Національна академія наук україни

інститут мікробіології та вірусології

ІМ. Д.К.заболотного

удк 579.222.6

Козицька Світлана Миколаївна

Взаємозв’язок енергетичного та конструктивного обміну у штамів стафілокока, які стійкі до антибіотиків

03-00-07-мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського державного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Вінніков Альберт Іванович

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Соколов Іван Георгійович

доктор медичних наук

Сельникова Ольга Петрівна

Провідна організація - Київський Національний університет

ім.Тараса Шевченка

Захист відбудеться 17 лютого 1999року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01.при Інституті мікробіології та вірусології ім Д.К.Заболотного НАН України (252143, Київ, вул.Заболотного, 154, Інститут мікробіології і вірусології НАН України, зал засідань)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології НАН України.

Автореферат розісланий “_17_____”___січня__________ 1999р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Зростання кількості захворювань, етіологічним фактором яких є Staphylococcus aureus складає одну із актуальних проблем мікробіології та клінічної медицини. Особливої гостроти набуває ця проблема в зв`язку із розповсюдженням антибіотикорезистентних штамів, що завдає труднощів при підборі лікарських засобів для боротьби із даною інфекцією. В останній час, поряд із високою стійкістю до антибіотиків, які використовувалися раніше, швидко відбувається пристосування і до нових препаратів, що впроваджуються в лікувальну практику.

Широке поширення резистентних штамів стафілокока, за думкою більшості авторів, пов,язане із дуже пластичним обміном речовин, що дає можливість для появи метаболічних реакцій, які лежать в основі біохімічних механізмів резистентності. З другого боку, генетичні детермінанти, що кодують антибіотикостійкість в ході процесів генетичної рекомбінації дуже швидко поширюються в популяціях стафілококів.

Механізми стійкості мікроорганізмів для багатьох антибіотиків розшифровані. Фенотипічний прояв стійкості може бути пов,язаний із синтезом ферментів, що інактивують антибіотик, із порушенням проникливості поверхневих структур, що запобігає створенню бактеріостатичних концентрацій препарата всередині клітини, модифікацією мішені дії антибіотика та виникненню обхідних метаболічних шляхів. Крім того, як показує аналіз літературних даних, резистентність до ряду антибіотиків може бути пов,язана одночасно із розвитком декількох біохімічних механізмів стійкості.

Все це свідчить про те, що стійкість до антибіотиків є складним біологічним явищем, яке пов,язано з одним із напрямків еволюції патогенних бактерій та торкається всього метаболізму мікробної клітини. Тому необхідно комплексне порівняльне вивчення реакцій енергетичного та конструктивного обмінів у чутливого та стійких до антибіотиків штамів стафілокока з метою пошуку загальних закономірностей та шляхів розвитку біохімічних механізмів резистентності, механізмів генетичної детермінації фенотипічного прояву стійкості, а також можливих шляхів передачі генетичних детермінант в популяції стафілококів.

Мета і завдання досліджень. В зв,язку із викладеним, метою роботи був порівняльний аналіз інтенсивності реакцій енергетичного та конструктивного обмінів у чутливого штаму стафілокока та ряду його варіантів, які стійкі до тетрацикліну, хлорамфеніколу, еритроміцину, пеніциліну та фузидину.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі задачі:

1. Вивчити особливості функціонування основних катаболічних циклів штамів стафілокока в зв,язку з стійкістю до антибіотиків.

2. Провести порівняльне вивчення окислювальних процесів у чутливого та резистентних штамів стафілокока.

3. Дослідити основні реакції біосинтезу білків, нуклеїнових кислот та ліпідів у стійких до антибіотиків стафілококів.

Наукова новизна роботи. Вперше показано, що стійкість до ряду різних по механізму дії на бактеріальну клітину антибіотиків у стафілокока супроводжується загальними закономірностями перебудови енергетичного та конструктивного обмінів.

Встановлено зміну співвідношення основних катаболічних циклів у резистентних варіантів стафілокока в порівнянні із чутливим штамом. Показано посилення ролі гліколізу на фоні зниження активності пентозофосфатного циклу в катаболізмі вуглеводів.

Виявлено зменшення швидкості окислення пірувату та ацетату стійкими штамами, що свідчить про зниження окислювальної активності ЦТК та більш інтенсивний відток інтермедіатів циклу на біосинтетичні процеси.

Стійкість до антибіотиків, які вивчались супроводжується посиленням синтезу найбільш важливих для клітини біополімерів-нуклеїнових кислот, білків, ліпідів.

Практичне значення роботи. Отримані результати можуть бути використані для складання більш повної комплексної характеристики механізмів стійкості до антибіотиків, що в свою чергу значно полегшить підбір лікарських засобів для боротьби з патогенними стафілококами та дасть основу для розробки схем раціональної антибіотикотерапії захворювань стафілококової етіології.

Зв,язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлені дослідження-це частина роботи, що проводиться на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського державного університету в рамках держбюджетної теми №01-11-97 “Дослідження особливостей метаболічних процесів у мікроорганізмів та розробка технічних умов виробництва нових біологічно-активних препаратів”, яка координується планом науково-дослідних тем Міністерства освіти України.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана особисто автором під керівництвом докт.біол.наук, професора А.І.Віннікова. Особиста участь дисертанта полягала у проведенні лабораторних досліджень, аналізі, узагальненні одержаних експериментальних даних, співставленні їх з літературними матеріалами. Вимірювання активності ферментів проведено спільно з канд.біол.наук,доц. В.Г.Гаврилюк та канд.біол.наук,доц. Л.П.Голодок. Автор приносить щиру вдячність співробітникам кафедри біохімії Київського національного університету докт.біол.наук,проф. В.М. Войцицькому та докт.біол.наук,доц. С.В.Хижняк за допомогу в проведенні експерименту по включенню мічених сполук в клітини стафілококів.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на I Міжнародній науково-практичній конференції /Дніпропетровськ 1995/; II Українському радіобіологічному з`їзді /Дніпропетровськ, 1995/; Кейстонському симпозиумі з молекулярної та клітинної біології /США,1996, 1997/; VII з,їзді Українського біохімічного товариства /Київ,1997/; II Українському біофізичному з,їзді /Харків, 1998/; I Міжнародній науково-практичній конференції “Наука та освіта” /Дніпропетровськ, 1998/, VII Міжнародній конференції “Альянс Франсез” (Дніпропетровськ, 1998).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 8 наукових робіт.

структура та об’єм дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, обговорення, висновків і списку цитованої літератури, який включає 227 найменувань. Робота викладена на 140 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 17 рисунками та 19 таблицями.

ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

Огляд літератури складається із 3 розділів, в яких висвітлені питання катаболічного обміну і акумуляції енергії у стафілококів, охарактеризовані особливості біосинтезу основних класів сполук – білків, нуклеїнових кислот, ліпідів та вуглеводів, а також приведені основні біохімічні механізми стійкості до ряду найбільш важливих антибіотиків. Показано, що процеси метаболізму у стафілококів вивчені недостатньо і тому необхідне подальше більш детальне вивчення як окремих енергетичних та біосинтетичних реакцій, так і метаболізму в цілому, що сприятиме більш ефективній боротьбі із даною інфекцією.

матеріали і методи досліджень

Об,єктом досліджень були штами Staphylococcus aureus: 8325-4 та його варіанти, які містять плазміди резистентності до різних антибіотиків. Штами були предоставленi з колекцiї iнституту епiдемiологiї та мiкробiологiї iм. Д.К.Гамалеї АМН Росiї.

Для одержання суспензiї "спочиваючих" клiтин проводили накопичення бiомаси штамів стафiлокока на твердому живильному середовищi, що мiстить МПА, рН 7,0-7,2 при t =37о С до середини логарифмiчної фази росту. Для одержання безклiтинного гомогенату руйнування клiтин стафiлокока проводили на ультразвуковому дезинтеграторi УЗДН-1 з експоненцiальним випромiнювачем. Озвучування проводили на протязi 10 хвилин преривисто з iнтервалом в 30 сек. Незруйновані клiтини та клiтиннi стiнки осаджували центрифугуванням при 20 000 об/хв. на протязi 60 хв.

При вирощуваннi штамів стафiлокока в безкисневому середовищi анаеробнi умови створювались в анаеростатi при замiнi його атмосфери на газоподiбний азот.

Активностi катаболічних ферментiв глiколiзу, пентозофосфатного шляху та циклу трикарбонових кислот визначали відповідними загальноприйнятими методами Активність гексокінази, лактатдегідрогенази та фумаратгiдратази визначали за методами приведеними у Кочетова /1980/, 6-фосфофруктокінази, альдолази фруктозо-1-6-дифосфату, піруваткінази, НАДН-дегiдрогенази, iзоцитратдегiдрогенази - за методами приведеними в Methods in enzymol./1982/, глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази та 6-фосфоглюконатдегiдрогенази за методом Kornberg, Horecker /1955/, транскетолази - за методом Dische в модифiкацiї Brownstone, Denstedt /1961/, цитратсинтази - за методом Muller-Kraft, Babel /1983/, малатдегiдрогенази - за методом Лі Кім Банг /1970/.

Данi спектрофотометричних вимiрювань одержували на “Specord uv vis” (Німеччина) при 300 С. Активнiсть ферментiв виражали в нмоль перетвореного субстрату за 1 хвилину на 1 мг бiлка.

Iнтенсивнiсть окислення субстратiв дихальним ланцюгом вивчалось полярографiчним методом на полярографi LP-7 (ЧССР), з використанням закритого електрода типа Кларка.

Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів на цілих клітинах стафілокока вивчали за методом, який розроблений Liberman, Skulachev/1970/ із застосуванням синтетичних ліпофільних проникаючих іонів тетрафенілфосфонію (ТРР+). Крім того, генерацію вимірювали по інтенсивності флуоресценції 8-анілінонафталін-1-сульфонату (АНС-).

Визначення накопичення ключових метаболiтiв катаболiзму глюкози: молочної кислоти, оцтової кислоти, пiровиноградної кислоти проводили за методами приведеними у Асатіані /1961/. Концентрацію СО2 визначали манометричним методом в апараті Варбурга. Визначення накопичення метаболiтiв в анаеробних умовах проводили при iнкубуваннi в пробiрках Тунберга (вакуум -4 мм рт. стовпця).

В експериментах по дiї iнгiбiтора NаF на iнтенсивнiсть глiколiзу вказаний iнгiбiтор вносили в iнкубацiйне середовище в концентрацiї 10-3 М.

Визначення активностi біосинтетичних ферментів аспартат- та аланiнамiнотрансфераз проводили за методом Танкелюн та ін. /1986/, ацетил-СоА-карбоксилази – за методом Olsen and Merrik /1968/.

В дослідах по включенню мiчених попередникiв бiлка та нуклеїнових кислот клітини стафілококів вирощували до ранньої експоненціальної фази на МПБ при 370С. Після визначення концентрації білка в клітинах в дослідні пробірки вносили суспензію, що містила 1-2 мг білка.

Для характеристики синтезу білка вносили: DL- [4- 14С ] аспарагінову кислоту, DL –[метил-14 С] - метіонін, [14 С] - серин, [14С] - ізолейцин, [2,3-3Н] -триптофан. Для дослідження синтезу нуклеїнових кислот вносили [8- 14С] - аденін, [2-14С] - урацил, [5-метіл-3Н] - тимін. Контролем служили суспензії клітин стафілокока, що були інактивовані прогріванням на протязі 10 хв.

Фракціонування біомаси проводили за методом Park, Hancock /1960/. Радiоактивнiсть визначали за допомогою сцинтилляцiйного лiчильника фiрми “ Intertechnigue” (Францiя). Інтенсивність включення мічених попередників оцінювали в імпульсах за 1 хв на 1 мг білка.

Визначення бiлка в безклiтинному гомогенатi проводили за методом Lowry et al. /1951/. Статистичну обробку експериментальних даних проводили по Лакіну /1990/

Результати досліджень та їх обговорення

1.Активність катаболічних ферментів у штамів стафілокока, що вивчались.

В роботі було проведено порівняльне вивчення активності ключових ферментів основних катаболічних шляхів та накопичення центральних метаболітів у чутливого та резистентних до ряду антибіотиків штамів стафілокока.

На першому етапі було проведено вивчення накопичення кінцевих продуктів гліколізу. Встановлено, що більша частина глюкози, яка утилізується по схемі Ембдена-Мейергофа -Парнаса, перетворюється в молочну кислоту. Швидкість накопичення молочної кислоти знаходиться в межах 0,210-0,270 мкмоль на 1 мг білка за 1 год. Антибіотикорезистентні штами стафілококів характеризуються більшими на 14-29% швидкостями накопичення лактату. Поряд з цим, відмічено накопичення в невеликих кількостях ацетату та СО2 (табл.1).

Таблиця 1

Накопичення кінцевих продуктiв глiколiзу цiлими клiтинами штамів стафiлокока в анаеробних умовах.

Штами | Кількість, мк моль на 1 мг білка за 1 год.

стафілокока | Лактат | Ацетат | СО2

8325-4 | 0,210+0,030 | 0,011+0,002 | 0,010+0,001

NТ-4 | 0,270+0,040 | 0,014+0,003 | 0,012+0,002

NС-4 | 0,250+0,050 | 0,013+0,003 | 0,011+0,001

Порівняльне вивчення накопичення лактату в аеробних та анаеробних умовах у штамів стафілокока, що вивчались, вказує на незначну різницю в швидкості гліколізу в даних умовах. Ефект Пастера, розрахований по формулі А Клейнцеллера /1965/, достигав 25,2-28,0% (табл.2).

Таблиця2

.Накопичення лактату цiлими клiтинами штамів стафiлокока в аеробних та анаеробних умовах.

Штами | Кількість лактату, мкмоль на 1мг білка за 1 год | Ефект

стафілокока | аеробні умови | анаеробні умови | Пастера,

%

8325-4 | 0,157+0,021 | 0,210+0,030 | 25,2

NТ-4 | 0,197+0,025 | 0,270+0,040 | 27,0

NС-4 | 0,180+0,035 | 0,250+0,050 | 28,0

Для з’ясування регуляторних механізмів гліколізу у стафілокока було вивчено накопичення лактату при внесенні ряду інтермедіатів на фоні присутності в середовищі глюкози. Швидкість гліколізу зростає при додаванні глюкозо-6-фосфату, фруктозо-1,6-дифосфату та пірувату. Нами були зроблені припущення, що у стафілокока лімітування гліколізу може відбуватися на рівні гексокінази, фосфофруктокінази, піруваткінази. Доказом цьому послужили визначені нами низькі активності вказаних трьох ферментів в порівнянні із альдолазою фруктозо-1,6-дифосфату, яка не відноситься до ферментів, що регулюють швидкість гліколізу.

В розвиток отриманих результатів було проведено оцінку ролі гліколізу в загальному катаболізмі глюкози по активності гексокінази та лактатдегідрогенази, а також по рівню накопичення піровиноградної кислоти та впливу на цей процес інгібітора фтористого натрію у досліджуємих штамів стафілокока.

Активність гексокінази та лактатдегідрогенази у штамів, які несуть плазміди резистентності вища, ніж у вихідного штаму на 15-69%. Рівень активності в анаеробних умовах вищий ніж в аеробних для всіх штамів (табл.3).

Антибіотикорезистентні штами характеризуються і більшими величинами накопичення пірувату на 29-57% (рис.1). NaF інгібує накопичення пірувату стафілококами в аеробних умовах на 11-62%, в анаеробних умовах на 35-61%. Процент інгібування для резистентних варіантів значно вищий в порівнянні із чутливим штамом, що свідчить про перевагу гліколітичного шляху в катаболізмі вуглеводів у резистентних штамів.

Висока iнтенсивнiсть аеробного глiколiзу у стафiлококiв, що також виявлена в рядi дослiджень (Гершанович /1962,1964/), можливо, пояснюється тим, що стафiлококи - факультативно анаеробнi мiкроорганiзми.

Таблиця 3

Активнiсть ферментів гліколізу у штамiв стафілокока, чутливого та

стiйких до антибiотикiв.(нмоль за1хв. на 1мг бiлка).

Штами

стафiлокока | Гексокіназа | Лактатдегідрогеназа

Аеробнi умови | Анаеробнi умови | Аеробнi умови | Анаеробні умови

8325-4 | 15,01,2 | 16,80,4 Р0,05 | 30,23,1 | 40,42,5 Р0,05

NТ - 1 | 13,10,3 Р0,05 | 12,90,8 Р0,05 | 48,25,2 Р0,05 | 51,3±4,5 Р0,05

NТ - 4 | 17,90,6 Р0,05 | 19,60,7 Р0,05 | 39,4±3,4 Р0,05 | 50,34,2 Р0,05

NС - 1 | 17,30,9 Р0,05 | 19,40,6 Р0,05 | 34,72,3 Р0,05 | 49,34,1 Р0,05

NС - 4 | 15,80,4 Р0,05 | 18,10,7 Р0,05 | 43,21,6 Р0,05 | 46,42,5 Р0,05

994 | 18,10,8 Р0,05 | 17,40,9 Р0,05 | 47,13,2 Р0,05 | 52,42,7 Р0,05

NЕ - 1 | 17,10,4 Р0,05 | 20,00,6 Р0,05 | 24,63,7 Р0,05 | 24,33,4 Р0,05

NF - 8 | 18,90,4 Р0,05 | 20,30,4 Р0,05 | 51,14,4 Р0,05 | 64,36,2 Р0,05

NЕ - 5 | 17,60,7 Р0,05 | 19,50,6 Р0,05 | 42,83,4 Р0,05 | 54,32,7 Р0,05

NF - 2 | 18,00,6 Р0,05 | 19,30,5 Р0,05 | 39,64,8 Р0,05 | 44,35,2 Р0,05

Альтернативним гліколізу є пентозофосфатний шлях, який поставляє інтермедіати для процесів біосинтезу. При аналізі результатів по активності ферментів пентозофосфатного циклу нами було встановлено, що активність ферментів окислювального етапу дегідрогеназ глюкозо-6-фосфату та 6-фосфоглюконату знижена у резистентних до антибіотиків варіантів в середньому на 10-38 % в порівнянні із чутливим штамом (рис2).

Активність фермента біосинтетичної частини -транскетолази також нижча у стійких варіантів на 14-48%. Для всіх штамів характерно незначне збільшення активності ферментів пентозофосфатного циклу в аеробних умовах.

Таким чином, для резистентних до різних антибіотиків варіантів характерна зміна співвідношення основних катаболічних процесів: підвищення гліколітичного шляху на фоні зниження інтенсивності пентозофосфатного циклу.

3.Особливості процесів окислення у стійких до антибіотиків

стафілококів

В результаті порівняльного дослідження чутливого та резистентних варіантів по окисленню ряду субстратів нами встановлено, що стафілококи активно окислюють глюкозу, піруват та ацетат (табл.4). Споживання кисню при окисленні глюкози знаходиться в межах 47,1-83,6 нмоль за 1хв. на 1мг білка. Стійкі до антибіотиків варіанти характеризуються більшими на 25-77% величинами окислення глюкози. Але вже при окисленні пірувату різниця в швидкості окислення між вихідним штамом та резистентними варіантами значно зменшується. А порівняльний аналіз швидкості окислення ацетату вказує на зниження активності окислювальних ферментів ЦТК у резистентних варіантів та більш інтенсивне холосте окислення.

Таблиця 4

Окислювальна активність цілих клітин штамів стафілокока

Штами | Швидкість поглинання кисню нмоль О2 хв-1. мг-1 білка

стафілокока | Глюкоза | Піруват | Ацетат

8325-4 | 47,1 3,0 | 31,1 3,4 | 15,2 2,7

NT-1 | 75,8 6,3 Р0,05 | 25,3 4,3 Р0,05 | 12,4 2,5 Р0,05

NC-1 | 83,6 7,1 Р0,05 | 27,5 5,6 Р0,05 | 12,5 3,5 Р0,05

994 | 71,5 6,8 Р0,05 | 21,8 3,7 Р0,05 | 11,1 2,8 Р0,05

NF-8 | 59,0 4,0 Р0,05 | 20,8 3,1 Р0,05 | 9,9 1,9 Р0,05

NF-2 | 69,3 5,7 Р0,05 | 20,3 4,6 Р0,05 | 9,8 1,5 Р0,05

Результати дослідів по окисленню ряду амінокислот штамами стафілокока показали менш інтенсивне окислення в порівнянні з глюкозою.

Таблиця 5

Інтенсивність окислення ряду амінокислот цілими клітинами штамів стафілокока.

Штами | Швидкість окислення, нмоль О2 хв-1. мг білка-1

стафілокока | Аспарагінова кислота | Метіонін | Ізолейцин | Триптофан | Серин

8325-4 | 14,0 3,6 | 12,33,5 | 11,43,0 | 10,53,1 | 15,33,5

NT-1 | 11,8 2,7 | 10,92,2 | 10,73,2 | 9,62,0 | 12,52,9

NC-1 | 11,5 2,4 | 11,02,9 | 10,92,8 | 9,52,1 | 12,01,8

994 | 11,0 2,0 | 10,51,7 | 10,03,1 | 9,31,9 | 11,92,4

NF-8 | 10,2 2,8 | 10,42,1 | 9,02,0 | 9,01,5 | 10,12,5

NF-2 | 10,4 2,2 | 10,11,8 | 9,51,9 | 9,22,3 | 10,22,3

Величини окислення в середньому склали 9-15 нмоль О2 за хв. на мг білка (табл.5). Вказуючи на невелику різницю між резистентними варіантами та чутливим штамом, можна відмітити центральну тенденцію до зниження інтенсивності окислення амінокислот у стійких штамів, що підтверджує раніше зроблений висновок, про загальне зниження окислювальних ферментів у даних штамів.

З метою з’ясування, як відбувається окислення амінокислот у штамів стафілокока через дихальний ланцюг, чи це пов,язано з холостим окисленням, нами проведено визначення генерації трансмембранної різниці електричних потенціалів на сопрягаючій мембрані стафілококів при використанні в якості субстрата - амінокислот. Одержані результати свідчать про поступання відновлюючих еквівалентів в дихальний ланцюг при окисленні амінокислот.

Про зниження окислювальної активності у резистентних штамів стафілококів можна стверджувати і на основі зменшення активності ключового ферменту ЦТК -цитратсинтази на 20-37% в порівнянні з чутливим варіантом. Але, в той же час, при визначенні активності ферментів, пов’язаних з процесами біосинтезу - зворотньої малатдегідрогенази та фумаратгідратази ми виявили збільшення активності ферментів у стійких штамів в середньому на 15-86% (рис3).

В анаеробних умовах активність ферментів ЦТК проявляється, але знижена в середньому на 10-37%.

Приведені дані свідчать про зниження окислювальної активності, у резистентних варіантів та про направленість інтермедіатів ЦТК на біосинтетичні процеси.

4.Біосинтетичні процеси стафілококів

Відомо, що енергетичний обмін тісно взаємопов,язаний з біосинтетичними реакціями. Нами були визначені активності ферментів синтезу амінокислот- аспартат- та аланінамінотрансфераз у колекції штамів стафілокока (табл.6). Встановлено, що реакція переамінування

Таблиця 6

Активнiсть аспартат- та аланінамiнотрансфераз у штамiв стафiлокока,

якi стiйкi до антибiотикiв (нмоль субстрату за 1хв. на 1 мг бiлка )

Штами стафiлокока | Аспартатамінотрансфераза | Аланінамінотрансфераза

Аеробнi умови | Анаеробнi умови | Аеробнi умови | Анаеробнi умови

8325-4 | 23,42,4 | 29,5 1,3 Р0,05 | 10,60,7 | 11,90,3 Р0,05

NТ - 1 | 30,41,6 Р0,05 | 34,4 0,9 Р0,05 | 12,50,4 Р0,05 | 14,0 0,7 Р0,05

NТ - 4 | 36,02,1 Р0,05 | 41,90,7 Р0,05 | 16,01,2 Р0,05 | 17,0 0,9 Р0,05

NС - 1 | 28,00,6 Р0,05 | 31,8, 1,3 Р0,05 | 15,30,2 Р0,05 | 14,6 0,4 Р0,05

NС - 4 | 38,40,7 Р0,05 | 39,31,8 Р0,05 | 12,70,6 Р0,05 | 14,9 0,5 Р0,05

994 | 39,82,3 Р0,05 | 41,9 0,3 Р0,05 | 14,80,9 Р0,05 | 16,7 0,3 Р0,05

NЕ - 1 | 36,50,5 Р0,05 | 37,41,1 Р0,05 | 18,00,7 Р0,05 | 19,5 0,4 Р0,05

NF - 8 | 25,71,3 Р0,05 | 30,41,6 Р0,05 | 12,10,9 Р0,05 | 12,7 1,1 Р0,05

NЕ - 5 | 34,40,4 Р0,05 | 36,01,2 Р0,05 | 14,40,2 Р0,05 | 15,4 0,6 Р0,05

NF - 2 | 30,42,0 Р0,05 | 34,20,8 Р0,05 | 17,80,5 Р0,05 | 19,1 0,3 Р0,05

амінокислот відбувається інтенсивніше у стійких штамів на 20-70%. В анаеробних умовах активність ферментів вища в порівнянні із аеробними для всіх штамів, включаючи вихідний, що можливо пов,язано із зниженням окислювальних процесів та посиленням реакцій біосинтезу.Аналогічні результати були одержані і по включенню амінокислот в клітини стафілококів (табл.7). Резистентні варіанти характеризуються більшим на 14-31% величинами включення аспарагінової кислоти, метіоніну, ізолейцину, триптофану та серину. Це може свідчити про посилення синтезу білка у штамів стафілококів, які резистентні до антибіотиків.

Таблиця 7

Включення мiчених амiнокислот в клітини чутливого та стiйких штамiв стафiлокока (імп.за хв-1.на мг білка-1)

Штами стафiлокока | Аспарагiно-ва кислота | Трипто-фан | Серин | Метiонiн | Ізолейцин

8325-4 | 8340317 | 5910400 | 7120560 | 6810340 | 7380506

NT-1 | 7839405 Р0,05 | 6737210 Р0,05 | 6194310 Р0,05 | 7491420 Р0,05 | 9077114 Р0,05

NC-1 | 9924470 Р<0,05 | 6974220 Р<0,05 | 7761150 Р0,05 | 7763210 Р0,05 | 7675300 Р0,05

994 | 10008320 Р0,05 | 7565417 Р0,05 | 8473480 Р0,05 | 8512610 Р0,05 | 8708280 Р0,05

NF-8 | 9674280 Р0,05 | 7683250 Р0,05 | 8829610 Р0,05 | 8921706 Р0,05 | 8856410 Р0,05

NF-2 | 10675510 Р0,05 | 6914320 Р0,05 | 8402340 Р0,05 | 8035510 Р0,05 | 8339530 Р0,05

Для вивчення інтенсивності синтезу нуклеїнових кислот було проведено включення азотистих основ в клітини стафілококів. Результати показали більш інтенсивне включення резистентними варіантами. Аденін та тимін включаються на 12-45% активніше, урацил на 10-20% (рис.5)

Більша активність характерна і для синтезу ліпідів у резистентних варіантів. На це вказує збільшення на 32-89% активності ацетил-КоА-карбоксилази-ключового ферменту у синтезі ліпідів у стійких штамів в порівнянні з чутливим штамом.(рис.4).

Одержані результати по активності біосинтетичних ферментів, включенню амінокислот та азотистих основ вказують на більш інтенсивний синтез найбільш важливих класів сполук- нуклеїнових кислот, білків та ліпідів у стійких до антибіотиків варіантів.

ВИСНОВКИ

1. У стафілококів, які взяті для дослідів, основна частина глюкози, що утилізується по схемі Ембдена-Мейергофа-Парнаса перетворюється в молочну кислоту, накопичення лактату складає 0,210-0,270 мкмоль, крім того в мінімальних кількостях накопичується ацетат та СО2. Ефект Пастера достигав 25,2-28,0%. Лімітування гліколізу здійснюється на рівні гексокінази, фосфофруктокінази, піруваткінази.

2.Антибіотикорезистентні варіанти стафілококів характеризуються більш високими на 15-26% активностями гексокінази та на 15-69% лактатдегідрогенази як в аеробних так і в анаеробних умовах.

3.Активність дегідрогеназ глюкозо-6-фосфату та 6-фосфоглюконату на 10-38%, транскетолази на14-48% нижча у резистентних штамів стафілокока, що свідчить про зниження активності пентозофосфатного циклу.

4.Окислення глюкози цілими клітинами стафілокока вище на 25-77% у резистентних варіантів, а піруват та ацетат на 15-25% інтенсивніше окислюються чутливим штамом. У стійких до антибіотиків штамів нижча активність основних енергопостачаючих реакцій ЦТК та більш інтенсивне холосте окислення.

5.Активність ацетил-КоА-карбоксилази на 32-89%, малатдегідрогенази на 15-36%, фумаратгідратази на 15-86%, вища у резистентних варіантів, що свідчить про направленність потоку інтермедіатів ЦТК на біосинтетичні процеси.

6.Штами стафілокока, які стійкі до антибіотиків, характеризуються більш високими на (20-70%) активностями ферментів амінокислотного обміну - аспартат- та аланінамінотрансфераз.

7.Резистентні до антибіотиків варіанти на 14-31% інтенсивніше включають мічені амінокислоти: аспарагінову кислоту, метіонін, триптофан, ізолейцин, серин в порівнянні із чутливим варіантом, що вказує на більш інтенсивний синтез білка.

8.Радіоактивні азотисті основи –аденін, тимін та урацил - на 10-45% інтенсивніше включаються клітинами резистентних штамів, ніж чутливим штамом, що може свідчити про більш інтенсивний синтез нуклеїнових кислот.

Список публікацій по темі дисертації

1. Гаврилюк В.Г.,Козицкая С.Н.,Голодок Л.П.,Винников А.И. Активность ключевых ферментов гликолитического и пентозофосфатного путей у плазмидосодержащих стафилококков// Укр. биохим. журн.-1996.-№1.-С.45-48.

2. Гаврилюк В.Г.,Козицкая С.Н.,Голодок Л.П.,Винников А.И. Особенности

метаболизма стафилококков,устойчивых к антибиотикам// Вестник ДГУ

серия Биология и екология .-1996.-С.31-38.

3. Козицкая С.Н.,Гаврилюк В.Г., Голодок Л.П.,Винников А.И.Активность

ряда ферментов анаболического обмена у стафилококков, содержащих

плазмиды устойчивости к антибиотикам// Микробиол.журн.-1997.-№1.-

С.37-41.

4. С.Н.Козицкая В.Г.Гаврилюк Л.П.Голодок А.И.Винников Особенности

процессов катаболизма углеводов у плазмидосодержащих

стафилококков // Сборник ДГУ“Регуляция в живых системах”.-1998.-

С.67-71

5. Козицька С.М. Інтенсивність включення мічених амінокислот в ході

біосинтезу білка у стафілококів, які стійкі до антибіотиків// Тез.VII

Укр.біохім. з їзду.- Київ.-С.138-139.

6. С.М.Козицька В.Г.Гаврилюк Л.П.Голодок А.І.Вінніков Активність ряду

ферментів анаболічного обміну у стафілококів, які містять плазміди

стійкості до антибіотиків// Тез.VII Укр.біохім. з їзду.- Київ.-С.139-140.

7..Kozitskaia S.N.,.Gavrilyuck V.G.,Golodok L.P.,Vinnikov A.I.Regulation du

metabolisme constructif des staphylocoques contenant des plasmides de resistance aux antibiotiques// V-e Conference Internat.France Ukraine T.3.-

1998.-P.66-67

8. Козицька С.М.,Гаврилюк В.Г.,Голодок Л.П.,Вінніков А.І. Вивчення

основних метаболічних реакцій у стійких до антибіотиків стафілококів//1

Міжнародна науково-практ. конф. “Наука та освіта”.-Дніпропетровськ.-

1998.-С.62-63.

Козицька С.М. Взаємозв’язок енергетичного та конструктивного обміну у штамів стафілокока, які стійкі до антибіотиків.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03-00-07-мікробіологія.-Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ, 1999.

Дисертація присвячена вивченню реакцій енергетичного та конструктивного обмінів у чутливого та резистентних до ряду антибіотиків штамів стафілокока. Результати досліджень показали, що стійкі до антибіотиків штами стафілокока характеризуються інтенсифікацією реакцій гліколітичного розщеплення вуглеводів. Основна частина глюкози перетворюється в молочну кислоту, в незначних кількостях накопичується ацетат та СО2. Ефект Пастера достигав 25,2-28,0%. Показано, що стійкі варіанти стафілокока характеризуються більшими на 15-69% активностями гексокінази та лактатдегідрогенази. Активність ферментів пентозофосфатного циклу – дегідрогеназ глюкозо-6-фосфату та 6-фосфоглюконату, а також транскетолази знижена у резистентних варіантів на (10-38% та 14-48% відповідно). Показано, що глюкозу активніше окислюють резистентні варіанти, а ацетат та піруват- чутливий штам. Активність ключового фермента ЦТК-цитратсинтази у стійких штамів знижена на фоні інтенсифікації фумаратгідратази. Встановлено, що активність біосинтетичних ферментів –трансаміназ аланіну та аспартату, а також активність ацетил-КоА-карбоксилази вища у резистентних варіантів в середньому на 20-89%. При аналізі включення мічених попередників білка та нуклеїнових кислот в клітини стафілококів показано більш інтенсивне включення резистентними варіантами в порівнянні із вихідним чутливим штамом.

Ключові слова: стафілококи, плазміди, антибіотикорезистентність, енергетичний обмін, реакції біосинтезу.

Козицкая С.Н. Взаимосвязь энергетического и конструктивного обмена у штаммов стафилококка, устойчивых к антибиотикам.-Рукопись

Дисертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07-микробиология.-Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 1999.

Дисертация посвящена изучению реакций енергетического и конструктивного обменов у чувствительного и резистентных к ряду антибиотиков штаммов стафилококка. Результаты исследований показали, что устойчивые к антибиотикам штаммы стафилококка характеризуются интенсификацией реакций гликолитического расщепления углеводов. Основная часть глюкозы превращается в молочную кислоту, в незначительных количествах накапливается ацетат и СО2. Величины накопления лактата для исследуемых штаммов в аеробных условиях составили 0,157 – 0,197 мкмоль на 1 мг белка за 1 час, в анаеробных –0,210 – 0,270 мкмоль. Антибиотикорезистентные штаммы стафилококков характеризуются большими на 14-29% величинами накопления лактата в аэробных и анаэробных условиях в сравнении с чувствительным штаммом. Эффект Пастера достигал 25,2—28,0%. При изучении скорости гликолиза на бесклеточном гомогенате при внесении ряда интермедиатов было установлено, что скорость гликолиза увеличивается при добавлении глюкозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-дифосфата, пирувата, в тоже время как фруктозо-6-фосфат, глицеральдегид-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, 2-фосфоглицерат, фосфоенолпируват подобного действия не оказывают. Показано, что устойчивые варианты стафилококка характеризуются большими на 15-69% активностями гексокиназы и лактатдегидрогеназы. Накопление пирувата клетками резистентных штаммов также больше на 29-57% в сравнении с чувствительным штаммом. NaF в концентрации 10-3 М ингибирует накопление пирувата исследуемыми штаммами. Процент ингибирования для исходного штамма ниже как в аэробных так и в анаэробных условиях, чем для резистентных штаммов. Активность ферментов пентозофосфатного цикла-дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата, а также транскетолазы снижена у резистентных вариантов на (10-38% и 14-48% соответственно). В результате сравнительного исследования чувствительного и резистентных вариантов по окислению ряда субстратов установлено, что клетки резистентных штаммов стафилококка активно окисляют глюкозу, а пируват и ацетат - чувствительный штамм. Окисление аминокислот исследуемыми штаммами происходит менее интенсивно, чем глюкозы и отмечено незначительное снижение окисления у резистентных вариантов. Активность ключевого фермента ЦТК-цитратсинтазы у устойчивых штаммов снижена на фоне интенсификации фумаратгидратазы. Определено, что активность биосинтетических ферментов -трансаминаз аланина и аспартата выше у резистентных вариантов в среднем на 20-70%, Аналогичные результаты были получены и при исследовании включения аминокислот в клетки стафилококков. Резистентные варианты характеризуются большим на 14-31% уровнем включения аспарагиновой кислоты, метионина, изолейцина, триптофана и серина. Активность фермента, связанного с синтезом липидов - ацетил-КоА-карбоксилазы также выше на 32-89% у штаммов, устойчивых к антибиотикам. Включение меченых предшественников нуклеиновых кислот в клетки стафилококков более интенсивно осуществляется резистентными вариантами в сравнении с исходным чувствительным штаммом.

Ключевые слова: стафилококки, плазмиды, антибиотикорезистентность, энергетический обмен, реакции биосинтеза.

S.N.Kozitskaya. Interrelation of Energetic and Constructive Metabolism in staphylococcus strains resistant to antibiotics. -Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of biological sciences on a speciality 03.00.07- microbiology. –Institute of microbiology and virology Nati.Acad.Sci.of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation is devoted to the investigation of the energetic and constructive metabolism reactions in staphylococcus strains sensitive and resistant to some antibiotics. The investigation results have shown that staphylococcus strains resistant to antibiotics are characterized by the intensification of Carbohydrates glycolitic splitting reactions. Glucose major part transforms into dairy acid. Acetate and CO2 are accumulated in small amounts. Paster effect reached 25,2 — 28,0%. It is shown that staphylococci resistant variants are characterized by 15-69 % larger hexokinase and lactate dehydrogenase activities. Ensyme activities of pentosophosphate cyclo dehydrogenase glucose-6-phosphate and 6-phosphogluconate and transketolase are reduced in resistant variants on (10-38 % and 14-48 % respectively) .It is shown that glucose is oxidized more actively by resistant variants, and acetate and pyruvate are oxidized by sensitive strains. Citrate syntase key enzyme activity in resistant strains is increased on the fumarase intensification background. It is determined that the activity of biosynthetic enzymes, alanin transaminase and aspartat transaminase and also acetyl-KoA-carboxylase activity is higher in resistant variants on the average on 20-89%. The involrement of proteins and nucleic acids labelled predecessors into staphylococci cells more intensive in resistant variants compared to the initial sensitive strain.

Key words: staphylococci, plasmids, antibioticresistance, energetic metabolism, biosynthesis reactions.