Київський національний університет

Імені Тараса Шевченка

Цейслєр Юлія Вадимівна

УДК 577.322.7:57.04:537.8

Вплив магнітних полів наднизької частоти на структурно-функціональні властивості глобулярних білків

03.00.02 – біофізика

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри біофізики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Темур'янц Наталія Арменаківна,

кафедра фізіології людини і тварин і біофізики

Таврійського національного університету

імені В.І. Вернадського МОН України

доктор медичних наук, професор

Думанський Юрій Данилович

Інститут гігієни та медичної екології

ім. Марзаєва АМН України,

завідувач лабораторії гігієни електромагнітного випромінювання

Захист відбудеться “19” 09 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, Київ -33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Україна, м. Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий “15”_08__ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми дисертаційної роботи. На даний час все більшу актуальність набуває проблема впливу змінних магнітних полів (ЗМП) на організм людини і тварин як одного з глобальних екологічних факторів, пов’язаного з небезпекою “електромагнітного забруднення” середовища (Думанский Ю.Д. та інш., 2003, Гатовский С.И. та інш., 1998). Також становить інтерес вивчення біологічної дії ЗМП з характеристиками, які є близькими до природних електромагнітних випромінювань. Достовірно встановлено високу біологічну активність наднизькочастотних електромагнітних полів (ННЧ ЕМП), які характеризуються високою проникаючою здатністю на всіх рівнях організації живих систем і викликають функціональні зміни в багатьох фізіологічних процесах (Темур'янц Н.А. та інш., 1992; Холодов Ю.А. та інш. 1992; Klitzing L., 1992; Lednev V.V., 2004). Отже, гігієнічна оцінка магнітних полів (МП) і з’ясування механізмів їх впливу на живі організми є важливим завданням сучасної біології і медицини.

Результати досліджень первинних механізмів впливу ЗМП ННЧ на біологічні об’єкти призвели до формування цілого ряду незалежних гіпотез, які намагаються пояснити окремі квазірезонансні ефекти впливу ЗМП на молекулярному і клітинному рівнях (Аксенов С.И., 2004; Бинги В.Н., 1995; Lednev V.V., 1991; Liboff A.R., 1998). Проте, слід відмітити, що молекулярні механізми впливу ЕМП на біологічні системи залишаються нез’ясованими у зв’язку з відсутністю єдиного об’єктивного і науково- теоретичного пояснення широкого спектру біологічних ефектів, що спостерігаються. Згідно уявлень окремих дослідників щодо механізмів біологічних ефектів слабких ЕМП, первинними акцепторами впливу даного фізичного фактору є клітинні і молекулярні структури (білки, хроматин, біологічні мембрани, мітохондрії тощо) (Белова Н.А. та інш., 2000; Калиновський П.С., 2005). Ці структури знаходяться в клітині у постійному контакті з водною фазою. Саме роль води в біологічних ефектах ЕМП виявляється суттєвою і багатогранною, завдяки тому, що природні макромолекули і оточуюча їх вода формують єдину систему, яка не може бути розділеною на компоненти без руйнування її суті (Бецкий О.В. та інш. 2003). Це обумовлює залежність поведінки макромолекул від дії електромагнітного поля опосередковано через водне оточення. Внаслідок цього стає можливою зміна гідрофобних взаємодій, які відіграють важливу роль в організації просторової структури білкових молекул та інших клітинних структур при дії МП (Martynyuk V.S., Panov D.A., 2004), формуванні молекулярних асоциатів, що впливає на динамічну поведінку і функціонування біополімерів. Таким чином, можна очікувати, що внаслідок індукованих ЗМП змін властивостей водної фази буде змінюватися поведінка неполярних речовин, що знаходяться в ній і в певній кількості розчиняються. Окремі експериментальні дані свідчать про можливість такого впливу (Классен В.И.,1982; Мартинюк В.С. та інш., 1999, 2005). Враховуючи наведене вище, є актуальним з’ясування механізмів дії ЗМП ННЧ на структурно-функціональні властивості білкових молекул в умовах їх зв’язування з низькомолекулярними речовинами гідрофобної природи. Дослідження ефектів ЗМП НЧ малої інтенсивності, використовуючи підхід, у рамках якого динамічна структура води є головною первинною мішенню дії ЗМП, що опосередковує великий спектр біологічних ефектів, наблизить нас до розуміння первинних механізмів дії МП і дозволить отримати нову інформацію про зміни біологічної активності таких важливих макромолекул, як білки.

Зв’язок роботи з програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка на кафедрі біофізики у межах державної теми № 01БФ036-07 “Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів в збудливих біологічних системах”.

Мета дослідження - вивчення впливу магнітного поля ННЧ на структурно-функціональні особливості окремих глобулярних білків в умовах їх взаємодії з низькомолекулярними гідрофобними речовинами.

Завдання дослідження:

1. Дослідити вплив ЗМП ННЧ на оптичні характеристики гемоглобіну, метгемоглобіну, цитохрому с і сироваткового альбуміну;

2. Вивчити вплив ЗМП ННЧ на структурні зміни гемоглобіну, метгемоглобіну, цитохрому с і сироваткового альбуміну в умовах їх взаємодії з неспецифічними гідрофобними лігандами – хлороформом і бензолом;

3. Дослідити вплив ЗМП ННЧ на ренатурацію метгемоглобіну в умовах його взаємодії з гідрофобними лігандами і без неї;

4. Вивчити залежність флуоресцентних властивостей сироваткового альбуміну від частотних характеристик ЗМП ННЧ.

Об’єктом дослідження були глобулярні білки з різними особливостями просторової структури: гемоглобін - олігомірний б-спіральний гемопротеїд (М=64.5 кДа); метгемоглобін – гемоглобін зі ступенем окиснення заліза у гемі Fe3+, якій відрізняється від гемоглобіну певними змінами у просторовій структурі (М=64.5 кДа); цитохром с - невеликий за розміром (М=13.3 кДа) переважно б-спіральний гемопротеїд з невеликою кількістю в-складчастої структури; сироватковий альбумін - простий білок (М=67 кДа) з 48% б -спіралей, 15% в-складок і 37% неупорядкованих рухливих петель.

Предметом дослідження були зміни структурних властивостей білків під впливом електромагнітних полів наднизької частоти в умовах відсутності та наявності речовин гідрофобної природи.

Методичні прийоми та методи дослідження: біофізичні (методи абсорбційної і диференційної спектроскопії, аналітичний електрофорез, флуоресцентні методи, моделювання ЗМП в області наднизьких частот, метод фіктивного впливу ЗМП), біохімічні (методи кислотної денатурації та лужної ренатурації білків, визначення окиснювальної здатності ферменту), математичні (стандартні методи варіаційної статистики для обробки результатів).

Наукова новизна отриманих результатів полягає в тому, що вперше на прикладі гемоглобіну, метгемоглобіну, цитохрому с і сироватковому альбуміну в умовах їх взаємодії з гідрофобними сполуками (бензолом і хлороформом) досліджено вплив МП частотою 8 Гц на спектральні характеристики білків.

На прикладі метгемоглобіну вперше досліджено вплив гідрофобних сполук, ЗМП ННЧ та їх комбінації на ренатурацію і показано, що МП підсилює денатурацію білку, викликану неполярними речовинами. Вперше досліджено вплив МП ННЧ і хлороформу на окиснювальну здатність цитохрому с і показано, що МП прискорює зв’язування хлороформу білком і знижує каталітичну активність білка. Вперше досліджено комбінований вплив ЗМП ННЧ і гідрофобних сполук на власну флуоресценцію сироваткового альбуміну і встановлено залежність змін інтенсивності флуоресценції цього білку від частоти магнітного поля.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів

Отримані результати дослідження розширюють сучасні уявлення про молекулярні механізми дії ЗМП на білкові об’єкти і є новими доказами правильності гіпотези про те, що гідрофобні взаємодії в біологічних структурах можуть бути важливою ланкою у первинних механізмах дії ЗМП ННЧ.

Враховуючи той факт, що забруднення навколишнього середовища призводить до потрапляння в організм людини і тварин багатокомпонентних сумішей, що вмістять гідрофобні складові, а також те, що багато біологічно активних речовин, які широко використовують у сучасній медицині та фармакології, є гідрофобними за своєю природою, отримані результати мають практичне і теоретичне значення для уточнення біологічної активності гідрофобних сполук в умовах впливу магнітного поля наднизьких частот і можуть бути використані при розробці стандартів гігієнічного нормування.

Методи і методичні підходи, що були застосовані у дисертаційній роботі, використовуються в лабораторному практикумі зі спецкурсу “Фізико-хімічні методи дослідження в біофізиці”, що викладається на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок автора дисертації полягає у самостійному дослідженні і узагальнені літературних даних, проведенні основної експериментальної частини роботи і статистичної обробки отриманих експериментальних результатів. Постановка мети та завдань дослідження здійснювалась при участі наукового керівника. Спільно з докторантом кафедри біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка Мартинюком В.С. проведені дослідження і інтерпретація отриманих результатів біологічної дії ЗМП ННЧ на спектральні характеристики білків.

Окремі дослідження структурно-функціональних властивостей цитохрому с та сироваткового альбуміну було проведено спільно з аспірантом кафедри біохімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського Калиновським П.С.

Апробація результатів дисертації. Результати дослідження та основні положення дисертації були представлені та обговорені на Українській конференції молодих вчених “Сучасні проблеми природознавства” (Сімферополь, 2003); III Міжнародному конгресі “Слабкі та надслабкі поля та випромінювання у біології та медицині” (Санкт-Петербург, 2003); IV Міжнародному конгресі “Слабкі та над слабкі поля та випромінювання у біології та медицині” (Санкт-Петербург, 2006); V Міжнародній кримській конференції “Космос і біосфера” (Партеніт, Крим, Україна, 2003); VI Міжнародній кримській конференції “Космос і біосфера” (Партеніт, Крим, Україна, 2005); XX Українській конференції з органічної хімії (Одеса, України, 2004); Української конференції “Прикладна фізична хімія” (Алушта, Україна, 2004); 3rd Alexander Gurwitsch Conference “Biophotons and Coherent System in Biology, Biophysics and Biotechnology ” (Partenit, Ukraine, 2004); 77-ій науково-практичної конференції Кримського державного медичного університету ім. С.И. Георгиєвського (Сімферополь, 2005); V, VI всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2005, 2006); IV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006), V Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна” Сучасний стан науки: досягнення, проблеми та перспективи розвитку (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 22 наукові роботи (10 статей у провідних фахових виданнях, а також 12 тез доповідей в матеріалах конференцій).

Структура та об’єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 159 сторінках друкованого тексту і містить вступ, 3 основних розділи, в яких представлено огляд літератури, опис об’єктів і методів дослідження, отримані експериментальні результати та їх обговорення і висновки, а також список літератури, що складається з 248 джерел, 71 з яких іноземною мовою. Робота ілюстрована 33 рисунками і 7 таблицями.

Основний зміст роботи

У “Вступі” обґрунтовано актуальність теми, визначено мету та завдання дослідження, розкрито наукову новизну, теоретичне и практичне значення роботи, особистий внесок здобувача, наведено інформацію про апробацію результатів дослідження.

В розділі “Огляд літератури” проаналізовано і узагальнено наукові дані про екологічну значущість низькочастотних магнітних полів, їх вплив на системному, клітинному і молекулярному рівні. Також проведено аналіз окремих гіпотез, що пояснюють механізми дії низькочастотних магнітних полів. Отже проведений аналіз літературних джерел дозволив обґрунтувати необхідність досліджень зі з’ясування первинних акцепторів дії даного фізичного фактору.

В розділі “Матеріали і методи” наведено методи дослідження та статистичного аналізу. Матеріалом дослідження були розчини білків у дистильованій воді: гемоглобіну людини (0.02%), отриманого шляхом гемолізу еритроцитів за методом “осмотичного шоку”, водні розчини комерційних ліофільних електрофоретично-гомогенних препаратів бичачого метгемоглобіну (0.02%) (“Fluka”, Німеччина), цитохрому с (0.05%) і бичачого сироваткового альбуміну (0.1%) (“Біоритм”, Україна).

Спектрофотометричний аналіз оптичних властивостей білків проводили за (Виноградова З.П. та інш., 1983) на спектрофотометрах “Spektromom 195” (Угорщина) і СФ-16 (“ЛОМО”, Санкт-Петербург). Флуоресцентний аналіз оптичних властивостей сироваткового альбуміну проводили за (Демченко А.П., 1988) на спектрофлуориметрі (“ЛОМО”, Санкт-Петербург). Зміну окиснювальної здатності цитохрому c оцінювали за (Генкин М.В., Блюменфельд Л.А., 1991). Насичення білків неполярними лігандами проводили шляхом напластовування полярної фази на неполярну у випадку з хлороформом і навпаки напластовування неполярної фази на полярну у випадку з бензолом.

Для вивчення ренатураційної здатності метгемоглобіну попередньо проводили кислотну денатурацію цього білка при додаванні до його розчинів 0.1 н НСI у співвідношенні 50:1. Одразу після додавання кислоти експериментальні зразки насичували хлороформом і бензолом протягом 1, 2, 4 і 24 годин, після чого розчини піддавали ренатурації додаванням 0.2 М фосфатного буферу рН=7.0, який нейтралізував кислоту. Процес ренатурації реєстрували за зростанням оптичної густини метгемоглобіну з моменту початку нейтралізації рН розчинів через кожні 20 хвилин протягом 2-х годин до виходу кінетичних кривих на плато і досягнення кінцевого результату ренатурації метгемоглобіну при довжині хвилі л=408 нм, яка відповідає піку Соре (максимуму поглинання гему) і є чутливою ділянкою адсорбційного спектру цього білку до змін оточення цього хромофору.

Аналіз змін гомогенності альбуміну проводили за методом аналітичного електрофорезу (Cololnell K. C., Pigmon W., 1965; Devis B.I., 1964).

При моделюванні магнітного поля застосовували систему кілець Гельмгольця, на які протягом експерименту подавали змінний електричний струм. Джерелом струму був генератор сигналів спеціальної форми Г6-28. Індукцію експериментального поля контролювали мікротеслометром Г-79. Імпульси були прямокутної форми і різної полярності. Вектор індукції застосованого МП був орієнтованим у напрямку паралельному вектору геомагнітного поля. Частота 8 Гц була вибрана на основі раніше встановленої її високої біологічної проникності, геофізичної значущості і у зв’язку з відносно слабкою вивченістю механізму впливу на живі системи. У дослідженнях частотної залежності реакції сироваткового альбуміну на дію змінного магнітного поля застосовували діапазон 0-100 Гц. Індукція МП 25 мкТ відповідає 25% гранично допустимого рівня для житлових приміщень і офісів (Гатовский С.И. та інш., 1998). Контрольні зразки знаходились в умовах фонових значень МП, інтенсивність якого складала 20-65 nT, що приблизно у 500 - 1000 разів нижче інтенсивності МП в кільцях Гельмгольця. Неоднорідність магнітного поля в кільцях Гельмгольця не перевищувала 5%. Експозиція складала 1, 2, 4 і 24 години.

Для оцінки можливого впливу відмінностей у рівні фонових МП в місцях розташування експериментальних і контрольних зразків проводили експерименти з фіктивною дією МП. В цьому випадку дослідні (експериментальні) зразки поміщали в установку, але не піддавали дії МП.

Обробку експериментальних даних проводили за допомогою параметричних статистичних методів (Лакин, 1990). При розрахунках застосовували такі статистичні показники як середня арифметична , дисперсія д і стандартна похибка середньої величини s. В якості критерію достовірності відмінностей між отриманими показниками застосовували t-критерій Ст'юдента. Для забезпечення коректності порівняння вибірок за даним критерієм, попередньо порівняні вибірки перевіряли на нормальність розподілу.

РЕЗУЛЬТАТИ дослідження І Їх ОБГОВОренння

Вплив МП ННЧ на спектри поглинання білків

Дослідження впливу МП частотою 8 Гц здійснювалось на водних розчинах чотирьох глобулярних білків, що належать до різних структурних класів: гемоглобін - олігомірний б-спіральний гемопротеїд (М=64.5 кДа); метгемоглобін – гемоглобін зі ступеню окиснення заліза у гемі Fe3+, якій відрізняється від гемоглобіну певними змінами у просторовій структурі і магнітними властивостями атому заліза (М=64.5 кДа); цитохром с - невеликий (М=13.3 кДа) переважно б-спіральний гемопротеїд з невеликою кількістю в-складчастої структури, який у гемовій структурі містить залізо зі змінним ступенем окиснення; сироватковий альбумін - простий білок (М=67 кДа) з 48% б -спиралей, 15% в-структури і 37% неупорядкованих рухливих петель.

Спектральний аналіз всіх білків показав переважну відсутність достовірних змін в спектрах білків при дії МП ННЧ. Однак в окремих випадках адсорбційні спектри характеризуються достовірними змінами. Так наприклад, адсорбційні спектри розчинів цитохрому с свідчать про зростання інтенсивності гіперхромного ефекту з часом експозиції в МП, але достовірними ці зміни стають лише після добової експозиції при досягненні 22%-ого гіперхромізму з одночасним довгохвильовим (“червоний”) зсувом, величина якого складає 4 нм.

Залежність змін власної флуоресценції альбуміну від частоти МП

Проведено дослідження впливу МП ННЧ індукцією 25 мкТл у смузі 0-100 Гц з кроком в 2 Гц на спектри власної флуоресценції сироваткового альбуміну. Оптимальний час експозиції в МП був встановлений експериментальним шляхом.

Результати дослідження показали доволі складний характер залежності зміни інтенсивності флуоресценції в районі максимуму спектра л=338-340 нм від частоти МП (рис.1). Середньоквадратичні відхилення (у) від середнього значення у виборці контрольних і фіктивно експонованих зразків (n=18) складало 3.9 %, отже виявлені ефекти впливу МП, що перевищували 11.7 % (3у), не можуть бути випадковими і є надійним свідченням конформаційних змін сироваткового альбуміну. Як видно з рисунка 1. інтенсивність власної флуоресценції білка підвищувалась під дією МП в окремих частотних діапазонах, максимальні зміни інтенсивності флуоресценції білка спостерігали при дії МП частою 48-68 Гц, що ще раз підтверджує ефективність впливу промислових частот на живі системи саме на молекулярному рівні і свідчить про необхідність подальшого дослідження такого впливу з метою вдосконалення гігієнічних норм МП ННЧ і його використання у медицині. Дослідження власної флуоресценції сироваткового альбуміну при його 40 хвилинній експозиції в МП частотою 8 Гц довели, що зареєстровані значення не виходять за межі “коридору 3у”.

Таким чином, дослідження залежності інтенсивності флуоресценції сироваткового альбуміну від частоти МП свідчать про те, що 40-хвилиний вплив МП з частотами 46 Гц, 56-68 Гц, 72-74 Гц і 85 Гц в цілому підвищує інтенсивність флуоресценції, тоді як дія МП на частотах 2 Гц, 14-26 Гц, 36 Гц, 52-56 Гц, 76-80 Гц, 88-92 Гц призводить до зниження інтенсивності власної флуоресценції.

Рис.1. Залежність змін інтенсивності власної флуоресценції сироваткового альбуміну (відносно контролю; %) на максимумі л=338-340 нм при збудженні на довжинах хвиль л=255 нм, л=278 нм, л=288 нм від частоти МП (експозиція МП 40 хв), n=18.

Дія МП на спектрофотометричні властивості білків в умовах їх взаємодії з гідрофобними лігандами

Оскільки ефекти безпосереднього впливу МП на білки є відносно слабкими, для полегшення виявлення впливу МП ННЧ на властивості білкових молекул, структурні зміни індукували різними чинниками. У такому випадку нативна конформація в значній мірі втрачає свою стійкість і слабке магніто-польове опромінення може не лише впливати на динаміку структурних змін, але і переважно закріпити один з конформаційних станів, який раніше міг бути досить рідкісним. Факторами, здатними дестабілізувати біополімери, можуть бути низькомолекулярні неполярні і слабо полярні неспецифічні ліганди, наприклад, такі, як бензол і хлороформ. Важливо відмітити і екологічне значення цих гідрофобних речовин, які потрапляють в організм людини, тварин і рослин із забрудненого оточуючого середовища з атмосферним повітрям, питною водою і їжею. Крім того, органічні речовини, що застосовуються в якості розчинників, доволі часто, не дивлячись на доведену їх канцерогену дію, містять у своєму складі хлороформ і бензол (Воронин В.М. та інш. 1987). Також треба враховувати, що велика кількість речовин, які широко використовуються в сучасній медицині та фармакології, мають гідрофобну природу. Враховуючи все наведене вище, є важливим виявлення механізмів дії МП ННЧ на структурно-функціональні властивості білкових молекул в умовах їх взаємодії з низькомолекулярними речовинами гідрофобної природи. У цьому дослідженні було застосовували насичення білків бензолом і хлороформом (Измайлова В.Н., Ребиндер П.А., 1976; Мартынюк В.С., Шадрина О.Г., 1999).

На рисунку 2 представлено спектри поглинання метгемоглобіну на ділянці смуги Соре з максимумом оптичної густини в контрольних зразках на довжині хвилі max = 404 нм. Як видно, у випадку зв’язування хлороформу з білком, спостерігається, з одного боку, достовірне (р<0,05) зниження значень оптичної густини (гіпохромний ефект) на 27.5% після 1 години інкубації (рис.2. А), на 32.5% після 2 годин (рис.2. Б) і на 42.5% після 4 і 24 годин (рис.2. В, Г). З іншого боку взаємодія метгемоглобіну з хлороформом, як і у випадку з альбуміном супроводжується довгохвильовим зсувом максимуму поглинання (“червоний” зсув). Слід наголосити на тому, що в аналогічних експериментах з окси-формою гемоглобіну і цитохромом с (л=380-430 нм) спостерігався протилежний за знаком зсув в блакитну область, який посилюється з часом, що свідчить про підвищення полярності середовища навколо простетичної групи. Причому у випадку з мет-формою спектральні зміни є більш інтенсивними за своїми абсолютними значеннями, “червоний” зсув складає 4 нм після всіх інкубаційних періодів.

При взаємодії метгемоглобіну з бензолом спектральні зміни мають декілька меншу вираженість, як і у випадку з іншими білками. Так гіпохромний ефект складає приблизно 20 % (р<0,05) після 1 і 2 годин інкубації (рис.3. А, Б), 8 % після 4 годин (рис.3. В) і 22 % після 24 годин (р<0,05) (рис.3. Г). “Червоний” зсув також є менш вираженим і складає 2 нм в усьому часовому інтервалі (рис. 3.).

Отже аналіз основних характеристик спектрів поглинання метгемоглобіну показав, що дія МП ННЧ призводить до збільшення “червоного” зсуву (рис. 2. А, Б), викликаного взаємодією з хлороформом, на 2 нм і 4 нм відповідно після 1 і 2 години впливу. Водночас ЗМП ННЧ не впливає на спектральні характеристики метгемоглобіну, насиченого бензолом (рис. 3.). Слід, однак, відмітити загальну тенденцію до зростання “червоного” зсуву на 1-2 нм, що видно з положення мінімуму на диференційних спектрах після 1-ої, 4-ої і 24-ої години експозиції.

Отримані результати, на наш погляд, свідчать про те, що МП ННЧ посилює зв’язування хлороформу з метгемоглобіном і, ймовірно, стимулює більш глибокі конформаційні перебудови в молекулі, які індуковані цим низькомолекулярним неспецифічним лігандом більш полярної природи (дипольний момент молекули хлороформу µхлороформ = 1.06 D), у порівнянні з бензолом (дипольний моментом молекули бензолу µбензол ? 0).

Рис. 2. Абсорбційні (1, 2, 3) і диференційні (4, 5) спектри поглинання 0.02% контрольних розчинів метгемоглобіну, і тих, що взаємодіють з хлороформом під впливом МП (8 Гц 25 мкТ) протягом 1 (А), 2 (Б), 4 (В) і 24 (Г) годин (n=20): 1 - контрольний спектр інтактного білка; 2 – білок, що взаємодіє з хлороформом; 3 - білок, що взаємодіє з хлороформом під впливом МП; 4 – диференційний спектр білку, що взаємодіє з хлороформом; 5 – диференційний спектр білку, що взаємодіє з хлороформом під впливом МП.

Звертає на себе увагу ще одна особливість поведінки такої модельної системи, яка полягає в тому, що вплив МП ННЧ змінює її оптичні властивості в залежності від часу, порівняно з такою в контрольних і фіктивно-експонованих зразках. Внаслідок цього величина ефекту дії даного слабкого фізичного фактору також змінюється протягом експозиції. Найбільш добре це видно у випадку формування гіпохромного ефекту на абсорбційних спектрах метгемоглобіну під впливом МП в умовах насичення бензолом. Виходить так, що гіпохромний ефект формується під дією МП ННЧ з деяким гальмуванням, після 1 години він складає 10%, після 2-ї – 13.8%, що майже в два рази менше, ніж без впливу фізичного фактору, і лише після 4-ої години стає таким же за розміром, як ефект, що формується під дією одного ліганду. За своїм характером ці МП-індуковані зміни в якісь мірі є схожими з тими, що спостерігалися в експериментах з окси-гемоглобіном і альбуміном. Після довготривалої добової експозиції оптична густина білку, навантаженого бензолом і обробленого МП ННЧ, знижується ще на 8.5% порівняно з метгемоглобіном, який не піддавали дії МП ННЧ.

Рис. 3. Абсорбційні (1, 2, 3) і диференційні (4, 5) спектри поглинання 0.02% контрольних розчинів метгемоглобіну, і тих, що взаємодіють з бензолом під впливом МП (8 Гц, 25 мкТ) протягом 1 (А), 2 (Б), 4 (В) і 24 (Г) годин (n=20): 1 – контрольний спектр інтактного білка; 2 – білок, що взаємодіє з бензолом; 3 - білок, що взаємодіє з бензолом під впливом МП; 4 – диференційний спектр білку, що взаємодіє з бензолом; 5 – диференційний спектр білку, що взаємодіє з бензолом під впливом МП.

Таким чином, вплив МП ННЧ індукує динамічні зміни спектральних характеристик метгемоглобіну, гемоглобіну, цитохрому с і сироваткового альбуміну при їх зв’язуванні з низькомолекулярними гідрофобними речовинами. При цьому дані динамічні зміни в деякій мірі специфічні для кожного з білків і кожного з лігандів. Якщо ж знехтувати часовими особливостями формування спектральних перебудов і усереднити дані за всіма часовими точкам, то достовірного впливу МП на спектральні характеристики білків виявлено не буде.

Аналіз результатів дії МП ННЧ на процес ренатурації метгемоглобіну без навантаження цього білка гідрофобними лігандами показав малий вплив цього фактору. Значно більші зміни під впливом МП ННЧ відбуваються, якщо навантажити білок гідрофобними низькомолекулярними сполуками. Наприклад, при дії МП на метгемоглобін, що взаємодіє з хлороформом, відбувається зниження плато кінетичних кривих ренатурації на 17%, 20.5%, 12% і 1.2% відповідно після 1, 2, 4 і 24 годин денатурації у МП (рис. 4. А). Гальмуюча дія хлороформу на ренатурацію білка достовірно посилюється при одногодинній експозиції в магнітному полі як у порівнянні з контрольними зразками (рис. 4. А), так і з фіктивно обробленими. При двохгодинній магнітно-польовій експозиції пригнічення ренатурації достовірно (р<0.05) надійно зареєстровано тільки у перші хвилини процесу ренатурації. При більш тривалих добових впливах МП ННЧ ефекти дії цього фактора проявляються вкрай слабо, що скоріш за все пов’язано з більш глибокими змінами просторової структури, що формуються при тривалому насиченні денатурованого метгемоглобіну, на фоні яких малі впливи МП ННЧ залишаються малопомітними.

Рис. 4. Вплив МП ННЧ на ренатурацію метгемоглобіну при його насиченні хлороформом (А) і бензолом (Б). Процес ренатурації реєстрували при довжині хвилі л=408 нм: товста лінія – кінетична крива ренатурації метгемоглобіну, насиченого лігандом; тонка лінія - кінетична крива ренатурації метгемоглобіну, насиченого лігандом під впливом МП ННЧ; 1, 2, 4, 24 – час (в годинах) насичення неполярними лігандами розчинів білка; мп – вплив МП ННЧ; * - достовірний вплив МП відносно контрольних зразків (p<0.05).

У разі бензолу, МП ННЧ знижує плато кінетичних кривих ренатурації на 7.5%, 3.5%, 15% і 1.5% відповідно після 1, 2, 4 і 24 годин денатурації у МП. Отже, ЗМП достовірно посилює гальмування процесу ренатурації при одно- та чотирьохгодинній експозиції, при цьому вплив магнітного поля протягом 4 годин є більш ефективним (рис. 4. Б). Також спостерігається 20-ти хвилинна затримки процесу ренатурації білка, насиченого бензолом, яка зберігається в умовах впливу МП.

Отже, в цілому МП ННЧ посилює інгібуючу дію гідрофобних лігандів на процес ренатурації метгемоглобіну у перші години експерименту (з 1-ої по 4-ту годину у випадку взаємодії з хлороформом і у 1-у і 4-у годину у випадку з бензолом) та не проявляється при тривалих добових впливах. Цей феномен також знайдено в інших дослідженнях з різними білками, можливо, він пов’язаний зі змінами у динаміці переходів молекул білку з одних конформаційних станів в інші.

Дія МП ННЧ на окиснювальну здатність цитохрому c в умовах його взаємодії з хлороформом

Виявлені спектральні зміни свідчать про динамічний характер взаємодії цитохрому с з хлороформом, а МП в цілому прискорює і підвищує об’єм зв’язування ліганду з гідрофобними порожнинами молекули білка. Для більш повного дослідження впливу МП ННЧ на цитохром с було проведено оцінку одночасної дії низькочастотного МП і гідрофобного ліганду – хлороформу, на функціональну активність цитохрому с. Як відомо, органічні розчинники, до числа яких відноситься хлороформ, мають виражену денатуруючу дію, отже було важливо виявити його вплив на функціональну активність ферменту. Для внесення ясності у цю проблему було проведено дослідження окиснювальної здатності цитохрому с в умовах його насичення хлороформом і впливу МП ННЧ за (Генкин М.В., Блюменфельд Л.А., 1991). Активність ферменту, тобто швидкість відновлення окисненої форми цитохрому с аскорбатом, оцінювали за зміною оптичної густини при довжині хвилі л=550 нм.

Як видно з рисунку 5, в обох експериментальних серіях, як при вивченні дії МП, так и при фіктивній дії цього фактору, для проб, що інкубувалися з хлороформом є характерним зростання активності порівняно з контролем після першої години експозиції на 6.5 %. Інгібуюча дія хлороформу в експериментальній модельній системі проявляється відносно слабо, але достовірно (р<0,05) виявляється через 2 години інкубації, як в експериментах з впливом МП ННЧ, так і в серії з фіктивною дією поля. Втрата активності ферменту не перевішує 10 %. Це вказує на те, що насичення білка хлороформом не призводить до значних необоротних конформаційних еребудов і, відповідно, не призводить до повної втрати активності білку.

Рис. 5. Зміна активності цитохрому с (у%) при його зв’язуванні з хлороформом по відношенню до контрольних зразків, які не підлягали впливу гідрофобного ліганду (А – експеримент з МП ННЧ; Б – експеримент з фіктивним впливом МП ННЧ): лінія “0%” - контроль; * - достовірний вплив МП відносно контрольних зразків (p<0.05); ** - достовірний вплив МП відносно насичених хлороформом зразків (p<0.05).

Отримані результати в експериментах з МП (рис. 5) показують, що прискорення зв’язування хлороформу цитохромом с, викликане дією фізичного фактору, призводить до достовірного (р<0,05) зниження окиснювальної здатності білка в першу годину експерименту на 18%. Даний факт свідчить про те, що МП ННЧ стимулює зв’язування хлороформу цитохромом с і посилює денатуруючу дію неполярного розчинника на нативну структуру біополімеру. Проте слід відмітити стійку тенденцію до відновлення ферментативної активності цитохрому с аж до рівня контрольних значень при довготривалій трьохгодинній експозиції. Цей факт, ймовірно, пов'язаний з оборотністю впливу гідрофобного ліганду, що веде до відновлення активності ферменту (рис. 5 Б).

Дія МП на флуоресцентні властивості сироваткового альбуміну в умовах його взаємодії з хлороформом і бензолом

Аналіз спектрів власної флуоресценції також показав динамічний характер конформаційних перебудов в білкових молекулах. Зв’язування хлороформу з сироватковим альбуміном призводить до значних змін спектрів флуоресценції (рис. 6.). Передусім звертає на себе увагу той факт, що практично зникає власна флуоресценція триптофану з максимумом на довжині хвилі л=338-340 нм, яка є характерною як для нативного стану білка так і для даного білка, інкубованого з бензолом. На цьому фоні стає помітним вклад тирозинової флуоресценції з максимумом л=305 нм. Вважається, що флуоресценція тирозину може бути відокремленою в спектрі власної флуоресценції білків лише в окремих випадках, при цьому положення максимуму тирозинової складової слабо залежить від конформаційних перебудов білка, а флуоресценція тирозину є малочутливою до зміни властивостей оточення, порівняно з триптофаном. В даному випадку в результаті дії хлороформу на молекули сироваткового альбуміну спостерігається саме флуоресценція тирозину. Ймовірно, завдяки своїй відносно високій стійкості до змін в оточуючому середовищі вона зберігається на характерній смузі з максимумом л=305 нм. Водночас з цим інтенсивність флуоресценції при її збудженні на л=288 нм, тобто на лінії максимуму поглинання триптофану практично є такою ж самою, як і при збудженні на довжині хвилі максимуму поглинання тирозину. Можна припустити, що в результаті конформаційних перебудов, викликаних зв’язуванням хлороформу, полярність оточення триптофану суттєво зменшується і спектр його флуоресценції зсувається в блакитну область приблизно на 30 нм. Це дуже сильні зміни, але зсуви такого порядку описані в літературі (Емельяненко В.И. та інш., 2005; Костюк П.Г. та інш., 2001). При цьому складаються умови такого характеру, коли або відбувається дуже швидка дисипація енергії збудження даного хромофора, що призводить до значного падіння квантового виходу його флуоресценції, або, навпаки, енергія збудження не дисипує, а триптофан знаходиться довгий час в збудженому стані, при цьому підвищується вірогідність його переходу в триплетний стан з подальшими випромінюванням і дисипацією значної частини енергії електронного збудження.

Також звертає на себе увагу поява в спектрах власної флуоресценції сироваткового альбуміну ще одного максимуму у смузі л=445-450 нм. Цей максимум не пов'язаний з підвищенням полярності оточення триптофану, тому що у воді максимум флуоресценції лежить в межах л=352-353 нм. У зв’язку з тим, що літературні дані про флуоресценцію альбуміну на даній ділянці спектра практично відсутні, можна лише припустити, що зареєстрований максимум є фосфоресценцією триптофану, яка відображує вірогідність переходу збудженого хромофору в триплетний стан. Подібне явище може мати місце, якщо залишок триптофану знаходиться в щільному гідрофобному оточенні.

Насичення альбуміну хлороформом в умовах впливу МП ННЧ (рис. 6) призводить до більш сильних змін спектрів флуо- і фосфоресценції, характер цих змін залежить від часу експозиції. Так, при одногодинному насиченні хлороформом білкових розчинів в МП ННЧ мали місце наступні зміни. При збудженні флуоресценції на довжині хвилі л=255 нм флуоресценція тирозинових залишків з максимумом на л=305 нм не змінювалась (рис. 6 А). Однак, як видно, вплив МП ННЧ приводив до появи фосфоресценції триптофану, яка в розчинах сироваткового альбуміну, що насичується хлороформом без магнітно-польового впливу, був відсутнім. Через це величину даного ефекту у відносних одиницях трудно розрахувати. Теоретично вона складає декілька порядків. При збудженні свічення на довжині хвилі л=278 нм флуоресценція зразків, що піддавали впливу МП ННЧ, не змінюється, тоді як фосфоресценція підвищується. У той же час дія МП ННЧ підвищує інтенсивність флуоресценції у смузі л=300-370 нм і на 45% знижує інтенсивність фосфоресценції в смузі л=400-500 при збудженні на довжині хвилі л=288 нм (рис. 6. А).

При двогодинному впливі МП ННЧ відмінності у свіченні зразків при збудженні хромофорів на довжинах хвиль л=255 і л=278 були менш вираженими, однак зниження фосфоресценції на максимумі л=447 нм є більш сильним, ніж при одногодинному впливі МП ННЧ і складає 57-58% відносно інтенсивності свічення неопромінених зразків (рис. 6 Б).

Після чотирьох годин експозиції зразків в МП ННЧ з одночасним насиченням хлороформом відбувались найбільш сильні зміни в спектрах флуоресценції і фосфоресценції сироваткового альбуміну (рис. 6. В). При збудженні на довжині хвилі 255 нм інтенсивність флуоресценції тирозинових хромофорів збільшувалась на 20%, а фосфоресценція триптофану – знижувалась на 50%. (рис. 6. В). Подібні, але менш виражені зміни мали місце при свічення білкових розчинів на довжині хвилі л=278 нм. При збудженні на довжині хвилі л=288 нм було виявлено протилежні зміни, зокрема інтенсивність флуоресценції триптофану відносно інтенсивності свічення зразків, що не піддавали дії МП ННЧ, на 10-15% зменшувалась, а фосфоресценції – у два рази зростала (рис. 6. В). Після добової експозиції зразків альбуміну в МП відмінності між спектрами флуоресценції і фосфоресценції опромінених і неопромінених зразків були мінімальними і достовірністю не відрізнялись (рис. 6. Г). Ймовірно, за такий доволі довгий період опромінення білки прийшли в такий структурний стан, який за спектральними характеристиками співпадає з неопроміненими білками.

Спектри флуоресценції сироваткового альбуміну при взаємодії з бензолом є типовими для цього білку, в яких домінує флуоресценція триптофану з максимумом на 338-340 нм. Аналіз результатів дослідження показує, що ефекти дії ЗМП ННЧ проявляються в спектрах власної флуоресценції альбуміну, що інкубувався разом з бензолом і залежить від часу експозиції. Одногодинний вплив МП ННЧ, підвищуючи кількість зв’язування з білком бензолу, призводить до зниження інтенсивності флуоресценції на всіх трьох довжинах хвиль збуджуючого світла. При цьому характер такого зниження дозволяє зробити висновок про те, що на ділянці розташування самого триптофану його оточенця суттєво не змінюється, тоді як на ділянках розташування тирозинових і фенілаланінових залишків відбуваються більш глибокі зміни. Можна припустити, що МП опосередковує додаткове зв’язування бензолу у гідрофобних порожнинах, в яких розташовані залишки фенілаланіну і тирозину.

Характер змін параметрів флуоресценції при двогодинному насиченні білка бензолом в магнітному полі був іншим. Вплив МП ННЧ посилював флуоресценцію при її збудженні на довжинах хвиль 255 нм і 288 нм і не змінював параметрів флуоресценції при збудженні світловими хвилями на 278 нм.

Подальша експозиція експериментальних розчинів в МП ННЧ з бензолом тривалістю до 4 годин посилювала зміни, які спостерігалися при 2-х годинній експозиції. Мали місце більш помітні зміни інтенсивності флуоресценції на рівні 12-15% при збуджені на довжині хвилі 278 нм. Звертає на себе увагу той факт, що для даної експозиції індуковані МП зміни параметрів флуоресценції мають протилежний характер порівняно з одногодинною експозицією, що вказує на динамічний характер конформаційних змін, викликаних впливом бензолу і МП ННЧ. Подібний коливальний характер описано в рефрактометричних дослідженнях розчинності бензолу з максимальним його зв’язуванням при 4-х годинному впливі ЗМП ННЧ (Мартынюк В.С., Шадрина О.Г., 1999).

Рис. 6. Спектри флуоресценції 0.1%-их розчинів сироваткового альбуміну, що взаємодіє з