НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

БОНДАРЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІІВНА

УДК 615.322:615.45.074:543.8:546.215

АНАЛІТИЧНІ СИСТЕМИ НА ОСНОВІ СПРЯЖЕНИХ РЕАКЦІЙ ОКИСНЕННЯ ОРГАНІЧНИХ ВІДНОВНИКІВ ГІДРОГЕН(АЦИЛ)ПЕРОКСИДАМИ ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ У ФАРМАЦЕВТИЧНОМУ АНАЛІЗІ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фізичної та колоїдної хімії Національного фармацевтичного університету.

Міністерство охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, доцент

Блажеєвський Микола Євстахійович

Національний фармацевтичний університет,

професор кафедри фізичної та колоїдної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

Болотов Валерій Васильович

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри аналітичної хімії

доктор фармацевтичних наук, професор

Буряк Валерій Прокопович

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри токсикологічної та неорганічної хімії

Захист відбудеться „20” грудня 2007 року о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул.. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий „19” листопада 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, д.б.н., проф. Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема розроблення нових методів кількісного визначення біологічно активних речовин (БАР) природного та синтетичного походження залишається однією з основних тенденцій розвитку сучасної фармацевтичної хімії. Довготривалість процедур визначення, використання токсичних органічних розчинників та висококоштовних приладів, а також висока вартість аналітичних реагентів обумовлюють шкідливі умови праці та підвищення витрат на здійснення аналізу як у лабораторіях з контролю якості лікарських засобів, так і в центральних заводських лабораторіях фармацевтичних підприємств. Тому опрацювання нових більш досконалих та простих у виконанні методик аналізу лікарських препаратів надалі залишається актуальним питанням.

Літературні дані свідчать, що застосування гідроген пероксиду та його ацильних похідних як реагентів в кінетичних методах аналізу є вельми перспективним напрямком розроблення нових методик аналітичного визначення лікарських та біологічно активних речовин. Зокрема, використання ефекту інгібування реакцій каталітичного окиснення гідроген(ацил)пероксидами індикаторних речовин дозволяє розробляти нові високочутливі та достатньо вибіркові методики кількісного визначення лікарських та біологічно активних речовин у різноманітних об’єктах. Крім того, перспективним убачається застосування в практиці фармацевтичного аналізу спряжених реакцій окиснення гідроген пероксидом індикаторних речовин в присутності лікарських та біологічно активних речовин як індукторів процесу окиснення. Згідно даних літератури в теперішній час розроблена відносно невелика кількість методик, які ґрунтуються на використанні вказаних реакцій, а тому такі дослідження є актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана на кафедрі фізичної та колоїдної хімії НФаУ і є складовою частиною держбюджетних тем „Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно-активних речовин, встановлення зв’язку „структура – дія”, створення нових лікарських препаратів” (номер державної реєстрації 198U007011).

Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи є розроблення нових аналітичних систем на основі реакцій хемілюмінесцентного окиснення люмінолу (H2L) в присутності гемоглобіну (Нb), а також спряженого окиснення 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (ТМБ) та п-фенетидину (ПФ) гідроген пероксидом на лікарські і біологічно активні речовини та їх застосування у фармацевтичному аналізі.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1. Вивчити кінетичні особливості перебігу реакцій хемілюмінесцентного окиснення люмінолу гідроген пероксидом в присутності гемоглобіну і/або лікарських та біологічно активних речовин.

2. Розробити нові кінетичні методики кількісного визначення лікарських та біологічно активних речовин за ефектом інгібування хемілюмінесценції системи H2L – Н2О2 – Нb.

3. З’ясувати кінетичні закономірності перебігу спряжених індикаторних реакцій окиснення 3,3',5,5'-тетраметилбензидину та п-фенетидину в присутності лікарських та біологічно активних речовин.

4. Оптимізувати умови перебігу реакцій спряженого окиснення ТМБ та ПФ гідроген пероксидом в присутності лікарських та біологічно активних речовин та розробити нові кінетичні методики їх кількісного визначення.

5. Вивчити аналітичні характеристики та можливість практичного застосування розроблених методик у фармацевтичному аналізі.

Об’єкти дослідження – парацетамол, кофеїн, адреналін, допамін, рутин, кверцетин, дигідрокверцетин, вікасол, ацетилсаліцилова кислота, зопіклон та їх лікарські форми, триацетин; нові аналітичні реакції окиснення H2L, ТМБ, ПФ та застосування їх у фармацевтичному аналізі.

Предмет дослідження. Кінетичні закономірності реакцій окиснення індикаторних речовин Н2О2 у присутності лікарських та біологічно активних речовин, а також реакцій хемілюмінесцентного окиснення H2L гідроген пероксидом в присутності Нb, лікарських та біологічно активних речовин; кількісне визначення лікарських та біологічно активних речовин в об’єктах фармацевтичної галузі.

Методи дослідження. У дисертаційній роботі використаний комплекс взаємодоповнюючих фізико-хімічних методів дослідження: хемілюмінесценції, УФ/ВИД спектроскопії та хімічної кінетики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для хемілюмінесцентного визначення лікарських та біологічно активних речовин за ефектом інгібування запропонована нова аналітична система H2L – Н2О2 – Нb. Виявлена сильна інгібіторна дія парацетамолу, кофеїну, катехоламінів, флавоноїдів та кислоти аскорбінової на хемілюмінесценцію в системі H2L – Н2О2 – Нb. Вперше встановлена вибіркова інгібіторна дія парацетамолу та кофеїну в присутності кислоти аскорбінової та теофіліну і теоброміну відповідно у хемілюмінесцентній системі H2L – Н2О2 – Нb. Запропоновані умови, розроблені методики та показана можливість кінетичного визначення парацетамолу, кофеїну, катехоламінів (адреналін, допамін), флавоноїдів (рутин, кверцетин, дигідрокверцетин), кислоти аскорбінової, пірокатехіну, кислоти елагової в субстанціях та лікарських препаратах за ефектом інгібування хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2 – Нb. Вперше виявлена активуюча дія вікасолу в реакції хемілюмінесцентного окиснення люмінолу гідроген пероксидом. Запропонований хімізм активуючої дії вікасолу в реакції хемілюмінесцентного окиснення люмінолу гідроген пероксидом. Розроблені методики та показана можливість кількісного визначення вікасолу в лікарських формах за його активуючою дією методом хемілюмінесценції. Перевагами новоопрацьованих методик перед чинними фармакопейними є вищі чутливість та вибірковість у поєднанні з експресністю і простотою виконання аналізу.

Практична цінність роботи. Опрацьовані методики кількісного визначення лікарських та біологічно-активних речовин можуть бути використані для розробки аналітичної нормативної документації на лікарські препарати, рослинну сировину та об’єкти довкілля, а також в практиці державних лабораторій з контролю якості лікарських препаратів та центральних заводських лабораторій фармацевтичних підприємств. Запропоновані методики виконання аналізу не вимагають застосування висококоштовних приладів, а також токсичних хімічних реактивів; за чутливістю, швидкістю виконання та селективністю є більш досконалими, ніж існуючі. Опубліковані три інформаційних листи: „Методика кількісного визначення вікасолу в лікарських формах хемілюмінесцентним методом” (№ 217 – 2005), „Методика кількісного визначення зопіклону в таблетках кінетичним методом за індикаторною реакцією спряженого окиснення п-фенетидину гідроген пероксидом” (№ 218 – 2005) та „Методика кількісного визначення кофеїну в каві методом хемілюмінесценції” (№ 216 – 2005) для впровадження в практику роботи контрольно-аналітичних та науково-дослідних лабораторій.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літературних даних, експериментальні роботи, що стосуються вивчення аналітичних систем на основі спряжених реакцій окиснення органічних відновників гідроген(ацил)пероксидами та їх застосування у практиці фармацевтичного аналізу, виконані дисертантом самостійно за вказівками наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Основний зміст дисертаційної роботи доповідався на III Міжнародній науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003) та на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Застосування іонометрії та кінетичних методів у хімічному та фармацевтичному аналізі” (Харків, 2004).

Публікації. Основний зміст роботи відображений в 15 наукових працях, у тому числі 5 статтях, 7 тезах доповідей, 3 інформаційних листах.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається з умовних скорочень, вступу, огляду літератури (розділ 1), експериментальної частини (розділ 2), результатів досліджень та їх обговорення (розділи 3 _5), загальних висновків, списка використаних джерел та додатку. Загальний об’єм дисертації складає 133 сторінки. Робота ілюстрована 17 формулами, 30 рисунками і 17 таблицями. Список використаних джерел містить 219 бібліографічних найменувань і викладений на 23 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, сформульовані мета і основні задачі дослідження, наведені наукова новизна та практична цінність роботи.

У першому розділі _огляді літератури показані аналітичні можливості та перспективи застосування ефекту інгібування хемілюмінесцентних реакцій у фармацевтичному аналізі, розглянуті причини пригнічення хемілюмінесценції у водних розчинах.

Критично розглянуті хімічні реакції інгібіторів, які призводять до зменшення виходу хемілюмінесценції. Наведена класифікація інгібіторів за механізмом їх хімічної взаємодії з компонентами хемілюмінесцентної реакції. Антиоксиданти класу фенолів, ароматичних амінів та більшість інших інгібіторів знижують вихід світла в результаті дезактивації необхідних для виникнення хемілюмінесценції йон-радикалів ·О-О–. Зроблене припущення, що інгібування хемілюмінесцентних реакцій сполуками з подвійним зв’язком C = N обумовлене координацією радикалів ·ОН до подвійного зв’язку, а відтак рекомбінацією новоутвореного радикалу з відповідальним за хемілюмінесценцію надоксид-радикалом. Обґрунтований вибір нової аналітичної хемілюмінесцентної системи H2L – Н2О2 – Нb як основи для визначення лікарських та біологічно-активних речовин методом інгібування хемілюмінесценції.

У другому розділі „Експериментальна частина” наведені дані про об’єкти дослідження – досліджувані субстанції та лікарські засоби, реактиви, апаратуру, методи та умови здійснення експерименту.

У третьому розділі „Кількісне визначення лікарських та біологічно активних речовин методом хемілюмінесценції за ефектом інгібування реакцій окиснення люмінолу в присутності гемоглобіну” розроблені методики та показана можливість визначення лікарських та біологічно активних речовин _парацетамолу, кофеїну, катехоламінів (адреналін, допамін), флавоноїдів (рутин, кверцетин, дигідрокверцетин), кислоти аскорбінової та поліфенольних сполук (пірокатехін, кислота елагова) кінетичним методом за ефектом інгібування хемілюмінесценції нової аналітичної системи H2L – Н2О2 – Нb.

Досліджена можливість визначення парацетамолу (ПЦ) в лікарських сумішах кінетичним методом інгібування хемілюмінесценції з використанням нової аналітичної системи H2L – Н2О2 – Нb. Відомо, що взаємодія геміну Нb з гідроген пероксидом включає одноелектронні стадії, одна з яких призводить до утворення аніон-радикалу ·О-О–, який відповідальний за виникнення хемілюмінесценції в досліджуваній системі. Характер світіння відображає нерівноважні умови виникнення хемілюмінесценції, яка залежить від концентрації інгібітора процесу, вірогідно, відповідного амінофенолу. Тому дослідження впливу ПЦ на хемілюмінесценцію в системі H2L – Н2О2 – Нb викликає неабиякий як загальний науковий, так і практичний інтерес.

Досліджений вплив порядку змішування розчинів H2L, натрію гідроксиду, Н2О2, ПЦ та Нb та їх концентрацій на інтенсивність виникаючої хемілюмінесценції. Встановлено, що оптимальним є порядок змішування компонентів, коли останнім додається розчин Нb. Кількісне визначення ПЦ в препаратах виконували методом порівняння зі стандартом, використовуючи лінійні ділянки концентраційної залежності ДIхл. Інші компоненти комбінованих лікарських форм – кислота аскорбінова, феніраміну малеат у регламентованих кількостях не впливали на ефект інгібіторної дії ПЦ у хемілюмінесцентній реакції. Оптимальними концентраціями реактивів у даній хемілюмінесцентній системі є: с (NaOH)=0,035 М, с (Н2О2)=0,045 М, с (H2L) = 2•10-4 М, С (Нb) = 3,75·10-2 мкг/мл.

У табл. 1 наведені результати аналізу модельної суміші точно відомого складу ПЦ з кислотою аскорбіновою. Вони свідчать про відсутність впливу кислоти аскорбінової на правильність результатів аналізу ПЦ (д < ).

Оптимальні умови індикаторної системи та аналітичні характеристики методик кількісного визначення ПЦ в лікарських формах представлені в табл. 2. При визначенні ПЦ від 5·10-4 М до 2,5·10-3 М ? 1 %; Сн = 75 нг/мл.

Таблиця 1

Визначення парацетамолу в суміші парацетамолу з аскорбіновою кислотою (n = 5, Р = 0,95)

Модельна суміш точно відомого складу | Знайдено парацетамолу, г | Метрологічні характеристики

Склад:

парацетамолу 0,2800 г

аскорбінової кислоти 0,1000 г

води до 100 мл | 0,2792; 0,2802;

0,2806; 0,2799;

0,2808 | = 0,2801; = ± 6,3·10-4;

= ± 2,8·10-4; = ± 7,8·10-4;

= 0,225 %; д= + 0,04%

Опрацьована методика та показана можливість визначення кофеїну (К) в лікарських сумішах кінетичним методом за ефектом інгібування хемілюмінесценції системи H2L – Н2О2 – Нb. При змішуванні лужних розчинів Н2О2 та H2L в присутності каталітичної кількості Нb спостерігається хемілюмінесценція. Ключовою частинкою у послідовності реакцій, які призводять до виникнення хемілюмінесценції через утворення трансанулярного пероксиду люмінолу при розкладанні якого й утворюється емітер світіння – 3-амінофталат, є аніон-радикал ·О-О–. Наявність К у системі H2L – Н2О2 – (К) – Нb призводить до зменшення максимальної Iхл – інгібування хемілюмінесцентної реакції. Цей ефект зростає при збільшенні концентрації інгібітора процесу. Характер світіння нагадує спалах і свідчить про нестаціонарні умови процесу його виникнення (рис. 1).

Таблиця 2

Характеристика методів кінетичного визначення лікарських та біологічно активних речовин

№

п/п | Визначувана

сполука (дія) | Метод, індикаторна

система | сн | Інтервал визначуваних концентрацій | Об’єкт аналізу | , %

(д, %)

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

1. | Парацетамол (ПЦ), (інг.) | ХЛ1: H2L–Н2О2 –Нb

0,04М NaOH,

0,045М Н2О2,

2•10-4М H2L,

0,04 мкг/мл Нb | 5·10-7М

(75 нг/мл) | 5·10-7М – 2,5·10 -3М | Табл. парацетамолу по 0,2 г.

Панадол Юніор: ПЦ 0,24 г.

Фервекс д/діт.: ПЦ 280 мг, АК 100 мг, ФМ2 10 мг.

Фервекс: ПЦ 500 мг, АК 200 мг, ФМ2 25 мг.

Ефералган з віт. С: ПЦ 330 мг, АК 200 мг. |

0,6

(-0,2)

0,7

0,4

1,0

0,6

2. | Кофеїн (К), (інг.) |

ХЛ1: H2L–Н2О2 –Нb

0,05М NaOH,

0,075М Н2О2,

1•10-4М H2L,

0,04 мкг/мл Нb | 1·10-6М

(0,2 мкг/мл) |

1·10-6М _

1·10-4М |

Табл. коф.-бенз. натрію по 0,2 г.

Р-н коф.-бенз. натрію 10%.

Зерна кави „Арабіка” |

1,0

(-0,6)

1,3

(-0,6)

3,6

Продовження табл. 2

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

3. | Катехоламі-ни:

адреналін (А), (інг.)

допаміну г/х (ДА), (інг.) | ХЛ1: H2L–Н2О2 –Нb

0,05-0,06 М NaOH,

0,0375М Н2О2,

2•10-4М H2L,

0,04 мкг/мл Нb | 1·10 -7 М

(33 нг/мл)

(19 нг/мл) | 1·10 -7М _

1·10-5М |

Р-н адреналіну г/тр. 0,18%.

Розчин дофаміну 0,5%. |

2,8

(0)

1,3

(+ 0,2)

4. | Флавоноїди:

рутин (Р), (інг.)

кверцетин (КВ),

(інг.)

дигідроквер-цетин (ДКВ), (інг.) | ХЛ1: H2L–Н2О2 –Нb

0,05М NaOH,

0,0375-0,075М Н2О2,

1,5•10-4М H2L,

0,04 мкг/мл Нb |

5,4·10-7 М

(0,36 мкг/мл)

7,6·10-6 М

(2,3 мкг/мл)

3·10-8 М

(9 нг/мл) | (5,4 – 100) ·10-7 М

(7,6 – 82,5)·10-6 М

(3 – 250)·10-8 М | Табл. Аскорутин: АК 0,05 г, Р 0,05 г.

Гранули кверцетину: КВ 0,08 г.

Мод. р-н: ДКВ 0,3 г, решта – EtOH 96 %. |

2,4

(+ 0,9)

0,7

(– 0,4)

0,7

(– 0,4)

5. | Аскорбінова кислота (АК),

(інг.) |

ХЛ1: H2L–Н2О2 –Нb

0,05М NaOH,

0,075М Н2О2,

1-1,5•10-4М H2L,

0,04 мкг/мл Нb | 3,7·10-7 М

(18 нг/мл) | 3,7·10-7 М _

3,5·10-6 М |

Табл. Аскорутин: АК 0,05 г, Р 0,05 г.

Табл. АК по 0,1 г.

Р-н АК д/ін 5%.

Плоди шипшини: АК 0,2 %. |

1,4

(+0,9)

0,8

(+0,5)

0,8

(–0,4)

1,21

Продовження табл. 2

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

6. | Вікасол (В), (акт.) |

ХЛ1: H2L–Н2О2

0,07М NaOH,

0,075М Н2О2,

1•10-4М H2L | 3·10-7 М

(100 нг/мл) | 3·10-7 М _8·10-5 М |

Табл. Вікасол-Дарниця по 0,015 г.

Р-н В 1% д/ін. | 3,0

(+2,6)

4,1

(+ 1)

7. | Аспірин (АС)

(акт.)

Зопіклон (ЗП)

(акт.) |

СФ3 (кінетич-

ний):

ТМБ – Н2О2

1,6·10-3 М ТМБ, 1% Н2О2, рН 8,4

ПФ – Н2О2

4 мг/мл ПФ, рН 8,3

3-4% Н2О2 | 3·10-6 М

(0,5 мкг/мл)

5·10-6 М

(2

мкг/мл) | 3·10-6 М – 1·10-4М

5·10-6 М _1·10-4М |

Табл. Ацетилсаліци-лова кислота по 0,5 г

Табл. Соннат-КМП: ЗП 0,0075 г |

3,7

(+0,2)

1,6

(+0,1)

Примітки: 1 – хемілюмінесцентний; 2 – феніраміну малеат;

3 – кінетичний у спектрофотометричному варіанті.

Зроблене припущення, що явище інгібування обумовлене координацією радикалів НО· з подвійним зв’язком C = N імідазольного кільця кофеїну, а відтак рекомбінацією новоутвореного радикалу НОInh· з надоксид-радикалом ·О-О– відповідно:

Оптимальним є порядок змішування, коли останнім додається розчин гемоглобіну. Встановлено, що інші пуринові сполуки, а саме теобромін та теофілін у співмірних кількостях по відношенню до кофеїну не виявляють інгібіторної дії на хемілюмінесценцію в досліджуваній системі.

Кількісне визначення К в препаратах виконували методом порівняння зі стандартом, використовуючи лінійні ділянки концентраційної залежності ДIхл. Встановлено, що інші компоненти комбінованих лікарських форм (зокрема бензоат натрію) не впливали на ефект інгібіторної дії К у хемілюмінесцентній реакції.

Оптимальні умови та результати кількісного визначення кофеїну в лікарських засобах та зернах кави наведені в табл. 2. При визначенні К в таблетках кофеїн-бензоату натрію по 0,2 г і розчині для ін’єкцій 10 % відносне стандартне відхилення не перевищує 1,3 % (д = – 0,6 %), а в зернах кави „Арабіка” – 3,6 %. Сн = 0,2 мкг/мл.

Вперше встановлена інгібіторна дія катехоламінів _адреналіну (А) та допаміну (ДА) на хемілюмінесценцію в системі H2L – Н2О2 – Нb. На прикладі адреналіну процес інгібування можна зобразити схемою, наведеною на рис. 2:

Найвища інгібіторна дія А або ДА в досліджуваній хемілюмінесцентній системі досягається, коли останнім додається розчин гемоглобіну. Концентраційні залежності Io/Iхл для А та ДА в логарифмічних координатах мають лінійний характер в інтервалі більше як трьох порядків зміни концентрацій інгібіторів. Для здійснення кількісного визначення інгібіторів в об’єктах регламентованого складу зручно використовувати лінійні ділянки градуювальних залежностей ДIхл від концентрації аналітів. У спеціально проведених дослідах встановлено, що інші компоненти комбінованих лікарських форм (натрію дисульфіт, натрію хлорид) помітно не впливали на ефект інгібіторної дії А та ДА у хемілюмінесцентній реакції. Розроблена методика та показана можливість здійснення кількісного визначення А та ДА в готових лікарських формах кінетичним методом за ефектом інгібування хемілюмінесценції, яка виникає в системі H2L – Н2О2 – Нb. Оптимальні умови індикаторної системи та характеристики методик кількісного визначення катехоламінів в лікарських препаратах наведені в табл. 2. Інтервал визначуваних концентрацій А і ДА 1·10-7 _1·10-5 М; Сн для А і ДА становить 33 нг/мл і 19 нг/мл відповідно. При визначенні А і ДА в розчинах для ін’єкцій _2,8 % і 1,3 % відповідно. Встановлено, що наявність флавоноїдів в хемілюмінесцентній системі H2L – Н2О2 – Нb призводить до зменшення максимальної інтенсивності світіння: ДIхл пропорційне концентрації інгібіторів. На рис. 3 представлені залежності ДIхл від концентрації флавоноїдів.

Лінійна залежність зменшення максимальної інтенсивності хемілюмінесценції (r = 0,998 – 0,999) ДIхл в присутності флавоноїдів покладена в основу хемілюмінесцентного методу їх кількісного визначення в модельних розчинах та лікарських препаратах. В табл. 3 наведені результати кількісного визначення флавоноїдів методом хемілюмінесценції за ефектом інгібування.

Розроблені методики та показана можливість здійснення кількісного визначення рутину (Р), кверцетину (КВ) та дигідрокверцетину (ДКВ) в лікарських препаратах кінетичним методом за ефектом інгібування хемілюмінесценції системи H2L – Н2О2 – Нb. За інгібіторною дією досліджувані флавоноїди можна розташувати в ряд: ДКВ > Р > КВ. Аналітичні характеристики методик наведені в табл. 2. При визначенні Р в таблетках „Аскорутин” ? 2,4 % (д = + 0,9 %), КВ в гранулах кверцетину та ДКВ у розчині = 0,7 % (д = – 0,4%). Сн для Р, КВ та ДКВ становить 0,4 мкг/мл, 2,3 мкг/мл і 9 нг/мл відповідно.

Таблиця 3

Результати кількісного визначення флавоноїдів методом хемілюмінесценції за ефектом інгібування (n = 5, Р = 0,95)

№ п/п | Визначувана речовина | Рівняння градуювального графіка | сmin, М | Інтервал визначуваних концентрацій | , %

1. | Дигідро-

кверцетин | ДI = 1,8·107·с + 18

(r = 0,998) | 1,5·10-8 | 3,0·10-8 – 2,5·10-6 М | ±3,0

2. | Кверцетин | ДI = 4,4·105·с – 1,4

(r = 0,999) | 3,8·10-6 | 7,6·10-6 –8,25·10-5 М | ±1,8

3. | Рутин | ДI = 5,1·106·с + 2

(r = 0,998) | 2,7·10-7 | 5,4·10-7 – 1·10-5 М | ±2,0

Вивчений вплив порядку змішування розчинів H2L, натрію гідроксиду, Н2О2, кислоти аскорбінової (АК) і Нb та їх концентрацій на інтенсивність виникаючої хемілюмінесценції. Встановлено, що глюкоза, крохмаль та інші допоміжні речовини в регламентованих кількостях не чинили помітного впливу на інтенсивність хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2 – Нb. Запропоновані умови та розроблені методики кількісного визначення АК методом ХЛ в лікарських засобах та плодах шипшини. Результати визначення наведені в табл. 2. Інтервал визначуваних концентрацій АК 3,7·10-7 – 3,5·10-6 М, Сн 18 нг/мл. При визначенні АК в препараті „Аскорутин” (в присутності Р) = 1,4 % (д = + 0,9 %), в плодах шипшини = 1,2 % (д = 0 %).

Вивчені антиоксидантні властивості відомих біоантиоксидантів – пірокатехіну (ПК) та елагової кислоти (ЕК) з використанням як модельної аналітичної системи H2L _Н2О2 – Hb, в якій генеруються одночасно ·ОН та ·О2- радикали. Показано, що за інгібіторною дією ЕК переважає ПК. Аналітичні характеристики розроблених методик ХЛ визначення ПК та ЕК за інгібіторною дією в системі H2L – Н2О2 – Нb наведені в табл. 4. ? 0,8 % (д = – 0,2 ...0 %). Для ПК та ЕК Сн становить 1,2·10-6 М і 4·10-8 М відповідно.

Таблиця 4

Результати кількісного визначення пірокатехіну та кислоти елагової хемілюмінесцентним методом (n = 5, Р = 0,95)

Уведено речовини, М | Знайдено речовини, М | Метрологічні характеристики

пірокатехіну

10,00·10-4 | 9,94·10-4; 1,00·10-3;

9,99·10-4; 1,00·10-3;

9,97·10-4 | = 9,98·10-4; = ± 2,5·10-6; = ± 1,1·10-6;

= ± 3,2·10-6; = 0,25 %;д= _0,2 %

елагової кислоти

10,0·10-5 | 1,01·10-4; 9,91·10-5;

1,01·10-4; 1,00·10-4;

9,99·10-5 | = 1,00·10-4; = ± 8,1·10-7; = ± 3,6·10-7;

= ± 1,0·10-6; = 0,8 %; д= 0 %

У четвертому розділі „Кількісне визначення вікасолу в лікарських формах за ефектом активування хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2” встановлено, що вікасол (В) чинить активуючий вплив на процес хемілюмінесцентного окиснення люмінолу гідроген пероксидом в сильнолужному середовищі. Таку поведінку В пояснено генеруванням у розчині активних форм оксигену, які безпосередньо беруть участь у виникненні емітера хемілюмінесценції. Це явище покладено в основу розроблення нової хемілюмінесцентної методики кількісного визначення В у його лікарських формах. Зроблене припущення, що в умовах генерування хемілюмінесценції (рН ? 12) відбувається елімінування сульфітної групи з молекули вікасолу в результаті гідролізу і утворення молекули 2-метил-4-нафтохінону (вітаміну К3), який, на відміну від вікасолу, здатний до оборотних редокс-перетворень:

вікасол 2-метил-1,4-нафтохінон

Не виключена можливість ізомеризації вікасолу з утворенням натрієвої солі 2-метил-1,4-нафтогідрохінон-3-сульфокислоти, яка також володіє здатністю до оборотних процесів окиснення-відновлення:

Такий механізм перетворень вікасолу підтверджується, зокрема, одержаними нами спектральними даними. На рис. 4 наведені диференційні електронні спектри сумішей натрію гідроксид – В, натрію гідроксид – цинковий пил – В та H2L – натрію гідроксид – Н2О2 – В. На спектрі продуктів взаємодії досліджуваної хемілюмінесцентної композиції з В знаходили смуги, ідентичні таким, що належать продукту відновлення В – відповідному гідрохінону. В реакційній суміші знаходили 2-метил-1,4-нафтогідрохінон з виходом більше 60%. Окиснення 2-метил-1,4-нафтогідрохінону (Н2А) у 2-метил-1,4-нафтохінон (А) у лужному середовищі практично повністю відбувається за механізмами, опосередкованими надоксидними аніонрадикалами ·О-О–:

Хоча, в процесі відновлення як 2-метил-1,4-нафтохінон, так і 2-метил-1,4-нафтохінон-3-сульфокислота не утворюють помітних кількостей семіхінонової форми, кількість утвореного при відновленні ·О-О– (за умов наявності Н2О2 в системі) виявляється достатньою для збудження хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2 – В. Крім того, спостерігали кореляцію між швидкістю окиснення люмінолу та інтенсивністю хемілюмінесценції в досліджуваній системі. На рис. 5 наведені типові кінетичні криві хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2 та H2L – Н2О2 – В. Як видно з рис. 5 при наявності В у системі H2L – Н2О2 спостерігається підвищення максимальної Iхл – активування хемілюмінесцентної реакції. Цей ефект зростає при збільшенні концентрації активатора процесу.

Досліджений вплив порядку змішування розчинів H2L, натрію гідроксиду, Н2О2 і В та їх концентрацій на інтенсивність виникаючої хемілюмінесценції. В результаті досліджень встановлено, що оптимальним є порядок змішування, коли останнім додається розчин В. Інші компоненти лікарських форм – натрію бісульфіт та інші допоміжні речовини у регламентованих кількостях не впливали на ефект активуючої дії В у ХЛ реакції окиснення H2L ГП. Достатня вибірковість ХЛ реакції та прямо пропорційна залежність максимальної інтенсивності ХЛ від концентрації В покладена в основу опрацювання нового методу кількісного визначення В у готових лікарських засобах. Аналітичні характеристики розроблених методик ХЛ визначення В в таблетках та розчині для ін’єкцій наведені в табл. 2. Інтервал визначуваних концентрацій В 3,7·10-7 _8·10-5 М. При визначенні В в таблетках по 0,015 г і розчині для ін’єкцій 1 % = 3,0 % (д = + 2,65 %) і 4,1 % (д = + 1 %) відповідно.

У п’ятому розділі „Кількісне визначення деяких естерів кінетичним методом за ефектом активування індикаторної реакції” досліджена можливість здійснення кількісного визначення кислоти ацетилсаліцилової (АСК) в лікарських формах кінетичним методом за новою індикаторною реакцією спряженого окиснення 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (ТМБ) гідроген пероксидом. На рис. 6 наведено схему перетворень, покладених в основу опрацьованого методу визначення АСК.

Ймовірно, що при взаємодії АСК з ГП у слабко лужному середовищі має місце утворення надоцтової кислоти, причому її вихід пропорційний концентрації АСК в системі. Максимальна швидкість окиснення ТМБ в досліджуваній системі досягається при рН 8,4. Результати вивчення впливу послідовності змішування реактивів, а також часу попереднього витримування розчинів ГП з АСК в присутності буферної суміші перед додаванням ТМБ дали підставу вважати за оптимальний такий порядок змішування розчинів: АСК – Н2О2 – ТМБ. На підставі з’ясованих кінетичних закономірностей перебігу двох спряжених реакцій: пергідролізу АСК та каталітичного окиснення ТМБ гідроген пероксидом запропоновано нову методику кінетичного визначення АСК в таблетках „Ацетилсаліцилова кислота”. Результати представлені в табл. 2. Інтервал визначуваних концентрацій 3·10-6 _1·10-4 М; при визначенні АСК в таблетках по 0,5 г = 3,7 % (д = + 0,15 %), Сн = 0,5 мкг/мл.

Розроблені методики та показана можливість кінетичного визначення мікрограмових кількостей зопіклону (ЗП) та триацетину (Т) з використанням як індикаторної – реакції Шенемана, в якій ЗП та Т виступають як ацилюючі реагенти.

На рис. 7 наведена схема пергідролізу ЗП.

Рис. 7. Схема хімічних перетворень при кінетичному визначенні зопіклону з використанням п-фенетидину. С (ПФ) = 4 мг/мл, С (Н2О2) = 4 %, рН 8,25 (Ф), с (ЗП) = 2·10-5 М.

Аналіз виконували методом фіксованого часу, вимірюючи оптичну густину розчину при 358 нм, що відповідає максимуму світлопоглинання утворюваного продукту окиснення п-фенетидину – 4,4'-азоксифенетолу (lg е = 4,0) за 10 хв (ЗП) та 30 хв (Т). Запропоновані умови та опрацьовані методики кінетичного визначення ЗП в таблетках та Т у водних розчинах. При визначенні ЗП в таблетках по 0,0075 г = 1,6 % (д = + 0,05 %). Результати аналізу наведені в табл. 2 та 7.

Таблиця 7

Результати визначення триацетину кінетичним методом

(n = 5, Р = 0,95)

Уведено Т, мг/мл | Знайдено Т, мг/мл | Метрологічні характеристики

0,218 |

0,196; 0,231;0,227;

0,221; 0,2145 | = 0,2179; = ± 1,4·10-2; = ± 0,6·10-2;

= ± 1,7·10-2; = 6,3 %;д= – 0,05 %

ВИСНОВКИ:

1. Опрацьовані нові аналітичні системи на основі реакцій хемілюмінесцентного окиснення люмінолу в присутності гемоглобіну та спряженого окиснення 3,3',5,5'-тетраметилбензидину та п-фенетидину гідроген пероксидом на лікарські та біологічно активні речовини та показана можливість їх застосування у фармацевтичному аналізі.

2. Встановлений інгібіторний вплив лікарських та біологічно активних речовин _парацетамолу, кофеїну, катехоламінів (адреналін, допамін), флавоноїдів (рутин, кверцетин, дигідрокверцетин), кислоти аскорбінової та поліфенольних сполук (пірокатехін, кислота елагова) на хемілюмінесценцію в системі H2L – Н2О2 – Нb.

3. Вперше встановлена вибіркова інгібіторна дія на ХЛ в системі H2L – Н2О2 – Нb парацетамолу в присутності кислоти аскорбінової, а також кофеїну в присутності теофіліну та теоброміну.

4. Запропоновані умови, опрацьовані методики та показана можливість здійснення кінетичного визначення парацетамолу, кофеїну, катехоламінів (адреналін, допамін), флавоноїдів (рутин, кверцетин, дигідрокверцетин), кислоти аскорбінової, поліфенольних сполук (пірокатехін, кислота елагова) в модельних розчинах та лікарських засобах методом інгібування хемілюмінесценції із застосуванням як індикаторної нової аналітичної системи H2L – Н2О2 – Нb.

5. Виявлений активуючий вплив вікасолу та запропонований хімізм процесу активації хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2. Розроблені методики та показана можливість хемілюмінесцентного визначення вікасолу в субстанції та лікарських препаратах.

6. Запропоновані умови, розроблені методики та показана можливість кінетичного визначення лікарських та допоміжних речовин за реакцією спряженого окиснення гідроген пероксидом 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (кислота ацетилсаліцилова) та п-фенетидину (зопіклон, триацетин) в лікарських засобах та модельних розчинах.

Опубліковані праці, що відображають основні положення дисертації:

1. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Кількісне визначення парацетамолу в лікарських формах методом хемілюмінесценції // Фармац. журн. – 2004. _№ 5. – С. 68 – 73. (Особистий внесок _виконання експериментальних досліджень, участь в узагальненні результатів та їх обговоренні, підготовка матеріалів та написання статті).

2. Бондаренко Н.Ю., Блажеєвський М.Є. Кількісне визначення кофеїну хемілюмінесцентним методом в лікарських формах // Фармац. журн. – 2005. _№ 2. – С. 75 – 79. (Особистий внесок _виконання експериментальних досліджень, участь в узагальненні та обговоренні результатів, написання статті).

3. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Визначення катехоламінів у лікарських формах методом інгібування хемілюмінесценції // Журн. орг. та фарм. хімії – 2005. – Т. 3, № 3 (11). – С. 79 – 82. (Особистий внесок _виконання експериментальних досліджень, участь в узагальненні результатів та їх обговоренні, підготовка матеріалів та написання статті).

4. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Кількісне визначення флавоноїдів в лікарських засобах методом хемілюмінесценції // Фармаком. – 2005. _№ 2/3. – С. 177 – 181. (Особистий внесок _виконання експериментальних досліджень, підготовка матеріалів статті до друку).

5. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Кількісне визначення вікасолу в лікарських формах методом хемілюмінесценції // Фармац. журн. – 2006. _№ 2. – С. 74 – 78. (Особистий внесок _виконання експериментальних досліджень, участь в узагальненні результатів та їх обговоренні, підготовка матеріалів та написання статті).

6. Бондаренко Н.Ю., Блажеєвський М.Є. Порівняльне дослідження кінетичних методів визначення гемоглобіну за пероксидазною активністю // Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія. ІІІ Міжнар. науково-практ. конф., Харків, 21-23 травня 2003 р. Тези доповідей. – Харків, 2003. – С. 52.

7. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Визначення рутину в таблетках „Аскорутин” методом хемілюмінесценції // Матеріали ІІІ Міжнар. наук.-практ. конф. „Динаміка наукових досліджень’2004”. – Т. 69. – Дніпропетровськ: „Наука і освіта”, 2004. _С. 12 _14.

8. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Визначення адреналіну в лікарських формах методом хемілюмінесценції // Матеріали І Міжнар. наук.-практ. конф. „Науковий потенціал світу’2004”. – Т. 75. – Дніпропетровськ: „Наука і освіта”, 2004. _С. 40 _42.

9. Бондаренко Н.Ю., Блажеєвський М.Є. Кількісне визначення кофеїну в лікарських формах хемілюмінесцентним методом // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно-активних добавок. Матер. наук.-практ. конф. з міжнар. участю, Тернопіль: „Укрмедкнига”, 2004. – С. 265 _267.

10. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Кількісне визначення вікасолу в лікарських формах методом хемілюмінесценції // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України. Матер. VI Нац. з’їзду фармацевтів України, Харків, 28-30 вересня 2005 р. – Харків, 2005. – С. 133 _134.

11. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Кінетичне визначення ацетилсаліцилової кислоти в лікарських формах // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України. Матер. VI Нац. з’їзду фармацевтів України, Харків, 28-30 вересня 2005 р. – Харків, 2005. – С. 134.

12. Блажеєвський М.Є., Бондаренко Н.Ю. Кінетичний метод визначення зопіклону за реакцією пероксикислотного окиснення // Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів. Матер. 1-ї Міжнар. наук.-практ. конф., Тернопіль, 6-7 квітня 2006 р. – Тернопіль, 2006. – С. 81 – 83.

13. Бондаренко Н.Ю., Блажеєвський М.Є. Методика кількісного визначення кофеїну в каві методом хемілюмінесценції // Інформ. лист. – 2005, № 216 – 2005. – 3 с.

14. Бондаренко Н.Ю., Блажеєвський М.Є. Методика кількісного визначення вікасолу в лікарських формах хемілюмінесцентним методом // Інформ. лист. – 2005, № 217 – 2005. – 3 с.

15. Бондаренко Н.Ю., Блажеєвський М.Є. Методика кількісного визначення зопіклону в таблетках кінетичним методом за індикаторною реакцією спряженого окиснення п-фенетидину гідроген пероксидом // Інформ. лист. – 2005, № 218 – 2005. – 3 с.

Бондаренко Н.Ю. Аналітичні системи на основі спряжених реакцій окиснення органічних відновників гідроген(ацил)пероксидами та їх застосування у фармацевтичному аналізі. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія. – Національний фармацевтичний університет, Харків, 2007.

Дисертація присвячена розробленню нових аналітичних систем на основі реакцій хемілюмінесцентного окиснення люмінолу в присутності гемоглобіну та спряженого окиснення 3,3',5,5'-тетраметилбензидину та п-фенетидину гідроген пероксидом на лікарські та біологічно активні речовини з метою їх застосування у фармацевтичному аналізі.

Встановлений інгібіторний вплив, запропоновані умови, опрацьовані методики та показана можливість здійснення кінетичного визначення парацетамолу, кофеїну, катехоламінів (адреналін, допамін), флавоноїдів (рутин, кверцетин, дигідрокверцетин) кислоти аскорбінової та поліфенольних сполук (пірокатехін, кислота елагова) в модельних розчинах та лікарських засобах методом інгібування хемілюмінесценції із застосуванням як індикаторної нової аналітичної системи H2L – Н2О2 – Нb. Вперше встановлена вибіркова інгібіторна дія на ХЛ в системі H2L – Н2О2 – Нb парацетамолу в присутності кислоти аскорбінової, а також кофеїну в присутності теофіліну та теоброміну. Виявлений активуючий вплив вікасолу та запропонований хімізм процесу активації хемілюмінесценції в системі H2L – Н2О2. Розроблені методики та показана можливість хемілюмінесцентного визначення вікасолу в субстанції та лікарських препаратах.

Запропоновані умови, розроблені методики та показана можливість кінетичного визначення лікарських та допоміжних речовин за реакцією спряженого окиснення гідроген пероксидом 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (кислота ацетилсаліцилова) та п-фенетидину (зопіклон, триацетин) в лікарських засобах та модельних розчинах.

Ключові слова: кінетичний метод аналізу, інгібування хемілюмінесценції, окиснення, люмінол, гемоглобін як каталізатор, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, п-фенетидин.

Bondarenko N.U. Analytical systems on the basis conjugated reactions of organic reducing agents oxidation by hydrogen(acyl)peroxides and their use in the pharmaceutical analysis. – Manuscript.

The manuscript rights is submitted for a Candidate Degree in pharmacy by speciality 15.00.02 – pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. – National Pharmaceutical University, Kharkov, 2007.

In the dissertation the development of new analytical systems on the basis of luminol chemiluminescence oxidation reaction in the presence of hemoglobine and conjugated oxidation of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine and n-phenetidine by hydrogen peroxide on medicinal and biologically active substances with the aim of their use in the pharmaceutical analysis has been suggested.

The inhibitor influence has been established the terms have been proposed, the methods have been worked out and the possibility of kinetic identification of paracetamol, caffeine, catecholamines (adrenaline, dopamine), phlavonoids (rutin, quercetin, dihydroquercetin), ascorbic acid and polyphenolic compounds (pyrocatechin, elagic acid) in the model solutions and medicinal preparations by chemiluminescence inhibition method using new analytical H2L – Н2О2 – Нb system as indicator.

In the chemiluminescence system H2L – Н2О2 – Нb selective ingibitor paracetamol action in the presence of ascorbic acid, and also caffeine in the presence of theophiline and theobromine has been firstly established. The activating vikasol enfluence has been established and the chemistry of chemiluminescence activating process in H2L – Н2О2 system has been proposed.

The methods have been developed and the possibility of chemiluminescence vikasol identification in a substance and medicinal preparations have been shown.

The conditions have been proposed, the methods have been developed and the possibility of kinetic identification of medicinal and auxiliary substances by means of conjugated oxidation reaction by hydrogen peroxide 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (acetylsalicylic acid) and n-phenetidine (zopiklon, triacetin) in medicinal preparations and model solutions.

Key words: kinetic method of analyses, chemiluminescence ingibition, oxidation, luminol, hemoglobin as catalizator, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, n-phenetidine.

Бондаренко Н.Ю. Аналитические системы на основе сопряженных реакций окисления органических восстановителей гидроген(ацил)пероксидами и их применение в фармацевтическом анализе. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия. – Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2007.

Диссертация посвящена разработке новых аналитических систем на основе реакций хемилюминесцентного окисления люминола в присутствии гемоглобина, а также сопряженного окисления первичных ароматических аминов _3,3',5,5'-тетраметилбензидина и п-фенетидина пероксидом водорода в присутствии активированных эстеров с целью их применения в фармацевтическом анализе для количественного определения лекарственных, биологически активных и вспомогательных веществ.

Систематизированы имеющиеся данные об использовании эффекта ингибирования хемилюминесцентных реакций в фармацевтическом анализе. Сделан вывод о перспективности использования ингибирования хемилюминесцентных реакций для качественного и количественного определения биологически активных и лекарственных веществ. Рассмотрены вопросы классификации ингибиторов по механизму их химического взаимодействия с компонентами хемилюминесцентных реакций.

Предложена в качестве индикаторной на ингибиторы новая хемилюминесцентная система гидразид 3-аминофталевой кислоты (люминол) – пероксид водорода – гемоглобин (катализатор), в которой генерируются одновременно два типа активных форм кислорода _?ОН и ·О-О– радикалы.

Установлено ингибиторное влияние, предложены условия, разработаны методики и показана возможность осуществления кинетического определения парацетамола, кофеина, катехоламинов (адреналин, допамин), флавоноидов (рутин, кверцетин, дигидрокверцетин), кислоты аскорбиновой и полифенольных соединений (пирокатехин, кислота эллаговая) в модельных растворах и готовых лекарственных препаратах методом ингибирования хемилюминесценции с использованием как индикаторной новой аналитической системы H2L – Н2О2 – Нb.