МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. М. ГОРЬКОГО

БІЛОДІД ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 618.146:616.006-091:612.017.1

Ендогенний інтерферон, показник апоптозу та інтеграція в геном вірусу папіломи людини 16 типу як фактори ризику розвитку раку шийки матки

14.01.07 – онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України.

Науковий керівник: |

доктор медичних наук, професор

Карташов Сергій Михайлович, Харківська медична академія післядипломної освіти, професор кафедри онкохірургії та онкогінекології.

Офіційні опоненти: |

доктор медичних наук, професор

Коссе Валентин Анатолійович, Дніпропетровський медичний інститут народної медицини МОЗ України, професор кафедри клінічних дисциплін;

доктор медичних наук, доцент

Купрієнко Микола Вікторович, Донецький обласний протипухлинний центр МОЗ України, завідувач гінекологічним відділенням.

Провідна установа: | Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, кафедра онкології, МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться “27” червня 2007 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.01 у Донецькому державному медичному університеті ім. М. Горького за адресою: 83003, Україна, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Донецького державного медичного університету ім. М. Горького за адресою: 83003, Україна, м.Донецьк, пр. Ілліча, 16.

Автореферат розісланий “24” травня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор І.І. Солдак

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рак шийки матки (РШМ) залишається однією з найбільш розповсюджених форм новоутворень, посідаючи 7-е місце серед усіх злоякісних пухлин і 4-е місце серед раків у жінок (Думанский Ю.В., Семикоз Н.Г., 2004; Воробьева Л.И., 2005; Brychtova S. et al., 2004). Показник захворюваності на РШМ в Україні значно зріс за останні 5 років, зокрема у жінок молодого віку (Воробьева Л.И., Жилка Н.Я., 2004; Шалимов С.А. и др., 2004).

Встановлено, що основним фактором ризику розвитку РШМ є вірус папіломи людини (ВПЛ) 16 і 18 типів, а наступними за частотою йдуть 31 і 33 типи (Винокуров В.Л., 2003; Вишневская Е.Е., 2002; Jansen K.U., Shaw A.R., 2004). Оскільки ВПЛ інфекція досить широко розповсюджена серед здорових жінок, очевидно, що для прогресії РШМ необхідні додаткові епідеміологічні, імунологічні та генетичні фактори (Вакуленко Г.О., 2001; Новик В.И., 2002; Nishimura S. et al., 2004).

Важливе місце в цьому питанні відводять ІНФ- (Кондратьева Е.А., 2003; Gallo G.et al., 2003). Однак до цього часу не встановлені причини як прогресії дисплазії в РШМ, так і причини її спонтанної регресії. ІНФ- є плейотроптним цитокіном із широким спектром клінічної активності як противірусної, так і антиканцерогенної. Однак механізми, які лежать в основі цих ефектів, вивчені не до кінця.

Антиканцерогенні властивості ІНФ- пов’язані також зі здатністю стимулювати систему репарації ДНК, модулювати експресію генів, утягнених у процес канцерогенезу, впливати на апоптоз (Возианов А.Ф., 1998; Kruse A.J.et al., 2004). Існують дані про індукцію самим ІНФ- апоптозу в пухлинних клітинах, а також про модуляцію апоптозіндукуючої активності інших проапоптичних агентів (Кудрявцев Ю.И., 2000; Munoz N. et al., 2004).

Більшість авторів розглядають інтеграцію вірусної ДНК як необхідну умову прогресії цервікальних дисплазій у РШМ (Мазуренко Н.Н., 2003; Ferber M.J. et al., 2003). Багато авторів вважають, що підсилення атипії клітин шийки матки пов’язане зі зниженням активності апоптозу і загибелі клітин (Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Kruse A.J. et al., 2004). Відносно слабо вивчені методи профілактики РШМ із використанням препаратів, здатних викликати апоптозний ефект. Не вивчені питання лікування передраку шийки матки у хворих, інфікованих ВПЛ високого онкогенного ризику. (Вакуленко Г.О., 2000; Воробьева Л.И., 2003; Демидов Л.В., 2003; Кадагидзе З.Г. и др., 2002; Wang J.L. et al., 2004).

Таким чином, дослідження механізму канцерогенного впливу ВПЛ високого онкогенного ризику на клітини епітелію шийки матки, встановлення його зв’язку з процесом апоптозу і власними факторами захисту організму-хазяїна, які перешкоджають інтеграції ДНК ВПЛ в геном клітини і малігнізації епітелію, уточнення ролі інтеграції та використання препаратів інтерферону на ефективність лікування хворих із передраком є актуальним завданням онкології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана за планом НДР Харківської медичної академії післядипломної освіти “Етіопатогенетичні фактори розвитку раку органів репродуктивної системи у жінок та їх вплив на перебіг та рецидування захворювання” (№ держреєстрації 01.05.U.002871). Автор була співвиконавцем робіт і безпосередньо вивчала поширені способи обстеження та лікування хворих на передрак та рак шийки матки.

Мета дослідження. Визначити роль ендогенного ІНФ-, апоптозного індексу (АІ) та фактора інтеграції ВПЛ у прогресії РМШ для профілактики інвазивних форм захворювання.

Задачі дослідження.

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження: хворі з фоновими, передраковими захворюваннями та на РШМ.

Предмет дослідження: інтеграція ВПЛ 16 типу в геном клітини, рівень ІНФ- в крові, МІ і АІ в епітелії шийки матки як фактори патогенезу РШМ; вплив інтерферону-б-2-в (лаферону) на результати лікування хворих із передраком, рецидивом передракового процесу, пре- та мікроінвазивними формами РШМ, інфікованих ВПЛ.

Методи дослідження: клінічні, морфологічні, радіоімунологічні, імуноферментні, молекулярно-біологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено, що на етапі розвитку інвазивного раку від дисплазії I ст. до Ca in situ інтегрована форма ВПЛ частіше поєднується з епісомальною формою ВПЛ, на відміну від мікро- та інвазивного РШМ, при яких переважають інтегровані форми ВПЛ. Уперше показано, що рецидив дисплазії III ст. і Ca in situ у більшості випадків зумовлений фактором інтеграції ВПЛ 16 типу в геном клітини.

Установлено, що епісомальні форми ВПЛ високого онкогенного ризику підвищують проліферативну активність епітелію шийки матки і впливають на показники апоптозу, зокрема знижують АІ, в процесі трансформації передпухлинної патології в преінвазивний і мікроінвазивний РШМ. Показано, що високий рівень ендогенного ІНФ- в крові хворих, інфікованих ВПЛ високого онкогенного ризику, обмежує проліферативну активність епітелію шийки матки і знижує ймовірність інтеграції вірусу в геном.

Установлено, що інтеграція ВПЛ 16 типу у хворих із дисплазією I-III ст. і Ca in situ відбувається на фоні зниженого рівня ІНФ- в крові, зниженого показника апоптозу і підвищеної проліферативної активності епітелію шийки матки, яка може бути зумовлена не тільки властивостями ВПЛ високого онкогенного ризику, але й неспецифічним запальним процесом.

Уперше показано, що збереження підвищеної проліферативної активності епітелію шийки матки і зниженого АІ, при виникненні у хворих із дисплазією I-III ст. і Са in situ інтеграції ВПЛ, є однією з умов, необхідних для подальшої прогресії захворювання.

Практичне значення одержаних результатів. Установлено, що хворим із фоновими захворюваннями шийки матки, дисплазією I-III ст. і Ca in situ, виявленим уперше, необхідно обов’язкове обстеження на ВПЛ високого онкогенного ризику, а у випадку виявлення папіломавірусу 16 типу – обстеження на наявність інтеграції ВПЛ в геном.

При відсутності інтеграції ВПЛ хворим із дисплазією I-II ст. необхідне проведення терапії препаратами інтерферону з подальшим спостереженням у кабінеті патології шийки матки у спеціалізованому закладі. При виявленні фактора інтеграції ВПЛ хворим із дисплазією I-II ст. необхідно проводити ДЕК шийки матки, а при дисплазії III ст. і Ca in situ розширювати показання до гістеректомії.

При проведенні органозберігаючих методів лікування у хворих, інфікованих ВПЛ високого онкогенного ризику, використання препаратів інтерферону доцільне тільки при наявності у хворих епісомальної форми ВПЛ. Дослідження АІ в комбінації з показником МІ та визначення фактора інтеграції можна використати як прогностичний критерій: сполучення інтеграції ВПЛ і зниженого АІ на фоні високої проліферативної активності епітелію шийки матки є критеріями прогресії передраку шийки матки в інвазивний рак.

Результати досліджень впроваджені в практичну роботу Харківського обласного клінічного онкологічного диспансеру (акт впровадження від 18 жовтня 2005 р.), кафедр онкохірургії та онкогінекології, онкології та дитячої онкології ХМАПО (акт впровадження від 17 квітня 2006 р.), Харківського НДІ медичної радіології (акт впровадження від 22 травня 2006 р.).

Особистий внесок здобувача. На основі вивчення даних літератури і проведеного патентного пошуку за темою дисертації автором були визначені мета і задачі дослідження, а також запропоновані підходи до їх вирішення. Здобувач самостійно здійснював набір і формування банку даних первинного матеріалу, клінічне обстеження і хірургічне лікування хворих, а також обстеження жінок групи ризику. Самостійно оброблені і проаналізовані результати дослідження, сформульовані основні положення і висновки дисертації, підготовлені публікації, зроблені доповіді на з’їздах і конференціях.При написанні дисертаціі не були використані ідеї та розробки співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були викладені та обговорені на III з’їзді онкологів країн СНД (м. Мінськ, 2004 р.); обласних науково-практичних конференціях: “Рак шейки матки” (м. Харків, 2002 р.) і “Опухоли женских репродуктивных органов” (м. Харків, 2003 р.);науково-практичній конференції “Ліки – людині” (м. Харків, 2004 р.); клінічних конференціях ХОКОД (2003, 2005 рр.); Харківському науковому товаристві онкологів 2004 р.; на науково-практичний конференції молодих вчених (м. Харків, 2005 р.).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 6 статтях наукових журналів, 4 матеріалах і тезах конференцій, 1 деклараційному патенті на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 152 сторінках комп’ютерного тексту і складається зі вступу, 6 розділів, заключення, висновків, списку використаних джерел, який містить 210 найменувань вітчизняної та іноземної літератури на 20 сторінках. Робота проілюстрована 14 таблицями на 14 сторінках і 7 рисунками на 11 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Матеріал дисертації представляє результати обстеження 472 жінок, які знаходились на обстеженні і лікуванні в ХОКОД з 1999 по 2006рр. Вік хворих коливався від 18 до 45 років, а середній вік склав 31,92,2 років. Контролем послужили дані обстеження 40 практично здорових жінок віком від 18 до 43 років (середній вік 28,32,9 років). В усіх досліджуваних випадках діагноз був верифікований морфологічно. Розподіл хворих, залежно від патологічних змін шийки матки, був таким: фонові захворювання – 50 хворих, дисплазія I ст. – 32; рецидив дисплазії I ст. – 28; дисплазія II ст. – 76; рецидив дисплазії II ст. – 40; дисплазія III ст. – 56; рецидив дисплазії III ст. – 44; Ca in situ – 64; рецидив Ca in situ – 12; РШМ у стадіях: Т1аNоМо – 30; Т1вNоМо – 18; Т2а-вNо-хМо – 22 хворих.

Дослідження кількості ІНФ- в сироватці крові проводили імуноферментним методом із використанням набору реагентів ProCon IF2 plus виробництва ООО "Протеїновий контур" (С.-Петербург). Дослідження проводили в лабораторії “Вірола” ХМАПО (зав. лаб. Мікулінський Ю.Ю.).

Цитологічні методи дослідження мазків із шийки матки і цервікального каналу (з екто- та ендоцервікса) проводили в цитологічних лабораторіях поліклініки і стаціонару ХОКОД (зав. лаб. Медведєва І.А.). Для оцінки характеру цитологічних змін у мазках використовували класифікацію Папаніколау.

Для виявлення інфекційних агентів у статевих шляхах використовували полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), посів біоматеріалу на живильні середовища з подальшим фаготипуванням мікроорганізмів мікроскопічно (Назарова Е.К., 2003; Тиц Н.У., 1997). При проведенні досліджень використовувались набори фірми “Новые технологии” (м.Москва). Дослідження проводили в лабораторії НДІ ім. І.І. Мечнікова (м.Харків).

Для визначення ДНК ВПЛ використовували ПЛР з праймерами для 16, 18, 31 і 33 типів. При виявленні у жінок ВПЛ 16 типу визначалась наявність інтеграції цього типу вірусу в геном (рис.1). Виявлення в біопсійному матеріалі ДНК ВПЛ 16 і визначення статусу інтегрованості вірусної ДНК в геном виконували методом ПЛР. Для одержання ДНК із матеріалу використовували метод Sambrook et al., 1989. ПЛР проводили за допомогою програмованого термоциклера Терцик-2 фірми “ДНК-технологія” (Росія) і з використанням термофільної ДНК-полімерази НПО “Силекс М” (Росія). Результати ПЛР оцінювали електрофорезом в 1% агарозі з подальшим забарвленням у розчині бромистого етидію з концентрацією 1 мг/мл, за маркер молекулярної ваги використовували ДНК плазміди гідролізовану ферментом HpaII (рис.1), (Gallo G., 2003; Panu Peitsaro., 2002). Дослідження проводили в лабораторії “Вірола” ХМАПО (зав. лаб. Мікулінський Ю.Ю.).

Для виявлення клітин, які знаходяться в стані апоптозу, досліджуваний матеріал, забір якого виконували шляхом біопсії або зскрібання з пухлинної тканини, рівномірно наносився на покривні скельця. Мазки промивались фосфатно-сольовим буфером (pH-7,0) і фіксувались 4% параформальдегідом, забарвлення виконувалось протягом 20 хв. барвником Hoechst 33342 (5 мг/мл) при кімнатній температурі. Із використанням флуоресцентного мікроскопа підраховувалась кількість клітин із характерною для апоптозу морфологією (ядерна конденсація, ДНК деградація та ін.) (Новожилова А.П., 1996; Allen S., 2001). Результат виражався у відсотковому співвідношенні клітин, тобто показник АІ відповідає кількості клітин, які знаходяться у стані апоптозу зі 100 досліджених пухлинних клітин (Yamasaki F.,1997). Дослідження проводили в лабораторії “Вірола” ХМАПО (зав.лаб. Мікулінський Ю.Ю.).

1 2 3 4 5 6 7 pUC 19

Рис.1. Інтеграція ВПЛ 16 типу в геном клітини

Зразки 4, 7 – інтеграція вірусу (продукт ампліфікації гена Е2 відсутній).

Зразки 1, 2, 3, 5, 6 – вірус в епісомальній формі (продукт ампліфікації гена).

Операційний матеріал, включаючи первинну пухлину, піддавали морфологічному дослідженню. Згідно з класичною гістологічною методикою обробки тканин застосовували фіксацію в 10% розчині формаліну і парафінову проводку. Гістологічні зрізи, товщиною 5-6 мкм, забарвлювали гематоксиліном та еозином, а також за методом Ван-Гізона (Автандилов Г.Г., 1980). Після перегляду препарату під мікроскопом визначали патологію шийки матки. При діагностуванні фонової патології або передраку використовували класифікацію Бохмана Я.В. При виявленні РШМ визначали гістологічну структуру пухлини, рівень інвазії у строму. Незалежно від патології шийки матки, в усіх випадках підраховували мітотичний індекс (МІ) – кількість мітозів на 1000 клітин (Автандилов Г.Г., 1980). Для характеристики морфологічної структури злоякісних новоутворень шийки матки використовували гістологічну класифікацію пухлин (ВООЗ, №9, 1973 р.) (Бохман Я.В.,1989). Дослідження проведені в патоморфологічній лабораторії ХОКОД (зав. відділом Тур Л.В.) і консультовані на кафедрі клінічної та лабораторної діагностики ХМАПО (проф. Т.П. Якимова).

Методи лікування, які застосовувались в обстежуваних групах хворих, були представлені таким чином. У групі хворих із фоновими захворюваннями шийки матки в усіх випадках було проведено консервативне лікування, у 50% хворих препаратами інтеферону--2в. У хворих із дисплазією I-II ст. (108 осіб) у 76 (70,4±4,4%) було проведено консервативне лікування і в 32 пацієнтів (29,6±4,4%) – ДЕК шийки матки. Інтерферонотерапія була застосована у 16 жінок (14,8±3,4%). У хворих із рецидивом дисплазії I-II ст. консервативне лікування було проведено 28 (41,2±6,0%) хворим і ДЕК шийки матки у 40 (58,8±6,0%) жінок. Лікування препаратами інтерферону було у 12 жінок. У групі хворих із дисплазією III ст. і Ca in situ (120 хворих) в усіх випадках була проведена ДЕК шийки матки. Інтерферонотерапія використана у 32 хворих. У хворих із рецидивом дисплазії III ст. і Ca in situ (56 хворих) методи лікування включали: 48 (85,7±4,7%) хворим була виконана екстирпація матки; у 8 (14,3±4,7%) хворих була виконана ДЕК шийки матки. Препарати інтерферону не застосовували. У групі хворих із мікроінвазивним раком (30 хворих): у 8 (26,7±8,1%) хворих була виконана ДЕК і в 22 (73,3±8,1%) – екстирпація матки. Препарати інтерферону не застосовували. У групі хворих із інвазивним раком (40 хворих), яка була використана нами за контроль, операція Вертгейма була виконана у 20 (50%) хворих: 17 хворих із Т1вNоМо і 3 хворих із Т2аNоМо, причому в 15 випадках із передопераційним опроміненням. У 20 хворих (50%) була проведена сполучена променева терапія.

Усім хворим, інфікованим ВПЛ, застосовувались схеми лікування і методики, розроблені відділом онкогінекології Інституту онкології АМН України (патент України на винахід №52334 України ПМК А61К 38/21).

В усіх хворих були вивчені безпосередні результати лікування. Критеріями оцінки ефективності лікування були: тривалість ремісії і частота виникнення рецидиву (ВООЗ, 1998).

Для аналізу результатів використовувалися статистичні методи. При порівнянні двох груп використані критерії Стьюдента (у випадку нормального закону розподілу) або Вілкоксона (у випадку відмінного від нормального закону розподілу). При порівнянні 3 і більше груп були використані методи множинних порівнянь. В усіх випадках вірогідними вважали відмінності при рівній значущості р<0,05.

Для виявлення зв'язку між аналізованими ознаками використовувалися методи кореляційного аналізу (розраховувався показник рангової кореляції Спірмена ). Для оцінки результатів лікування та оцінки впливу факторів на частоту рецидивів використовувався метод розрахунку відносного ризику (ВР). Розрахунки проводилися в статистичному пакеті "MedStat" (Лях Ю.Є., Гур'янов В.Г., 2004). Для оцінки середніх значень величин розраховувався 95% вірогідний інтервал (ВІ)

Результати дослідження та їх обговорення. У нинішній час основним етіологічним фактором РШМ вважають ВПЛ. У зв’язку з цим, ми дослідили ВПЛ 16, 18, 31 і 33 типу, а також асоціацій таких вірусів у залежності від патології шийки матки (p<0,01)(рис.2). Нами встановлено, що у хворих із фоновими захворюваннями досліджувані типи ВПЛ зустрічались в 24,0±6,0% випадків. Хворі з дисплазією I-II ст. (25,9 ±6,0%) не мали принципової відмінності від хворих із фоновими захворюваннями і групою контролю (p>0,26). У хворих із рецидивом дисплазії I-II ст. ми встановили збільшення кількості жінок, інфікованих досліджуваними типами ВПЛ (в 35,3±7,8% випадків), що вище (p=0,047) від контролю ВР = 7,1 (ВІ 1,8-28,3) і вірогідно нижче (p=0,003) від аналогічних показників хворих із мікроінвазивними та інвазивними стадіями РШМ. Хворі з дисплазією III ст. і Ca in situ за частотою виявлення ВПЛ високого онкогенного ризику (63,3±4,4%) мають вірогідну відмінність від хворих із фоновою патологією (p=0,003), рецидивом дисплазії I-II ст. (p<0,001) і контрольною групою (p<0,001). У хворих із рецидивом дисплазії III ст. і Ca in situ відзначено збільшення кількості хворих, які мають ВПЛ (71,4±6,04%), що в 14,3 разів (ВІ 3,7-55,7) вище від контролю і вірогідно (p<0,001) вище від показників хворих, порівняно з фоновою патологією, але практично не відрізнялись (p>0,9) від аналогічних показників із мікро- (80,0±7,3%) та інвазивними (75 ±5,5%) стадіями РШМ. При цьому у половині випадків був виявлений ВПЛ 16 типу, що об’єднує цю групу з показниками хворих, які мають РШМ папіломавірус 16 типу.

Рис.2. Частота виявлення ВПЛ високого онкогенного ризику в епісомальній формі і ВПЛ 16 типу в інтегрованій формі

Нами вивчена частота асоціації інтегрованого в геном клітини ВПЛ 16 типу з іншими типами ВПЛ високого онкогенного ризику у хворих, у залежності від характеру патології шийки матки (рис.2). Нами встановлено, що в жінок контрольної групи і хворих із фоновими захворюваннями шийки матки були діагностовані тільки епісомальні форми ВПЛ 16 типу. Інтегрована форма вірусу в обстежуваних групах хворих уперше була виявлена у хворих із дисплазією I-II ст. (у 3,7±1,9% випадків). Однак у цій групі хворих переважали епісомальні форми вірусу (11,1 ±3,0% випадків). У хворих із рецидивом дисплазії I-II ст. частота виявлення епісомальної форми ВПЛ (5,9±2,9%) не відрізнялась від частоти виявлення інтегрованих форм вірусу 16 типу (5,9±2,9%). У хворих з дисплазією III ст. і Ca in situ частота виявлення ВПЛ була вірогідно (p<0,001) вищою, ніж в інших вище аналізованих групах, а також, відзначений ріст кількості хворих, які мають інтегровану форму вірусу (20±3,6%). Однак у цій групі хворих уперше виявлена наявність тільки інтегрованої форми ВПЛ, а в усіх попередніх групах інтегрована форма сполучалася з епісомальною формою ВПЛ 16 типу. Розвиток рецидиву дисплазії III ст. і Ca in situ супроводжувався принциповою відмінністю від усіх вищеаналізованих груп хворих, який полягав у збільшенні кількості хворих із інтегрованим в геном клітини ВПЛ 16 типу (50±6,7% хворих) і значним зменшенням кількості хворих тільки з епісомальною формою (14,3±6,7%). Однак у групі хворих із мікроінвазивними формами раку переважали інтегровані форми ВПЛ (60±8,9% випадків у порівнянні з 6,7±4,6% випадків хворих, в яких була асоціація з епісомальною формою 16 типу), що вірогідно (p<0,02) відрізняє цю групу від хворих із дисплазією I-III ст. і Ca in situ та рецидивом дисплазії I-II ст. і об’єднує з групою хворих, які мають рецидив дисплазії III ст. і Ca in situ. У хворих з інвазивним РШМ з усіх діагностованих нами випадків (65±7,9% хворих) переважали тільки інтегровані форми ВПЛ (55±7,9%), і лише в 10±4,7% випадків інтегровані сполучались з епісомальними формами вірусу.

Однією з найважливіших властивостей ІНФ- є його антипроліферативна дія, у зв’язку з чим ми вивчили МІ і кількість цитокіну в крові в залежності від патології шийки матки (рис. 3).

Рис. 3. Мітотичний індекс і кількість в крові інтерферону-б у залежності від патології шийки матки

Дослідження показали, що поглиблення патології на шийці матки супроводжується вірогідним (p<0,05) ростом МІ -- при фоновій патології, дисплазії епітелію I-II ст., дисплазії III ст. і Ca in situ, рецидиві дисплазії епітелію шийки матки I-II ст., рецидиві дисплазії III ст. і Ca in situ, мікроінвазивному та інвазивному РШМ. У той же час, рівень ІНФ- коливався. Так, розвиток фонової патології, дисплазії I-II ст., дисплазії III ст. і Ca in situ, супроводжується вірогідним збільшенням кількості досліджуваного цитокіну, порівняно з контролем. Ці дані можна розглядати як один із захисних механізмів, що перешкоджають малігнізації процесу, що збігається з даними літератури (Коптелова Н.В., 1994; Прядко Н.Г., 1999; Giandomeniko V., 1998). Однак повторний розвиток дисплазії III ст. і Ca in situ відбувається на фоні різкого зниження рівня ІНФ-.

Враховуючи, що інтеграція ВПЛ в геном клітини є однією з необхідних умов розвитку РШМ, ми вивчили зв'язок між патологією шийки матки, проліферативною активністю епітелію або пухлини, рівнем ІНФ- і наявністю інтеграції ВПЛ в геном клітини (рис. 4).

Рис. 4. Апоптозний індекс, мітотичний індекс та рівень інтерферону- в крові хворих з дисплазією I-III ст. і Ca in situ, у залежності від наявності інтеграції ВПЛ 16 типу

Нами встановлено, що зв'язок між показниками простежується з урахуванням форми виявлення ВПЛ 16 типу – епісомальною або інтегрованою в геном клітини. Так, наявність у хворих із дисплазією III ст. і Ca in situ тільки епісомальної форми вірусу супроводжувалася найбільшим рівнем досліджуваного цитокіну в крові (20,71 пкг/мл) і найменшим показником МІ (1,87%о). У випадку ж появи у хворих цієї групи інтеграції ВПЛ 16 типу в геном відбувається зниження рівня ІНФ- (6,02 пкг/мл, Р0,01) і ріст проліферативної активності епітелію шийки матки (2,40%о, Р<0,05). Поява ж інтеграції ВПЛ відбувається на фоні зниженої кількості ІНФ- в крові, що, мабуть, і є однією з причин вбудовування ДНК ВПЛ в геном клітини. Наші дослідження показали, що при розвитку рецидиву дисплазії I-III ст. і Ca in situ у хворих, які мають тільки епісомальну форму ВПЛ 16 типу, незважаючи на зниження рівня ІНФ- (11,92 пкг/мл), показник МІ практично не змінився (1,88%о), у порівнянні з хворими, в яких це захворювання розвинулось уперше (порівняно з 20,71 пкг/мл і 1,87%о). Мабуть, у таких випадках існує можливість регресії цього процесу. Підсумовуючи результати досліджень хворих при первинному і повторному розвитку дисплазії I-III ст. і Ca in situ, установлено, що досліджувані показники вірогідно відрізнялись у залежності від форми ВПЛ: рівень ІНФ- склав 18,832,8 пкг/мл при епісомальній і 8,01,3 пкг/мл, при інтегрованій формі (Р0,01), а МІ – 1,870,32%о і 2,780,45%о (Р0,05), відповідно.

Відомо, що показники апоптозу мають зв’язок із типом патологічного процесу. Установлено, що АІ збільшується в міру поглиблення патології. При цьому можна виділити деякі захворювання шийки матки, розвиток яких призвів до вірогідного збільшення АІ: фонові зміни на шийці матки (вірогідне збільшення АІ у порівнянні з контролем: 1,090,09% і 0,780,07%, відповідно); дисплазію III ст. і Са in situ (1,510,11%, вірогідний ріст у порівнянні з фоновою патологією, дисплазією I-II ст.), а також мікро- та інвазивні форми раку (1,830,22% і 3,820,43%, відповідно, Р0,01, у порівнянні з фоновою патологією, дисплазією I-III ст. і Са in situ).

Виявлення у хворих із фоновою патологією і дисплазією I-II ст. ВПЛ призвело до збільшення АІ (Р<0,05) у порівнянні з групою хворих, в яких такі віруси виявлені не були. У той же час, розвиток у хворих дисплазії III ст. і Са in situ (1,300,13% при ВПЛ+ і 1,870,26% при ВПЛ), а також у випадку розвитку рецидиву дисплазії I-III ст. і Са in situ (0,550,09% при ВПЛ+ і 1,850,65% при ВПЛ), наявність ВПЛ призвели до вірогідного зниження показника апоптозу, порівняно з аналогічною групою хворих, не інфікованих ВПЛ. Однак у хворих із мікроінвазивним РШМ така залежність уже не простежується (1,770,29% при ВПЛ+ і 2,070,79% при ВПЛ). Одержані дані, з нашої точки зору, можна пояснити тим, що ВПЛ знижують АІ у процесі переходу передпухлинної патології в преінвазивний і мікроінвазивний РШМ.

Беручи до уваги дані літератури про те, що інтеграція ВПЛ в геном клітини є необхідною, але недостатньою умовою розвитку інвазивного РШМ, ми простежили зв'язок між формою виявлення ВПЛ та АІ. Встановлено, що поява інтеграції в геном ВПЛ 16 типу призвело до вірогідного зниження апоптозу у хворих із дисплазією I-III ст. і Са in situ (0,780,21%), у порівнянні з групою хворих, які мають тільки епісомальну форму ВПЛ (1,530,29%). Одержані дані дозволяють говорити про те, що інтеграція ВПЛ змінює генотип клітин шийки матки і пригнічує апоптоз. Система гомеостазу трансформовані клітини в нормі піддає апоптозу. Однак у ряді випадків у роботі цієї системи настають зміни, які перешкоджають апоптичній загибелі тих клітин, в геном яких інтегрований ВПЛ 16 типу. Наявність цього типу ВПЛ в епісомальній формі не призводить до зниження показника апоптозу в усіх випадках (при дисплазії I-III ст. і Са in situ АІ склав 1,530,29%, у порівнянні з тільки інтегрованою формою – 0,850,33% і сполученням інтегрованої та епісомальної форм – 0,730,27%; при рецидиві дисплазії I-III ст. і Са in situ АІ, відповідно, склав 0,720,28%, у порівнянні з 0,650,23% і 0,400,08%). Тобто, у більшості випадків відбувається зворотна ситуація – АІ вірогідно зріс. Ці дані дозволяють говорити про те, що у більшості випадків імунна система справляється навіть з тією інфекцією, яка потенціально має високий онкогенний ризик.

Аналізуючи результати лікування хворих із дисплазією I-III ст. і Ca in situ, а також із рецидивом цих захворювань, в яких було проведено органозберігаюче лікування, установлено: по-перше, рецидив захворювання встановлений в досить великому відсотку випадків – в 21,0±2,3%. При оцінці результатів лікування, в залежності від наявності у хворих ВПЛ встановлено, що частота виникнення рецидивів вірогідно (p<0,001) відрізнялась у групі хворих, які мали ВПЛ 35,3% випадків (ВІ 27,4% - 43,6%; ВР=3,7 (ВІ 2,2-6,2) разів у порівнянні з 9,5% (ВІ 5,6%-11,4%) у хворих, не інфікованих ВПЛ.

Проведені дослідження у групі хворих, в яких захворювання асоціювалося з ВПЛ, показали зв'язок із наявністю у хворих інтеграції ВПЛ 16 типу в геном клітини. Зокрема, при наявності у хворих інтеграції ВПЛ в геном клітини, частота виникнення рецидивів (66,7% ВІ 50,1%-81,4%) виявилась вірогідно (p<0,001) вищою, ніж у групі хворих, які не мають інтеграції (24,0%, ВІ 16,1%-32,9%; ВР=2,8 ВІ 1,8%-4,2%).

Ми проаналізували результати лікування хворих у залежності від використання препаратів інтерферону. Застосування препаратів інтерферону у хворих, інфікованих ВПЛ, дозволило знизити частоту (p<0,007) виникнення рецидивів з 47,1% (ВІ 35,2%-59,2%) до 23,5% (ВІ 14,1%-34,5%); ВР=2,0 ВІ (1,2%-3,3%). Однак, аналіз даних із урахуванням наявності інтеграції ВПЛ 16 типу в геном показав, що ефект від застосування інтерферонотерапії був одержаний у групі хворих, в якій були діагностовані тільки епісомальні форми ВПЛ (частота рецидивів склала 41,7% (ВІ 27,9%-56,1% випадків) без інтерферону і 7,7% (ВІ 2,0%-16,6% випадків) з використанням препаратів інтерферону, (p<0,001 у порівнянні з групою хворих, в якій не проводилась інтерферонотерапія), ВР=5,4 (ВІ 2,0%-14,7%). У той же час, у хворих із інтегрованим у геном ВПЛ 16 типу, використання препаратів інтерферону не вплинуло на результати лікування (частота рецидивів 75,0% (ВІ 49,5%-93,5%) випадків при використанні і 60,0% без інтерферонотерапії) і не є статистично значущим, р=0,55. Крім того, у групі хворих, в яких використовували препарати інтерферону, частота рецидування була вірогідно нижчою (23,5±5,1% випадків) у порівнянні з 76,5±5,1% випадків, при яких рецидиву виявлено не було. У той же час, без препаратів інтерферону групи хворих із рецидивом (47,1±6,2% випадків) і без рецидиву (53,9±6,1%) практично не відрізнялись.

Ми оцінили результати лікування з урахуванням показників МІ, АІ та рівнем ІНФ- в крові. Проведені дослідження показали, що МІ, АІ та рівень ІНФ- в крові мали значну відмінність у хворих із рецидивом і без рецидиву. Зокрема, МІ був вищим (2,50±0,1%0 у хворих без рецидиву, порівняно з 1,69±0,07%0, р0,001), а рівень ІНФ- підвищувався (р<0,001) (16,80 пкг/мл у хворих без рецидиву і був вищим у порівнянні з 14,32±0,45 пкг/мл), порівняно з 10,81±0,56 пкг/мл у хворих із рецидивом. У той же час АІ був вищим у хворих без рецидиву (1,13±0,03%о у порівнянні з 0,76±0,04%о, р0,001 у хворих із рецидивом).

Подальший аналіз показників виявив також значні відмінності з урахуванням наявності ВПЛ. Зокрема, при відсутності ВПЛ досліджувані показники у хворих із рецидивом і без нього мали такі відмінності: так, рівень ІНФ- в крові (19,82±0,55 пкг/мл) і АІ (1,34±0,04%) були вищими (р0,05) у хворих без рецидиву (у порівнянні з 11,4±0,71 пкг/мл і 0,74±0,04%, р<0,001, відповідно). У той же час МІ був вищим (р0,01) у хворих із рецидивом (2,78±0,008%0, порівняно з 1,98±0,12%0, р<0,01).

Результати дослідження свідчать, що початкові показники рівня ендогенного ІНФ- в крові, а МІ і АІ в епітелії шийки матки можна використовувати як прогностичні і передбачити імовірність розвитку рецидиву захворювання. Враховуючи, що частота рецидування у хворих із дисплазією I-III ст. і Ca in situ залежить від наявності у пацієнтів ВПЛ, а також беручи до уваги дані літератури про лікування ВПЛ інфекції інтерферонутримуючими препаратами, ми проаналізували результати лікування хворих у залежності МІ, АІ і кількості ендогенного ІНФ- в крові хворих.

Проведені дослідження показали, що у випадку наявності інтеграції ВПЛ 16 типу в геном клітини показники,які характеризують проліферативну активність, процес апоптозу і рівень ендогенного ІНФ-, чітко корелювали з явищем інтеграції ВПЛ. Однак, застосування у хворих із інтегрованим в геном ВПЛ 16 типу препаратів інтерферону, у загальноприйнятих для лікування ВПЛ інфекції дозах, не зменшує частоту виникнення рецидиву захворювання (75,0%), порівняно з 60,0% без інтерферонотерапії. У той же час, у хворих, інфікованих епісомальними формами ВПЛ високого онкогенного ризику, застосування препаратів інтерферону дозволяє одержати ефект при підвищеній проліферативній активності патологічно зміненого епітелію шийки матки і на фоні зниженого рівня ендогенного ІНФ- в крові та зниженого показника апоптозу (частота рецидиву 7,7% у порівнянні з 47,1% без інтерферонотерапії).

Таким чином, проведені в роботі дослідження показали зв'язок між тяжкістю патології шийки матки і частотою виявлення ВПЛ, а також інтеграцією ВПЛ 16 типу в геном. Крім того, на етапі розвитку інвазивного раку інтегрована форма ВПЛ частіше сполучається з епісомальною, на відміну від мікро- та інвазивного РШМ, в яких переважають тільки інтегровані форми ВПЛ. Показано, що високий рівень ІНФ- в крові хворих, інфікованих ВПЛ 16 типу, стримує мітотичну активність клітин і перешкоджає інтеграції вірусу в геном епітелію шийки матки. Крім того, висока проліферативна активність епітелію шийки матки може бути зумовлена не тільки властивостями ВПЛ високого онкогенного ризику, але й неспецифічним запальним процесом, який може бути не лише однією з необхідних умов для інтеграції ВПЛ, тобто діяти як ініціюючий фактор, але й може сприяти подальшому розвитку неопластичного процесу, тобто бути промотором. Дослідження також показали, що АІ залежить від патології шийки матки і наявності ВПЛ високого онкогенного ризику, а інтеграція ВПЛ 16 типу в геном клітини відбувається на фоні зниженого показника апоптозу. Сполучення інтеграції ВПЛ 16 типу і зниженого АІ є однією з умов, необхідних для прогресії передраку шийки матки в мікро- та інвазивний рак. Нами також доведено, що наявність інтеграції ВПЛ 16 типу в геном клітини у хворих із дисплазією I-III ст. і Ca in situ потребує більш радикальних методів лікування, тому що органозберігаючі методи призводять до частого виникнення рецидивів, а використання препаратів інтерферону є ефективним тільки у хворих із епісомальною формою ВПЛ і не впливає на ефективність лікування хворих із інтегрованим в геном клітини ВПЛ.

ВИСНОВКИ

В дисертації обґрунтовано значення рівня ендогенного ІНФ- в крові, проліферативної активності епітелію шийки матки та АІ для виникнення інтеграції ВПЛ 16 типу в геном клітини і показана роль фактора інтеграції у прогресії передраку в інвазивний РШМ.

1. У міру поглиблення ступеня тяжкості патології шийки матки від фонової (24,0±6,0%) до рецидиву дисплазії I-II ст. (35,3±7,8%) та преінвазивного раку (63,3±4,4%) частота виявлення ВПЛ високого онкогенного ризику (16, 18, 31 і 33 типу) вірогідно (р<0,05) зростає. У той же час виникнення інтеграції ВПЛ 16 типу в геном клітини вірогідно частіше (р<0,001) діагностується тільки у хворих з рецидивом дисплазії III ст. і Ca in situ (71,4 ±6,04%), що об’єднує цю групу з мікро- (80,0±7,3%) та інвазивними стадіями (75,0±5,5%) РШМ, і принципово відрізняє (р<0,05) їх від хворих із фоновою патологією шийки матки (0%), дисплазією I-II ст. (25±6,0%) та преінвазивними формами РШМ, діагностованими вперше (63,3±4,4%).

2. На етапі розвитку інвазивного раку (дисплазія I-II ст. (3,7±1,9%), дисплазія III ст. і Ca in situ (20,0±3,6%), рецидив дисплазії III ст. і Ca in situ (50,0±6,7%) інтегрована форма ВПЛ частіше (р<0,001) сполучається з епісомальною, на відміну від мікро- (60,0±8,9%) та інвазивного (65,0±7,9%) РШМ, при яких переважають тільки інтегровані форми ВПЛ 16 типу.

3. Високий рівень ендогенного ІНФ- в крові хворих, інфікованих ВПЛ високого онкогенного ризику, обмежує проліферативну активність епітелію шийки матки і перешкоджає (знижує ймовірність) інтеграції вірусу в геном. Інтеграція ВПЛ 16 типу в геном клітини у хворих із дисплазією I-III ст. і Ca in situ відбувається на фоні зниженого рівня ІНФ- в крові (8,01,3 пкг/мл у порівнянні з 18,832,8 пкг/мл, р0,01 при епісомальній формі), зниженого показника апоптозу (АІ склав 0,780,21% у порівнянні з 1,530,29%, р0,05 при епісомальній формі ВПЛ) і підвищеній проліферативній активності епітелію шийки матки (МІ склав 2,780,42%о у порівнянні з 1,87%о, р0,05 при епісомальній формі).

4. Висока проліферативна активність епітелію шийки матки може бути зумовлена не тільки властивостями ВПЛ, але й неспецифічним запальним процесом: МІ склав – при фоновій патології 0,340,03%о з запаленням і 0,210,02%о, р0,05 без запалення; при дисплазії I-III ст. і Ca in situ 2,390,19%о і 1,720,10%о, р0,01; при рецидиві дисплазії I-III ст. і Ca in situ 2,560,37%о і 1,710,19%о, р0,05, відповідно). Сполучення інтеграції ВПЛ і зниженого АІ на фоні високої проліферативної активності епітелію шийки матки є однією з умов, необхідних для прогресії передраку шийки матки в мікро- та інвазивний рак.

5. АІ залежить від характеру патології шийки матки: фонові зміна на шийці матки супроводжуються вірогідним збільшенням АІ у порівнянні з контролем (1,090,09% і 0,780,07%, відповідно); дисплазія