НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Черкашина інна володимирівна

УДК: 615.38:611.013.12:612.592

Вплив перфторана на функціональні характеристики сперміїв людини при гіпотермічному зберіганні та кріоконсервації

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: | академік НАН України, доктор медичних наук, професор Грищенко Валентин Іванович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор ІПКіК НАН України, м.Харків

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії та фармакології НГС, м. Харків

доктор медичних наук, с.н.с.

Бондаренко Володимир Олександрович, Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, завідувач відділенням патології статевих залоз, м. Харків

Захист відбудеться “18___”вересня 2007 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків – 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, м. Харків – 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий “_7__” серпня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Прогрес у лікуванні безплідності в певній мірі пов’язаний із застосуванням методів низькотемпературного зберігання сперми та використанням її в допоміжних репродуктивних технологіях. Основним технологічним прийомом при сучасних методах низькотемпературного зберігання сперміїв, є використання кріозахисних середовищ, середовищ інкубації і еквілібрації суспензії клітин. Склад і властивості таких розчинів в основному визначають ефективність процесу заморожування-відігрівання і, як наслідок, відновлення морфофункціональних властивостей клітин після відігрівання. Саме тому розробка кріозахисних середовищ для гіпотермічного зберігання і кріоконсервації репродуктивних клітин людини є однією з актуальних проблем сучасної кріобіології.

Існує ряд біологічно-активних речовин, інтерес до яких згодом не тільки не слабшає, а підсилюється, відкриваючи нові області та можливості їх застосування в кріобіологічних дослідженнях. Однією з таких композицій є створений в 1980-і роки (Ф. Ф. Белоярцев, Г. Р. Иваницкий, И. Л. Кнунянц) кровезамісник, що має газотранспортні властивості “Перфторан”. Основною функціональною характеристикою цієї фторуглеродної емульсії є здатність переносити гази, у тому числі кисень. Використання перфторана як компонента кріозахисних середовищ для сперміїв людини відкриває нові можливості у вивченні механізмів кріопошкодження та кріозахисту цих клітин, змінюючи співвідношення аеробних та анаеробних процесів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт з теми “Вивчення особливостей дії низьких температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні клітини в залежності від етапу гамета- і ембріогенезу, розробка середовищ збереження, кріоконсервування й репарації нелетальних кріопошкоджень цих біооб’єктів” № 2.2. 6.96. № ДР 0101U003480. Інституту проблем кріобіології і кріомедицини, затвердженої президією НАН України.

Метою роботи було з'ясувати ефективність і деякі сторони механізму дії газотранспортного кровезамісника “Перфторан” на спермії людини при гіпотермічному зберіганні і кріоконсервації. Відповідно до поставленої мети роботи передбачалося вирішити наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

Об'єкт дослідження. Процеси кріопошкодження і кріозахисту сперміїв людини інкубованих у середовищі з газотранспортним кровезамісником “Перфторан”

Предмет дослідження. Функціональні та біохімічні характеристики сперміїв людини при гіпотермічному зберіганні і кріоконсервації в присутності газотранспортного кровезамісника “Перфторан”.

Методи дослідження: біохімічні (вміст молочної кислоти, загальна антиокисна активність, вміст дієнових і триєнових кон’югатів, активність супероксиддісмутази), кріобіологічні (кріоконсервація сперміїв в умовах надшвидких швидкостей охолодження, гіпотермічне зберігання сперміїв)

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показана можливість використання кровезамісника з функцією транспорту кисню для зберігання сперміїв людини в умовах гіпотермії. Визначено ефективну концентрацію препарату в середовищі - 40 % за об’ємом.

Досліджено специфічні зв'язки процесів перекісного окислювання ліпідів у сперміях людини з інкубацією клітин у середовищі з підвищеним вмістом кисню.

Уперше встановлений і науково обґрунтований антиоксидантний ефект емульсії “Перфторан” при гіпотермічному зберіганні сперміїв людини.

Визначено ефективність використання емульсії “Перфторан” як компонента кріозахисного середовища для збільшення життєздатності відігрітих сперміїв і доведено неможливість використання перфторана в якості кріоконсерванта.

Практична значимість отриманих результатів. Результати нових підходів до вивчення функціональної активності сперміїв шляхом аналізу змін біохімічних параметрів еякуляту у відповідь на присутність у кріозахисному середовищі донора кисню можуть бути використані в допоміжних репродуктивних технологіях на етапі підготовки сперміїв до штучної інсемінації та реінсемінації ооцитів, транспортування зразків сперми для використання в наукових чи практичних цілях протягом кількох діб в умовах гіпотермії.

Використання перфторана в допоміжних репродуктивних технологіях для поліпшення функціональних властивостей сперміїв людини бажано здійснювати включаючи його до складу середовища, що дозволяє значно збільшити тривалість руху клітин після відігріву і шанси запліднення яйцеклітини. Комплексні дослідження функціональних характеристик репродуктивних клітин при впливі біологічно-активних речовин є основою для створення високоефективних і простих у реалізації способів низькотемпературного зберігання сперматозоїдів, що сприяє більш раціональному використанню відігрітого матеріалу для лікування безплідності.

Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Разом з керівником здійснене наукове планування експериментів, поставлені мета та задачі дослідження. В опублікованих разом з співавторами друкованих працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботі [1] у підборі ефективної робочої концентрації перфторана для сперміїв людини;

у роботі [2] у вивченні динаміки накопичення молочної кислоти в сперміях людини при введенні перфторана в середовище гіпотермічного зберігання;

у роботі [3] у виконанні експериментів та обговоренні результатів;

у роботі [4] у визначенні концентрації активно-рухливих та рухливих сперміїв в середовищі гіпотермічного зберігання, яке містило перфторан.

у роботі [5] у проведенні досліджень по визначенню життєздатності сперміїв при тривалому часі інкубації та використанні інгібіторів фосфодіестерази;

у роботі [6] у виконанні фарбування барвником тріпановим синім фрагментів, що зберігалися в середовищі, яке містило перфторан;

у роботі [7] у розробці середовища для отримання сперми собак

у роботі [8] у проведенні експерименту та статистичній обробці результатів;

у роботі [9] у проведенні гіпотермічного зберігання сперміїв людини та вибору еякулятів за характеристиками, які відповідають нормам ВООЗ;

у роботі [10] у підборі сперми за критеріями ВООЗ, оцінці сперміїв людини після гіпотермічного зберігання за морфологічними критеріями та процентом рухливих форм;

у роботі [11] у обговоренні проблеми функції кріобанків сперми людини при сучасному розвитку допоміжних репродуктивних технологій;

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на конференції молодих вчених ІПКіК НАН України (1999 р., Харків), на Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (2001 р., Харків), на XVII робочій нараді “Консервація генетичних ресурсів” з міжнародною участю (2002 р., Росія, Пущено), конференції молодих вчених ІПКіК НАН України “Холод у біології і медицині” (2003 р., Харків).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, у тому числі 5 статей в наукових фахових виданнях, 2 патенти на винахід, 4 тези доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 133 сторінках друкованого тексту, з яких 111 сторінок основного змісту. Дисертація складається з введення, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та аналізу і узагальнення результатів дослідження. Робота містить 16 рисунків, 5 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Об'єктом дослідження були еякуляти людини при нормоспермії. Підготовку та дослідження сперми проводили згідно рекомендацій ВООЗ (World Health Organization, 1999). Концентрацію і рухливість сперміїв визначали за допомогою камери Маклера (Makler counting chamber, Ізраїль).

Визначення концентрації молочної кислоти здійснювали ферментативним методом по накопиченню нікотинамідаденіндінуклеотида відновленого (НАДН) у системі сполучених ферментативних реакцій. Оптичну щільність вимірювали за допомогою спектрофотометра Shimadzu QV-50 (Японія) при довжині хвилі 340 нм. Концентрацію молочної кислоти виражали в ммоль/л.

Визначення дієнових (ДК) і триєнових (ТК) коньюгатів здійснювали модифікованим методом Плацера із соавт. (1976). Принцип методу ґрунтується на поглинанні ліпідним екстрактом монохроматичного світового потоку в ультрафіолетовій області спектра при довжинах хвиль 233 та 278 нм.

Активність супероксиддісмутази (СОД) визначали по відновленню барвника нітросинього тетразолія (НСТ). Для цього в контрольну пробу вносили 0,2 мл 1 ммоль/л розчину ЕДТА, 0,1 мл 1розчину желатина, 0,5 мл 24 ммоль/л розчину НСТ, 1 мл 0,03 ммоль/л розчину феназінметасульфата (ФМС) і доводили об’єм інкубаційної проби до 3 мл. У опитну пробу додатково вносили еякулят. У контрольній та опитній пробах реакцію запускали додаванням 0,1 мл 1 ммоль/л розчину НАДН. Інкубацію здійснювали протягом 10 хв. при 25С на відкритому повітрі. Через 10 хв. вимірювали величину оптичної щільності при 540 нм. Активність СОД виражали в умовних одиницях, за 1 у.е. приймали 50уповільнення окислювально-відновної реакції. 

Загальну антиоксидантну активність визначали в модельній системі суспензії желточних ліпопротеідів і виражали в моль/л від 50 % інгібування ПОЛ в модельній системі в порівнянні з класичним антиоксидантом іонолом.

За умови гіпотермії приймали охолодження суспензії клітин до температури 10С при відкритому доступі кисню. Надвисокі швидкості охолодження досягалися зануренням контейнерів в охолоджений до температури рідкого хладоагенту твердий хладоносій. Композиційний кріоконсервант містив гліцерин, жовток курячого яйця, цитрат натрію і глюкозу. Заморожування здійснювали в поліпропіленових кріопробірках фірми “Corning” (Данія) об’ємом 1 мл. Розморожування сперми здійснювали, поміщаючи контейнери на 5 хвилин у воду при 37оС.

В роботі використовувався фармакопейний газотранспортний кровезамісник “Перфторан” - емульсія яка має високу газотранспортну здатність, стабільність, монодісперсність, а також нерєактогенні та нетоксичні властивості. Згідно з статтею 9 Закону України “Про лікарські засоби” пункт 6 постановлення Кабінету Міністрів України від 13.09.00 № 1422 “Про затвердження порядку державної реєстрації (перереєстрації) лікарського засобу і розмірів збору за державну реєстрацію (перереєстрацію) лікарського засобу” перфторан було зареєстровано в Україні та внесено до Державного реєстру лікарських засобів у формі емульсії для інфузій по 100 мл, 200 мл, та 400 мл. Номер реєстраційного свідотства UA/2558/01/01. Перфторан при порівняно малому показнику абсолютної кисневої ємності (7 об.% кисню при рО2 760 мм. рт ст.) забезпечує завдяки низької в’язкості (3,5 сП) більш високу динамічну ємність кисню, ніж інші відомі емульсії, тобто, кращу доставку кисню до тканин. Для роботи точно були дотримані умови зберігання та розморожування препарату для підтримки його субмікронної структури. Препарат зберігався при температурі +4єС – 2 тижня, або при температурі –18єС – 2 роки. Дозволялась 5-кратна розморозка/заморозка. Перфторан не зберігався при температурі нижче –18єС та його відігрів не здійснювався при температурі висче ніж +30єС. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою набору засобів аналізу даних комп'ютерної програми Microsoft Excel 2003.

Результати власних досліджень і їх обговорення. Проведено підбір ефективних робочих концентрацій перфторана. Вплив цього препарату на клітини визначали по фіксуванню максимальної рухливості сперміїв при варіюванні вмісту ПФ у суспензії. Вірогідно високий відсоток рухливих клітин після 30 годин інкубації був зафіксований при концентрації ПФ 40 об. %. Подальше збільшення концентрації ПФ в середовищі інкубації приводило до зниження життєздатності сперміїв (рис. 1). Отримані нами експериментальні дані дозволяють зробити висновок, що ефективною робочою концентрацією ПФ для сперміїв людини треба вважати 40по об?єму. Експериментальні дані вказують на те, що вплив ПФ на рухливість сперміїв людини дозволяє значно збільшити тривалість рухів клітин після гіпотермії. Внесення в середовище після 72 годин інкубації інгібітора фосфодіестерази пентоксіфіліна в кінцевій концентрації 3,5 ммоль/л не призвело до активації клітин у контролі. Тобто це свідчить про відсутність у сперміїв можливості використовувати субстрати плазми для метаболізму з метою поновлення руху.

Рис. 1. Вплив різних концентрацій перфторана (1 – 30, 2 - 35, 3 - 40, 4 – 45 об. %) на рухливість нативних сперміїв в інтервалі часу від 1 до 30 годин; * - показники вірогідні по відношенню до контролю (p < 0,05).

Однак, в присутності перфторана спермії відновили свою рухливість до рівня який відповідає значенням на початок експерименту, що дозволило зафіксувати повну зупинку сперміїв тільки після 120 годин інкубації (рис. 2).

Рис. 2. Вплив перфторана на рухливість сперміїв людини після гіпотермічного зберігання; PF – стимуляція 3,5 мМ пентоксіфіліном.

Таким чином в присутності перфторана спермії втрачали рухливість, але залишались життєздатними.

Численні дослідження способів та умов кріоконсервації сперміїв людини дозволили виділити спосіб надшвидкого охолодження суспензії, як один з оптимальних (В.І. Грищенко, Ю.В. Калугін, Н.А. Лучко, 1998). Спосіб дозволяє досягати високої життєздатності гамет після кріоконсервації та гарної повторності результатів. У ході комплексних досліджень морфофункціонального статусу сперміїв, які було кріоконсервовано в умовах надшвидкого охолодження, автори досягли високого відсотка неушкоджених акросом, що сприяє гарній запліднюючій здатності відігрітої сперми.

Доцільним уявляється дослідити кріозахисні властивості емульсії перфтора на предмет використання його в якості кріоконсерванта. Результати досліджень по включенню перфторана до складу кріозахисного середовища представлені на рис 3. Аналіз отриманих даних переконливо свідчить про відсутність кріозахисних властивостей у емульсії ПФ. Залишкова рухливість сперміїв, яка спостерігалась в зразку після відігрівання, скоріше свідчить про ефективність способу надшвидкого охолодження. Навпроти, у контролі, де замість ПФ використовувалось спеціально розроблене (В.І. Грищенко, Ю.В. Калугін, Н.А. Лучко, 1998) глюкозо-цитратно-желточне кріозахисне середовище з низьким вмістом компонентів, кріопротектором у якому був гліцерин, після відігрівання рухливість сперміїв була високою.

Рис. 3. Рухливість сперміїв людини після відігріву, при додаванні перфторана в середовище кріоконсервації (а) та при використанні його як кріоконсерванта (б).

Подальша інкубація відігрітих суспензій дозволила відзначити істотні відміни в показниках рухливості сперміїв у контрольній і опитній групі (рис 4.).

Рис. 4. Показники рухливості відігрітих сперміїв людини після кріоконсервації в середовищі, що містить перфторан.

При вмісті ПФ в кріоконсерванті відігріті клітини зберігали рухливість протягом 12 годин, у той час як у контрольній суспензії повна зупинка рухливості спостерігалася після 6 годин інкубації. Ми вважаємо, що при глибокому охолодженні до температури рідкого азоту, субмікронна структура емульсії втрачає свою тонку організацію, та основну функціональну властивість - здатність забезпечувати спермії киснем.

Молочна кислота (лактат), є кінцевим продуктом фруктоліза в сперміях людини. В процесі інкубації в еякуляті відбувається накопичення лактату. При цьому рН зрушується в кислу сторону, рухливість сперміїв знижується, відбувається процес автоінтоксикації. Інтенсивність автоінтоксикаційних процесів перебуває в прямої залежності від температури, складу середовища інкубації, збагачення сперми киснем, вмісту активно-рухливих сперміїв в еякуляті.

За отриманими результатами можна зробити висновок, що при внесенні перфторана в середовище гіпотермічного зберігання сперміїв концентрація молочної кислоти зменшувалася після 48 годин інкубації та наростала після 72 годин в контролі і опиті (табл. 1).

У той же час, при зберіганні клітин у середовищі з ПФ рівень лактату був вищій ніж у контролі поза інтервалом часу 48 - 72 годин. Мінімальний вміст молочної кислоти в наших експериментах збігався з повною зупинкою клітин в контролі і значному зниженні рухливості сперміїв в зразках, що містять ПФ. На підставі отриманих нами експериментальних даних, а також даних літературних джерел, ми вважаємо, що спермії людини можуть проявляти властивості

Таблиця 1

Концентрація молочної кислоти в спермі людини після різних строків зберігання в середовищі, що містить перфторан.

Гіпотермія, год. | Концентрація молочної кислоти, ммоль/л

Контроль | ПФ

0 | 0,88 0,08 | 0,88 0,08

5 | 0,91 0,15 | 1,24 0,09*

24 | 0,91 0,13 | 1,17 0,1*

36 | 1,13 0,12 | 1,19 0,11

48 | 1,35 0,23 | 1,2 0,31

55 | 0,89 0,34 | 0,78 0,25

72** | 1,0 0,16 | 1,22 0,20

96 | 1,14 0,25 | 1,44 0,27

110 | 1,1 0,17 | 1,5 0,10*

120 | 1,06 0,21 | 1,72 0,24*

* – показники вірогідні по відношенню до контролю р < 0.05; ** - додання пентоксіфіліна в кінцевій концентрації 3,5 ммоль/л.

факультативних аеробів, здатними за певних умов використовувати кисень перфторана для забезпечення рухливості.

Більшість уяв про механізми кріоушкодження та кріозахисту клітин пов’язано з станом біологічних мембран, як найбільш чутливих до низько температурної дії структур. Процеси перекісного окислювання ліпідів, як відомо, починаються з утворення первинних та вторинних продуктів.

Аналізуючи вміст первинних продуктів перекісного окислювання ліпідів можна зробити висновок, що накопичення дієнових коньюгатів в опиті гальмується перфтораном, тоді як у контрольній суспензії збільшення концентрації цих продуктів трансформації поліненасичених жирних кислот істотно прискорено. Утворення триєнових коньюгатів свідчить про подальшу інтенсифікацію процесів ПОЛ. Швидкість утворення ТК у сперміях відрізняється вірогідно низьким вмістом ТК у порівнянні із ДК, що свідчить про їх низьку концентрацію, і/або активне залучення в процес утилізації цих продуктів таких чинників як антиоксидантні ферменти сперміїв (рис 5).

Більшість прямих підходів до оцінки ліпідної пероксидації, кількісне визначення гідроперекісей ліпідів (первинних продуктів) спричиняє ряд труднощів у трактовці результатів в внаслідок нестійкий хімічній природі визначаємих речовин. Тому аналіз вторинних та кінцевих продуктів перетворення гідроперекісей представляє великий інтерес.

Рис. 5. Вміст діенових (а) та триенових (б) кон’югатів в спермі людини при використанні перфторана в середовищі гіпотермічного зберігання; показники вірогідні по відношенню до контролю (p < 0,05).

Однією з таких сполук є проміжний продукт продукт этапа ферментного окислення арахідонової кислоти та кінцевий продукт окислювальної деградації ліпідів – малоновий діальдегід.

Проведені нами дослідження довели, що концентрація малонового діальдегіда (МДА) в еякуляті, який не містив перфторан, зростала впродовж інкубації, та по досягненню 24 годин спостерігався максимум вмісту цієї речовини (рис 6).

Рис. 6. Вміст МДА в спермі при використанні перфторана в середовищі гіпотермічного зберігання; * - показники вірогідні по відношенню до контролю (p < 0,05).

Це можна пояснити закономірним розвитком процесів ПОЛ у сперміях, що мають тенденцію збільшувати свою інтенсивність з часом.

Навпаки, при додаванні перфторана до сперміїв рівень МДА знижувався, що вдалося вірогідно зафіксувати після 5 годин гіпотермії. Після 24 годин інкубації концентрація МДА знизилася майже у два рази в порівнянні з його вмістом в контрольній суспензії. Таким чином, ґрунтуючись на даних визначення концентрації МДА, нами зафіксований антиоксидантний ефект перфторана для сперміїв людини в умовах гіпотермії.

Особе місце серед ферментів антиоксидантного захисту має супероксиддісмутаза, тому що вона бере участь у перериванні ланцюга вільнорадикальних процесів у початковій стадії одноелектронного відновлення молекулярного кисню, викликаючи дисмутацію супероксидного аніон-радикала (О2* –), що утворився. Зміна активності СОД в еякуляті представлена в таблиці 2.

Таблиця 2

Зміна активності супероксиддісмутази і рухливості сперміїв при гіпотермічному зберіганні в середовищі з перфтораном.

Гіпотермія, год. | Контроль | Перфторан

Активність СОД, у.о. | Рухливість (a+b), % | Активність СОД, у.о. | Рухливість (a+b), %

0 | 158 20,4 | 65 5,2 | 154 25,8 | 65 5,2

5 | 160 12,9 | 21 3,4 | 140 23,9 | 40 7,5

24 | 150 10,1 | 0 | 122 11,1* | 25 3,8

* – показники вірогідні по відношенню до контролю (р < 0,05).

Активність СОД в середовищі гіпотермічного зберігання, яке містить ПФ, була вірогідно нижче по відношенню до контролю тільки після 24 годин інкубації. До того часу активність ферменту була стабільно високою, хоча спостерігалася невірогідна тенденція до її зниження. Навпаки, спостереження за кінетичними характеристиками сперміїв показало зниження процента рухливих клітин з часом в обох дослідних групах. Дані експериментів можуть свідчити про інтенсивність утворення супероксид-аніон-радикала на початкових етапах низькотемпературного зберігання сперміїв. Слід зазначити, що низька активність СОД після 24 годин інкубації відповідала наявності рухливих сперміїв в зразку з ПФ, в той час як в контролі рухливих клітин не спостерігалось.

Аналізуючи ці зміни активності СОД, можна бачити, що збільшення інтенсивності утворення супероксид аніон-радикала прискорено у контрольній групі, в той час як в середовищі з перфтораном цей процес загальмований. На підставі експериментальних даних ми робимо висновок, що взаємодія емульсії ПФ з мембранами сперміїв приводить до таких функціональних змін у ліпідному біслої, які перешкоджають утворенню О2* – . Емульсія ПФ здатна зв’язувати (сорбувати) цитотоксичні лізофосфоліпіди, які виникають при гідролізі жирних кислот фосфогліцерідів під впливом фосфоліпази A2. Однак цей процес є вторинним і може пояснювати антиокісну дію ПФ в даній серії експериментів, яка пов’язана тільки із збереженням рухливості сперміїв після 24 годин інкубації на фоні зниження активності СОД.

Кисень-залежна природа процесів перекісного окислювання ліпідів припускає складну багаторівневу систему його регуляції, у якій переважають внутрішньоклітинні механізми. Рівень ПОЛ, сперми визначається, з одного боку, процесами радикало- та перекісеутворення, а з другого - станом ендогенних систем антиокисного захисту, тому оцінка антиокисної активності цих систем має практичне значення. Спермії дуже чутливі до пошкодження активними формами кисню в результаті високого вмісту поліненасичених жирних кислот в плазматичній мембрані та низької концентрації ферментів антиокісного захисту у цитоплазмі. Це вказує на необхідність комплексного дослідження процесів ПОЛ по показнику загальної антиокисної активності (ЗАА). ЗАА сперми визначається наявністю антиокислювачів, ферментативних систем знешкодження перекисів і вільних радикалів, SH-з'єднань, стероїдних гормонів та ін. Механізм дії присутніх в спермі інгібіторів перекісного окислювання ліпідів та їх внесок у загальний антиоксидантний потенціал сперми різні. Однак важливо не стільки врахувати внесок того або іншого ендогенного антиоксиданту, скільки оцінити резерви антиоксидантного захисту сперми в цілому. Результати визначення ЗАА сперми до та після кріоконсервації представлені на рисунку 7.

Рис. 7. Загальна антиокислювальна активність сперми в нативному стані (а) та після кріоконсервації (б) при доданні до середовища інкубації перфторана; * — показники вірогідні по відношенню до контролю (p < 0,05).

В нативному стані ЗАА була високою – 65,7 % і рівномірно знижувалася протягом 12 годин інкубації. При внесенні перфторана в середовище нативних сперміїв, динаміка зміни загальної антиокисної активності мала той же характер, однак, значення цієї величини були вірогідно вище в порівнянні з контролем – 86,4 % та 68,7 % відповідно. У цій роботі встановлено, що сперма має досить високий свій антиокисний потенціал, який вірогідно підсилюється при додаванні в середовище перфторана. Антиокисний ефект газотранспортного кровезамісника проявляється відразу й залишається на досить високому рівні як після 6, так і після 12 годин інкубації.

При заморожуванні-відігріванні спостерігалося різке зниження показника ЗАА в контролі (48,3 %) у порівнянні з опитними зразками (78,3 %). Незважаючи на високі показники рухливості та життєздатності клітин після відігрівання, дані спостереження свідчать, що після кріоконсервації в спермі різко зростають процеси ПОЛ. Характерно, що динаміка зміни ЗАА кріоконсервованих суспензій сперміїв була одноманітною в контролі і опиті, рівномірно знижуючись від 6 до 12 годин інкубації. Різке падіння рівня ЗАА в обох дослідних групах після 12 годин можна пояснити відсутністю активно-рухливих і рухливих сперміїв в еякуляті (а + b) на фоні наявності великої кількості клітин, що коливаються на місті. Для даних умов характерно ще більше зростання процесів ПОЛ і відповідно зниження антиоксидантних властивостей перфторана.

Результати дослідження ЗАА в умовах гіпотермічного зберігання сперміїв представлені на рис 8.

Рис. 8. Загальна антиоксидантна активність сперми в умовах гіпотермії при вмісті перфторана в середовищі інкубації; * — показники вірогідні по відношенню до контролю, p < 0,05.

При гіпотермії спостерігалася вірогідно висока загальна антиоксидантна активність при доданні перфторана в середовище в порівнянні з контролем для всіх інтервалів часу. У випадку гіпотермічного зберігання навіть після 24 годин інкубації ЗАА в опитних зразках залишалася на високому рівні (62,0 %).

Ми пов’язуємо ці спостереження, перш за все з гальмуванням загального метаболізму сперміїв при зниженні температури. Цим пояснюється наявність активно-рухливих форм сперміїв в відігрітому зразку через 24 години гіпотермії. З другого боку, неспецифічна гідрофобна взаємодія субмікронних часток емульсії з плазматичною мембраною спермія, на нашу думку, є основним процесом який відповідає за кріозахист сперміїв до яких додано перфторан в умовах гіпотермії, бо на відміну від глибокого охолодження, грубі порушення структури і функції сперміїв в цьому випадку відсутні. Гальмування розвитку процесів ПОЛ температурним фактором, в поєднанні з антиокісним ефектом перфторана збільшує загальну антиокісну активність системи в цілому. Слід також відмітити, що при зниженні температури розчинність кисню в рідинах збільшується. Таким чином, збільшується і час донорно-акцепторної взаємодії газотранспортного кровезамісника з мембранами сперміїв, що підтверджують дані ЗАА, отримані нами після 48 годин інкубації.

Одним з пояснень встановлених нами антіокисних властивостей перфторана по відношенню до сперміїв людини може бути припущення про зміну структурно-фазового стану ліпідів при гіпотермічному зберіганні. Ми вважаємо, що весь комплекс змін в мембранах сперміїв при зниженні температури (термотропні фазові переходи ліпідів, зміна структури мембранної води, сегрегація та агрегація білків, порушення бар’єрних властивостей) під впливом перфторана набуває розладу. Являв собою емульсію, перфторан містить в своєму складі емульгатор проксанол 268 – блок-сополімер этіленоксида та пропіленоксида, які мають властивості спиртів. Ця речовина не може не впливати на динамічну рівновагу фазових перетворень в мембранах під впливом температури. При певному ступені емульгіровання частка структурованих ліпідів в мембранах сперміїв із зниженням температури, за нашою уявою, не повинна зростати. Таким чином, одним з можливих механізмів антиокисної активності перфторана при гіпотермічному зберіганні сперміїв людини може бути інгібування температурно-залежних змін цитоплазматичної мембрани

Отримані в цій роботі результати по використанню перфторана як компонента кріозахисних середовищ для гіпотермії та кріоконсервації сперміїв людини свідчать про прояв їм властивостей, не зв'язаних у повній мірі зі здатністю транспортувати кисень. З погляду відновлення функціональних властивостей клітин після відігрівання перфторан можна розглядати як ефективне доповнення до середовищ низькотемпературного зберігання сперміїв людини. Використання газотранспортного кровезамісника “Перфторан” для низькотемпературного зберігання сперміїв людини забезпечує високий рівень функціональної активності клітин після відігріву, що свідчить про цілісність мембранних структур та нормальний хід основних біохімічних процесів.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі викладено теоретичне й експериментальне узагальнення наукової задачі, спрямованої на вивчення впливу газотранспортного кровезамісника “Перфторан” на процеси кріоушкодження та кріозахисту сперміїв людини при гіпотермічному зберіганні та кріоконсервації. Перспектива застосування газотранспортної емульсії “Перфторан” в експериментальних дослідженнях визначила необхідність удосконалення середовищ кріоконсервації та гіпотермічного зберігання сперміїв людини.

1.

2.

3.

4.

5.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ праць

1. Грищенко В.И., Черкашина И.В., Кучков И.Н., Гапон А.А., Микулинский Ю.Е., Юрченко Г.Г. Влияние перфторана на подвижность и переживаемость спермиев человека при гипотермии// Пробл. Криобиол. – 2001 - № . – С. 8 – 11.

2. Черкашина И.В. Динамика накопления лактата в спермиях человека при введении перфторана в среду гипотермического хранения// Пробл. Криобиол. – 2003. - № 3. – С. 75 – 79.

3. Чадаев В.Е., Кучков И.Н., Черкашина И.В., Кузьмина И.Ю. Перспективы использования перфторированных углеводородов для гипотермического хранения спермиев человека// Сучасні аспекти репродуктології, перінатальної медицини та кріобіології. - Харків. - 2003. - С. 236 - 241.

4. Грищенко В.И., Чадаев В.Е., Черкашина И.В., Кузьмина И.Ю., Кучков И.Н. Возможность использования перфторана для гипотермического хранения спермиев человека// Врачебная практика – 2004. № 5, с.84 – 87.

5. Чадаев В.Е., Кучков И.Н., Черкашина И.В., Гольцев К.А., Добрунова И.В. Морфологические и функциональные характеристики спермиев человека после криоконсервирования в условиях сверхбыстрого охлаждения// Пробл. Криобиол. – 2005. – Т. 15. № 4. – С. 665 – 670.

6. Патент № 380303А Украина, МПК 7, АО1N1/02 Спосіб гіпотермічного збереження фрагментів тканини печінки/ Грищенко В.И., Мікулінський Ю.Ю., Гончарук О.І, Грубман С.О., Черкашина І.В. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Заявл. 21.06.00 № . Публ. 15.05.01. Бюл. № 4.

7. Патент № 68172А Украина, МПК А61D19/02, АО1N1/02 Спосіб отримання сперми собак/ Грищенко В.І., Копейка Є.Ф., Єгоров М.І., Кучков І.М., Черкашина І.В. Інститут Проблем Кріобіології і Кріомедицини НАН України. 15.07.2004. Бюл. № 7

8. Ovsyannikova T.N., Dyagileva H.A., Cherkashina I.V. Effect of hypertermia on lipoperoxidation potential of testes and liver of rats// Biophysical proceeding of Kharkov National University. – 1999. – Sep. – P. 36.

9. Алексеевская Э.И., Крамар М.И., Чуб Н.Н., Юрченко Г.Г., Тодоров П., Чадаев В.Е., Черепанова Т.А., Кучков И.Н., Черкашина И.В. Стимулирующее действие цитохрома С и холинхлорида на активность сукцинатдегидрогеназы в спермиях человека, хранившихся в условиях гипотермии// Пробл. Криобиол. – 2001 - № . – С. 14.

10. Грищенко В.И., Черкашина И.В., Кучков И.Н., Гапон А.А., Микулинский Ю.Е., Юрченко Г.Г., Алексеевская Э.И. Влияние перфторана на некоторые функциональные свойства спермиев человека при гипотермии// Пробл. Криобиол. – 2001 - № . – С. 27.

11. Кучков И.Н., Чадаев В.Е., Кузьмина И.Ю., Черкашина И.В. Функция криобанков спермы человека при современном развитии вспомогательных репродуктивных технологий// Матеріали науково-практичної конф. “Від фундаментальних досліджень – до прогресу в медицині”. - Харків. - 2005. - С. 183 - 184.

АНОТАЦІЯ

Черкашина І.В. “Вплив перфторана на функціональні характеристики сперміїв людини при гіпотермічному зберіганні та кріоконсервації”. - рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків 2007.

Дисертація присвячена вивченню впливу газотранспортного фторвмісчуючого кровезамісника “Перфторан” на біохімічні процеси в сперміях людини, кріозахист і кріопошкодження при наявності його в середовищі гіпотермічного зберігання і кріоконсервації. Отримані в роботі результати дозволяють зробити висновок, що в присутності донора кисню перфторана спермії людини можуть ставати факультативними аеробами та в умовах гіпотермії залишатися рухливими впродовж 120 годин. Перфторан не може використовуватися як кріозахисне середовище при глибокому охолодженні сперміїв до температури рідкого азоту. Маючи антиоксидантні властивості ця газотранспортна емульсія може використовуватись як додаток до середовищ низькотемпературного зберігання сперміїв людини у концентрації 40 об. %.

Ключові слова: газотранспортний кровезамісник перфторан, спермії людини, гіпотермія, кріоконсервація, ПОЛ.

АННОТАЦИЯ

Черкашина И.В. “Влияние перфторана на функциональные характеристики спермиев человека при гипотермическом хранении и криоконсервации”. - рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украини, Харьков 2007.

Диссертация посвящена изучению влияния газотранспортного фторсодержащего кровезаменителя “Перфторан” на подвижность, содержание молочной кислоты, перекисное окисление липидов в спермиях человека, а так же на процессы криоповреждения и криозащиты в спермиях при гипотермическом хранении и криоконсервации в средах содержащих перфторан.

Проведен подбор эффективной рабочей концентрации эмульсии для спермиев. Показано, что целесообразно использовать её в количестве 40 об. %. Изучена переживаемость спермиев при содержании перфторана в среде инкубации в условиях гипотермии. Показано, что полная остановка клеток в присутствии донора кислорода перфторана происходит через 120 часов гипотермического хранения. При внесении перфторана в среду гипотермического хранения спермиев нами установлено, что концентрация молочной кислоты убывала после 48 часов инкубации и нарастала после 72 ч. в обеих исследуемых группах. В то же время, при хранении клеток в среде с ПФ уровень лактата был выше, чем в контроле вне временного интервала 48 - 72 ч. Минимальное содержание молочной кислоты в наших экспериментах совпадало с полной остановкой клеток в контроле и значительным снижением подвижности спермиев в образцах, содержащих ПФ. Данные динамики накопления молочной кислоты убедительно свидетельствуют о способности спермиев человека в этих условиях использовать кислород для поддержания подвижности. Проведенные эксперименты по криоконсервации показали, что перфторан не может являться криозащитной средой для спермиев человека, однако его присутствие в криозащитной среде позволяет увеличить переживаемость отогретых клеток в два раза. Показано, что перфторан проявляет антиоксидантные свойства, как в нативном состоянии спермиев, так и в условиях гипотермии и криоконсервации. Из полученных результатов следует, что антиоксидантный эффект проявляется сразу, на этапе образования первичных продуктов ПОЛ – диеновых и триеновых конъюгатов. Результаты определения активности супероксиддисмутазы свидетельствуют о достоверном снижении образования супероксидного анион-радикала в образцах содержащих эмульсию перфторан. Установлено, что сперма имеет довольно высокий свой антиоксидантный потенциал, который достоверно усиливается при добавлении в среду перфторана. Антиоксидантный эффект газотранспортного кровезаменителя проявляется сразу и остаётся на достаточно высоком уровне как после 6, так и после 12 часов инкубации. При замораживании-отогреве наблюдалось резкое снижение показателя АОА в контроле (48,3 %) по сравнению с опытными образцами (78,3 %). Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что во временном интервале 48 – 72 ч, под воздействием ПФ, спермии человека, полностью утилизировав фруктозу семенной плазмы, переходят на аэробный путь обмена и начинают активно метаболизировать кислород.

Несмотря на высокие показатели подвижности и переживаемости клеток после отогрева, данные наблюдения свидетельствуют, что после криоконсервации в сперме резко возрастают процессы ПОЛ.

Ключевые слова: газотранспортный кровезаменитель перфторан, спермии человека, гипотермия, криоконсервация, ПОЛ.

SUMMARY

Cherkashina I.V. “Influence of perftoran on functional characteristics of human sperm under hypothermia and cryopreservation”. - manuscript.

The thesis for scientific degree of a candidate's biological sciences on speciality 03.00.19 - cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2007.

The thesis is devoted to the study of influence of perftoran - perfluorocarbon blood substitute whith gas-transport function on human sperm motility, content of lactate, total antioxidant capacity score, content of conjugated dienes and of thiobarbituric acid-reactive substances, SOD-activity, under hypothermia and cryopreservation.

The results obtained allow to suggest that most efficient concentration of perftoran is 40 % v/v. It has been demonstrated, that perftoran adding to sperm enables to prolong the survival of cells under hypothermia up to 120 hrs.

The authors conclude that cryopreservation and hypothermia does enhance lipid peroxidation in human sperm. Perftoran acted as an antioxidant by decreasing the contents of conjugated dienes and of thiobarbituric acid-reactive substances. Obtained experimental data of motility and lactate content demonstrate that human spermatozoa may serve as facultative aerobs under certain condition capable of using oxygen to provide motility.

Key words: gas-transport blood substitute perftoran, human sperm, hypothermia, cryopreservation, lipid peroxidation.