7-му добу експерименту, т.б. на 2 доби раніше, ніж у тварин, лікованих маззю мірамістиновою. Спочатку у нас склалося враження, що мазь “Нітацид” є більш активною, ніж новий препарат, по відношенню до P. aeruginosa (відсутність росту синєгнійної палички відзначена вже на 5-ту добу експерименту). Але проаналізувавши рівень летальності тварин прийшли до наступних висновків. Оскільки рівень летальності у групах контрольної патології та мазі “Нітацид” надзвичайно високий та становить 60% та 50% відповідно, а у групах, лікованих мазями “Веногепар” та мірамістиновою – 12,5%, слід вважати більш ефективними мазь “Веногепар” та мазь мірамістинову. Високий рівень летальності у групі тварин, яких лікували маззю “Нітацид” можна пояснити більш високою токсичністю діючих компонентів зазначеного препарату (перш за все, стрептоциду) у порівнянні з мазями “Веногепар” та мірамістиновою. Крім того, в умовах гнійної інфекції відбувається інтоксикація організму за рахунок розпаду некротизованих тканин, а також токсинів, що є продуктами життєдіяльності мікроорганізмів. Більш висока ефективність мазей “Веногепар” та мірамістинової обумовлена, очевидно, й здатністю мірамістину посилювати фагоцитоз у зоні ушкодження в умовах порушеного периферичного кровообігу (Фесенко В.П., 1995).

Електронно-мікроскопічними дослідженнями на моделі гнійної рани, викликаної змішаною аеробно-анаеробною інфекцією, встановлено, що мазь “Веногепар” викликає активацію регенеративних внутрішньоклітинних процесів. Результати мікроскопічних досліджень свідчать про підвищену активність внутрішньоклітинних органел, активацію обмінних та репаративних процесів під впливом досліджуваного препарату. Активність регенеративних внутрішньоклітинних процесів у групах тварин, яких лікували препаратами порівняння – мазями “Нітацид” та мірамістиновою, була нижчою, ніж під впливом мазі “Веногепар”.

Висока ефективність нового препарату обумовлена комплексом діючих речовин. Біофлавоноїд троксерутин завдяки антиоксидантним властивостям сприяє посиленню репаративних процесів та діє на клітинному рівні як мембранопротектор. Очевидно, антиоксидантна дія троксерутину опосередковано через ендоплазматичний ретикулум сприяє посиленню синтезу білка в клітинах, що є встановленим фактом для поліфенольних сполук (Бунятян Н.Д., 1999; Казимирко В.К., Мальцев В.І., 2004 ). Мефенамова кислота, на відміну від інших НПЗЗ, що пригнічують загоєння ран, здатна стимулювати репаративні процеси (Компендіум, 2006). Відомо, що мефенамова кислота проявляє антимікробні властивості та посилює антимікробну дію мірамістину (Загорій Г.В., 2004). Диметилсульфоксид виявляє виражену антирадикальну дію, що призводить до стабілізації мембран, попередження розвитку вторинних некрозів, стимуляції загоєння ран (Ткачова О.В., 2003, Сейфула Р.Д., 1990). Численними експериментальними та клінічними дослідженнями доведена також здатність мірамістину посилювати регенераторні процеси та репаративну активність в рані (Ляпунов М.А., 1998). Згідно з даними Ляпунова М.А., Мінухіна В.В. та співавторів мазеві основи з проксанолом-268 мають кращу пенетрацію під струп, ніж мазі на ПЕО-основі, що пов'язано зі здатністю краще змочувати ранову поверхню та розтіканням по ній проксанолу-268 (Ляпунов М.А., 1998). Отже, висока активність нового препарату обумовлена наявністю у складі мазі не лише мірамістину та інших діючих речовин, а й найбільш відповідної мазевої основи.

Таким чином, аналіз результатів усіх проведених досліджень дозволяє зробити висновок, що висока ефективність мазі “Веногепар” обумовлена різнобічністю фармакологічної дії компонентів мазі. У результаті вивчення специфічної фармакологічної ефективності нового комбінованого препарату – мазі “Веногепар” – нами встановлені виражені протизапальні, антитромботичні, антиоксидантні, гіпохолестеринемічні, протимікробні та протигрибкові властивості.

Обов’язковою умовою при доклінічному дослідженні лікарських препаратів є дослідження гострої, хронічної та специфічної токсичності. Результати дослідження гострої токсичності при однократному нашкірному нанесенні кролям, щурам і мишам свідчать про відсутність токсичного впливу мазі “Веногепар”.

Відповідно до класифікації речовин за токсичністю, мазь “Веногепар” при внутрішньошлунковому введенні відноситься до VI класу (відносно нешкідливі речовини) (ЛД50>15000 мг/кг). Комплекс досліджень дерматотоксичної дії мазі дозволив встановити відсутність місцевоподразнювальної дії мазі як при однократному нанесенні, так і при тривалому застосуванні препарату. Мазь „Веногепар” не викликає алергічної реакції як при нанесенні на непошкоджену шкіру, так і при використанні на скарифікованих ділянках шкіри тварин. При вивченні специфічної токсичної дії експериментально доведена відсутність імунотоксичної, ембріотоксичної, гонадотоксичної та кумулятивної дії мазі “Веногепар” (Яковлєва Л.В., Беркало Н.М., 2005; Беркало Н.М., 2004). Результати дослідження хронічної токсичності мазі “Веногепар” вказують на відсутність токсичного впливу препарату при його тривалому застосуванні на функції життєвоважливих органів і систем організму дослідних тварин: щурів та кролів. Таким чином, дослідження показали, що новий препарат не чинить токсичної дії на організм дослідних тварин.

Показання до застосування у медичній практиці. Мазь “Веногепар” призначена для лікування патологій венозної системи – флебітів, тромбофлебітів, тромбозів, хронічної венозної недостатності.

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично та експериментально обгрунтовано доцільність використання нової комплексної мазі, призначеної для лікування венозних захворювань, зокрема поверхневих тромбофлебітів. Аналіз результатів усіх проведених досліджень