НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ОРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ

Черенок Сергій Олексійович

УДК 547.03+547.562.4+547.241

Каліксаренфосфонові кислоти

02.00.03 – органічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Київ 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України.

Науковий керівник: член-кор. НАН України, доктор хімічних наук, професор

Кальченко Віталій Іванович

Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ,

завідувач відділу хімії фосфоранів

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

Пінчук Олександр Михайлович

Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ,

завідувач відділу фосфорорганічних сполук

кандидат хімічних наук

Сорочинський Олександр Євгенович

Інститут біоорганічної хімії

та нафтохімії НАН України, м.Київ,

старший науковий співробітник

Провідна установа: Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України,

м. Одеса.

Захист дисертації відбудеться “07” червня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.217.01 в Інституті органічної хімії НАН України за адресою 02660, м. Київ-94, вул. Мурманська, 5, факс (044) 573-26-43.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту органічної хімії НАН України.

Автореферат розісланий “26” квітня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор хімічних наук Вовк М.В.

ВСТУП

Актуальність проблеми. Каліксарени - макроциклічні сполуки, отримані циклоконденсацією фенолів з формальдегідом, - завдяки нанорозмірній чашоподібній структурі, мають перспективи біомедичного застосування. Біологічний потенціал каліксаренів обумовлений їх здатністю моделювати дію природних ензимів, зв’язуватись з активними сайтами протеїнів та ДНК, виконувати роль ліпофільних контейнерів для транспортування біологічно активних йонів і нейтральних органічних молекул через клітинні мембрани. Серед різноманіття біоактивних каліксаренів найбільш вивченими є каліксарени, функціоналізовані фрагментами сульфонової кислоти. Каліксаренсульфонати, завдяки зв’язуванню з багатими на аргінін та лізин специфічними сайтами білків, є антикоагулянтами та антитромботиками. Вони проявляють ензимінгібіторні та противірусні властивості. Каліксаренсульфонати є ефективними блокаторами кальцій-залежних хлоридних каналів біологічних клітин. Нещодавно каліксаренсульфонати запатентовані як рецептори для діагностики пріону.

На відміну від сульфокаліксаренів, каліксарени, функціоналізовані фрагментами фосфонових кислот, досліджені набагато менше. Фосфонові кислоти мають широкий спектр біологічної дії. Вони проявляють антибактеріальні, протипухлинні, гербіцидні та інші види біологічної активності. Фосфонові кислоти інгібують ферменти, каталізують перетворення моноалкілфосфатів в процесах біосинтезу. В останній час велика увага приділяється біологічній активності хіральних похідних фосфонових кислот, котра суттєво залежить від їх стереохімічної будови.

Таким чином, розміщення на каліксареновій платформі фрагментів фосфонових кислот, особливо хіральних, викликає значний інтерес з точки зору створення біоактивних сполук.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з тематикою відділу хімії фосфоранів “Дизайн, синтез та дослідження біоактивних каліксаренів” (№ держреєстрації 0102U000802) та в рамках програми НАН України “Новітні медико-біологічні проблеми та навколишнє середовище людини” за темами “Синтез і стереохімія фосфорильованих похідних каліксаренів та їх комплексоутворення з біологічно активними молекулами” (№ держреєстрації 0103U000612) та “Інгібітори неспецифічних фосфатаз: хімічний дизайн і механізми впливу в модельних біохімічних системах” (№ держреєстрації 0104U007742).

Метою роботи була розробка зручних синтетичних шляхів функціоналізації верхнього вінця каліксаренів різноманітними фрагментами фосфонових кислот, дослідження структури, стереохімії, комплексоутворення та фізіологічної активності отриманих сполук.

Завдання дослідження:

1)

2)

3)

4)

5)

Об’єкт дослідження – каліксаренфосфонові кислоти.

Предмет дослідження – розробка методів синтезу каліксаренфосфонових кислот.

Методи дослідження – органічний синтез, колонкова хроматографія, ЯМР спектроскопія, мас-спектроскопія, елементний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведеного дослідження розроблені методи синтезу амфіфільних каліксарен- дифосфонових та тетрафосфонових кислот, які містять два або чотири гідрофобні алкільні замісники (С10, C12) на нижньому вінці макроциклу.

Розроблені методи стереоселективного фосфорилювання диформілкаліксарену, які ведуть до утворення рацемічної або мезо форм каліксарен-біс-б-гідроксиметилфосфонової кислоти. При цьому показано, що приєднання натрієвих солей діалкілфосфітів до диформілкаліксарену йде з утворенням виключно мезо форми. В той же час, приєднання до диформілкаліксарену триалкілфосфітів в присутності хлористого водню приводить до утворення рацемічної форми з діастереоселективним надлишком 70-86 %.

Реакцією моноформіл- та диформілкаліксаренів з діалкілфосфітами в присутності надлишку металічного натрію синтезовані каліксаренмоно- та диметиленбісфосфонати. Встановлено, що реакція проходить постадійно через утворення каліксарен-біс-б-гідроксиметилфосфонатів та фосфорильованих хінонметидів.

Розроблені умови діастереоселективного приєднання (d.e. 80 – 95 %) діетилфосфіту до C=N зв’язку хіральних моноіміно- та діімінокалікс[4]аренів. Отримані індивідуальні RS, SR діастереомери каліксарен-моно-б-N-a-фенілетиламінометилфосфонатів та RSSR, SRRS діастереомери каліксарен-біс-б-N-a-фенілетиламінометилфосфонатів.

Каталітичним гідрогенолізом діастереомерів каліксарен-б-N-a-фенілетиламінометилфосфонатів отримані R і S енантіомери каліксарен- моно-a-амінометилфосфонатів та RR і SS діастереомери каліксарен-біс-a-амінометилфосфонатів. Реакцією отриманих сполук з триметилбромосиланом та метанолом синтезовані оптично чисті R і S енантіомери каліксарен-моно-б-амінометилфосфонової кислоти та RR і SS діастереомери каліксарен-біс-б-амінометилфосфонової кислоти.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені зручні методи синтезу каліксаренів, функціоналізованих по верхньому вінцю макроциклу фрагментами фосфонових, б-гідроксиметилфосфонових, б-амінометилфосфонових та метиленбісфосфонових кислот.

Амфіфільні каліксаренфосфонові кислоти утворюють на поверхні розподілу фаз вода-повітря стабільні ленгмюрівські плівки, здатні зв’язувати біологічно активні катіони K+, Na+, Ca2+ і Mg2+ з водної фази. Амфіфільні каліксаренфосфонові кислоти та їх солі утворюють наночастинки (d = 150-1200 нм) в водних розчинах та на поверхні розподілу фаз вода-повітря. Отримані амфіфільні каліксарени є перспективними сполуками для створення нових систем доставки ліків.

Каліксарен-біс-б-гідроксиметилфосфонові кислоти утворюють з амінокислотами та дипептидами еквімолярні комплекси, стійкість яких (lgK = 3.46 - 4.6) залежить як від стереохімічної конфігурації хіральних атомів вуглецю каліксарен-біс-б-гідроксиметилфосфонових кислот, так і від природи амінокислот.

Каліксарен-б-амінометилфосфонові кислоти та каліксарен- метиленбісфосфонові кислоти є ефективними інгібіторами лужних фосфатаз. RR-Каліксарен-біс-б-амінометилфосфонова кислота інгібує лужну фосфатазу з нирок свині в 50 разів сильніше, ніж ії SS енантіомер.

Отримані каліксаренфосфонові кислоти є перспективними сполуками для дизайну фізіологічно активних речовин та реагентів для біохімії і медицини.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено синтез 64 нових фосфоровмісних каліксаренів, аналіз спектральних даних, дослідження стереохімії отриманих сполук, комп’ютерне моделювання будови каліксаренів, а також узагальнення отриманих результатів.

Автор щиро вдячний: проф. В. Зеленкевичу та докторам А. Марцинович та Я. Познанському (Institute of Physical Chemistry PAS, Warsaw, Poland) за дослідження комплексоутворення каліксаренфосфонових кислот; доктору Е. Колеману (Institut de Biologie et Chimie des Prote?ines, Lyon, France) та дослідження тонких плівок каліксаренів; д.х.н. А.І. Вовку, к.х.н. О.В. Музичці та к.х.н. І. В. Муравйовій (Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України) за дослідження каліксаренфосфонових кислот як інгібіторів фосфатаз, професору Я. Ліпковському за рентгеноструктурні дослідження; к.х.н. А.В. Соловйову та к.х.н. О.В. Лукіну за проведення мас-спектрометричних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на XIX Українській конференції з органічної хімії (Львів, 2001), Міжнародному симпозіумі з хімії фосфору, присвяченому 100-річчю з дня народження академіка А.В. Кірсанова (Київ, 2002), ХХVIII Міжнародному симпозіумі з макроциклічної хімії (Гданськ, 2003), XVI Міжнародній конференції з хімії фосфору (Бірмінгем, 2004), XX Всеукраїнській конференції з органічної хімії (Одеса, 2004), Українсько-польсько-молдовському симпозіумі з супрамолекулярної хімії (Кишинів, 2005), XV Міжнародній конференції “Фізичні методи в координаційній та супрамолекулярній хімії” (Кишинів, 2006).

Публікації. За матеріалами роботи надруковано 7 статтей та тези 7 доповідей.

Обсяг та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 178 сторінках машинопису і складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків та списку літератури з 167 найменувань. Перший розділ містить огляд літератури з синтезу, дослідженню будови та властивостей хіральних фосфоровмісних каліксаренів. Власні дослідження автора представлені в наступних трьох розділах.

В другому розділі описані калікс[4]арени, функціоналізовані по верхньому вінцю макроциклу фрагментами фосфонових, б-гідроксиметилфосфонових, б-амінометилфосфонових та метиленбісфосфонових кислот, їх синтез, стереохімія, хімічні властивості. В третьому розділі описані рецепторні властивості каліксарен-б-гідроксифосфонових кислот по відношенню до амінокислот та дипептидів. В четвертому розділі представлені результати досліджень каліксаренфосфонових кислот як інгібіторів лужних фосфатаз.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

Амфіфільні каліксаренфосфонати

Каліксаренфосфонати 4-6 були отримані дією на бромокалікс[4]арени 1-3 три-ізопропілфосфіту в присутності NіBr2 (180 оС, 40 хв) з виходами 85-92 % (схема 1).

Схема 1

Амфіфільні каліксаренфосфонові кислоти 7-9 були одержані взаємодією каліксаренфосфонатів 4-6 з наступним алкоголізом силілових естерів метанолом (схема 1).

Кислоти 7-9 утворюють стійкі комплекси включення складу 1:1 з водою, метанолом, ацетоном, ацетонітрилом. Кислоти 7-9 не мають чітко визначеної точки плавлення, що може вказувати на наявність асоціатів в твердому стані.

Дослідження методом мас-спектроскопії підтвердило міжмолекулярну асоціацію каліксаренфосфонових кислот 7-9. Так, в мас-спектрах спостерігаються піки, що відповідають димерним структурам.

Конформація каліксаренфосфонових кислот 7-9 була досліджена методами ЯМР та комп'ютерного моделювання (HyperChem 7, PM3).

Для діалкоксикаліксаренфосфонових кислот 7, 8 спостерігається стереохімічно жорстка конформація сплощений конус, яка підтверджується наявністю двох дублетів АВ спінової системи аксіальних та екваторіальних протонів ArCH2Ar метиленових груп з константами спін-спінової взаємодії аксіальних та екваторіальних протонів 13 Гц та різницею їх хімічних зсувів Dd 0.6 – 0.7 м.ч.

Конформаційно мобільна конформація конус спостерігається для тетраалкілованих фосфонових кислот 9, що підтверджується наявністю двох дублетів АВ спінової системи аксіальних та екваторіальних протонів ArCH2Ar метиленових груп з константами спін-спінової взаємодії аксіальних та екваторіальних протонів 13 Гц та різницею їх хімічних зсувів Dd 1.1 – 1.2 м.ч.

Поверхнева взаємодія катіонів металів з мезосистемами амфіфільних каліксаренфосфонових кислот

В Інституті біології і хімії протеїнів (Ліон, Франція) була досліджена здатність синтезованих нами амфіфільних каліксарентетрафосфонових кислот 9b,c утворювати ліпідоподібні наночастинки.

Утворення молекулами 9b та 9c наночастинок вивчали методом динамічного розсіювання світла в чистій воді та в присутності різних концентрацій катіонів Na+, K+, Mg2+ і Ca2+. Противоіоном у всіх випадках виступав Cl- .

У чистій воді діаметри наночастинок склали 170 нм для 9b і 137 нм для 9c. У присутності моновалентних катіонів ніяких помітних змін у розмірі наночастинок у діапазоні концентрацій від 0.1 до 145 мМ не спостерігалося. В той же час, для катіонів Ca2+ та Mg2+, в діапазоні концентрації солі від 0.1 до 1 мМ, спостерігається зменшення діаметрів частинок від 170 нм у чистій воді для 9b до 118 нм при концентрації Ca2+ 1мМ та до 124 нм при концентрації Mg2+ 1 мМ. Для сполуки 9d відповідні значення були 137 нм у чистій воді, 104 нм при концентрації Са2+ 1 мМ, 119 нм при концентрації Mg2+ 1 мМ. Вище цих концентрацій спостерігається швидка агрегація і флокуляція. В усіх випадках при концентрації солей, вищих 3 мМ, розмір частинок був більшим 1 мm. Поведінку агрегатів двовалентних іонів можна пояснити з точки зору утворення сольових містків між гідроксифосфорильними групами на поверхні наночастинок.

Каліксарен-б-гідроксифосфонові кислоти

Мезо форми каліксарен-ді-б-гідроксифосфонатів 11-13 отримували взаємодією диформілкаліксарену 10 з діалкілфосфітами в присутності металічного натрію (реакція Абрамова) в розчині діоксану з виходом 80-85 % (схема 2).

При проведенні реакції в діоксані при температурі 14 оС в реакційній суміші утворювалися виключно мезо форми каліксарен-б-гідроксифосфонатів 11-13. Як побічні продукти утворювались каліксаренметиленбісфосфонати 33, 34, 37 з виходом 10-15%. Рацемічних форм каліксаренгідроксифосфонатів 15-17, а також продуктів характерного для гідроксифосфонатів фосфонат – фосфатного перегрупування, в реакційній суміші зафіксовано не було.

Схема 2

Рацемічні каліксарен-ді-б-гідроксифосфонати 15-17 були отримані взаємодією диформілкаліксарену 10 з триалкілфосфітами в розчині діоксану в присутності сухого хлороводню з виходом 65-70 % (схема 3).

Схема 3

Приєднання триалкілфосфітів до диформілкаліксарену 10 в присутності хлороводню проходить менш стереоселективно, ніж реакція Абрамова. В процесі реакції утворюється суміш рацемічної та мезо форм каліксарен-б-гідроксифосфонатів. В спектрах ЯМР 1Н, 31Р каліксаренгідроксифосфонатів спостерігаються сигнали обох форм. Найбільш характеристичними є сигнали РСН груп, які відрізняються не лише за хімічними зсувами, а також за константами спін-спінової взаємодії протон-фосфор. Відношення інтенсивності сигналів в спектрах ЯМР 31Р, що відповідають утвореним стереоізомерам, знаходиться в значній залежності як від розміру алкільних груп біля атома фосфору, так і від температури та концентрації хлороводню в реакційній суміші.

Вміст рацемічних каліксарен-б-гідроксифосфонатів 15-17 в реакційній суміші збільшується із збільшенням довжини алкільних фрагментів триалкілфосфіту та зниженням температури реакції. Найбільш оптимальною температурою для отримання рацемічних форм каліксаренгідроксифосфонатів є 10 оС. Подальше зниження температури веде до суттєвого збільшення часу реакції та практично не впливає на ії стереоселективність.

Таким чином, вдалося досягти вмісту рацемічних форм каліксарен-біс-б-гідроксифосфонатів в реакційній суміші до 81-93 %. Чисті рацемічні форми каліксарен-б-гідроксифосфонатів були отримані кристалізацією з циклогексану.

Рацемічну та мезо форму каліксарен-б-гідроксифосфонатів легко розрізнити за аналізом сигналів протонів незаміщених фенольних ядер в ПМР спектрах. Завдяки осі С2, в ПМР спектрах рацемічних форм каліксаренгідроксифосфонатів спостерігаються три дублети дублетів протонів незаміщених фенольних груп. Мезо форма каліксаренгідроксифосфонатів має площину симетрії, і в спектрах ПМР спостерігаються два дублети та два триплети сигналів протонів незаміщених фенольних ядер.

У спектрах ПМР каліксаренгідроксифосфонатів 11-13, 15-17 спостерігаються два дублети аксіальних та два дублети екваторіальних протонів. Різниця хімічних зсувів між аксіальними та екваторіальними протонами Dd складає 0.85-0.87 м.ч., що свідчить про конформацію каліксарен-б-гідроксифосфонатів 11-13, 15-17 сплощений конус.

Діастереомерно чисті мезо та рацемічна форми каліксарен- гідроксифосфонових кислот 14, 18 були отримані взаємодією відповідних естерів 11, 17 з триметилбромосиланом та наступним розкладом силілових естерів, що утворилися, метанолом (схеми 2,3). Виходи каліксаренгідроксифосфонових кислот на даній стадії становили 90-95 %.

Будова сполук 14, 18 підтверджена методами ЯМР 1Н, 31Р та мас-спектроскопії. В розчинах ДМСО в спектрах ПМР каліксарен- гідроксифосфонових кислот 14, 18 спостерігаються широкі сигнали внаслідок їх асоціації у розчинах, в той час як в спектрах ПМР цих сполук в дейтерометанолі спостерігаються вузькі сигнали всіх характеристичних груп. В спектрах ПМР каліксаренгідроксифосфонових кислот 14, 18 сигнали метиленових груп ArCH2Ar проявляються як два дублети аксіальних та екваторіальних протонів спінової системи АВ (13 Гц) з різницею хімічних зсувів між ними Dd 0.85-0.9 м.ч. Це свідчить про те, що каліксарен-б-гідроксифосфонові кислоти 14, 18 перебувають в конформації сплощений конус, яка є характерною і для вихідних естерів 11, 17. Для кислот 14, 18 спостерігається міжмолекулярна асоціація за рахунок утворення міжмолекулярних водневих зв’язків. Дослідження методом мас-спектроскопії підтвердило міжмолекулярну асоціацію каліксаренгідроксифосфонових кислот 14, 18. Так, в мас-спектрах зафіксовані піки (M = 1458.6), що відповідають димерним структурам.

Каліксаренметиленбісфосфонові кислоти

Основним методом синтезу похідних метиленбісфосфонових кислот є реакція Арбузова гемінальних дигалогеналканів з триалкілфосфітами та наступний гідроліз отриманих естерів. Однак, у випадку синтезу каліксаренметиленбісфосфонових кислот 31, 42 цей метод обмежений доступністю відповідних дигалогеналкільних похідних каліксаренів.

Разом з тим, у літературі описана досить екзотична реакція приєднання двох молекул діалкілфосфіту до 4-гідрокси-3,5-ди-трет-бутилбензальдегіду в присутності діізопропіламіну. Ця реакція приводить до 4-гідрокси-3,5-ди-трет-бутилфенілметиленбісфосфонату з помірними виходами.

З огляду на доступність моноформіл- і диформілкаліксаренів 28, 10 було вирішено адаптувати цей підхід до синтезу каліксаренметиленбісфосфонових кислот.

На першому етапі даний підхід був випробуваний і оптимізований на модельному 4-гідроксибензальдегіді 19 (схема 4). Досягти успіху вдалося при використанні замість діізопропіламіну більш сильної основи-металічного натрію.

Схема 4

При взаємодії 4-гідроксибензальдегіду з великим надлишком натрієвих солей діалкілфосфітів, отриманих in situ, в розчинах діалкілфосфітів при кімнатній температурі легко утворюються 4-гідроксифенілбісфосфонати 22-26. Виходи бісфосфонатів 22-26 практично кількісні. Швидкість реакції в значній мірі залежить від природи діалкілфосфіту. При переході від диметилфосфіту до дибутилфосфіту тривалість реакції зростає з 24 до 72 год (t = 20 оC).

Перша стадія – приєднання фосфіту до альдегіду по зв’язку С=O відбувається за класичною схемою реакції Абрамова з утворенням б-гідроксифосфонатів 20. Далі б-гідроксифосфонати під дією натрієвої солі діетилфосфіту відщеплюють молекулу води з утворенням як проміжної сполуки високореакційноздатного фосфорильованого хінонметиду 21. Хінонметид 21 далі реагує з діалкілфосфітами за схемою 1,4-приєднання з утворенням бісфосфонатів 22-26. Слід зазначити, що бензальдегід, а також 4-метоксибензальдегід, які не здатні утворювати хінонметиди, в даних умовах реагують за класичною схемою реакції Абрамова – б-гідроксифосфонати, що утворюються на першій стадії, ізомеризуються далі в бензилфосфати. Продуктів фосфонат-фосфатного перегрупування у випадку одержання метиленбісфосфонатів 22-26 зафіксовано не було, що пов’язано з більш швидким перетворенням гідроксифосфонатів 20 в хінонметиди 21.

Розроблений метод бісфосфорилювання гідроксибензальдегіду виявився прийнятним для формілкаліксаренів 10, 28. При взаємодії формілкаліксаренів 10, 28 з натрієвими солями діалкілфосфітів в розчині діалкілфосфітів при кімнатній температурі протягом 48 годин практично кількісно утворюються метиленбісфосфонати 30, 33-37 (схема 5). При використанні на першій стадії реакції дибутилфосфіноксиду, а на другій стадії – діалкілфосфітів, були отримані каліксарени 38, 39, які містять біля одного метиленового вуглецю два різних за природою фосфорильних замісники.

Схема 5

Каліксаренгідроксифосфіноксид 32 - менш реакційноздатний, ніж гідроксифосфонати 11-13, 29. Він повільно реагує з натрієвими солями діалкілфосфітів з утворенням каліксаренфосфонатофосфіноксидів 38, 39 та вкрай повільно взаємодіє з натрієвою сіллю дибутилфосфіноксиду. При нагріванні диформілкаліксарену 10 з надлишком натрієвої солі дибутилфосфіноксиду в діоксані протягом 24 днів при температурі 70 оС в реакційній суміші методом ПМР був зафіксований симетричний каліксаренбісфосфіноксид 40, вихід якого складав всього 10 %. Молекулярний пік сполуки 40 (М=1177.6) був зафіксований також у мас-спектрі реакційної суміші. В індивідуальному стані каліксаренбісфосфіноксид виділити не вдалось

Каліксаренметиленбісфонові кислоти 31, 41, 42 були отримані взаємодією алкілових естерів 30, 34, 38 з триметилбромосиланом та наступним розкладом проміжних силілових естерів метанолом (схема 5).

Кислоти 31, 41, 42 – безбарвні кристалічні сполуки, добре розчинні в лужних водних розчинах, спиртах, ДМСО. Кислоти 31, 41, 42 не мають чітко визначеної точки плавлення, що може вказувати на наявність ассоціатів в твердому стані.

Асиметричний синтез каліксарен-б-амінофосфонових кислот

Асиметричний синтез каліксарен-б-амінофосфонових кислот був здійснений за схемою 6. На першій стадії хіральні моно- та діімінокалікс[4]арени 43, 47 були синтезовані конденсацією стехіометричних кількостей формілкалікс[4]аренів 10, 28 з оптичними антиподами б-фенілетиламіну в киплячому м-ксилолі над молекулярними ситами.

Схема 6

Каліксарени 44, які містять хіральні діетоксифосфоніламінометильні групи на верхньому вінці макроциклу, були отримані взаємодією хіральних моноімінокаліксаренів 43 з надлишком натрієвої солі діетилфосфіту в розчині діетилфосфіту з виходом 80-85%.

Хіральні каліксарени 48, які містять дві діетоксифосфоніламінометильні групи на верхньому вінці макроциклу, були отримані взаємодією хіральних діімінокаліксаренів 47 з надлишком натрієвої солі діетилфосфіту в розчині діетилфосфіту з виходами 71-77 %

Для отримання діалкоксифосфоніл-a-амінометильних похідних калікс[4]аренів хіральні фенілетильні замісники сполук 44, 48 видалялись гідрогенолізом в розчині метанолу на каталізаторі Pd/C з утворенням R- або S-енантіомерів, і RR- або SS-діастереомерів етилових естерів моно- або біс-амінофосфонових кислот 45, 49 відповідно. Виходи каліксаренамінофосфонатів 45, 49 становили 80-90 %.

Оптично активні каліксарен-б-амінофосфонові кислоти 46, 50 були отримані взаємодією оптичних антиподів каліксаренамінофосфонатів 45, 49 з триметилбромосиланом та наступним алкоголізом силілових естерів метанолом.

Будова сполук 46, 50 підтверджена методами ЯМР 1Н , 31Р, мас-спектроскопії та поляриметрії. Сигнали фосфору каліксаренамінофосфонових кислот 46, 50 знаходяться в області 14-16 м.ч. Кути обертання оптично чистих моно- та дизаміщених каліксаренамінофосфонових кислот складають +18o, -18o (46a та 46b), та -12o, +12о (50a та 50b), відповідно.

В розчинах амінофосфонові кислоти знаходяться в конформаційно жорсткій конформації сплощений конус, що підтверджується наявністю двох дублетів АВ спінової системи аксіальних та екваторіальних протонів ArCH2Ar метиленових груп з константами спін-спінової взаємодії аксіальних та екваторіальних протонів 13 Гц та різницею їх хімічних зсувів Dd 0.7 – 0.8 м.ч.

Для кислот 46, 50 характерною є міжмолекулярна асоціація за рахунок утворення міжмолекулярних водневих зв’язків.

Комплексоутворення каліксаренгідроксифосфонових кислот з амінокислотами та дипептидами Робота виконана в співробітництві з Інститутом фізичної хімії Польської академії наук

Методом калориметричного титрування та комп’ютерного моделювання досліджено комплексоутворення рацемічної форми каліксаренгідроксифосфонової кислоти 18 та еквівалентної суміші мезо та рацемічної форми (50:50) з серією амінокислот та дипептидів.

Константи зв’язування амінокислот та дипептидів знаходяться в діапазоні lgK = 3.46 - 4.6 та залежать як від стереохімічної конфігурації хіральних атомів вуглецю каліксарен-біс-б-гідроксифосфонових кислот, так і від природи амінокислот та дипептидів.

Значні від’ємні значення ДHo вказують на домінантну роль електростатичних взаємодій між депротонованою негативно зарядженою фосфорильною групою каліксарену та позитивно зарядженим NH3+ фрагментом амінокислоти в формі цвітер-іона. Незначний тепловий ефект, отриманий при титруванні N-захищених амінокислот каліксаренами, вказує на те, що NH3+ амонійна група є головним учасником процесу комплексоутворення та керує утворенням комплексів каліксарен-амінокислота.

Збільшення довжини аліфатичних фрагментів амінокислот приводить до росту констант зв'язування.

В усіх випадках рацемічна форма каліксаренгідроксифосфонової кислоти 18 зв’язує амінокислоти ліпше, ніж це робить суміш рацемічної та мезо форми.

Калікс[4]аренфосфонові кислоти як інгібітори лужних фосфатаз Дослідження каліксаренфосфонових кислот як інгібіторів лужних фосфатаз проводилось в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України під керівництвом д.х.н. Вовка А.І.

а) Інгібування лужної фосфатази з кишок теляти

Вплив каліксаренбісфосфонових кислот та їх немакроциклічних аналогів на активність лужних фосфатаз досліджували, вивчаючи кінетику ферментативного гідролізу п-нітрофенілфосфату (табл. 1).

Вплив каліксаренів 31, 34, 42 на лужну фосфатазу з кишок теляти описувався закономірностями змішаного або частково змішаного інгібування.

Таблиця 1

Константи інгібування лужної фосфатази з кишок теляти

Сполука | Ki , мкМ | Ki, мкМ

метиленбісфосфонова кислота | 675 | 750100

27 | 224 | 290110

31 | 25 | 46

42 | 0.38 | 2.8

34 | 820180 | 85002100

Значення Kм 369 мкМ, Ki - константа дисоціації комплексу ензим-інгібітор; Ki - константа дисоціації комплексу ензим-субстрат-інгібітор

Значення констант Ki і Ki суттєво знижуються при переході від метиленбісфосфонової кислоти та модельної сполуки 27 до фосфорильованого каліксарену 31. Подальше значне збільшення ефективності інгібування спостерігається при введенні в структуру калікс[4]арену двох фрагментів метиленбісфосфонової кислоти.

б) Інгібування лужної фосфатази з нирок свині

Вплив сполук 46, 50 на лужну фосфатазу з нирок свині описаний закономірностями змішаного або частково змішаного інгібування (табл. 2)

Таблиця 2

Константи інгібування (мкM) лужної фосфатази з нирок свині сполуками 46, 50 та вільні енергії утворення комплексів ензим-інгібітор ДG, ккал/моль).

Інгібітор | Ki | Ki | ДG | (S)-4-гідроксибензил б-амінофосфонова кислота | 580 110 | 6800 840 | -4.4 | 46a | 73 13 | 540 90 | -5.6 | 46b | 32 5 | 780 100 | -6.1 | 50a | 1.7 3 | 130 30 | -7.8 | 50b | 86 11 | 610 210 | -5.5 |

ДG = -RT ln (Ki-1); Ki - константа дисоціації комплексу ензим-інгібітор; Ki - константа дисоціації комплексу ензим-субстрат-інгібітор

Рівень інгібування лужної фосфатази з нирок свині сполуками 46, 50 виявився чутливим до абсолютної конфігурації хірального атома вуглецю каліксарен-б-амінофосфонових кислот. Значення Ki для ізомера 46b в два рази менше, ніж спостерігалося для ізомера 46a. В той же час, енантіоселективність інгібування суттєво підвищувалася в випадку каліксарен-біс-б-амінофосфонових кислот 50. Зокрема, (RR) енантіомер 50a інгібує лужну фосфатазу з нирок свині в 50 разів сильніше, ніж його (SS) енантіомер 50b. Це відповідає збільшенню вільної енергії комплексів на 2.3 ккал/моль.

Сила взаємодій ензим-інгібітор визначається як ефектом каліксаренової платформи, так і хіральним оточенням активного центру лужної фосфатази. Наскільки нам відомо, каліксаренамінофосфонова кислота 50а є першим інгібітором лужної фосфатази, яка взаємодіє з ензимом при мікромолярній концентрації. Таким чином, передорганізація двох фрагментів б-амінофосфонових кислот на платформі калікс[4]арену викликає значне збільшення інгібування лужної фосфатази.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Cherenok S., Dutasta J.-P., Kalchenko V. Phosphorus-containing chiral macrocycles // Current Organic Chemistry.-2006.-Vol.10.-P. 2307-2331. (Здобувачем здійснено збір, класифікацію та аналіз літературних джерел, підготовку таблиць, схем та робочого варіанту статті).

2. Houel E., Lazar A., Da Silva E., Coleman A.W., Solovyov A., Cherenok S., Kalchenko V. Interfacial interaction of cations with amphiphilic dihydroxyphosphonylcalix[4]arene mesosystems // Langmuir.-2002.-Vol. 18.-P. 1374-1379. (Здобувачем здійснено синтез амфіфільних каліксаренфосфонових кислот, проаналізовано спектральні дані отриманих сполук).

3. Vovk A.I., Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Kukhar V.P., Muzychka O.V., Lozynsky M.O. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as calf intestine alkaline phosphatase inhibitors // Org. Biomol. Chem.-2004.-Vol.2.-P.3162 – 3166. (Здобувачем здійснено синтез вихідних сполук та цільових каліксаренбісфосфонових кислот, аналіз спектральних даних отриманих сполук, підготовку робочого варіанту статті).

4. Zielenkiewicz W., Marcinowicz A., Poznan?ski J., Cherenok S., Kalchenko V. Complexation of isoleucine by phosphorylated calix[4]arene in methanol followed by calorimetry, NMR and UV–VIS spectroscopies, and molecular modelling methods // Journal of Molecular Liquids.-2005.-Vol.121.-P.8-14. (Здобувачем здійснено синтез вихідних речовин та цільової каліксарен-біс-б-гідроксифосфонової кислоти, аналіз спектральних даних отриманих сполук).

5. Cherenok S., Vovk A., Muravyova I., Shivanyuk A., Kukhar V., Lipkowski J., Kalchenko V. Calix[4]arene б-Aminophosphonic Acids: Asymmetric Synthesis and Enantioselective Inhibition of Alkaline Phosphatases // Organic Letters.– 2006.–Vol.8.– P.549-552. (Здобувачем здійснено синтез вихідних речовин та цільових каліксарен-б-амінофосфонових кислот, аналіз спектральних даних отриманих сполук, підготовку робочого варіанту статті).

6. Zielenkiewicz W., Marcinowicz A., Cherenok S., Kalchenko V., Poznan?ski J. Phosphorylated calixarenes as receptors of L-amino acids and dipeptides: calorimetric determination of Gibbs energy, enthalpy and entropy of complexation // Supramolecular Chemistry.– 2006.– Vol.18. – P.167-176. (Здобувачем здійснено синтез діастереомерно чистих каліксарен-біс-б-гідроксифосфонових кислот, аналіз спектральних даних отриманих сполук)

7. Zielenkiewicz W., Marcinowicz A., Poznan?ski J., Cherenok S., Kalchenko V. Calorimetric, NMR and UV investigations of aliphatic L-amino acids complexation by calix[4]arene bis-hydroxymethylphosphonous acid. // J. Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry.–2006.– Vol.55.– P.11-19. (Здобувачем здійснено синтез рацемічної форми каліксарен-біс-б-гідроксифосфонової кислоти, аналіз спектральних даних отриманих сполук).

8. Kalchenko V., Cherenok S., Solovyov A., Muzychka O., Vovk A., Kukhar V. Bio-relevant calixarene phosphonic asids // 16-International Conference on Phosphorus Chemistry. Abstracts.-Birmingham, UK, 2004.-P. 84.

9. Черенок С., Кальченко О., Кальченко В., Мартинович A., Познанський Я., Зеленкевич В. Синтез та комплексоутворення каліксаренфосфонових кислот з амінокислотами // ХХ Українська конференція з органічної хімії. Зб. тез. - Одеса, 2004. – С. 584.

10. Cherenok S., Boyko V., Yakovenko A., Kalchenko O., Kalchenko V. Chiral calixarene receptors // Moldavian-Polish-Ukrainian Symposium on Supramolecular Chemistry. Abstracts.-Chishinau, 2005.-P. 59.

11. Cherenok S., Vovk A., Muravyova I., Marcinowicz A., Poznanski J., Kukhar V., Zelenkiewicz W., Kalchenko V. Bio-relevant derivatives of calixarene phosphonic acids // Moldavian-Polish-Ukrainian Symposium on Supramolecular Chemistry, Abstracts.-Chishinau, 2005.-P. 23.

Анотація

Черенок С.О. Каліксаренфосфонові кислоти. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.03 – органічна хімія. Інститут органічної хімії НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена функціоналізації верхнього вінця каліксаренів фрагментами фосфонових, б-гідроксиметилфосфонових, б-амінометилфосфонових та метиленбісфосфонових кислот, дослідженню їх структури, стереохімії, комплексоутворення та фізіологічної активності отриманих сполук.

Показано, що утворення каліксаренбісфосфонатів проходить постадійно через стадії утворення каліксарен-б-гідроксиметилфосфонатів та фосфорильованих хінонметидів.

Встановлено, що амфіфільні каліксаренфосфонові кислоти та їх солі утворюють наночастинки (d=150-1200 нм) в водних розчинах та на поверхні розподілу фаз вода-повітря. Вивчено комплексоутворення каліксарен-біс-б-гідроксифосфонових кислот з амінокислотами та дипептидами. Показано, що ефективність зв’язування амінокислот (lgK = 3.46 - 4.6) залежить як від стереохімічної конфігурації хіральних атомів вуглецю каліксарен-біс-б-гідроксифосфонових кислот, так і від природи амінокислот. Каліксарен-б-амінометилфосфонові кислоти та каліксаренметиленбісфосфонові кислоти є ефективними інгібіторами лужних фосфатаз. Встановлено, що RR-каліксарен-біс-б-амінометилфосфонова кислота інгібує лужну фосфатазу з нирок свині в 50 разів сильніше, ніж ії SS-енантіомер.

Ключові слова: каліксарени, фосфорилювання, комплексоутворення, інгібування, діастереоселективний синтез.

Аннотация

Черенок С.А. Каликсаренфосфоновые кислоты. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.03 – органическая химия. Институт органической химии Национальной академии наук Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена разработке удобных методов функционализации каликсаренов фрагментами фосфоновых, б-гидроксиметилфосфоновых, б-аминометилфосфоновых и метиленбисфосфонових кислот, исследованию их структуры, стереохимии, комплексообразования и физиологической активности.

В результате проведенного исследования разработаны удобные методы синтеза амфифильных каликсарендифосфоновых и тетрафосфоновых кислот, содержащих два или четыре гидрофобных алкильных заместителя (С10, C12) на нижнем ободе макроцикла.

Разработаны методы стереоселективного фосфорилирования диформилкаликсарена, которые ведут к образованию рацемической и мезо форм каликсарен-бис-б-гидроксиметилфосфоновой кислоты. При этом показано, что присоединение натриевых солей диалкилфосфитов к диформилкаликсарену идет с образованием исключительно мезо формы. В то же время, присоединение к диформилкаликсарену триалкилфосфитов в присутствии хлористого водорода приводит к образованию рацемических форм с диастереоселективным избытком 70-86 %.

Реакцией моно- и диформилкаликсаренов с диалкилфосфитами в присутствии избытка металлического натрия синтезированы каликсарен- моно- и диметиленбисфосфонаты. Установлено, что реакция проходит постадийно через образование каликсарен-бис-б-гидроксиметилфосфонатов и фосфорилированных хинонметидов.

Разработаны условия диастереоселективного присоединения (d.e. 80-95 %) диэтилфосфита к C=N связи хиральных моноимино- и дииминокаликс[4]аренов. Получены индивидуальные RS и SR диастереомеры каликсарен-моно-б-N-б-фенилэтиламинометилфосфонатов, а также RSSR и SRRS диастереомеры каликсарен-бис-б-N-б-фенилэтиламинометилфосфонатов. Каталитическим гидрогенолизом диастереомеров каликсарен-б-N-б-фенилэтиламино-метилфосфонатов получены R и S энантиомеры каликсарен-моно-б-аминометилфосфонатов, а также RR и SS диастереомеры каликсарен-бис-б-аминометилфосфонатов. Реакцией полученных соединений с триметилбромосиланом и метанолом синтезированы оптически чистые R и S энантиомеры каликсарен-моно-б-аминометилфосфоновой кислоты и RR и SS диастереомеры каликсарен- бис-б-аминометилфосфоновой кислоты.

Установлено, что амфифильные каликсаренфосфоновые кислоты образуют на поверхности раздела фаз вода-воздух стабильные ленгмюровские плёнки, способные связывать биологически активные катионы K+, Na+, Ca2+ и Mg2+ из водной фазы. Методом динамического рассеяния света и микроскопии атомных сил показано, что амфифильные каликсаренфосфоновые кислоты и их соли образуют наночастицы (d = 150-1200 нм) в водных растворах и на поверхности раздела фаз вода-воздух. Полученные амфифильные каликсарены - перспективные соединения для создания новых систем доставки лекарств.

Методом калориметрического титрования и компьютерным моделированием изучено комплексообразование каликсарен-бис-б-гидроксиметилфосфоновых кислот с аминокислотами и дипептидами. Показано, что эффективность связывания аминокислот (lgК = 3.46 - 4.6) зависит как от стереохимической конфигурации хиральных атомов углерода каликсарен-бис-б-гидроксиметилфосфоновых кислот, так и от природы аминокислот.

Показано, что каликсарен-б-аминометилфосфоновые кислоты и каликсаренметиленбисфосфоновые кислоты являются эффективными ингибиторами щелочных фосфатаз. Установлено, что RR-каликсарен-бис-б-аминометилфосфоновая кислота ингибирует щелочную фосфатазу из почек свиньи в 50 раз сильнее, чем её SS энантиомер.

Полученные каликсаренфосфоновые кислоты - перспективные соединения для дизайна физиологически активных веществ и реагентов для биохимии и медицины.

Ключевые слова: каликсарены, фосфорилирование, комплексообразование, ингибирование, диастереоселективный синтез.

Summary

Cherenok S.O. Calixarenphosphonous asids. – Manuscript.

Thesis of Candidate of Sciences’s dissertation (eq. PhD) on speciality 02.00.03 – organic chemistry. Institute of Organic Chemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

The dissertation deals with the functionalization of calixarenes with phosphonic, б-hydroxyphosphonic, б-aminophosphonic and methylenebisphosphonic fragments at the wide rim of the macrocycle as well as structural, stereochemical, binding and biochemical studies of the compounds obtained.

Itestablished that the calixarene-б-hydroxyphosphonates and highly reactive phosphorylated quinonemethydes arein the synthesis of the calixarenebisphosphonates.

It was shown the amphiphilic calixarenephosphonic acids and their salts form nanoparticles (d=150-1200 nm) in aqueous solutions and on the air-water interphase. Binding properties of calixarene-б-hydroxyphosphonic acids towards aminoacids and dipeptides were studied. Binding of aminoacids depends on stereochemical configuration of calixarene-bis-б-hydroxyphosphonic acids and on the nature of the substrates. Calixareneaminomethylphosphonic acids and calixarenemethylenebisphosphonic acids are efficient inhibitors of alkali phosphatases. It was found that the RR-calixarene-bis-б-aminophosphonic acid inhibits the porcine kidney phosphatase 50 times stronger than its SS enantiomer.

Key words: Calixarenes, phosphorylation, complexation, inhibition, diastereoselective synthesis.