НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНЫ

Боброва Олена Миколаївна

УДК:547.42:615.361.013.3/8.014.41

ВПЛИВ крІопротекторІв І НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР НА ТЕРМОДИНАМІЧНІ ПАРАМЕТРИ Та СТРУКТУРНИЙ СТАН КОМПОНЕНТІВ КОРДОВОЇ КРОВІ І ПЛАЦЕНТИ ЛЮДИНИ

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Зінченко Олександра Василівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м.Харків, провідний науковий співробітник відділу кріобіофізики.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефраїмович, Харківський Національний Університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії;

- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Гордієнко Ольга Іванівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування.

Провідна установа:

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, відділ експериментальних клітинних систем, м.Київ.

Захист відбудеться “20” лютого 2007 р. о “13.30” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м.Харків, вул. Переяславська, 23).

Автореферат розісланий “19” січня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що останнім часом у терапевтичній практиці використання компонентів фетоплацентарного комплексу стало важливим підходом при лікуванні різних захворювань (В.І. Грищенко і співавт., 1996, 2000, 2003, 2004; Н.С.Луценко і співавт., 2001; Ю.А.Мошко, 2003; Я.О.Попович, 2005). Однак між моментом заготівлі і трансплантацією в організм реципієнта цих компонентів існує розрив у часі, тому виникає необхідність їх тривалого зберігання в біологічно повноцінному стані (В.І.Грищенко і співавт., 1995). В нинішній час перспективним вважається метод низькотемпературного консервування і збереження біологічних об'єктів (В.І.Грищенко і співавт., 1999, 2000). Однак заморожування біологічних об'єктів супроводжується рядом фізичних процесів, наприклад, таких як склування, кристалізація, рекристалізація, плавлення, що можуть спричиняти ушкоджуючу дію (Н.С.Пушкар і співавт., 1977; Н.В.Рєпін, 1986; Ю.В.Кучеренко, 1999). Для дослідження вказаних явищ широко застосовуються методи диференційної скануючої калориметрії (ДСК) і кріомікроскопії (Л.Ф.Розанов, 1977; О.В.Зінченко, 1983).

Різні біологічні об'єкти вимагають індивідуального підходу при розробці технології низькотемпературного консервування (концентрація і вид кріопротектора, режими еквілібрації з кріопротектором, охолодження, нагрівання і т.д.) (Н.С.Пушкарь і співавт., 1981; А.М.Белоус і співавт.,1994). Розробка методів кріоконсервування компонентів фетоплацентарного комплексу донедавна базувалося головним чином на емпіричному підході, тому становлять інтерес дослідження, які могли б сприяти оптимізації існуючих методів кріоконсервування. Зокрема, в літературі відсутні дані щодо динаміки насичення плаценти кріопротекторами, а існуючий метод кріоконсервування в присутності диметилсульфоксиду (ДМСО) потребує експериментального обґрунтування. Розробка методів заморожування і тривалого зберігання кордової крові (КК) і її компонентів являють собою актуальну задачу, завдяки доступності і дешевизні цього матеріалу порівняно з донорською кров'ю (В.І.Грищенко, 1995; А.Н.Стрижаков, 2003). Оскільки модифікація структурних елементів клітин відбувається ще на етапі їх підготовки до кріоконсервування (Л.Г.Кулешова, 1999; Н.Г.Землянских і співавт., 2005), то порівняльне дослідження впливу на клітини різних кріопротекторів і режимів еквілібрації в кріозахисних середовищах мають безпосередній зв’язок з проблемою кріоконсервування еритроцитів КК. Таким чином, комплексні експериментальні дослідження впливу кріопротекторів на низькотемпературні фазові переходи і склування, а також на структурний стан еритроцитів КК є актуальними і мають як теоретичне, так практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною фундаментальних наукових досліджень Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України і виконана відповідно до теми НДР відділу кріобіофізики “Дослідження впливу низьких температур і складу середовища на деякі елементи фетоплацентарного комплексу людини (клітини і плазма кордової крові, тканини плаценти і їх екстракти)” (шифр теми 2.2.6.99, № держреєстрації 0101У003482).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення закономірностей впливу проникних кріопротекторів і низьких температур на фазовий та структурний стан компонентів кордової крові, а також динаміки насичення плаценти кріопротекторами.

Завдання дослідження:

1. Дослідити вплив 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), гліцерину (Гл) і ДМСО на температуру фазових переходів і склування в еритроцитах, в плазмі КК і в плаценті. Визначити ентальпії кристалізації і плавлення евтектик в системах, що містять ДМСО.

2. Вивчити динаміку процесу насичення плаценти 1,2-ПД, Гл і ДМСО.

3. Провести порівняльний аналіз впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на морфологічний стан еритроцитів КК у залежності від концентрації кріопротектора, температури і часу еквілібрації.

4. Дослідити вплив 1,2-ПД, Гл, ДМСО і низьких температур на стан цитоплазми і бар'єрні властивості мембран еритроцитів КК.

5. Дослідити кріозахисну ефективність 1,2-ПД, Гл і ДМСО в процесі заморожування-відтавання еритроцитів КК.

Об'єкти дослідження – низькотемпературні фазові переходи і склування в компонентах фетоплацентарного комплексу, морфологічний стан еритроцитів, бар'єрні властивості мембран еритроцитів, гемоліз еритроцитів.

Предмет дослідження – еритроцити і плазма КК, плацента.

Методи дослідження. Методом ДСК досліджували низькотемпературні фазові переходи і склування. Характер кристалізації в суспензіях клітин вивчали методом кріомікроскопії. Визначення концентрації кріопротекторів у біологічних зразках проводили методом ядерного магнітного резонансу (ЯМР). Вплив кріопротекторів і низьких температур на морфологічний стан еритроцитів вивчали за допомогою методів світлової і растрової електронної мікроскопії (РЕМ). Методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) досліджували стан цитоплазми і бар'єрні властивості мембран еритроцитів. Метод спектрофотометрії використовували для вимірювання гемолізу еритроцитів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне дослідження метастабільних станів при температурах нижче 0С компонентів фетоплацентарного комплексу в присутності Гл, 1,2-ПД і ДМСО. Показано, що системи, які містять біологічні компоненти і кріопротектори, більш схильні до утворення аморфних фаз при охолодженні і до розвитку кристалізації води з аморфної фази при нагріванні, ніж водні розчини кріопротекторів відповідних концентрацій. Встановлено також, що як у плаценті, так і в еритроцитах і плазмі КК гальмується розвиток кристалізації і плавлення евтектик вода-ДМСО. Після еквілібрації фрагментів плаценти в розчинах, що містять 60 мас. % Гл і 1,2-ПД до 60 хв. і наступного охолодження до -196С не спостерігається розвитку процесів кристалізації з аморфної фази при нагріванні, що свідчить про те, що концентрація зазначених кріопротекторів у плаценті не досягає 40 мас %. Більш тривала еквілібрація сприяє затвердінню зразка в склоподібному стані і формуванню дрібнодисперсного льоду при нагріванні. Вивчення динаміки насичення плаценти кріопротекторами показало, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер – швидке проникнення кріопротектора у міжклітинний простір і повільне проникнення його всередину клітин .

Методами растрової електронної і оптичної мікроскопії встановлені закономірності впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на співвідношення різних форм еритроцитів КК до і після низькотемпературного впливу в залежності від концентрації кріопротекторів, температури і часу еквілібрації.

Методом ЕПР спінових зондів виявлене збільшення проникності мембран еритроцитів кордової крові для іонів ферриціаніду в присутності кріопротекторів високих концентрацій (Гл, 1,2  ПД – більш 40 мас. % і ДМСО – більш 30 мас. %), що пов'язано з порушенням бар'єрної функції мембран еритроцитів. Виявлено пошкоджуючу дію низькотемпературних фазових переходів розчинника на бар'єрні функції мембран еритроцитів. Результати аналізу змін структурного стану клітин під впливом кріозахисних речовин і низьких температур сприяють розширенню уявлень про механізми кріоушкодження і кріозахисту клітинних суспензій, що є однією з фундаментальних задач кріобіології.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених в дисертаційній роботі комплексних досліджень низькотемпературних фазових переходів і склування в плазмі, суспензіях еритроцитів кордової крові і в плаценті в присутності ряду проникних кріопротекторів можуть бути використані при розробці нових способів консервування різних біологічних об’єктів. Отримані результати з насичення плаценти кріопротекторами дозволяють оптимізувати існуючі методи її кріоконсервування. Результати аналізу впливу проникних кріопротекторів і низьких температур на морфологічний стан еритроцитів КК, а також на стан цитоплазми і бар'єрні функції мембран мають практичне значення при виборі кріопротектора і умов еквілібрації в процесі розробки методів кріоконсервування еритроцитів КК.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором проведені аналіз і узагальнення даних літератури, виконані експериментальні дослідження, здійснено узагальнення і статистична обробка отриманих експериментальних результатів. Дисертантом спільно з науковим керівником були інтерпретовані отримані результати і зроблени остаточні висновки. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах 1-3, 5-10 вивчено вплив проникних кріопротекторів на фазові переходи і склування в суспензіях еритроцитів КК і в плаценті людини;

- у роботі 4 проведено кріомікроскопічне дослідженння еритроцитів КК у присутності 1,2-ПД, Гл і ДМСО;

- у роботі 11 досліджено вплив кріопротекторів і низьких температур на стан цитоплазми і бар'єрні функції мембран еритроцитів;

- у роботах 12-14 вивчено вплив кріопротекторів на морфологічний стан еритроцитів КК.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлені і обговорені на Всеукраїнській науковій конференції “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины” (2001 р., м. Харків, Україна); ІІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (8-11 жовтня 2002 р., м. Львів, Україна); 3-й Міжнародній міждисциплінарній науково - практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (1-9 травня 2002 р., м. Ужгород, Україна); Конференції молодих учених “Холод у біології та медицині” (14-15 травня 2002 р., м. Харків, Україна); Міжнародній конференції “Cryobiomol 2003. Low temperature biology.” (14-18 September, 2003, Coimbra – Portugal); Ювілейній конференції молодих учених ІПКіК НАН України, присвяченій 350-річчю м. Харкова “Холод в биологии и медицине” (11-12 травня 2004 р., м. Харків, Україна); Науково – практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми трансфузіології” (3-4 червня 2004 р., м. Харків, Україна); І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (20-22 вересня 2004 р., м. Харків, Україна); П'ятій Харківській конференції молодих учених “Радиофизика и СВЧ электроника” (14 – 16 грудня 2005 р.); IІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології" (21-24 березня 2006 р., м. Львів, Україна); Другій всеукраїнській науково-технічній конференції студентів, аспірантів і молодих учених “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики" (17-22 квітня 2006 р., м. Севастополь, Україна), IІ Міжнародній конференції “Electronics and applied physics” (11-14 жовтня 2006 р., м. Київ, Україна).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 14 робіт, з яких 5 - у фахових наукових журналах, 9 - у збірниках матеріалів конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого матеріалам і методам дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і списку літератури. Робота викладена на 192 сторінках машинописного тексту, містить 16 таблиць і 61 ілюстрацію, що разом займають 25 окремих сторінок. Список використаних літературних джерел викладений на 26 сторінках, складається з 248 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Матеріалом дослідження були обрані компоненти КК (плазма і еритроцити) і фрагменти плаценти. Кров і плаценту заготовлювали при фізіологічних родах у соматично здорових жінок. Були використані наступні кріопротектори: 1,2-ПД ("Химпром", Кемерово), фармакопейний препарат ДМСО і Гл фірми "Reanal" (Угорщина). Відмиті Na – фосфатним сольовим буфером (рН 7,4) еритроцити змішували з розчинами 1,2 - ПД, Гл, ДМСО різних концентрацій. Експозиція еритроцитів з розчинами кріопротектіров складала 15 хв.

Фрагменти плаценти розміром 22 см і масою 1 г поміщали в 10%, 40%, і 60% розчини 1.2-ПД, Гл і ДМСО. Час еквілібрації зразків плаценти в розчинах 1.2-ПД і Гл складав 20, 60 хв і 24 години, а в розчинах ДМСО 20 хв, 1 год., 10 год., 18 год., 21 год., 24 год. і 7 діб при температурі 4С.

Заморожування всіх зразків здійснювалося шляхом занурення в рідкий азот. При цьому середня швидкість охолодження складала 200°С за хвилину. Відтавання проводилося на водяній лазні при температурі +40°С до появи рідкої фази.

Дослідження фазових переходів і склування в області температур 0-196 проводили на диференційному скануючому калориметрі, розробленому в інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (О.В.Зінченко, 1983). Термограми реєстрували при нагріванні зі швидкістю 0,5°С за хвилину. Похибка вимірювання температури складала 0,2 С, похибка вимірювання теплопоглинання 2,5 %. Для калориметричних досліджень еритроцити після змішування з розчинами кріопротекторів осаджували центрифугуванням при 800 g протягом 5 хв і відокремлювали щільну суспензію кліток від надосадової рідини. Таким чином одержували три види зразків: 1 – еритромаса, змішана з рівним об’ємом кріозахисного розчину, 2 – щільний осад еритромаси, отриманий після центрифугування першого зразка, 3 – надосадова рідина.

Концентрацію кріопротекторів у зразках визначали методом 1Н ЯМР високої роздільної здатності. Дослідження проводили на спектрометрі ядерного магнітного резонансу TESLA ВS 567А (Чехословаччина) з робочою частотою 100 МГц, використовуючи методику, описану В.Д.Зінченком (1994).

Кріомікроскопічні дослідження проводили за допомогою спеціальної кріоприставки до світлового мікроскопа. У дослідженнях був використаний інтерференційно-поляризаційний мікроскоп PSO-5 (Польща) у режимі інтерференційного контрасту в складі мікрокіноустановки МКУ-3. Охолодження і нагрівання проводили зі швидкостями 7-9 °С/хв.

Для досліджень методами світлової і растрової електронної мікроскопії проводили фіксацію клітин 1,2% розчинами глютаральдегіду. Морфологічний стан зразків оцінювали за допомогою оптичного мікроскопа МБР-3, спряженого з відеокамерою Panasonic WV-CP 470 і растрового електронного мікроскопа РЕММА-101А (AO “Selmi”) при прискорюючій напрузі 20-30 кВ (роздільна здатність - 6,0 нм).

Для дослідження динамічного стану цитоплазми еритроцитів КК, а також для оцінки бар'єрної функції мембран використовували метод ЕПР спінових зондів з додатковим уширенням (Г.И.Ліхтенштейн, 1974). Використовували водорозчинний зонд 2,2,6,6–тетраметил–4-оксопиперідін-1-оксил (ТЕМПОН), а як уширюючий агент застосовували феррицианід калію. Спектри ЕПР реєстрували на спектрометрі ЕПР Bruker ER – 100D (ФРН) з термостатуючим пристроєм, точність термостатування 0,5 С.

Для вимірювання гемолізу еритроцитів КК після додавання розчинів кріопротекторів і низькотемпературного впливу брали надосад, який отримували центрифугуванням суспензії еритроцитів протягом 5 хв. при 800g. Спектри поглинання надосадів реєстрували на спектрофотометрі Pye Unicam SP-8000 (Англія) при довжині хвилі 543 нм.

Отримані результати статистично обробляли за методом Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень і їх обговорення

Фазові переходи позаклітинних і внутрішньоклітинних розчинів є істотною причиною кріопошкодження клітин, оскільки, наприклад, повільне заморожування сприяє дегідратації клітин внаслідок осмотичних ефектів, що виникають при заморожуванні позаклітинних розчинів, а швидке – кристалізації внутрішньоклітинного розчину. У зв'язку з цим у роботі методом ДСК досліджувались умови розвитку склування, кристалізації льоду з аморфної фази, кристалізації і плавлення евтектичних складів, а також плавлення всієї системи в суспензіях еритроцитів з добавками кріопротектіров: 1,2-ПД, Гл і ДМСО різних концентрацій на етапі їх нагрівання після охолодження до -196°С.

На рис. 1 наведені типові термограми ДСК суспензій еритроцитів, щільної еритроцитарної маси і надосадової рідини, що містять 1,2-ПД і Гл, а також суспензій еритроцитів з розчинами ДМСО. Стрілками показані характерні стрибки теплопоглинання, ендо - і екзотермічні ефекти, що класифіковані в такий спосіб: 1 - стрибок теплопоглинання, що відповідає процесу переходу речовини з твердоаморфного стану в стан переохолодженої рідини (розсклування); 2 - інтенсивний ізотермічний пік кристалізації льоду з переохолодженої рідини; 3 - розмитий екзотермічний пік завершення кристалізації льоду при нагріванні; 4 - плавлення льоду в системі, 5 - евтектична кристалізація і 6 - евтектичне плавлення. На підставі термограмм визначені температури фазових переходів і склування для всіх досліджуваних систем.

При змішуванні эритроцитарної маси з 70 – 80% розчинами 1,2 – ПД спостерігається більш інтенсивний стрибок теплопоглинання 1 у порівнянні з таким же стрибком теплопоглинання у розчинах Гл тих же концентрацій. Це відповідає утворенню при тих самих умовах заморожування більшої кількості склоподібної маси. З термограмм також видно, що процес кристалізації льоду з аморфної фази розвивається при більш низьких концентраціях 1.2-ПД, ніж Гл, що вказує на більш високу стабільність аморфного стану в присутності 1,2-ПД у порівнянні з Гл тих же концентрацій.

Кристалізація льоду з аморфної фази реєструється в зразках, отриманих після змішування щільного осаду еритроцитів з кріозахисними розчинами, що містять 75 мас % Гл або 70 мас % 1,2-ПД, а також при більш високих концентраціях кріопротекторів. У той же час розбавлення тих же кріозахисних розчинів рівними об’ємами води при відсутності еритроцитів дає розчин, у якому кристалізація води з аморфної фази не реєструється. Ще більш інтенсивно і при більш низьких концентраціях кріопротекторів, ніж у суспензіях еритроцитів, виникає кристалізація льоду з аморфної фази в надосадовій рідині або в щільному осаді еритроцитів. Піки кристалізації льоду з аморфної фази реєструються в зразках надосадової рідини і у зразках щільної еритроцитарної маси, отриманих після центрифугування суспензій еритроцитів з розчинами 70 мас % Гл і 60 мас % 1.2-ПД. Однак у вихідній суміші еритроцитів при таких концентраціях кріопротекторів це явище не спостерігається. Відмінності, що спостерігаються, пояснюються особливостями розподілу кріозахисних речовин між внутрішньо- і позаклітинним середовищем еритроцитів. У щільному осаді еритроцитів знижується імовірність позаклітинної кристалізації, а висока концентрація кріопротектора усередині клітини сприяє склуванню внутрішньоклітинної рідини. У розбавленій суспензії клітин такий ефект склування потребує більш високих концентрацій кріопротектора.

Інтенсивність піка кристалізації евтектики 5 у вихідному зразку за характером свого прояву являє собою суперпозицію відповідних піків кристалізації евтектик у міжклітинній і внутрішньоклітинній рідині. Процес кристалізації льоду з аморфної фази реєструється в зразках еритроцитів, отриманих змішуванням суспензії еритроцитів з 70% розчином ДМСО, а при більш низьких концентраціях ДМСО процес кристалізації льоду з аморфної фази не розвивається.

На підставі отриманих термограм водних розчинів ДМСО і розчинів, приготовлених на фізіологічному розчині, побудована частина діаграми фізичних станів даної системи у діапазоні концентрацій від 0 до 60 мас. % ДМСО. На відміну від водних розчинів таких неелектролітів, як гліцерин і особливо 1,2-ПД, у системі вода - ДМСО кристалізація може відбуватися у всьому досліджуваному діапазоні концентрацій.

У роботі проведений порівняльний аналіз теплових ефектів, що супроводжують кристалізацію і плавлення евтектичних складів у розчинах ДМСО і у зразках клітин, що містять ДМСО (рис. 2). Видно, що інтенсивність розвитку процесів кристалізації і плавлення евтектичних складів зменшується в присутності еритроцитів і сильно залежить від щільності клітин у зразках. Крім того, тепловий ефект при плавленні евтектичних складів більший, ніж при кристалізації. Цей факт свідчить про те, що частина евтектичного складу закристалізувалася ще на етапі охолодження.

Методом ЯМР на ядрах 1Н визначали концентрацію кріопротекторів у вихідній суміші еритроцитів, у надосаді і у щільній масі еритроцитів, отриманих після центрифугування еритроцитів з кріопротекторами. Показано, що у всіх досліджених зразках концентрація кріопротекторів у надосадовій рідині більш висока, у порівнянні зі зразками осаду еритроцитів.

Морфологічні зміни є важливими характеристиками реакції клітин на зміну властивостей навколишнього середовища, що дозволяє робити висновки про стан еритроцитів у присутності того чи іншого кріопротектора. У роботі проведений аналіз впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на морфологічний стан еритроцитів КК у залежності від концентрації кріопротекторів, часу і температури еквілібрації.

У присутності Гл і 1,2-ПД переважають дискоїдні форми еритроцитів, однак ці кріопротектори вже в 10% концентрації призводять до деякого набрякання дискоцитів, що підсилюється при підвищенні концентрації (рис. 3 a-b). Зростання концентрації Гл у суспензії до 30-40% приводить також до зростання кількості стоматоцитів, а 1,2-ПД - кренованих клітин. Вже в присутності 10 % ДМСО кількість дискоцитів у суспензії зменшується в кілька разів у порівнянні з контролем, а при підвищенні концентрації ДМСО в клітинній суспензії до 20-30% спостерігаються лише одиничні клітини правильної дисковидної форми (рис. 3c). Після відмивання всіх трьох досліджених кріопротекторів спостерігається відновлення вихідної форми еритроцитів.

У випадку Гл оптимальною температурою еквілібрації можна вважати 20С, оскільки при цій температурі спостерігається максимальна кількість дискоцитів, у той час як при 0С и 37С зростає частка кренованих форм еритроцитів і сфероцитів. У випадку 1,2-ПД і ДМСО оптимальною можна вважати температуру еквілібрації 0С, оскільки при підвищенні температури спостерігається активізація морфологічних змін.

При збільшенні часу еквілібрації еритроцитів у розчинах кріопротекторів з 15 хв до 30 хв не було виявлено значних морфологічних змін у популяції еритроцитів при температурах 0 і 20С, однак при 37С зростала частка сфероцитів і сфероехіноцитів (рис. 3d, f) у присутності всіх досліджених кріопротекторів. Цей факт можна пояснити зміною фізіологічного розподілу внутрішньо- і позаклітинних іонів, зв'язаною з порушенням бар'єрних властивостей мембран еритроцитів.

Методом кріомікроскопії показано, що при швидкостях охолодження – нагрівання 7-9 °С/хв всі три досліджених кріопротектори в концентраціях до 10% не спричинюють значної кріозахисної дії на еритроцити і в відтанутій суспензії спостерігаються лише одиничні цілі клітини. Кріозхисний ефект проникних кріопротекторів істотно підсилюється при підвищенні їх концентрації в суспензії. Однак зростання концентрації гліцерину в суспензії до 30 - 40% і ДМСО до 40% призводить до руйнування значної кількості клітин ще на етапі експозиції з кріопротектором. Максимальна кількість збережених клітин спостерігається після заморожування еритроцитів у присутності 20% Гл і 30% ДМСО і 1,2–ПД.

Плазматичні мембрани є первинною ланкою, що сприймає зміни фізико-хімічних умов середовища при впливі факторів кріоконсервування, а фундаментальною властивістю мембран, чуттєвою до цих факторів, є їх бар'єрна функція. У даній роботі методом ЕПР спінових зондів з додатковим уширенням досліджена дія проникних кріопротекторів і заморожування-відтавання на бар'єрні функції мембран і стан цитоплазми еритроцитів.

Додавання в суспензію еритроцитів Гл і 1,2-ПД у концентраціях 10-30%, а ДМСО – 10-20% не призводить до значної трансформації вигляду спектрів ЕПР. Однак при підвищенні концентрації Гл і 1,2-ПД до 40%, а ДМСО до 30% спостерігається поява незначного широкого сигналу, а в присутності 40% ДМСО спостерігається істотне зростання інтенсивності широкого сигналу і зменшення вузького. Ці факти свідчать про збільшення проникності мембран для іонів ферріціаніду, що говорить про порушення бар'єрної функції частини клітин.

Заморожування суспензії еритроцитів у присутності 10-40% Гл, 10-20% 1,2-ПД і ДМСО не призводить до появи помітної суперпозиції сигналів, причому ширина вузького сигналу в межах похибки не змінюється. Ці дані свідчать про збереження бар'єрних властивостей мембран переважної кількості клітин. Заморожування-відтавання клітин у присутності 30-40% ДМСО супроводжується не лише різким зменшенням інтенсивності вузького сигналу, але і збільшенням інтенсивності широкого сигналу у порівнянні з їх значеннями до заморожування, указуючи на ушкодження мембран значної частини клітин. Виявлено зменшення мікров'язкості цитоплазми еритроцитів після заморожування-відтавання в присутності Гл досліджуваних концентрацій, що може бути наслідком показаного вище набрякання еритроцитів у присутності даного кріопротектора.

При дослідженні впливу розсклування на бар'єрні функції мембран еритроцитів істотних змін у вигляді спектру не було виявлено, однак було зареєстровано істотне зростання інтенсивності широкого сигналу при дослідженні впливу кристалізації і плавлення евтектичних складів, що свідчить про збільшення кількості клітин з ушкодженими мембранами.

Для оцінки кількості ушкоджених кліток, після додавання кріопротекторів і після заморожування-відтавання в роботі також контролювали рівень гемолізу еритроцитів. Показано, що після еквілібрації еритроцитів при 0С у присутності 10-20 % кріопротекторів протягом 15 хв гемоліз складає менше 2%. Підвищення концентрації кріопротекторів до 30% викликає незначне зростання гемолізу, а до 40% - різкий стрибок цього показника. За рівнем гемолізу в присутності високих концентрацій кріопротектори можна розташувати в ряд: 1,2-ПД<Гл<ДМСО. Заморожування зануренням у рідкий азот призводить до різкого зростання рівня гемолізу у всіх досліджуваних зразках, однак для кожного кріопротектора можна виділити оптимальний концентраційний діапазон, що дозволяє зберегти максимальну кількість клітин: для ДМСО – 10 - 20%, для Гл і 1,2-ПД – 20 - 30%.

Ступінь насичення тканини кріопротектором і однорідність розподілу кріопротекторів у тканині визначають стійкість тканини до руйнування при низькотемпературному консервуванні, особливо до механічних руйнувань. У роботі за допомогою методів ДСК і ЯМР досліджена динаміка проникнення кріопротекторів у тканину плаценти з часом. Проведений аналіз термограм ДСК показав, що в плаценті, витриманій у 10%-х розчинах Гл і 1,2-ПД не реєструється ніяких особливостей крім стрибка теплопоглинання (рис. 4а, б) у температурному діапазоні склування. На термограмах плаценти, витриманої в 40%-х розчинах вказаних кріопротекторів спостерігається також розмитий пік завершення кристалізації при нагріванні. На термограммах ДСК плаценти, витриманої в 60%-х розчинах 1,2-ПД і гліцерину протягом доби, поряд із зазначеними вище особливостями, реєструється інтенсивний пік кристалізації льоду з аморфної фази, причому цей пік реєструється відразу після завершення процесу розсклування. У даному випадку насичення тканини плаценти досягло такого рівня, при якому стали можливими процеси утворення аморфних фаз при охолодженні і зародження кристалів льоду і їх подальшого росту при нагріванні. Аналогічне явище кристалізації льоду з аморфної фази реєструються у водних розчинах гліцерину, починаючи з концентрації 41% і вище і у водних розчинах 1,2-ПД – 31,9% і вище. Таким чином, у тканинах плаценти після 24 годин еквілібрації концентрація гліцерину складає не менше 41%, а 1,2-ПД – не менш 31,9%. Збільшення як концентрації кріопротектора в суміші, так і часу експозиції зразків плаценти призводить до збільшення стрибка теплопоглинання 1, отже, до збільшення відносної кількості склоподібної фази у зразку. При цьому ефект більш виражений у присутності 1,2-ПД. Методом ЯМР показано, що протягом перших 20 хвилин експозиції відбувається значне насичення тканини плаценти 1,2-ПД, а збільшення часу еквилибрації призводить до поступового подальшого насичення (табл.). Нерівномірність процесу насичення зв'язана, імовірно, з неодночасністю насичення поза- і внутрішньоклітинного простору. Той факт, що навіть протягом доби в плаценті не досягається концентрація кріопротектора, яка є у середовищі еквілібрації, пояснюється, на нашу думку, існуванням у тканині води, зв'язаної біологічними компонентами, яка не бере участь у процесі розчинення.

Таблиця

Значення концентрацій кріопротекторів у зразках плаценти

Час еквілібрації | Концентрація кріопротектора в розчині, мас % | 1,2-ПД в плаценті,

мас % | ДМСО в плаценті, мас %

20 хв. | 10 | 9,10,9 | 7,00,7

24 год. | 10 | 10,01,0 | 8,00,8

20 хв. | 40 | 14.81,5 | 17,01,7

60 хв. | 40 | _ | 24,02,4

24 год. | 40 | 19.31,9 | 23,02,3

20 хв. | 60 | 29,02,9 | 37,03,7

60 хв. | 60 | _ | 30,03,0

24 год. | 60 | 37,03,7 | 21,02,1

Для зразків плаценти, витриманих у 10% розчині ДМСО на термограмах тільки через 18 годин з'являються незначні екзо- і ендотермічні піки кристалізації і плавлення евтектичних складів, а стрибок теплопоглинання, що відповідає склуванню, спостерігається через 60 хвилин експозиції (рис. 4в). Еквілібрація зразків плаценти в 40%-му і 60%-му розчинах ДМСО призводить до того, що в зразках при нагріванні розвивається кристалізація і відповідно плавлення евтектичних складів. Наявність стрибка теплопоглинання, що відповідає склуванню в зразках, які досліджуються, (рис. 4в), вказує на те, що, затвердіння тканини плаценти, насиченої розчинами ДМСО у всіх випадках супроводжується утворенням склоподібних фаз при охолодженні. Величина стрибка теплопоглинання, що спостерігається при розсклуванні, досягає максимальних значень через 18 годин еквілібрації як у 40%, так і 60% розчинах ДМСО, а через 21 годину еквілібрації тканини в цих розчинах спостерігається значне зменшення цього стрибка (рис. 4в). Одночасне зменшення стрибка теплопоглинання, а також теплових ефектів кристалізації і плавлення евтектичних складів і збільшення температури плавлення зразка при експозиції плаценти як у 40%, так і 60% розчинах ДМСО понад 21 години можуть, на нашу думку, свідчити про те, що протягом цього часу молекули ДМСО в тканинах окислюються до ДМСО2 або взаємодіють з активними речовинами плаценти. Продукти хімічних перетворень ДМСО можуть не виявляти склоутворюючих властивостей і в меншій мірі утворювати евтектичні склади. Ці процеси вимагають подальшого вивчення.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі викладено теоретичне й експериментальне узагальнення наукової задачі, спрямованої на вивчення впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на низькотемпературні фазові переходи і склування компонентів фетоплацентарного комплексу, а також на структурний стан еритроцитів кордової крові.

1. Установлено закономірності розвитку кристалічних і склоподібних фаз у суспензії еритроцитів, надосадовій рідині і щільному осаді еритроцитів, а також у плазмі крові і плаценті людини в залежності від виду і концентрації проникного кріопротектора в температурному діапазоні 0 - C.

2. Показано, що стрибок теплоємності при переході системи з твердоаморфного стану в стан переохолодженої рідини істотно відрізняється в досліджених систем, указуючи на те, що в присутності 1,2 – ПД, Гл або ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці. Серед досліджених кріозахисних речовин стабільність аморфного стану найвища в присутності 1,2-ПД. Встановлено, що в умовах використання низькомолекулярних кріопротекторів, що мають коефіцієнт розподілу між внутрішньо- і позаклітинним середовищем близький до одиниці, висока щільність клітин сприяє склуванню внутрішньоклітинної рідини.

3. У системах, що містять ДМСО, на відміну від систем з кріопротекторами з ряду поліолів спостерігається кристалізація евтектичних складів. Це явище, поряд із кристалізацією льоду з аморфної фази нижче 0C, являє собою додатковий фактор кріопошкодження.

4. Виявлено, що біологічні компоненти пригнічують розвиток процесів кристалізації і плавлення евтектичних складів у присутності ДМСО. При збільшенні кількості клітин у суспензії еритроцитів спостерігається посилення цієї пригнічуючої дії. Встановлено, що системи, які містять біологічні компоненти і кріопротектори, більш схильні до утворення аморфних фаз при охолодженні і до розвитку кристалізації води з аморфної фази при нагріванні, ніж водні розчини кріопротекторів відповідних концентрацій.

5. Вперше методами ДСК і ЯМР досліджена динаміка насичення плаценти кріозахисними речовинами - Гл, 1,2-ПД і ДМСО. Показано, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер, зумовлений неодночасним насиченням поза- і внутрішньоклітинного простору. Показано, у фрагментах плаценти, охолоджених до-196С після їх еквілібрації протягом 60 хв у розчинах, що містять 60 мас. % Гл або 1,2-ПД, не розвиваються процеси кристалізації з аморфної фази при нагріванні. Це свідчить про те, що концентрація зазначених кріопротекторів у плаценті не досягає 40мас. %. Більш тривала еквілібрація сприяє затвердінню зразка в склоподібному стані при охолодженні і формуванню дрібнодисперсного льоду при нагріванні. Експериментально виявлено, що після 18 годин еквілібрації плаценти в розчинах ДМСО 40 і 60 мас. % спостерігається зменшення вмісту ДМСО в плаценті.

6. При заморожуванні еритроцитів з середньою швидкістю 200 єС/хв у присутності Гл і 1,2-ПД максимальне збереження спостерігається в діапазоні концентрацій 20 ч мас %, а з ДМСО – 10 ч мас %. Наявність оптимальних концентрацій кріопротекторів пояснюється тим, що, з одного боку, зростання концентрації кріопротектора призводить до збільшення кількості склоподібної фази, знижуючи тим самим дію пошкоджуючих ефектів, зв'язаних з льодоутворенням, однак, з іншого боку, підвищує токсичність кріопротекторів.

7. Показано, що зростання концентрації Гл і 1,2-ПД викликає набрякання еритроцитів. У присутності 30ч40 мас % Гл спостерігається утворення стоматоцитарних форм, у присутності 1,2-ПД в тих же концентраціях – кренованих форм клітин. ДМСО у всьому дослідженому діапазоні концентрацій призводить до кренованості клітин. При досягненні концентрації ДМСО 30 мас % морфологічним змінам піддаються всі клітини в суспензії. Встановлено оптимальні температури еквілібрації еритроцитів КК у розчинах кріопротекторів, що складають для Гл - 20С, для 1,2-ПД і ДМСО - 0С.

8. Виявлено збільшення проникності мембран еритроцитів кордової крові для іонів феріціаниду в присутності кріопротекторів високих концентрацій (Гл , 1,2  ПД – більше 40 мас % і ДМСО – більше 30 мас %), що пов'язано з порушенням бар'єрної функції мембран еритроцитів. Виявлено пошкоджуючу дію низькотемпературних фазових переходів розчинника на бар'єрні функції мембран еритроцитів. Зменшення мікров'язкості цитоплазми після заморожування еритроцитів у присутності Гл може свідчити про набрякання клітин, що підтверджується дослідженнями методом РЕМ.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние ДМСО на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0С // Проблемы криобиологии. - 2003. - № 2. - С. 16-21.

2. Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние глицерина и 1.2-пропандиола на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови при температуре ниже 0С // Доповіді НАН України. - 2003. - №12. - С. 155-160.

3. Зинченко А.В., Боброва Е.Н. Фазовые переходы и стеклование в экстрактах плаценты с добавками криопротекторов при температуре ниже 0С // Актуальные проблемы медицины и биологии. Сб. науч. работ. Киев: КНМУ, 2004. - №1 – С. 93–97.

4. Боброва А.В., Зинченко А.В., Коваленко Г.В. Криомикроскопические исследования замораживания–оттаивания суспензий эритроцитов кордовой крови в присутствии глицерина, 1,2-пропандиола и диметилсульфоксида // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”. – 2004. -Вип. №32, част. 1. – С. 7–12.

5. Боброва Е.Н., Зинченко А.В., Щетинский М.И. Динамика насыщения ткани плаценты диметилсульфоксидом // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 1. - С. 20-26.

6. Боброва Е.Н., Зинченко А.В., Щетинский М.И. Исследование насыщения ткани плаценты глицерином и 1,2-пропандіолом // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 2. - С. 147-152.

7. Боброва Е.Н, Зинченко А.В. О кристаллизации воды из аморфной фазы в суспензиях эритроцитов кордовой крови при охлаждении и нагреве с 1.2-пропандиолом и глицерином // Проблемы криобиологии. -2002. - № 1. - С. 122-123.

8. Зінченко О.В., Боброва О.М., Смирнов Я.В. Кристалізація і склування в суспензії еритроцитів кордової крові в присутності гліцерину та 1.2-пропандіолу в діапазоні температур 0 ч -196С // Тези доп. 3 з'їзду Укр. біофізичного товариства, м. Львів, Україна, 8-11 жовт. 2002. - С. 224.

9. Zinchenko A.V., Bobrova E.N. Low-temperature phase transition and glass transition in cord blood erythrocytes suspensions in dependence on 1,2-propanediol and glycerol concentration // Proc. Internat. Conf. Cryobiomol 2003. Low temperature biology, Coimbra – Portugal. 14-18 sept. 2003. - P. 160.

10. Боброва Е.Н., Зинченко А. В. Физические состояния суспензий эритроцитов кордовой крови в присутствии ДМСО ниже 0C // Тези доп. І Укр. наук. конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”, м. Харків, Україна, 20-22 вересня 2004 р. - С. 167.

11. Боброва Е.Н., Цымбал Л.В., Зинченко А.В. Влияние низких температур и неэлектролитов на проницаемость мембран эритроцитов для парамагнитных ионов // Материалы V Харьковской конференции молодых ученых “Радиофизика и СВЧ электроника”, г. Харьков, Украина, 14 – 16 дек. 2005. - С.46.

12. Боброва О.М., Рєпін М.В., Зінченко О.В Морфофункціональні параметри еритроцитів кордової крові при додаванні кріопротекторів // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”, м. Львів, Україна, 21-24 бер. 2006. – С.4.

13. Боброва Е.Н., Репин Н.В., Зинченко А.В. Влияние проникающих криопротекторов на морфологическое состояние эритроцитов кордовой крови // Материалы Второй всеукр. научн.-техн. конференции “Актуальные вопросы теоретич. и прикладной физики и биофизики”, г. Севастополь, Украина, 17-22 апр. 2006. С. 85-87.

14. Боброва О.М., Репін Н.В., Зінченко О.В. Морфофункціональні параметри еритроцитів кордової крові при додаванні кріопротекторів // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”, м. Львів, Україна, 21-24 бер. 2006. С.4.

АНОТАЦІЇ

Боброва О.М.. Вплив кріопротекторів і низьких температур на термодинамічні параметри та структурний стан компонентів кордової крові і плаценти людини. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню впливу 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), гліцерину (Гл) і диметилсульфоксиду (ДМСО) на фазові переходи і склування в компонентах фетоплацентарного комплексу нижче 0С, динаміки насичення плаценти кріопротекторами, а також впливу режимів еквілібрації з кріопротекторами і заморожування-відтавання на структурний стан еритроцитів кордової крові.

Отримані методом ДСК результати свідчать про те, що в присутності 1,2-ПД, Гл і ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці, при цьому стабільність аморфного стану найбільш висока в присутності 1,2-ПД; висока щільність клітин сприяє утворенню склоподібних фаз при охолодженні, призводить до процесу кристалізації з аморфної фази при нагріванні і пригнічує процес кристалізації евтектичних складів. Виявлено, що зростання концентрації Гл і 1,2-ПД викликає набрякання еритроцитів, а ДМСО - кренування. Встановлено оптимальні температури еквілібрації еритроцитів КК у розчинах кріопротекторів: Гл - 20С; 1,2-ПД і ДМСО - 0С. Методом ЕПР показано порушення бар'єрних функцій мембран еритроцитів кордової крові в