НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

Бобик Василь Іванович

УДК 577.27

577.112

576.385

Серцевий міозин як автоантиген при розвитку дилятаційної кардіоміопатії

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у лабораторії молекулярних механізмів автоімунних процесів відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: | кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Сидорик Людмила Леонідівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач лабораторії молекулярних механізмів

автоімунних процесів відділу сигнальних систем клітини.

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук, професор

Дробот Людмила Борисівна,

Інститут біохімії імені О.В.Палладіна НАН України,

завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Костецький Ігор Євгенович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу генетики людини.

Захист дисертації відбувся “ 25“ грудня 2007 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “25“ листопада 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Молекулярна медицина є розділом молекулярної біології, який вивчає порушення в роботі організму людини на молекулярному рівні і розробляє підходи щодо їх усунення. Наукову основу молекулярної медицини становить ідентифікація структурних і регуляторних генів людини, а також з'ясування генної природи і молекулярних механізмів спадкових і мультифакторних хвороб. Одним із перспективних напрямків розвитку молекулярної медицини є розробка підходів до діагностики та лікування серцево-судинних хвороб. Серед останніх особливе місце посідають різноманітні види кардіоміопатій, які характеризуються значними порушеннями скоротливої функції серцевого мязу. Основним проявом зазначених патологій є серцева недостатність, що постійно прогресує. Аритмія, тромбоемболії та раптова смерть є їхніми спільними симптомами , що можуть мати місце на будь-якій стадії. Одним з найпоширеніших захворювань серця є дилятаційна кардіоміопатія (ДКМП) – основна причина для пересадки серця. Хвороба відрізняється важким протіканням з високим рівнем інвалідності та смертності. За визначенням ВООЗ, дилятаційна кардіоміопатія – це дифузне гостре або хронічне ураження серцевого м’язу нез’ясованої етіології, що супроводжується розширенням порожнини серця, здебільшого лівого шлуночка, порушенням його систолічної функції і розвитком серцевої недостатності з подальшим розвитком колагенозу серцевого м’язу.

Найхарактернішими гістологічними змінами при ДКМП є фіброз стінок шлуночків, як результат розростання сполучної тканини або як наслідок опосередкованого заміщення волокон міокарда, поява химерних ядер міоцитів та дегенерація і лізис окремих клітин міокарда. При цьому гіпертрофія окремих міофібрил не забезпечує скорочувальної здатності міокарда, ступінь гіпертрофії є неадекватним дилятації, що розвивається (Гуревич , Яновская, 1985).

Існує декілька гіпотез щодо розвитку ДКМП. Можливо, що ДКМП – це синдром, причини виникнення якого докорінно різні. Серед причин розвитку ДКМП може бути інфекційне ураження міокарда вірусами, бактеріями, простішими, метаболічні порушення в окисленні жирних кислот, порушення мітохондріального оксидативного фосфорилювання у дихальному ланцюгу, токсична дія алкоголю, кобальту і кадмію, пестицидів, дефіцит селену та ряд інших. Водночас, молекулярні механізми захворювання недостатньо вивчені. На сьогодні встановлено, що дилатація супроводжується розвитком автоімунних процесів. У сироватках крові хворих виявлено підвищений рівень автоантитіл до низки антигенів, зокрема до білків скоротливого апарату, таких основних структурних білків як актин, міозин, С–білок, а також регуляторних білків – тропоміозин, тропоніни (Caforio at al. 1990, 1996, 1997; Рябенко и др., 2000,2001). Ще однією важливою причиною в розвитку ДКМП є зміни в функціонуванні антистресових білків – молекулярних шаперонів, що призводить до неправильного згортання білків скоротливого апарату та білків різних субклітинних компартментів кардіоміоциту, сприяє накопиченню дефектних білків, які є стресовим сигналом для кардіоміоциту, що може спричинити його загибель (Knowlton et al., 1998, 2001; Sritastava, 2002). Цей процес не є одномоментний, він складний і багатовекторний .

Тому з’ясування особливостей організації структурно – функціональних особливостей міофібрили та її компонентів, як і їхньої ролі при виникненні та розвитку ДКМП є на сьогодні актуальним. Не менш актуальним напрямком досліджень в галузі молекулярної медицини є створення адекватної лабораторної моделі розвитку захворювання, яка б дозволила спостерігати всі етапи розвитку хвороби і здійснювати моніторинг впливу фармакологічних засобів на її перебіг.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках таких бюджетних тем відділу сигнальних шляхів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України: 2.2.4.26 “Дослідження особливостей розвитку автоімунних процесів при деяких серцево-судинних захворюваннях” номер державної реєстрації 0196U005250 (1996–2000 рр.); 2.2.4.1 ”Вивчення молекулярних механізмів структурних змін кардіоспецифічних антигенів при розвитку дилятаційної кардіоміопатії” номер державної реєстрації 0101U000362 (2001–2005 рр.); 2.2.4.1 “Дослідження ролі молекулярних шаперонів у розвитку апоптозу кардіоміоцитів”, номер державної реєстрації 0105U005343 (2006–2010 рр.).

Мета та завдання дослідження. З’ясувати можливу роль кардіального міозину в розвитку кардіоспецифічних автоімунних процесів при прогресії ДКМП. Встановити, чи є кардіальний міозин автоантигеном і антигеном–мішенню при ДКМП. Розробити експериментальну тваринну модель ДКМП. Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні завдання: 1) отримати в препаративних кількостях міозин зі здорового та ураженого ДКМП та ІКМП міокардів людини; 2) створити банк сироваток хворих на ДКМП, ІКМП та здорових донорів; 3) порівняти імуногенність міозинів, отриманих із різних міокардів; 4) порівняти імунореактивність сироваток пацієнтів з різними серцево – судинними захворюваннями проти препаратів міозинів, отриманих із міокардів, уражених ДКМП та ІКМП; 5) показати можливу роль міокардіального міозину людини бути в ролі автоантигену та ідентифікувати антиген – мішень при ДКМП; 6) розробити експериментальну модель ДКМП; 7) дослідити експресію та клітинну локалізацію основного кардіопротекторного шаперону – цитоплазматичного Hsp70; 8) сформулювати робочу гіпотезу основних етапів розвитку ДКМП як захворювання, пов’язаного зі змінами конформації основних структурних білків міокарда.

Об’єкт дослідження – молекулярні основи патогенезу ДКМП

Предмет дослідження – структурні білки кардіоміоциту людини при ДКМП молекулярні шаперони родини Hsp70, автоантитіла до структурних білків кардіоміоциту при ДКМП.

Методи дослідження – біохімічні, імунологічні, цитологічні та молекулярно-біологічні методи виділення та аналізу білків міокарда людини та лабораторних тварин, сироваток крові пацієнтів з ДКМП та ІКМП, здорових донорів та піддослідних тварин, патоморфологічний аналіз зразків тканини міокарда, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що при ДКМП у сироватках пацієнтів підвищується рівень автоантитіл проти кардіальних міозинів, виділених з міокардів, уражених ДКМП та ІКМП. Встановлено, що антигеном-мішенню є важкий ланцюг міозину при ДКМП. Вперше показано зменшення вмісту шаперону в міокарді людини на кінцевій стадії розвитку захворювання та в процесі розвитку експериментального захворювання у піддослідних тварин. Модифіковано методи виділення та очистки міозинів з міокарду людини (здорового, ураженого ДКМП та ІКМП). Створено унікальну експериментальну модель автоімунного міозин-індукованого ураження міокарда лінійних мишей (ВАLВ/c), подібного до ДКМП людини.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати мають значне практичне значення причин виникнення та розвитку дилятаційної кардіоміопатії. Розроблена експериментальна модель автоімунного індукованого ДКМП-подібного захворювання дозволяє не тільки детальніше вивчати етапи та механізми розвитку захворювання, а й розробляти препарати і підходи до її лікування, проводити доклінічне випробування нових препаратів, що підтверджено вивченням кардіопротекторної та імуномоделюючої дії дію 2’-5’-олігоаденілату на розвиток захворювання.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Огляд літератури, написання тексту дисертації, обробку й аналіз отриманих результатів виконано безпосередньо здобувачем. Основний обсяг експериментальної роботи виконано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Дисертантом особисто виділено препарати міозинів і проведені імунологічні дослідження, велась робота з піддослідними тваринами. За безпосередньої участі здобувача отримані препарати важких і легких ланцюгів міозинів, проводились біохімічні дослідження препаратів міозинів та їхніх компонентів. Гістологічні та гістохімічні роботи виконано в співробітництві з співробітниками відділу некоронагенних захворювань міокарда і клінічної ревматології Інституту кардіології імені академіка М. Д. Стражеска АМН України та морфологічної лабораторії БІОНТЕК (м. Дніпропетровськ). АТРазну активність препаратів міозинів визначали спільно з к.б.н. Федорковою О. М. та Ковенею Т. В. Кількісний вміст шаперону Hsp70 в лізатах міокарда визначали разом з Капустян Л. М., а його клітинну локалізацію – зі співробітниками морфологічної лабораторії БОНТЕК. Автор вдячний Сергієнко О. В. та Труніній І. В. за проведення гістологічних досліджень. Автор висловлює подяку керівникові к.б.н. Сидорик Л. Л. та д.мед.н. Рябенку Д. В. за керівництво роботою, корисні поради при плануванні експериментів та обговоренні одержаних результатів. Одержані результати обговорено та надруковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися і були представлені на вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах і з’їздах, зокрема: 7 Європейському конгресі з біотехнології (Ніцца, Франція, 1995); 6Світовому конгресі з захворювань серця (Женева, Швейцарія, 1998) 15 З’їзді терапевтів України (Київ, Україна, 1998); Об’єднаному пленумі кардіологів, ревматологів та кардіохірургів з міжнародною участю (Київ, Україна, 1999); Конференції молодих вчених Українського молекулярно-біологічного товариства (Київ, Україна, 2001); 6 Літній конференцій по імунології( Пущіно, Росія, 2002); 7 Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, Україна, 2002); 7 Всеросійському Форумі “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, Росія, 2003); 8 Світовому конгресі з клітинної біології (Ніцца, Франція, 2004) року; Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 експериментальних статей у фахових виданнях та тези 4 доповідей на науково-практичних конференціях і з’їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, яка має три розділи, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел, що охоплює 266 найменувань. Дисертацію викладено на 132 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 20 рисунків та 16 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використано сироватки здорових донорів і хворих на ДКМП та ІКМП та секційний патоморфологічний матеріал, люб’язно надані доктором Д. В. Рябенко (Інститут кардіології імені академіка Н.Д. Стражеска АМН України). Діагноз ДКМП встановлювали згідно рекомендацій ВООЗ (HO/ISFC, 1985) на основі клінічних ознак, інструментальних ( ЕКГ, рентген, ЕхоКГ ) та лабораторних досліджень. Групу ДКМП склали 78 пацієнтів (67 чоловіків і 11 жінок ) віком від 23 до 66 років. У 37 з них діагностовано ІІ Б, а у 41 – ІІ А стадії хронічної серцевої недостатності. В групу не брали пацієнтів з фракцією викиду лівого шлуночка менше 50 %, з вродженими чи набутими клапанними пороками серця, з онкологічними, інфекційними і ендокринними захворюваннями, а також з ожирінням вище ІІ ступеня. Групу ІКМП склали 69 хворих ( 68 чоловіків і 1 жінка ) віком від 33 до 70 років, в яких ХСН розвивалась в результаті гіпертонічної хвороби та ішемічної хвороби серця, 15 з них перенесли інфаркт міокарда. В дослідження не брали хворих з аневризмою лівого шлуночка серця та хворих з перенесеним обширним або трансмуральним інфарктом міокарда. Групи хворих ДКМП та ІКМП були співставні за основними критеріями. У дослідах використано такі реактиви: PMSF – (фенілметилсульфонілфторид), 2-меркаптоетанол, трис, кумарова кислота, люмінoл, гематоксилін, еозин, малахітовий зелений, 3’3’–діамінобензидинтетрагідрохлорид, ABTS виробництва фірми “Sigma” (США), додецилсульфат натрію, персульфат амонію, N,N-метиленбісакріламід, кумасі блакитний R-250 та G-250, акриламід, TEMED, білкові маркери молекулярної маси для електрофорезу – фірми “Bio-Rad” (США), 2-меркаптоетанол, ЕGTA, EDTA, твін–20, тритон X-100 – “Merk” (ФРН) та –“Fluka” (Швейцарія) , нітроцелюлозні фільтри – “Millipore” (США) та “Shl & She” (ФРН), ДЕАЕ-Сефадекс G-75 та Сефадекс G-75 – “Pharmacia” (Швеція); солі та кислоти вітчизняного виробництва кваліфікації “хч” та “осч”. В роботі також використовували рентгенівську плівку та реактиви для її обробки виробництва фірми “Оніко” (Україна) та планшети для імуноферментного аналізу – фірм “Nunk” (Данія) і “Sarsted” (ФРН), анти видові антитіла кон’юговані пероксидазою хрону фірми “Sigma” (США) та ДіаПрофМед (Україна), антитіла проти Hsp70 отримані в лабораторії.

Препарати міозину отримували за методом Магосяна (Margossian, 1985) з модифікаціями, ланцюги розділяли з використанням методики, описаної Дабре (1989). Концетрацію білка визначали за методом Бредфорд (Bredford, 1976). Електрофоретичний аналіз отриманих білкових препаратів проводили у грaдієнті концентрації ПААГ (7-22%) за денатуруючих умов в буферній системі Леммлі (Laemmli, 1970). АТРазну активність міозинів визначали згідно (Kodama et al., 1986) і оцінювали за кількістю відщепленого неорганічного фосфату. Автоантитіла проти отриманих білків виявляли методом ELISA з модифікаціями (Matsiota, 1987). Імуноблот-аналіз сироваток з найвищою реактивністю проти досліджуваних антигенів проводили за методом Тернінк (Ternynck et al., 1990) з незначними модифікаціями. Для гістологічних досліджень тварин декапітували під легким ефірним наркозом. Серце зупиняли перфузією охолодженим до +4оС 4 % розчином параформальдегіду. Тканинний матеріал фіксували 24 години в 10 % розчині формаліну в фосфатному буфері, рН 7,4. Зневоднювання зразків у спиртах та їхню заливку в парафін проводили за стандартною схемою. Зрізи товщиною 5 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином за методом ван-Гізона. Для вивчення змін скоротливого апарату кардіоміоцитів використовували метод поляризаційної мікроскопії. Види пошкоджень і ступінь контрактурних змін КМЦ оцінювали за критеріями, запропонованими Ю.Г.Целларіусом (1980). Мікроскопію проводили при 200 кратному збільшенні. Морфометричну оцінку проводили не менш як на 30 довільно вибраних ділянках міокарда. Для визначення товщини лівого шлуночка з середньої частини органу перпендикулярно до анатомічної вісі вирізували блок завтовшки 4-5 мм. При виготовленні парафінових зрізів блоки орієнтували найширшою частиною до поверхні зрізання. Послідовні зрізи товщиною 4-5 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином. У кожному зразку досліджували по 10 полів зору, обраних випадково. Для просторової калібровки, яку проводили згідно рекомендацій виробника, використовували зображення стандартної шкали ОМОУ42 (ГОСТ 7513-75). На зображенні вручну оконтурювали зовнішню та внутрішню межу міокарда лівого шлуночка, вимірювали значення параметра і розраховували середнє значення за 10 вимірами. Наведені результати є середнім значенням дослідів, здійснених не менше як у трьох повторностях. Математичну обробку результатів досліджень проводили методами математичної статистики. При статистичній обробці результатів дослідження використовуючи пакет статистичних програм “STATISTICA for Windows 5.1”. Для оцінки достовірності різниці показників використовували t критерій Стюдента та Mann-Whitney U тест. Значення р<0,05 розглядали як критерій достовірності різниці.

Результати дослідження та їх обговорення.

Отримані нами дані та дані літератури свідчать що, при захворюваннях серцево-судинної системи, в сироватках хворих виявляють підвищені рівні автоантитіл до низки власних антигенів білка М7 мітохондрій та нуклеотидтранслокатору, -адренорецептору, тропонінів, міозину та ряду інших.

Більшість досліджень із виявлення антитіл до кардіального міозину в сироватках пацієнтів із серцевими патологіями проводили здебільшого методом непрямої імунофлуоресценсії та з використанням міозину, ізольованого зі здорового серця як антигену. Відомо, що міозин в серці ссавців є гетерогенною системою, співвідношення між окремими формами якої змінюється в процесі онтогенезу. У людини, в нормі, в передсердях переважає ізоформа міозину з важкими -ланцюгами, а в шлуночках знаходиться міозин із важкими -ланцюгами. В ембріональному серці в шлуночках також переважає міозин з важкими -ланцюгами, які замінюються на міозин із -ланцюгами в постнатальний період.

Ми використовували в нашій роботі як антиген міозини, виділені з шлуночка та передсердя здорового (МНШ, МНП), ураженого ДКМП (МДШ, МДП) та ІКМП (МКШ, МКП), а також скелетних м’язів. Виявили, що ці препарати міозинів не відрізнялися між собою ні за молекулярною масою, ні за ізоелектричною точкою (рис. 1 та рис. 2). |

Рис. 1. Електрофоретичний аналіз в 14% ПААГ у присутності додецилсульфату натрію частково очищених препаратів міозинів, отриманих із скелетних м?язів – 2, шлуночка здорового серця – 3, передсердя здорового серця – 4, шлуночка серця, ураженого ІКМП – 5, передсердя серця, ураженого ІКМП – 6 шлуночка серця, ураженого ДКМП – 7, передсердя серця, ураженого ДКМП – 8, маркери молекулярної маси білків – 1. Стрілочками позначені: А – важкі ланцюги; Б – легкі ланцюги міозину |

Рис. 2. Ізоелектрофокусування на гелевих пластинах Servalyt 3-10 препаратів міозинів, виділених із здорового – 1 та ураженого ДКМП –2 серця людини |

АТРазна активність і чутливість до іонів кальцію отриманих препаратів міозинів дещо відрізнялися, як видно із даних, наведених в табл. 1.

Таблиця 1

АТРазна активність та чутливість до іонів кальцію препаратів міозинів,

отриманих з різних міокардів людини (нМ Рі / мг·хв)

З даних, наведених в табл.2, видно, що всі сироватки як хворих на ДКМП і ІКМП, так і здорових донорів тією чи іншою мірою містять автоантитіла до препаратів міозинів, ізольованих із тканин серця і скелетних м?язів.

У групі здорових донорів вищий рівень автоантитіл виявлено до міозину, виділеного з передсердя хворого на ДКМП. Їхній рівень в 1,5 раза вищий, ніж до міозинів, виділених з передсердь інших сердець і в 2,5 раза вищий, ніж рівні автоантитіл проти всіх видів міозинів, виділених із шлуночків серця. У групі пацієнтів з ІКМП виявлені рівні автоантитіл не суттєво відрізнялись від таких у групі здорових донорів. Достовірною різниця була лише до міозину МКП.

Таблиця 2

Рівні автоантитіл до різних міозинів у сироватках хворих на ДКМП, ІКМП та здорових донорів ( розведення сироватки 1: 100 ) ( М м )

Примітки:

– достовірна різниця з відповідними показниками в групі здорових донорів (р005); – достовірна різниця з відповідними показниками в групі хворих на ІКМП.

У групі хворих на ДКМП рівні автоантитіл до всіх препаратів міозинів (крім МДП) достовірно вищі, ніж у групі здорових донорів, і достовірно вищі, ніж у групі ІКМП (за винятком скелетного та МДП) відповідно. При цьому відповідь на МДШ, МКШ найбільш значна.

В антитіло-позитивних сироватках пацієнтів з ДКМП виявлено достовірно вищі рівні автоантитіл, ніж у здорових донорів проти всіх препаратів міозинів. Рівні автоантитіл у сироватках пацієнтів з ІКМП також достовірно вищі в порівнянні зі здоровими донорами проти всіх препаратів міозинів. Рівні автоантитіл у групі ДКМП були достовірно вищі (р0,05) проти препаратів міозинів, отриманих з шлуночків сердець нормального, ураженого ДКМП та ІКМП, а також з передсердя нормального серця.

Таким чином, сироватки пацієнтів з ДКМП мають достовірно вищу імунореактивність щодо МДШ. Це дозволяє зробити висновок, що антиген-мішень знаходиться на молекулі МДШ.

Для детальнішого встановлення локалізації антигенної детермінанти молекулу міозину було розділено на важкі та легкі ланцюги, і досліджено імунореактивність сироваток хворих на ДКМП і здорових донорів проти важких і легких ланцюгів МНШ та МДШ. Результати цих досліджень подано в табл. 3.

Таблиця 3

Імунореактивність сироваток хворих на ДКМП і здорових донорів проти ланцюгів міозинів, виділених з нормального міокарда та міокарда, ураженого ДКМП ( М ± м ) в реакції твердофазного імуноферментного аналізу (розведення сироваток 1100)

Примітки:

– достовірна різниця щодо легких ланцюгів; – достовірна різниця стосовно здорових донорів; – достовірна різниця щодо нормального міозину.

Як видно з табл. 3, імунна відповідь на важкі ланцюги молекули МДШ достовірно вища, ніж на легкі ланцюги. Рівні автоантитіл на легкі ланцюги як МШД так МНШ достовірно не відрізняються при порівнянні їх як всередині груп, так і між групами пацієнтів з ДКМП та здорових донорів.

Рівень автоантитіл проти важких ланцюгів міозину МДШ в групі хворих на ДКМП достовірно вищий, ніж проти важких ланцюгів міозину МНШ, так само як проти важких міозину МДШ та МНШ в групі здорових донорів. Це свідчить про те, що антиген-мішень при ДКМП розташована на важкому ланцюзі молекули міозину, виділеного з шлуночка міокарда, ураженого ДКМП.

Білок, виділений з ураженого органу, вважається автоантигеном, якщо імунізація ним викликає у піддослідних тварин таке ж саме, або подібне досліджуваному захворювання. На даний час немає адекватної індукованої автоімунної моделі розвитку ДКМП.

При імунізації мишей лінії ВАLВ/c препаратами міозинів було отримано такі результати. На 21-ий день після імунізації в міокардах мишей були виявлені пошкодження міокарда з різними морфологічними характеристиками, але лише МДШ, викликав пошкодження подібні до тих, що спостерігаються при ДКМП (результати наведені на рис. 3), зокрема міоцитоліз та локальний кардіосклероз. |

Рис. 3. Морфологічні пошкод-ження міокарда миші на 21-ий день після імунізації препаратами кардіальних міозинів людини: К – сегментарні контрактурні пош-кодження КМЦ; РК– резорбція контрактур; ЛК – локальний кардіосклероз; М – міоцитоліз КМЦ

При цьому рівень антитіл у сироватках тварин проти МДШ з часом майже не змінювався, а проти МНШ падав (рис. 4), незалежно від того, яким міозином було імунізовано тварин.

Рис. 4. Імунна відповідь сироваток миші, отриманих на різних строках імунізації МНШ та МДШ людини проти міозину МНШ (А) та міозину МДШ (Б): 1 – міозин МДШ; 2 – міозин МНШ; 3 – ПАФ

Рівень же автоантитіл в сироватках тварин проти власного міозину з часом зростав при імунізації МДШ і майже не змінювався при імунізації МНШ (рис. 5).

Рис.5. Рівень автоантитіл проти кардіального міозину миші на різних строках імунізації кардіальним міозинами МНШ та МДШ людини:1 – МДШ; 2 – МНШ; 3 – ПАФ |

Як показують гістологічні дослідження, з часом зростала як кількість, так і глибина морфологічних пошкоджень міокарда у піддослідних тварин. Дані цих досліджень наведено в табл. 4.

Таблиця 4

Відносний об’єм (%), який займають КМЦ з різними типами пошкоджень в міокарді мишей після їхньої імунізації вентрикулярним міозином людини, хворої на ДКМП на різних етапах експерименту (за даними світлової мікроскопії) (М м)

Примітки:

– достовірна різниця з аналогічними показниками на першому етапі експерименту (14 днів ), р0,01; – достовірна різниця з аналогічними показниками в групі ПАФ, р0,01; К – сегментарні контрактури; РК – резорбція контрактур; ЛК – локальний кардіосклероз; М – міоцитолізис КМЦ.

Однією з характерних ознак ДКМП у людини є зменшення товщини стінки лівого шлуночка серця. При імунізації мишей лінії ВАLВ/с різними препаратами міозинів людини встановлено зменшення товщини лівого шлуночка серця порівняно з контролем в усіх експериментальних групах вже на 14 добу після імунізації. Ця тенденція з часом не змінювалась. Повного відновлення товщини лівого шлуночка не відбулося ні в одній з експериментальних груп. Найбільше зменшення параметра порівняно з контролем виявлено у тварин, імунізованих МДШ, що наглядно видно із рис. 6.

Рис. 6 Товщина міокарда лівого шлуночка мишей лінії ВLАВ/с після імунізації міозином, виділеним з шлуночка серця людини, ураженого ДКМП

У дорослому організмі відбувається постійне відновлення білкових компонентів міокарда. Проте нормальне функціонування білків можливе за умов їхнього коректного фолдингу. Встановлено, що за коректний фолдинг пептидних ланцюгів відповідає родина високо консервативних спеціалізованих молекул – так званих молекулярних шаперонів (Hsp), функції яких вперше були дослідженні при різних видах стресу, таких як тепловий шок, дії радіації, іонів важких металів, аналогів амінокислот, різних інфекціях, генних мутаціях тощо (Shoeckx et al., 2001). З іншого боку, численними дослідженнями встановлено важливу роль молекулярних шаперонів у нормальній життєдіяльності клітини: в регуляції сигнальних каскадів, імпорті /експорті попередників білків органел до відповідних функціональних компартментів, апоптозі, запальних процесах, презентації внутрішньоклітинних антигенів, роботі іонних каналів, репаративному фіброзі /колагенозі, тощо (Thomas et al., 1995).

ДКМП зараз класифікується не тільки як класична автоімунна патологія і хвороба інтеркалярних дисків, але і як хвороба, спричинена змінами структурно-функціонального стану цитоскелету внаслідок оксидативного стресу. У зв’язку з цим нашу увагу привернув молекулярний шаперон Hsp70, як один з найдослідженіших кардіопротекторних білків м'язових клітин міокарда. Але раніше дослідження кардіопротекторної ролі Hsp70 проводили при кардіоваскулярних патологіях, як наслідок гострого стресу, наприклад, при інфаркті міокарда (Marber et al.,1995; Okubo, 2001). Водночас, дані стосовно ролі Нsр 70 при захворюваннях серця, зумовлених хронічним стресом, таких як ДКМП, в літературі відсутні.

Визначення експресії молекулярного шаперону Нsр 70 в серці людини в нормі та при ДКМП методом імуноблот-аналізу з використанням поліклональних анти- Нsр70 антитіл свідчить про значне зниження рівня Нsр70 на кінцевій стадії розвитку ДКМП ( рис. 7). |

Рис. 7. Вміст шаперону Нsр 70 в шлуночку нормального (1–3) та ураженого ДКМП міокардів (4–6) людини (А).

GAPD – контроль нанесення (Б). Імуноблот-аналіз проводили з використанням поліклональних анти-Нsр 70 та анти-GAPDН антитіл

При імунізації мишей лінії ВАLВ/с міозином, виділеним з ураженого ДКМП серця (модель розвитку ДКМП), з часом спостерігали зменшення кількості шаперону Нsр 70 на кінцевому етапі розвитку захворювання (рис. 8). |

Рис. 8. Вміст шаперону Нsр 70 в лізатах міокардів модельних ДКМП мишей лінії ВАLВ/с на різних етапах розвитку хвороби (А): 1– до імунізації; 2 – 14 днів після імунізації; 3 – 21 день після імунізації: 4 – 58 днів після імунізації. GAPD – контроль нанесення (Б). Імуноблот-аналіз проводили з використанням поліклональних анти-Нsр 70 та анти-GAPDН антитіл

Ці зміни були підтверджені імуногістохімічними дослідженнями міокардів піддослідних тварин на різних стадіях експерименту (рис.9). |

Рис. 9. Локалізація шаперону Нsp70 в лівому шлуночку серця миші на 14 (А), 21 (Б), 56 (В) та 120 (Г) дні після імунізації кардіоміозином Д людини. Імуногістохімія з поліклональними анти–Нsp70 антитілами. Ядра забарвлювали гематоксиліном. Збільшення в 250 разів. Стрілками зазначено гранулярне забарвлення цитоплазми кардіоміоцитів

З рис.9 видно, що інтенсивність гранулярного забарвлення цитоплазми кардіоміоцитів у процесі розвитку експериментальної патології знижується, що свідчить про зменшення кількісного вмісту шаперону Нsp70. При цьому виявлено також ріст інтенсивності забарвлення в стромальних клітинах.

Зниження рівня експресії Hsp70 може призводити до апоптотичної загибелі кардіоміоцитів, що є характерною ознакою для ДКМП на кінцевій стадії розвитку патології (Narula et al.,1996).

Внаслідок зниження кількості Hsp70 в кардіоміоцитах при ДКМП і порушення його функціональної активності можуть з'являтися неправильно укладені білки. Зміна конформації власних білків є сигналом для імунної системи. Вона починає розпізнавати неправильно укладені власні білки як чужі. Можливо, при ДКМП відбувається презентація неправильно укладеного міозину антиген-презентуючими клітинами і, як наслідок, підвищується рівень антиміозинових антитіл. Відомо, що при індукції міокардиту у піддослідних мишей підвищується рівень молекул головного комплексу гістосумісності II в комплексі з міозином в міокарді (Neu et al., 1987, 1990), а при розвитку ДКМП у людини часто передує міокардит.

На основі отриманих нами результатів та аналізу даних літератури ми пропонуємо гіпотетичну модель молекулярних механізмів участі шаперонів у розвитку ДКМП ( рис. 10).

Рис.10. Схема можливих шляхів участі шаперону Hsp70 у розвитку ДКМП

Згідно з цією моделлю, зафіксоване нами зниження кількісного вмісту Hsp70 при ДКМП може бути причиною конформаційних порушень кардіальних білків і мітохондріальної дисфункції, і, як наслідок цих змін – зменшення сили скорочення міокарда, збільшення камер серця, руйнування окремих кардіоміоцитів (апоптоз) і заміна їх клітинами сполучної тканини.

Все ще залишається незрозумілим, які саме конформаційні зміни відбуваються в кардіальному міозині при ДКМП. Не викликає сумнівів те, що значну частину хворих із набутою формою ДКМП можна розглядати як осіб з автоімунною органоспецифічною патологією. Тому пошук автоантигенів специфічних для даної хвороби є надзвичайно важливим не тільки для встановлення етіології ДКМП, але й для розробки діагностикумів для виявлення хвороби на ранніх стадіях її розвитку та терапевтичних засобів її запобігання. Вперше виявлене нами підвищення імуногенності міозину із дилятаційного міокарда може бути основою для діагностичних критеріїв раннього розпізнавання цієї важкої хвороби, розробки специфічних методів її лікування та профілактики.

Вивчення кардіоваскулярних хвороб людини, зокрема молекулярних механізмів їхнього виникнення та розвитку вкрай важливе і складне. У людини одне серце і зміни, які виникають в ньому на клітинному та молекулярному рівнях можна визначити лише при взятті біопсії, що пов’язано з великими труднощами і ризиком, або після смерті пацієнта. Тому створення адекватної моделі захворювання на лабораторних тваринах є дуже важливим. Експериментальна модель хвороби повинна бути максимально наближена до тієї, що спостерігається у людини. В табл. 5 наведено кореляцію параметрів, які визначалися у хворих на ДКМП і отриманих нами в експерименті у мишей лінії ВАLВ/с при імунізації їх МДШ.

Таблиця 5

Ознаки, що спостерігаються при ДКМП та у піддослідних тварин

Виходячи з даних, наведених в табл. 5, при імунізації мишей лінії ВАLВ/с міозином, виділеним з серця, ураженого ДКМП, у останніх з часом спостерігається розвиток захворювання подібного до ДКМП. При цьому міозин, виділений з нормального серця не призводить до розвитку у мишей подібного захворювання. Враховуючи те, що процедуру виділення та очистки препаратів міозинів здійснювали за однакових умов, і дані препарати не відрізнялися ні за ізоелектричною точкою, ні за рухливістю в поліакриламідному гелі, ми припускаємо, що вони, можливо, відрізняються посттрансляційними модифікаціями як то: фосфорилювання, моно- і поліглікозилювання, ацетилювання тощо. Наслідком цих модифікацій є неправильний фолдинг молекули міозину, з’являються нові антигенні детермінанти, внаслідок чого вона стає для імунної системи організму автоантигеном.

Таким чином, ми отримали модель індукованого автоімунного ДКМП–подібного захворювання у піддослідних мишей лінії ВАLВ/с.

Створену модель було використано для вивчення терапевтичної та профілактичної дії 2’-5’-олігоаденілату при ДКМП. Введений внутрівенно 2’-5’-олігоаденілат виявляв дозозалежну імуномодулюючу і кардіопротекторну дію на мишей лінії ВАLВ/с з міозин-індукованим автоімунним пошкодженням міокарда. Найбільш виражений ефект спостерігали при малій (5мкг/кг) дозі 2’-5’-олігоаденілату вже на 14-ий день після імунізації і зберігався він до кінця експерименту. Висока (50 мкг/кг) доза 2’-5’-олігоаденілату спричиняла такі ж ефекти, але менш виражені. Водночас, імуномодулюючий ефект (зниження рівня автоантитіл проти власного серцевого міозину) зберігався до кінця експерименту (52 дні) тільки при введенні великої дози.

При профілактичному введенні 2’-5’-олігоаденілату більш виражені імуномодулюючі та кардіопротекторні ефекти спостерігали при великій дозі препарату. Рівень автоантитіл проти власного серцевого міозину у піддослідних мишей на 14-ий день падав в шість разів порівняно з контролем при введенні великої дози і в три рази при введенні малої дози препарату, але до кінця експерименту рівні автоантитіл вирівнювались і не відрізнялись від таких у контрольній групі.

Отже, було встановлено, що 2’-5’-олігоаденілат виявляє свою кардіопротекторну та імуномодулюючу дію як при профілактичному, так і при терапевтичному введенні. Але, якщо при терапевтичному введенні більш ефективною було використання низької дози 2’-5’-олігоаденілату, то при профілактичному введенні – висока доза.

ВИСНОВКИ

Досліджено роль серцевого міозину як автоантигену при розвитку дилятаційної кардіоміопатії. Встановлено, що кардіальний міозин, виділений з шлуночка серця, ураженого ДКМП, може бути автоантигеном. Імунізація піддослідних тварин препаратами цього міозину індукує у тварин захворювання, подібне до ДКМП у людини.

1. Вперше показано, що антиген-мішень при ДКМП знаходиться на важкому ланцюгу молекули міозину, виділеного з ураженого ДКМП міокарда.

2. Розроблено унікальну тваринну модель міозин–індукованого автоімунного ураження міокарда мишей, що дозволяє дослідити в динаміці дію різних молекулярних чинників у процесі розвитку захворювання. Показано, що міозин, виділений із серця, ураженого ДКМП, запускає автоімунний процес у модельних тварин.

3. Встановлено, що імунізація міозином, отриманим з шлуночка серця, ураженого ДКМП, призводить до зменшення товщини стінки міокарда у піддослідних тварин.

4. Показано зменшення кількісного вмісту шаперону Нsp70 і зміни його клітинної локалізації при розвитку ДКМП.

5. На основі отриманих результатів та аналізу літературних даних сформульовано і запропоновано робочу гіпотезу механізмів розвитку дилятаційної кардіоміопатії та участі в них основних білків коректного фолдингу – молекулярних шаперонів, зокрема Нsp70.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бобык В.И, Веберов А.В, Рябенко Д.В., Дубровская Г.В., Роднин Н.В.,.Сидорик Л.Л. Выделение основных тканеспецифических антигенов из миокарда здоровых лиц и больных дилятационной кардиомиопатией// Биополимеры и клетка.–1993. – Т. 9, №6. – С.63-66. Особистий внесок здобувача – отримання препаратів міозинів із здорового та ураженого ДКМП міокардів, визначення їх фізико-хімічних характеристик .

2. Sidorik L.L., Rodnin N.V., Bobyk V.I., Ryabenko D.V., Veberov A.V., Tkachenko T.Yu. Matsuka G.Kh.// Ivestigation of autoantibodies directed against tissue-specific myocardial antigens in dilated cardiomyopathy // Биополимеры и клетка – 1995. –Т11, №1. – С.81-86. Особистий внесок здобувача–виділення міозину з здорового та ураженого ДКМП міокардів, визначення імунореактивності сироваток здорових донорів та пацієнтів з ДКМП до цих міозинів.

3. Бобык В.И., Федоркова О.М., Рябенко Д.В., Ковеня Т.В., Сидорик Л.Л., Мацука Г.Х. Желудочковый и предсердный миозин при дилятационной кардиомиопатии: сравнительное исследование иммунореактивности // Биополимеры и клетка. – 1999. – Т.15, №5.– С.395-401. Особистий внесок здобувача – виділення препаратів міозинів і визначенні їх імунореактивності з сироватками хворих на ІКМП та ДКМП і здорових донорів.

4. Сидорик Л.Л., Дубей И.Я., Бобык В.И., Козлов А.В., Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Рябенко Д.В., Сергиенко О.В., Трунина И.В., Погребной П.В., Мацука Г.Х. Терапевтические эффекты действия различных доз 2’-5’-олигоаденилата при экспериментальном миозининдуцированном повреждении миокарда // Доповіді Національної академії наук України. – 2001. – №9. – С. 161-165. Особистий внесок – імунізація тварин та приготування препаратів для мікроскопії.

5. Сидорик Л.Л., Дубей И.Я., Бобык В.И., Козлов А.В., Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Рябенко Д.В., Сергиенко О.В., Трунина И.В., Погребной П.В., Мацука Г.Х. Эффекты профилактического действия различных доз 2’-5’-олигоаденилата при экспериментальном миозининдуцированном повреждении миокарда // Доповіді Національної академії наук України. – 2001. – № 10. – С. 171-174. Особистий внесок – імунізація тварин та приготування препаратів для мікроскопії, визначення рівня автоантитіл.

6. Бобык В.И., Ковеня Т.В., Федоркова О.М., Данилова В.М., Трегубов, В.С., Рябенко Д.В., Сидорик Л.Л., Мацука Г.Х. Поиск антигена-мишени при дилятационной кардиомиопатии // Біополімери і клітина. – 2004.– Т.20, №4. – С. 351-354. Особистий внесок здобувача – виділення препаратів міозинів та їхніх ланцюгів, визначення їхної імунореактивності з сироватками крові здорових донорів і пацієнтів з ДКМП.

7. Бобик В.І., Рябенко Д.В., Сергієнко О.В., Труніна І.В., Федоркова О.М., Морозова Л.М., Сидорик Л.Л. Розробка експериментальної аутоімунного міозин-індукованого пошкодження міокарда // Біополімери і клітина. – 2007. – Т. 23, № 2. – С. 115-121. Особистий внесок – імунізація тварин та приготування препаратів для мікроскопії, визначення рівня автоантитіл і АТРазної активності .

8. Сидорик Л.Л., Бобык В.И., Рябенко Д.В., Роднин Н.В., Ковеня Т.В., Мацука Г.Х. Кардиальный миозин и особенности иммунного ответа при ДКМП //Український кардіол. журнал. – 1998. – № 10. – С.45-71. Особистий внесок здобувача – виділення препаратів міозинів і визначення рівня антитіл.

9. Рябенко Д.В., Сидорик Л.Л., Бобык В.И., Сергиенко О.В., Трунина И.В, Федоркова О.М., Мацука Г.Х. Морфологические особенности аутоиммунного ровреждения миокарда, обусловленного различными миокардиальными антигенами человека: сравнительное экспериментальное исследование // Український ревматологічний журнал. – 2000. – Т2, №2. – С. 55-60. Особистий внесок здобувача – отримання антигенів, імунізація тварин та приготування препаратів для цитологічних досліджень.

10. Рябенко Д.В., Сидорик Л.Л., Бобык В.И., Сергиенко О.В., Трунина И.В, Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Мацука Г.Х. Миозин-индуцированное повреждение миокарда: экспериментальное исследование // Український ревматологічний журнал. – 2001. – Т. 1, №3. – С. 59-61. Особистий внесок здобувача – отримання антигенів, імунізація тварин та приготування препаратів для цитологічних досліджень.

11. Сидорик Л.Л., Федоркова О.М., Бобык В.И., Капустян Л.В., Рябенко Д.В. Изучение роли шаперона Hsp70 при развитии дилатационной кардиомипатии // Український кардіологічний журнал. – 2002. – №5. –С.59-62. Особистий внесок здобувача – визначення динаміки експресії Hsp70 в міокардах мишей методом імуноферментного аналізу та імуноблотингу.

12. Коваленко В.Н., Рябенко Д.В., Бобык В.И., Федоркова О.М., Сидорик Л.Л., Капустян Л.Н. Дилатационная кардиомиопатия: снижение уровня экспрессии шаперона Hsp70 в цитоплазме и митохондриях миокарда // Кардиология СНГ. – 2003. – Т 1,№ 1 – С. 78-83. Особистий внесок здобувача – визначення вмісту Hsp70 в цитоплазмі і мітохондріях міокарда.

13. Rodnin N., Bobyk V., Klimenko I., Kornelyuk A., Matsuka G., Sidorik L. Investigation of autoantibodies directed against tissue-specific myocardial antigenes at dilated cardiomyopathy // 7th European Congress of Biotechnology. – Nice, France. – 1995. – Vol.1. – P.7. Особистий внесок здобувача – отримання препаратів міозинів із здорового та ураженого ДКМП міокардів, визначення їхньої імунореактивності.

14. Sidorik L., Kiyamova