МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ДМИТРІЄВА Катерина Юріївна

УДК 577.1:577.15:616.36:616-001.17:616-001:615.015:615.03

БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ПОШКОДЖЕННЯ ФЕРМЕНТНИХ СИСТЕМ БІОТРАНСФОРМАЦІЇ КСЕНОБІОТИКІВ ПЕЧІНКИ ЗА УМОВ ОПІКОВОЇ ТРАВМИ ШКІРИ ТА КОРЕКЦІЇ АНТИОКСИДАНТАМИ ТРИМЕТАЗИДИНОМ І МЕКСИДОЛОМ

14.01.32 – медична біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті

імені М.І.Пирогова Міністерства охорони здоров’я

України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

ПЕНТЮК Олександр Олексійович,

завідувач кафедри загальної та біологічної хімії

Вінницького національного медичного університету

ім. М.І.Пирогова

Офіційні опоненти: Доктор медичних наук, професор

ХМЕЛЕВСЬКИЙ Юрій Володимирович ,

кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної

хіміії Національного медичного університету

ім.О.О.Богомольця

Доктор біологічних наук, професор

БРАЗАЛУК Олександр Захарович,

завідувач кафедри біохімії, медичної і

фармацевтичної хімії Дніпропетровської

державної медичної академії

Захист відбудеться 01.11.2007__р. о_13 год__30__хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.07 Національного медичного університету імені О.О.Богомольця (03057, Київ, пр. Перемоги, 34, фізико-хімічний корпус НМУ)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О.Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий 30.09.2007___р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.І.Толстих

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Опіки займають чільне місце серед травматичних уражень і відрізняються важким перебігом та високою смертністю [Н.Е.Повстяной, 1998]. Основними причинами смерті є опіковий шок, поліорганна недостатність, інфекційні ускладнення та сепсис [Т.Г.Григорьева, 2000; В.К.Гусак и соавт., 2002; D. et al., 2006; M.et al., 2006].

Хоча при опіковій травмі первинно уражується шкіра, однак, патологічний процес охоплює практично всі органи і метаболічні процеси [D.N.Herndon, R.G.Tompkins, 2004; К.et al., 2006]. Обпечена шкіра стає потужним джерелом вільних радикалів та токсичних субстанцій, і вже з перших хвилин в уражених тканинах посилюється утворення супероксидного та гідроксильного радикалів [W.Lu et al., 2002], оксиду азоту та пероксинітриту, нітротирозину [D.Saitoh et al., 2001; J.W.Horton, 2003; А.Rawlingson et al., 2003; R.L.2006], дієнових кон’югатів, малонового діальдегіду [N.S.Nagane et al., 2003; C. Ritter et al., 2003; J.W.Horton, 2003], білкових карбонільних груп [J.W.Haycock et al., 1997], 8-гідрокси-2'-дезоксигуанозину [X.Q. et al., 2007]. Активні форми кисню, оксид азоту, пероксинітрит, продукти пероксидації ліпідів є причиною опікового шоку, опікового набряку, внутрішньосудинного гемолізу, гіперметаболічного та респіраторного синдромів, мультиорганної дисфункції, післяопікової імуносупресії [Y.Xie et al., 1998; J.W.Horton, 2003; A.Rawlingson et al., 2003; M.A.Dubick et al., 2005; Д.А.Левит, И.Н.Лейдерман, 2006].

При опіках значно зростає продукція „середніх” молекул, до складу яких входять високоактивні прозапальні цитокіни (фактор некрозу пухлини-альфа, інтерлейкіни-6, 1-бета та інші), фактори росту, ендотелін, вазоактивні пептиди, пептидні гормони, похідні пуринів та інші [В.Е.Рябинин, Р.И.Лившиц, 1990; Г.П.Козинец та співавт., 2003; N.Tanaka, 2004; С.С.et al., 2006; Н.et al., 2007; Т.Р.et al., 2007]. Ці чинники негативно впливають на метаболізм, ініціюють гіперметаболічний синдром, виявляють вазо-, кардіо-, нейро- і імунодепресивні властивості [A.L.Dugan et al., 2004; A.Kowal-Vern et al., 2005; А.А.Алексеев, 2006; Д.А.Левит, И.Н.Лейдерман, 2006]. В своїй біологічній основі зростання рівнів цитокінів та інших клітинних медіаторів спрямовано на забезпечення процесів саногенезу і, зокрема, формування запальної відповіді. Однак, їх надмірна продукція може мати негативне значення, оскільки вони володіють значною цитотоксичністю і є індукторами апоптозу [U.Gaur, B.B.Aggarwal, 2003; J.W. Horton et al., 2004].

Лікування хворих з опіками вимагає застосування численних лікарських засобів і включає боротьбу з больовим синдромом, інфекцією та системним запальним синдромом, стабілізацію гемодинаміки, корекцію метаболічних порушень [Т.Г.Спиридонова, 2002; D.N.Herndon, 2003; R.K.Montgomery, 2004; F.Pea et al., 2005; А.А.Алексеев, И.Ю.Ларионов, 2006; D. et al., 2006]. Доведена ефективність застосування токоферолу, аскорбінової кислоти, ретинолу та інших антиоксидантів, які не лише обмежують вільнорадикальні процеси, але і відновлюють процеси мікроциркуляції, зменшують запальну відповідь та транслокацію мікроорганізмів з кишечника, виявляють антифібротичну дію [J.W.Horton, 2003; M.A.Dubick et al., 2005; Q.J.et al., 2007; M.D.Maldonado et al., 2007]. Серед перспективних препаратів з антиоксидантними властивостями особливо виділяються триметазидин та мексидол, які не лише прямо взаємодіють з радикалами кисню та активують антиоксидантні ферменти, але і проявляють антигіпоксичні та антиішемічні властивості [К.М.Дюмаев та співавт., 1995; Т.А.Девяткина, та співавт., 1999; А.В.Смирнов та співавт., 1999; A.Grynberg, 2000; C.Guarnieri et al., 2000; M.Ruiz-Meana, 2005]. Доцільність їх використання для корекції опікових уражень не доведена.

Важкі опіки викликають розвиток токсичного гепатиту [І.В.Гунас та співавт., 2003; M.G.Jeschke, 2004], гострої ниркової недостатності [Т.Г.Григорьева, 2000], наслідком яких може бути сповільнення елімінації ксенобіотиків [P.L.Bonate, 1990; U.Jaehde, F.Sorgel, 1995; M.J.Weinbren, 1999; М.Г.Крутиков, 2003] і зростання токсичності лікарських засобів [R.A.Herman et al., 1994; A.V.Maker, D.P.Orgill, 2005]. Однак, на сьогодні відсутні цілісні уявлення про те, в якій мірі і в якому напрямку опікове ураження здатне змінити формат взаємовідносин між організмом та ксенобіотиками. Ця проблема є важливою для нестероїдних протизапальних препаратів, які постійно застосовуються у хворих з опіками для знеболення і профілактики органних уражень [F.Isik, 2003].

Механізми впливу опікового ураження на процеси елімінації ксенобіотиків, а особливо на ферментні системи їх біотрансформаціі не досліджені. Відомим є лише факт зниження вмісту цитохрому Р-450 та деяких монооксигеназних активностей в печінці тварин з опіками. Однак, в цілому характер змін множинних форм цитохрому Р-450 та ферментів кон’югації ксенобіотиків за умов опікового ураження залишається нез’ясованим. Відсутні патогенетично обґрунтовані способи корекції порушень ферментних систем метаболізму ксенобіотиків, зокрема, невідомо, чи можуть препарати з антиоксидантним механізмом дії, такі як мексидол та триметазидин, захистити систему біотрансформації ксенобіотиків від несприятливого впливу опікового ураження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової тематики Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова: ,,Використання модуляторів активності метаболізуючих ферментів та сорбентів в якості засобів корекції фармакологічної активності та токсичності лікарських засобів” (№ держреєстрації – 0101V002832).

Мета дослідження. З’ясувати біохімічні механізми впливу опікової травми шкіри на ферментні системи біотрансформації ксенобіотиків печінки і обґрунтувати можливість корекції несприятливих змін в елімінації ксенобіотиків антиоксидантами триметазидином та мексидолом.

Задачі дослідження:

1. Дослідити вплив опікового ураження шкіри на стан мікросомальних мембран, ультраструктуру печінки щурів та оцінити зв’язок індукованих опіком змін з виразністю інтоксикаційного і запального синдромів, оксидативного та нітрозативного стресу.

2. Вивчити вплив опікового пошкодження шкіри щурів на активність цитохром Р450-залежних монооксигеназ (анілін-, пара-нітрофенол- та ацетанілідгідроксилазні активності, еритроміцин-, амідопірин-, метопролол-та напроксен-деметилазні активності), NADH- та NADPH-редуктаз, арілестерази, УДФ-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрасферази, глутатіон-S-трансферази, вміст глюкуронідів, сульфатів, глутатіону.

3. Дослідити вплив опікової травми на екскрецію з сечею метаболітів тест-препаратів – ацетаніліду та амідопірину та елімінацію нестероїдних протизапальних препаратів диклофенаку натрію і напроксену у щурів та пацієнтів з опіками.

4. Оцінити силу кореляційних зв’язків між показниками оксидативного і нітрозативного стресу, запального процесу, ендогенної інтоксикації та активністю метаболізуючих ферментів і здатністю організму тварин і пацієнтів з опіками до біотрансформації ацетаніліду, амідопірину, диклофенаку натрію і напроксену.

5. Дати біохімічну оцінку гепатопротекторним властивостям триметазидину і мексидолу та оцінити їх здатність захищати ферментні системи біотрансформації ксенобіотиків від несприятливого впливу опікового ураження.

Об’єкт дослідження – щури з термічними опіками шкіри III АБ ступеня площею 5, 10 і 20 %, хворі з опіками шкіри.

Предмет дослідження – показники інтоксикації, запалення, оксидативного та нітрозативного стресу у хворих та тварин; активність ферментів 1 та 2 фаз метаболізму ксенобіотиків; ультраструктурні зміни в печінці щурів; біотрансформація амідопірину та ацетаніліду, елімінація диклофенаку натрію та напроксену; антиоксидантні властивості триметазидину та мексидолу.

Методи дослідження – біохімічні, фармакологічні та морфологічні. Визначення активності множинних форм цитохрому Р450 та ферментів кон’югації в печінці, дослідження екскреції з сечею метаболітів ацетаніліду та амідопірину, вивчення елімінації напроксену та диклофенаку натрію, оцінка оксидативного і нітрозативного стресу, запального синдрому, дослідження ультраструктурної будови печінки, методи статистичної обробки.

Наукова новизна отриманих результатів. Сформульована концепція про системний вплив чинників опікового ураження на процеси біотрансформації ксенобіотиків, який проявляється гальмуванням ферментів першої та другої фази метаболізму чужорідних речовин та відповідними змінами процесів елімінації ксенобіотиків на рівні цілісного організму.

Вперше, за допомогою комплексу біохімічних та електрономікроскопічних методів, знайдені співвідношення між змінами структури печінки та ступенем гальмування ксенобіотик-метаболізуючих ферментних систем печінки в умовах опікового ураження. Фрагментація мембран ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій корелює зі зниженням вмісту в них фосфоліпідів, посиленням пероксидації ліпідів, зменшенням опірності мембран до дії дезоксихолату та трипсину і падінням активності мембрано-зв’язаних ферментів метаболізму ксенобіотиків.

Вперше показано, що під впливом опікового ураження в найбільшій мірі пригнічуються активності асоційовані з цитохромами Р4502Е1, 2С та 3А та активність UDP-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази і глутатіон-S-трансферази, а менш чутливими до дії опікових чинників виявились активності каталізовані цитохромами Р4501А2 та 2D і активність арілестерази.

Встановлено, що глибина післяопікової депресії ферментних систем тісно корелює з виразністю оксидативного та нітрозативного стресу та активністю запального процесу. Зокрема, пригнічення ферментних систем метаболізму ксенобіотиків в найбільшій мірі асоціюється з концентрацією малонового діальдегіду, дієнових кон’югатів, карбонільних груп білків, нітратів та нітритів, фактору некрозу пухлини-альфа та інтерлейкіну-6, посиленням активності прооксидантних ферментів ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот, падінням активності антиоксидантних ферментів – супероксидисмутази та каталази.

Доведено, що депримуючий вплив опікової травми на ферментні системи біотрансформації ксенобіотиків має своїм наслідком сповільнення елімінації диклофенаку натрію та напроксену і зростання їх анальгетичної активності.

Встановлено, що максимальні зрушення в активності цитохром Р450-залежних монооксигеназ, глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази та глутатіонтрансферази, як і зміни фармакокінетичної поведінки лікарських засобів, реєструються протягом першого тижня опікової травми з подальшою нормалізацією цих процесів до кінця місяця, паралельно стиханню явищ оксидативного і нітрозативного стресу та запального процесу.

Вперше доведена здатність триметазидину та мексидолу захищати систему біотрансформації ксенобіотиків від несприятливого впливу опікового ураження і продемостровано, що в основі їх протекторної дії лежать не лише антиоксидантні властивості, але і мембраностабілізуюча дія та здатність попереджувати активацію прооксидантних ферментів ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот і падіння активності супероксиддисмутази і каталази.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про особливості функціонування системи біотрансформації ксенобіотиків в умовах опікового ураження. Встановлено, що опікове ураження шкіри залежно від площі та важкості викликає несприятливі зміни метаболізму ксенобіотиків і, зокрема, приводить до сповільнення елімінації лікарських засобів та зростання їх фармакологічної активності.

У хворих з важкими опіками слід обережно відноситись до призначення диклофенаку натрію і напроксену та інших лікарських засобів, застосування яких спряжене з високим ризиком токсичних ускладнень, а у випадку важкого перебігу опікового ураження слід проводити корекцію їх дози.

Експериментально обґрунтована доцільність призначення антиоксидантних препаратів під час лікування опікової травми. Призначенням мексидолу, а, особливо, триметазидину, вдається значною мірою нівелювати прояви оксидативного та нітрозативного стресу, інтоксикаційного та запального синдромів, зменшити важкість ураження мембранних структур гепатоцитів та ступінь депресії системи метаболізму ксенобіотиків.

З врахуванням того, що найбільш значущі зміни в елімінації лікарських засобів відбуваються в перші два тижні опікової травми, для захисту ксенобіотик-метаболізуючих ферментів доцільно проводити антиоксидантну терапію в гострому періоді опікової травми. Наявність мембранопротективних властивостей у мексидолу та триметазидину дозволяє попереджувати транслокацію кишкових бактерій у внутрішнє середовище організму.

Результати досліджень впроваджені у навчальному процесі та практиці наукових досліджень кафедр загальної та біологічної хімії, фармакології, клінічної фармації і клінічної фармакології Вінницького національного медичного університету, Інституту хімії поверхні НАН України, Українського державного НДІ реабілітації інвалідів м. Вінниці, кафедр медичної хімії Буковинського, Тернопільського, Одеського та Запорізького медичних університетів.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проаналізована наукова література та патентна інформація з обраної проблеми, проведений підбір тематичних хворих. Автор особисто провів експериментальні дослідження, оцінив результати біохімічних досліджень, дав їм інтерпретацію. Біохімічні дослідження виконані в науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії Вінницького національного медичного університету (зав. лабораторією – к.м.н. О.І.Штатько), морфологічні дослідження виконані в науково-дослідному центрі Вінницького національного медичного університету під керівництвом професора І.В.Гунаса. Дисертантом написано всі розділи дисертації, сформульовані висновки та рекомендації, оформлено публікації. В роботах, опублікованих у співавторстві, автору належить основна ідея дослідження та фактичний матеріал.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були оприлюднені на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), на IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуаль-ні питання фармакології”(Вінниця, 2004), на науково-практичній конференції “Біопсихосоціальні аспекти здоров’я” (Вінниця, 2005), IХ Українському біохі-мічному з’їзді (Харків, 2006), на засіданнях обласного товариства біохіміків.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 12 наукових праць: 7 статей у виданнях, затверджених ВАК України (4 з них самостійні), 4 тези наукових конференцій та з’їздів. Видано інформаційний лист.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 172 сторінках тексту, основний зміст роботи - на 142 сторінках. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, 3-х розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, переліку літературних джерел. Список літератури містить 313 джерел (89 вітчизняних робіт, 224 роботи іноземних авторів). Робота проілюстрована 46 таблицями, 17 мікрофотографіями, 1 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Досліди на тваринах. Досліди проведені на 378 білих щурах-самцях масою 149-250 г згідно правил гуманного відношення до експериментальних тварин та затвердженні комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету. Під час дослідів щурі знаходились на традиційному раціоні віварію.

Під тіопенталовим наркозом (з розрахунку 25 мг/кг) був викликаний термічний опік III АБ ступеня площею 20 % від поверхні тіла шляхом прикладання на 6 с. мідної пластини нагрітої до 90 оС на депільовану шкіру спини щурів [І.В.Гунас, 1998]. Частині тварин в шлунок вводили триметазидин (10 мг/кг) чи мексидол (50 мг/кг) протягом 28 днів. Тварин виводили з експерименту під легким ефірним наркозом шляхом декапітації на 1, 3, 7, 14 і 28 добу досліду.

Мікросомну фракцію печінки отримували за S.A.Kamath et al. [1971]. Чистоту фракції тестували за маркерами мітохондрій - глутаматдегiдрогеназа [КФ 1.4.1.2], лізосом - кисла фосфатаза [КФ 3.1.3.2], мiкросом - глюкозо-6-фосфатаза [КФ 3.1.3.9] [А.А.Покровский, А.И.Арчаков, 1968]. Солюбілізацію компонентів мембран вивчали шляхом переосадження мікросом після обробки дезоксихолатом натрію (кінцева концентрація 0,05%), трипсином (40 мкг на 1 мг білка), чи комбінацією цих речовин.

В мікросомній фракції визначали вміст цитохрому Р450, ацетанілід- і анілінгідроксилазну активності за швидкістю утворення пара-амінофенолу, амідопірин-N-, еритроміцин-N-, індометацин-О- та метопролол-О-деметилазні активності - за утворенням формальдегіду [И.И.Карузина, А.И.Арчаков, 1977]. Пара-нітрофенолгідроксилазну активність оцінювали за перетворенням пара-нітрофенолу в пара-нітрокатехол [D.R.Koop, 1986]. Активність NADH і NADPH-редуктаз [КФ 1.6.2.2 і 1.6.2.4] оцінювали за швидкістю відновлення дихлорфеноліндофенолу [И.И.Карузина, А.И.Арчаков, 1977].

Активність УДФ-глюкуронілтрансферази [КФ 2.4.1.17] мікросомальної фракції оцінювали за швидкістю кон’югації пара-нітрофенолу [В.Burchell, Р.Weatheril, 1981]. В постмітохондріальній фракції визначали активність фенолсульфотрансферази [КФ 2.8.2.1] за кон’югацією бета-нафтолу [G.M.Kempen, G.S.Jansen, 1971], глутатіон-S-трансферази [КФ 2.5.1.18] за утворенням кон’югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом (альфа, мю, пі форми ферменту) [W.H.Habig, W.B.Jacobi, 1981; J.P.Ploemen, et al., 1996]; з нітрогліцерином – (мю форма) [W.H.Habig, W.B.Jacobi, 1981; R.Nigam et al., 1996]. Активність арілестерази [КФ 3.1.1.2] оцінювали за швидкістю гідролізу фенілацетату, вміст якого визначали в реакції Хестріна [А.А.Покровский, А.И.Арчаков, 1968].

Активність ксантиноксидоредуктази визначали в постядерному гомогенаті печінки як суму ксантиндегідрогеназної [КФ 1.1.1.204] та ксантиноксидазної [КФ 1.1.3.22] активностей [Y.Xia, J.L.Zweier, 1995; Н.Suzuki et al., 1998], оксидази D-амінокислот [КФ 1.4.3.3] - за перетворенням D-аланіну в піруват [А.D'Aniello et al., 1993], супероксиддисмутази [КФ 1.15.1.1] - за гальмуванням окислення кверцитину [В.А.Костюк та співавт., 1990], каталази - за швидкістю руйнування пероксиду водню [В.С.Асатиани, 1969]. Активність нейтрофільної мієлопероксидази [КФ 1.11.1.7] в гомогенатах печінки та кишечника оцінювали орто-діанізидиновим методом [J.A.Nemzek et al., 2000].

Вміст відновленого глутатiону і глутатіондисульфіду визначали у трихлороцтовому фільтраті в глутатiонтрансферазнiй реакції [К.Asaoka, К.Takahashi, 1981], глюкуронідів - методом Н.Yuki, N.H.Fischman [1963], сульфатів - турбiдиметричним методом [И.А.Цевелева, 1971]. В сироватці крові визначали вміст молекул середньої маси та дієнових кон’югатів спектрофотометрично [Н.И.Габриелян та співавт., 1985; В.Г.Гаврилов, М.И.Мишкорудная, 1983], карбонільних груп білків – по реакції з 2,4-динітрофенілгідразином [R.L.Levine et al., 1994], вміст креатиніну та сечовини –за реакцією з пікриновою кислотою чи диацетилмонооксимом [В.В.Меньшиков, 1987]. Вміст нітритів та нітратів в сироватці крові визначали за реакцією Грісса після осадження білків ацетонітрилом [И.М. Коренман, 1975]. Вміст фосфоліпідів оцінювали за реакцією з феротіоціанатом амонію [А.А.Пентюк та співавт., 1987], білку - біуретовим методом [Г.А.Кочетов, 1980], малонового діальдегіду - за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Ю.В.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972].

Амiдопiрин вводили внутрішньоочеревинно в дозі 30 мг/кг. Метаболіти - вільний та ацетильований 4-амiноантипiрин визначали по реакції утворення iндофенолового барвника з фенолом [Т.А.Попов, О.Б.Леоненко, 1977]. Ацетанiлiд вводили внутрішньоочеревинно в дозі 100 мг/кг. Суму анiлiдних та аміно фенольних метаболітів оцінювали по реакції дiазосполучення, частку амiнофенольних метаболітів - по реакції утворення iндофенолового барвника [И.М.Коренман, 1975; С.Сиггиа, Д.Г.Ханна, 1983; А.А.Пентюк і співавт., 1990], глюкуронiдних метаболітів визначали методом, що дозволяє диференціювати кон'югованi форми i вільну глюкуронову кислоту [Н.Yuki, N.H.Fischman, 1963], вільних та зв'язаних сульфатів - турбiдиметричним методом [И.А.Цевелева, 1971], меркаптурових кислот (глутатiоновi кон'югати) - по реакції з йодом або реактивом Елмана [D.V.Parke, R.T.Williams, 1951; V.R.Doorn et al., 1981].

Анальгетичну дію диклофенаку натрію і напроксену оцінювали за допомогою формалінового тесту, після введення під шкіру задньої лапки 0,1 мл 1% формаліну [J.E.Torres-Lopez еt al., 2002]. Напроксен (10 мг/кг) вводили в шлунок за 30 хв., а диклофенак (3 мг/кг) – в очеревину за 15 хв. до початку тесту.

Для вивчення елімінації диклофенаку натрію препарат вводили в шлунок одноразово в дозі 10 мг/кг, кров для дослідження забирали через 0,5, 1, 2, 4, 6 та 8 год. Напроксен вводили в шлунок одноразово в дозі 50 мг/кг, кров забирали через 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 та 24 год. Вміст диклофенаку натрію та його метаболітів визначали, як описано в одній з робіт [Н.А.Станиславчук та співавт., 1989]. Вміст напроксену визначали після екстракції його з плазми крові хлороформом та розділення на пластинах Силуфол в системі гексан-етилацетат-льодяна оцтова кислота (69,5:30:0,5) за реакцією з пара-диметиламінобензальдегідом [С.М.Полуян и соавт., 1993]. Параметри елімінації препаратів розраховували за двохчастинною моделлю [Л.Е.Холодов, В.П.Яковлев, 1985].

Мікроскопічні дослідження печінки проводили після фіксації в формаліні з подальшим фарбуванням гематоксилин-еозином і заливкою у канадський бальзам [О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982]. Електронно-мікроскопічне дослідження здійснювали на електронному мікроскопі Hitachi-12A.

В клініці обстежено 66 пацієнтів з опіками шкіри, з них 45 чоловіків і 21 жінка. Найчастішими причинами опіків було полум’я, окріп чи пара. Площа опікового ураження у 31 хворого склала менше 10 %, у 12 – від 11 до 20 %, у 14 - 21-30 %, а у 9 хворих - більше 31 %. Опіки легкого, середнього та важкого ступенів діагностовано, відповідно, у 31, 21 і 14 хворих. У 17 пацієнтів спостерігались важкі ускладнення опіків: ураження дихальних шляхів (7 хворих), опіковий шок (5 пацієнтів), сепсис та поліорганна недостатність (5 осіб). Середня тривалість лікування склала 32,9±3,59 днів.

В сироватці крові пацієнтів визначали вміст молекул середньої маси, карбонільних груп білків, малонового діальдегіду, нітратів та нітритів за методами описаними вище. Вміст інтерлейкіну-6 (ІЛ-6) та фактору некрозу пухлини-альфа (ФНП-альфа) - імуноферментними методами [R.Smith, S.Bagloni 1987; Н.Brailly et al., 1994] з використанням наборів фірми IMMUNOTECH, Франція.

Стаціонарні концентрації диклофенаку натрію та напроксену в плазмі крові визначались за годину перед наступним прийомом цих препаратів. Диклофенак (75 мг) вводили внутрішньом’язево, напроксен (1 г) перорально. Кров для дослідження елімінації диклофенаку натрію брали через 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 годин, напроксену – через 1, 2, 4, 6, 8, 10 та 14 годин. Параметри елімінації напроксену та диклофенаку натрію розраховували за двохчастинною моделлю.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Біохімічні та ультраструктурні зміни в печінці щурів з опіковою травмою та їх корекція триметазидином і мексидолом. У щурів з опіками шкіри площею 20% з першої доби і максимально на 3 добу в сироватці крові зростає вміст молекул середньої маси до 0,338±0,017 та 0,365±0,022 (в контролі 0,183±0,010 од./мл), карбонільних груп білків - до 0,415±0,020 та 0,454±0,021 (контроль - 0,222±0,011 од./мл), дієнових кон’югатів - до 1,07±0,047 та 1,28±0,057 (в контролі - 0,57±0,019 од./мл), нітратів і нітритів - до 127,8±7,8 і 157,6±10,2 (контроль - 37,8±3,5 мкмоль/л), відповідно. З 7 доби відбувається поступова нормалізація, але вірогідні зміни реєструються і на 28 добу.

Введення тваринам триметазидину та мексидолу зменшує на 22-29 та 12-17%, відповідно, підвищення рівнів молекул середньої маси, карбонільних груп, дієнових кон’югатів, нітратів та нітритів і сприяє більш швидкій нормалізації цих показників, які на 28 добу практично не відрізнялись від контролю.

Однією з причин активації вільно-радикальних процесів є різке посилення активності ферментів продуцентів активних форм кисню та падіння активності антиоксидантних ферментів. На 1 і 3 добу досліду активність в печінці ксантиноксидази зросла до 1,88±0,11 і 1,79±0,11 (контроль - 0,90±0,060 нмоль/хв. на 1 мг білка), оксидази D-амінокислот до 4,45±0,28 і 4,73±0,22 (в контролі - 1,81±0,14 нмоль/ хв. на 1 мг білка), тоді як активність каталази впала до 320±31 та 304±18 (в контролі 717±70 мкмоль/хв. на 1 мг білка), а супероксидисмутази - до 28,8±2,69 і 26,5±1,76 (в контролі 65,6±3,40 од,), відповідно. З 7 доби починається відновлення і на 28 добу активність каталази і супероксиддисмутази нормалізувалась повністю, а ксантиноксидази і оксидази D-амінокислот - частково. Введення мексидолу, а особливо триметазидину, суттєво зменшує зміни в активності ферментів при опіковому ураженні.

Опікова травма викликає значні зміни з боку мембранного апарату печінки. Так, на 3 та 7 добу рівень фосфоліпідів в мікросомній фракції зменшується до 4,11±0,18 і 3,92±0,25 мг/г печінки (в контролі - 6,00±0,19), вміст малонового діальдегіду зростав до 34,8±1,98 та 41,4±2,63, проти 10,2±0,79 нмоль/мг білка в контролі. Застосування антиоксидантів зменшувало масштаби змін цих показників і прискорювало їх нормалізацію. Так, якщо рівень малонового діальдегіду у нелікованих тварин на 3 день досліду зростав в 3,4 рази, то у щурів, що отримували триметазидин чи мексидол – лише в 2,3 та 2,4 рази, відповідно.

Досліди по солюбілізації підтвердили розвиток пошкоджень клітинних мембран у обпечених тварин. Якщо у інтактних щурів дезоксихолат натрію вилучав з мікросомальних мембран 6,5±0,87% білку, 3,4±0,59% фосфоліпіду, 13,7±0,88% активності NADH-редуктази, 7,9±0,91% активності NADPH-редуктази і 53,0±0,90% арілестерази, то після нанесення опіку частка солюбілізованих компонентів мембран зростає до 19,4±1,45%, 13,5±1,40%, 29,4±1,50%, 16,8±1,21% та 77,3±1,15%, відповідно. Подібні дані реєструються і при використанні в якості солюбілізуючого агента трипсину чи трипсину в поєднанні з дезоксихолатом. Триметазидин і мексидол підвищують стабільність мембран, і, наприклад, у тварин, що їх отримували, дезоксихолат натрію вилучав лише 10,4±1,29 та 14,8±1,19% білка, тоді як у нелікованих щурів - 19,4±1,45%.

Свідченням пошкодження клітинних мембран є факт посилення транслокації мікроорганізмів з порожнини кишечнику в його стінку та печінку, про яку судили по активності мієлопероксидази нейтрофілів. Так, на 7 добу з моменту нанесення опіку активність мієлопероксидази в печінці та кишечнику зросла в 4,4 та 3,8 рази (до 2,44±0,13 та 8,73±0,47 при 0,56±0,05 та 2,31±0,15 мкмоль/хв. на 1 мг білка в контролі, відповідно). До кінця місяця бар’єрна функція кишечника поновлюється, і цей процес значно прискорюється при введенні антиоксидантів, причому, протекторна дія триметазидину є більшою, ніж у мексидолу.

Морфологічні дослідження вказують на те, що ультраструктура печінки страждає вже з першого дня опікового ураження, коли на тлі судинних розладів розвиваються дистрофічні і запально-деструктивні зміни гепатоцитів, пошкодження їх мембранного апарату, руйнування кріст, а іноді і зовнішньої мембрани мітохондрій. На 3 - 7 добу посилюються дистрофічні та некротичні зміни гепатоцитів, розлади мікроциркуляції, руйнування мембран мітохондрій, ядер та ендоплазматичної сітки. З 14 доби на тлі дистрофічних та деструктивних змін стають помітними репаративні процеси (зокрема проростання капілярів в зони некрозу), а з 28 доби в значній частині гепатоцитів відновлюється структура ядер і мітохондрій, гранулярного та гладенького ендоплазматичного ретикулуму, однак повної нормалізації структури печінки ще не відбувається.

Введення тваринам мексидолу та триметазидину суттєво зменшувало мас-штаби пошкоджень печінки, хоча повністю не попереджувало їх. Вже з першого дня досліду зменшувалась виразність судинних розладів, дистрофічних та некротичних процесів в печінці. Триметазидин виявився більш ефективним протектором, ніж мексидол. Якщо при лікуванні мексидолом стан печінки на 28 добу лише наближається до норми, то при застосуванні триметазидину структура печінки повністю відповідає нормі, а завершення патологічного процесу в печінці було в меншій мірі пов’язаним з процесами фіброзування.

Вплив опікового ураження шкіри на ферментні системи метаболізму ксенобіотиків в печінці щурів та процеси їх елімінації. Вже з першої доби в мікросомній фракції печінки щурів з опіком шкіри знижується (на 38%) вміст цитохрому Р450 та монооксигеназні активності асоційовані з цитохромами Р4502Е1, 2С та 3А - в 2,1, 1,98 та 1,78 рази, відповідно (табл. 1). На 3 та 7 дні експерименту ці зміни поглиблювались, однак з 14 дня ставала помітною тенденція до їх нормалізації, хоча повного повернення до норми не відбувалось і на 28 добу. Дещо меншими були зміни активностей асоційованих з цитохромами Р4501А2 та 2D (ацетанілідгідроксилаза та метопролол-О-деметилаза). Так, активність ацетанілідгідроксилази на першу добу опікової травми падає лише в 1,4 рази (з 1,88±0,101 до 1,34±0,07 нмоль/хв. на 1 мг білка). Менш значними виявилось і зміни редуктаз. Зокрема, на перший день опікового ураження активність NADH- і NADPH-редуктаз дихлорфеноліндофенолу падає зі 88,7±4,72 та 78,1±4,13 в контролі до 60,4±4,08 та 52,3±3,82 нмоль/хв. на 1 мг білка, відповідно. Мексидол, а особливо триметазидин, ефективно протидіють падінню вмісту цитохрому Р450 та активності його множинних форм.

Таблиця 1

Вміст цитохрому Р450 (нмоль/мг білку) та активність (нмоль/хв. на 1 мг білка) його ізоформ в печінці щурів з опіком шкіри площею 20% на фоні введення триметазидину чи мексидолу (М±m; n=8-10)

Групи тварин | Цитохром Р450 | Анілінгідроксилаза

(P4502E1) | Напроксен-О-деметила-за (P4502С) | Еритроміцин-N-деметилаза

(P4503А)

Контроль | 0,86±0,05 | 0,84±0,036 | 0,89±0,038 | 1,00±0,050

1 доба | Опік | 0,53±0,03* | 0,40±0,022* | 0,45±0,019* | 0,56±0,030*

Опік+триметазидин | 0,67±0,04* | 0,55±0,029* | 0,64±0,032* | 0,76±0,030*

Опік + мексидол | 0,58±0,03* | 0,48±0,031* | 0,51±0,020* | 0,67±0,024*

3 доба | Опік | 0,47±0,02* | 0,32±0,019* | 0,39±0,032* | 0,48±0,030*

Опік+триметазидин | 0,59±0,03* | 0,49±0,029* | 0,62±0,024* | 0,70±0,030*

Опік + мексидол | 0,53±0,02* | 0,40±0,018* | 0,55±0,051* | 0,60±0,031*

7 доба | Опік | 0,50±0,02* | 0,45±0,030* | 0,46±0,028* | 0,58±0,030*

Опік+триметазидин | 0,68±0,04* | 0,72±0,036* | 0,66±0,029* | 0,77±0,024*

Опік + мексидол | 0,59±0,03* | 0,56±0,037* | 0,56±0,029* | 0,68±0,023*

14 доба | Опік | 0,59±0,02* | 0,54±0,026* | 0,51±0,033* | 0,63±0,026*

Опік+триметазидин | 0,79±0,03* | 0,76±0,029* | 0,72±0,026* | 0,78±0,028*

Опік+ мексидол | 0,69±0,03* | 0,68±0,039* | 0,61±0,025* | 0,70±0,018*

28 доба | Опік | 0,75±0,04* | 0,67±0,051* | 0,63±0,028* | 0,85±0,025*

Опік+триметазидин | 0,87±0,04 | 0,84±0,040 | 0,88±0,028 | 1,00±0,032

Опік + мексидол | 0,80±0,05 | 0,81±0,030 | 0,84±0,033 | 0,96±0,034

Примітка: * - р < 0,05 порівняно з контролем.

Суттєвого гальмування при опіках зазнають процеси кон’югації (табл. 2), а максимальні зрушення активності фенолсульфотрансферази, глутатіон-S-трансферази, UDP-глюкуронілтрансферази і рівня глутатіону припадають на 3 день досліду. Нормалізація реакцій кон’югації починається на 7 день експерименту, і на 28 добу активність глутатіон-S-трансферази та рівень глутатіону вже не відрізняються від контролю, а активність фенолсульфотрансферази та UDP-глюкуронілтрансферази наближаються до нього. Триметазидин та мексидол достатньо ефективно захищали ферменти кон’югації ксенобіотиків від опікового пошкодження і прискорювали нормалізацію їх активності.

Опікове ураження викликає також і деяке пригнічення гідролітичних реакцій. Зокрема, активність арілестерази в мікросомній фракції печінки тварин з опіками шкіри в перший день досліду падає на 38% (з 4194±200 в контролі до 2595±116 нмоль/хв. на 1 мг білка). Активність арілестерази поверталась до норми на 28 день експерименту.

Таблиця 2

Активність ферментів кон’югації (нмоль/хв. на 1 мг білка) та вміст відновленого глутатіону (мкмоль/г печінки) в печінці щурів в різні терміни після опіку шкіри площею 20 % на фоні введення триметазидину чи мексидолу (М±m; n=8-10)

Групи тварин | UDP-глюку-ронілтранс-фераза | Фенолсульфотрансфераза | Глутатіон-S-трансфераза |

Відновле-ний глутатіон

Контроль | 2,86±0,15 | 0,35±0,014 | 380±24 | 6,99±0,32

1 доба | Опік | 1,47±0,063* | 0,18±0,012* | 193±15* | 4,75±0,21*

Опік+триметазидин | 1,83±0,062* | 0,25±0,010* | 262±16* | 5,73±0,20*

Опік + мексидол | 1,64±0,047* | 0,21±0,012* | 238±17* | 5,24±0,18*

3 доба | Опік | 1,33±0,059* | 0,16±0,012* | 161±16* | 4,40±0,20*

Опік+триметазидин | 1,74±0,062* | 0,23±0,012* | 278±16* | 5,84±0,24*

Опік + мексидол | 1,55±0,070* | 0,20±0,011* | 230±16* | 5,24±0,24*

7 доба | Опік | 1,53±0,061* | 0,20±0,012* | 214±17* | 5,14±0,22*

Опік+триметазидин | 1,89±0,063* | 0,28±0,013* | 305±20* | 6,17±0,18*

Опік + мексидол | 1,76±0,070* | 0,24±0,011* | 267±16* | 5,74±0,14*

14 доба | Опік | 1,66±0,059* | 0,23±0,013* | 272±16* | 5,50±0,23*

Опік+триметазидин | 2,06±0,067* | 0,31±0,012* | 314±18 | 6,45±0,20*

Опік+ мексидол | 1,85±0,057* | 0,27±0,012* | 305±17* | 5,93±0,15*

28 доба | Опік | 2,08±0,080* | 0,28±0,013* | 334±24 | 6,44±0,24

Опік+триметазидин | 2,83±0,088 | 0,37±0,016 | 383±23 | 6,94±0,29

Опік + мексидол | 2,64±0,111 | 0,34±0,017 | 354±23 | 6,70±0,29

Примітка: * - р < 0,05 порівняно з контролем.

Для адекватної оцінки впливу опікової травми на систему біотрансформаціі ксенобіотиків ми дослідили метаболізм ацетаніліду та амідопірину в цілісному організмі щурів, вивчаючи екскрецію з сечею метаболітів цих тест-препаратів.

Зміни в метаболізмі амідопірину та ацетаніліду були найбільш глибокими у тварин з важкими опіками (площа 20%). Вони реєструються вже з першої доби після опіку і стають максимальними на третю добу. На 7 добу починається поступова нормалізація процесів біотрансформації цих речовин, яка однак повністю не завершується на 28 добу досліду. У щурів з опіками площею 10 та 5% метаболізм ацетаніліду та амідопірину змінювався в меншій мірі - на 28 день екскреція метаболітів цих тест-препаратів вже не відрізнялась від контролю.

Дослідження метаболізму амідопірину підтвердило, що опікове ураження викликає пригнічення реакції окислювального N-деметилювання, які каталізується членами підродини цитохрому Р4503A та P4502С [K.V.Ramana, K.K.Kohli, 1999] і реакції ацетилування, що каталізуються N-ацетилтрансферазою [J.A.Agundez et al., 1995]. Про це свідчить зниження екскреції головного продукту деметилування амідопірину - 4-аміноантипірину та зменшення частки ацетильованого 4-аміноантипіріну. Наприклад, на 3 день після нанесення опіку шкіри площею 20% екскреція загального 4-аміноантипірину падає до 1,13±0,076 мкмоль/100 г маси, при 5,26±0,28 в контролі, а частка ацетильованого 4-аміноантипірину – до 60,6±1,85% при 81,5±0,94% в контролі.

Вивчаючи біотрансформацію ацетаніліду ми довели, що при опіках пригнічується як реакція його гідроксилування до амінофенолу (ця реакція каталізується цитохромом Р4501А2) [G.Liu et al., 1991], так і окислення останнього до реакційно-здатного метаболіту N-ацетил-пара-бензохіноніміну, яке, як відомо, йде за участю цитохрому P4502Е1 [P.T.Manyike et al., 2000]. Про це свідчить зменшення екскреції у обпечених тварин загальної кількості амінофенольних метаболітів та меркаптурових кислот (останні є продуктами деградації глутатіонових кон’югатів N-ацетил-пара-бензохіноніміну). Так, на 3 день після нанесення опіку шкіри площею 20% екскреція амінофенольних метаболітів упала зі 41,3±1,66 мкмоль/100 г маси до 11,1±0,97, а меркаптурових ккислот зі 3,50±0,21 до 1,19±0,13. Суттєво зменшується також і екскреція з сечею тварин з опіками глюкуронідних та сульфатних метаболітів, що свідчить про гальмування реакцій кон’югації, каталізованих UDP-глюкуронілтрансферазою та фенолсульфотрансферазою. Так, на 3 день після нанесення опіку шкіри площею 20% екскреція глюкуронідних метаболітів ацетаніліду падає зі 22,5±0,85 мкмоль/100 г маси до 5,22±0,25, а сульфатних метаболітів зі 15,7±0,94 до 3,08±0,23, відповідно. Мексидол, а особливо триметазидин, ефективно зменшували масштаби змін в біотрансформації ацетаніліду та амідопірину індукованих опіками шкіри і сприяли практично повній нормалізації їх метаболізму до 28 добу досліду.

Опікова травма викликає сповільнення елімінації диклофенаку натрію та напроксену з плазми крові щурів. Так, наприклад, на 240 хв. з моменту введення диклофенаку натрію його концентрація в плазмі крові у щурів з опіками перевищувала таку у інтактних тварин на 24%, а 360 і 480 хв. – на 40 та 76%, відповідно. Аналогічно концентрація напроксену в порівнянні з контролем на 720 хв. є вищою на 66%, а на 1440 хв. – на 156%. При цьому у тварин з опіками період напіввиведення диклофенаку натрію зростає до 324±18 хв. при 177±14,0 хв в контролі, а напроксену – до 13,2±0,35 год, при 7,78±0,36 год в контролі. Кліренс диклофенаку натрію та напроксену у тварин з опіками падав, відповідно, до 4,77±0,25 та 0,20±0,01 мл/хв. при 8,04±0,45 та 0,37±0,01 мл/хв.

Застосування триметазидину та, в меншій мірі, мексидолу, суттєво зменшувало негативний вплив опікового ураження шкіри щурів на процеси елімінації диклофенаку натрію та напроксену, хоча і повністю не відміняло його.

Затримка елімінації диклофенаку натрію та напроксену супроводжується значним посиленням їх фармакологічної дії, що доведено за допомогою формалінового тесту. Це проявлялось зменшенням кількості похитувань лапкою в 1,5 та 3 рази, облизувань і покусувань лапки – майже в 1,5-2,5 рази, відповідно, і повним зникненням вокалізації в порівнянні з контролем. Відновлення звичайної реакції на дію препаратів відбулося лише на 14 добу.

Процеси елімінації диклофенаку натрію та напроксену у пацієнтів з опіками. Доведено, що важка опікова травма шкіри людей супроводжуються розвитком синдромів ендогенної інтоксикації та системної запальної відповіді, оксидативного та нітрозативного стресу, які максимально проявляються в перші два тижні з тенденцією до згасання в подальшому. Виявлена чітка залежність рівнів молекул середньої маси, малонового діальдегіду, карбонільних груп, нітратів і нітритів, фактору некрозу пухлини-альфа та інтерлейкіну-6 в сироватці крові від площі та важкості опікового ураження. В порівнянні з контролем на 1-5 добу опікової травми в сироватці крові зростає вміст молекул середньої маси в 2,38 рази (до 0,597±0,029 од. при 0,251±0,010 в контролі), малонового діальдегіду – в 2,43 рази (до 33,3±1,48 мкмоль/л при 13,7±0,62 в контролі), карбонільних груп білків – в 2,35 рази (до 105,6±3,52 од. при 45,0±2,42 в контролі), нітратів і нітритів – в 2,3 рази (до 0,358±0,014 мкмоль/л при 0,154±0,010 в контролі), фактору некрозу пухлини-альфа – в 2,6 рази (до 144,5±5,35 нг/л при 55,2±4,28 в контролі), а інтерлейкіну-6 – в 3,1 рази (до 19,8±0,74 нг/л при 6,35±0,82 в контролі). В подальшому (6-15 доба) ці зміни поглиблюються, і лише з 3 тижня йде поступова нормалізації цих показників. Однак навіть на момент виписки пацієнтів, частина показників ще перевищує контрольні значення.

В гострий період опікової травми реєструється сповільнення елімінації диклофенаку натрію та напроксену. Про це свідчить більш високі їх рівні в плазмі крові пацієнтів в перші дні опікової травми порівняно з періодом одужання. Так, стаціонарна концентрація диклофенаку натрію та напроксену в перші 5 днів складала, відповідно, 0,32±0,010 та 54,0±1,80 мкг/мл, а на момент виписки - 0,22±0,008 та 40,0±1,99 мкг/мл. Є чітка відповідність між важкістю опіку і зростанням стаціонарної концентрації диклофенаку і напроксену в плазмі крові і, зокрема, у хворих з площею опіків більше 31 % рівень цих речовин в плазмі крові виявився на 23 і 28% більшим, ніж у пацієнтів з опіками площею менше 10%.

Опікове ураження шкіри веде також і до пригнічення процесів кон’югації метаболітів диклофенаку натрію з глюкуроновою кислотою. Зокрема, якщо на момент одужання рівень глюкуронідів диклофенаку в сечі пацієнтів складав 5,85±0,31 мкг/мл, то в перші дні після госпіталізації - лише 3,77±0,40 мкг/мл, а співвідношення глюкуроніди/незмінений диклофенак в ці терміни спостереження складало, відповідно, 16,6±0,62 та 8,25±0,54. Екскреція глюкуронідів диклофенаку з сечею була тим меншою, чим важчою була опікова травма, і наприклад, вміст в сечі глюкуронідів диклофенаку у пацієнтів з площею опіків понад 30% був вдвічі меншим, ніж у хворих з площею опіків менше 10%. Розрахунки параметрів фармакокінетики також засвідчили факт сповільнення елімінації диклофенаку натрію та напроксену у хворих з опікам.

Так, якщо в перші 5 днів з моменту отримання опікового ураження період напівелімінації, площа під кривою концентрація/час та кліренс диклофенаку натрію складали, відповідно, 2,21±0,12 год, 7,18±0,31 мкг*год*мл-1 та 175,5±7,60 мл/хв., то на момент одужання