НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
ДІМОВА МАРІЯ ІВАНІВНА
УДК 579.864.1:615.331
БАКТЕРІОЦИНОГЕННІ І ПРОБІОТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ЛАКТОБАЦИЛ
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата
біологічних наук
Київ – 2007
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України
Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України
Коваленко Надія Костянтинівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фізіології промислових мікроорганізмів.
Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кіпріанова Олена Андріївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу антибіотиків;
доктор медичних наук, старший науковий співробітник Поліщук Олена Іванівна, Державна установа “Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського” АМН України, завідуюча лабораторії загальної мікробіології.
Захист відбудеться 21 листопада 2007 року о 10 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154.
Автореферат розісланий " 19 " жовтня 2007 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Антагоністичні властивості молочнокислих бактерій (МКБ) – предмет зацікавленості вчених та спеціалістів різних галузей. Головним метаболітом і антагоністом цих мікроорганізмів є молочна кислота. Однак, окрім молочної кислоти, вони можуть синтезувати й інші речовини, які виступають як антимікробний фактор, зокрема, бактеріоцини. Аналіз літературних даних свідчить про те, що в останні роки дослідження з бактеріоциногенії молочнокислих бактерій проводяться досить активно, але ще існує багато напрямків в цій області, які висвітлені недостатньо. В першу чергу, це стосується екології та розповсюдження штамів-продуцентів цих біологічно активних речовин. Переважна більшість описаних молочнокислих бактерій, що синтезують ці субстанції, були виділені з харчових продуктів. Майже відсутні дані про бактеріоциногенні МКБ холоднокровних і теплокровних тварин. В останні роки з’явилися дані, що бактеріоцини грампозитивних бактерій, зокрема, молочнокислих, діють не тільки на близькоспоріднені види, тому важливо дослідити це явище з якомога більшою кількістю тест-культур. Подібні дослідження відкривають ще одну сторінку біології бактеріоцинів та розширюють сфери їх застосування.
Зв’язок роботи з науковими програмами. Робота виконана у відповідності з напрямом науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в межах бюджетної тематики відділу фізіології промислових мікроорганізмів “Систематика і біосинтетичні можливості бактерій і дріжджів. Розробка наукових основ створення за їх допомогою нових біотехнологічних препаратів і процесів” номер 0104U003000 (2004-2008 рр.); з прикладною бюджетною тематикою відділу “Розробка наукових основ створення біотехнології одержання біоконсервантів з використанням пробіотичних штамів молочнокислих бактерій” номер 0104U003196, в межах теми “Роль мікроорганізмів у функціонуванні живих систем: фундаментальні проблеми та біоінженерні рішення. Пробіотична активність молочнокислих бактерій: фундаментальні аспекти і створення препарату” номер 0106U009464 (2006-2008 рр.) відповідно конкурсу спільних проектів учених НАНУ та Сибірського відділення РАН.
Мета та завдання досліджень. Метою роботи був пошук серед штамів молочнокислих бактерій, виділених з різних природних джерел, тих, що проявляють бактеріоциноподібну активність; вивчення властивостей бактеріоциногенного штаму; дослідження бактеріоциноподібної речовини.
Згідно поставленої мети робота включала такі завдання:
1) виділення штамів молочнокислих бактерій з різних природних джерел;
2) ідентифікація ізолятів з використанням мікробіологічних та молекулярно-генетичних методів;
3) вивчення антагонізму молочнокислих бактерій між близькоспорідненими штамами;
4) пошук та відбір бактеріоциногенних штамів;
5) вивчення властивостей бактеріоциноподібної речовини;
6) вивчення спектру дії бактеріоциноподібної речовини, а також штаму Lactobacillus plantarum УКМ В-2705;
7) дослідження чутливості культури L. plantarum УКМ В-2705 до антибіотиків;
8) вивчення адгезивних властивостей штама – продуцента бактеріоцина і дослідження впливу фізико-хімічних факторів на процес адгезії;
10) первинне вивчення природи адгезинів штаму L. plantarum УКМ В-2705.
Об’єктом дослідження були 67 штамів паличкоподібних молочнокислих бактерій - 55 колекційних культур, що зберігались в колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ НАНУ, 12 штамів - свіжевиділені ізоляти з різних екологічних ніш, а також 26 штамів ентерококів, свого часу виділених з шлунково-кишкового тракту (ШКТ) людей із захворюваннями травного тракту.
Предметом дослідження були: антагоністична активність молочнокислих бактерій, неасоційована та асоційована з синтезом бактеріоциноподібної речовини; бактеріоциноподібна речовина; пробіотичні властивості штаму L. plantarum УКМ В-2705.
Методи дослідження. Сучасні мікробіологічні, біохімічні, молекулярно-генетичні, а також метод виявлення бактеріоциногенної активності. В дослідах використовувались статистичні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше протестовано молочнокислі бактерії з різних природних джерел, включно таких, як ШКТ дельфінів на бактеріоцинсинтезуючу активність. Знайдено штам молочнокислих бактерій, що проявляв бактеріоциноподібну активність.
Використання широкого діапазону фенотипових властивостей молочнокислих бактерій дозволило ідентифікувати нові штами, ізольовані з різних природних джерел, і культури, які протягом тривалого часу зберігалися в умовах ліофільного анабіозу.
Вивчено властивості та спектр дії виявленої бактеріоциноподібної речовини. Показано дію концентрованого бактеріоцину на клінічно значущі умовно патогенні мікроорганізми родини Enterobacteriaceae. Вперше проведено дослідження з дії бактеріоцину на ентерококи, виділені з ШКТ здорових людей та людей із захворюваннями травного тракту; показано високий процент чутливості штамів, виділених від людей із патологіями кишечника.
Вивчено пробіотичні властивості штама L. plantarum УКМ В-2705 – продуцента бактеріоциноподібної речовини. Штам ідентифіковано з використанням генетичних методів (ПЛР). Вивчено його відношення до 57 антибіотиків різних класів. Виявлено адгезивні властивості штаму і вивчена природа адгезинів.
Практичне значення одержаних результатів. Шляхом відбору серед культур молочнокислих бактерій, виділених з різних природних джерел, відібрано штам Lactobacillus plantarum УКМ В-2705, який проявляв бактеріоциноподібну активність. Продуценти бактеріоцинів є перспективними для використання їх в харчовій промисловості та медицині. Вивчені основні пробіотичні властивості культури L. plantarum УКМ В-2705. Показано, що бактеріоциноподібна речовина та штам-продуцент діяли на умовно-патогенні мікроорганізми, зокрема, сконцентрований бактеріоцин штаму діяв на референс-штами K. pneumoniae, S. enterica ssp. enterica, P. vulgaris, E. coli, також на штами роду Enterococcus. Крім того, показано адгезивність штаму-продуцента до епітеліоцитів людини. Ці дані в сукупності визначають можливість перспективного використання штаму-продуцента та бактеріоциноподібної речовини при розробці пробіотичних препаратів.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем зібрана та проаналізована наукова література з теми дисертації, розроблені та удосконалені методичні підходи щодо виконання поставленої мети, одержані основні експериментальні дані, узагальнено отримані результати, проведено їх статистичну обробку. Були виділені штами молочнокислих бактерій з зобу бджіл, кишечника дельфінів та ШКТ людей, проведено скринінг культур на антагонізм по відношенню до близькоспоріднених штамів, включно на бактеріоциногенність. Здобувачем особисто було проведено ідентифікацію штамів молочнокислих бактерій з використанням мікробіологічних методів, в тому числі АРІ-тестування, а також реідентифікація штаму L. plantarum УКМ В-2705 за допомогою генетичних методів, зокрема методу полімеразної ланцюгової реакції з використанням родоспецифічних та видоспецифічних праймерів. Було вивчено властивості бактеріоциноподібної речовини, відношення до антибіотиків, адгезивні властивості та природу адгезинів штаму L. plantarum УКМ В-2705. Інтерпретація отриманих результатів та підготовка публікацій за результатами роботи проводились спільно з науковим керівником член-кор. НАН України, проф., д.б.н. Коваленко Н. К.
Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на І Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих вчених “Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2003); Десятому з’їзді товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); І міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005); міжнародній науковій конференції “Euprobio 2005” (Краків, Польща, 2005); ІІ Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих вчених “Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2005); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2005); ІІ міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2006); 10-й Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология – наука ХХІ века” (Пущино, Росія, 2006); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2006); ІІІ міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2007); Міжнародному конгресі “Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты” (Санкт-Петербург, Росія, 2007).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових робіт (5 статей у фахових журналах, 7 – в тезах доповідей).
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 136 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення), висновків, списку використаних джерел, що містить 230 джерел, з них 181 - закордонних авторів. Робота ілюстрована 38 таблицями і 10 рисунками.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури описано сучасний стан знань про явище бактеріоциногенії молочнокислих бактерій. Описано класифікацію бактеріоцинів. Розглянуто їх властивості, зокрема, хімічну природу, закономірності продукції, локалізацію генів, що відповідають за продукцію бактеріоцина. Відображено перспективи застосування цих антимікробних речовин, зокрема, штамів-продуцентів бактеріоцинів при розробці пробіотиків.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Досліджували 67 штамів молочнокислих бактерій: 55 колекційних культур, що зберігались в колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ НАНУ, 12 штамів – свіжевиділені ізоляти різних природних еконіш - ШКТ людини (дитини), зоб бджоли Apis mellifera, дистальний відділ ШКТ дельфінів (родина Delphinidae). Об'єктами дослідження також були 26 штамів ентерококів, свого часу виділених з ШКТ людей із захворюваннями травного тракту.
Колекційні культури попередньо оживляли у середовищі МРС в нашій модифікації, після цього їх активізували шляхом пасажів в тому ж середовищі. Для отримання монокультур молочнокислих бактерій з ШКТ людини використовували свіжовиділені фекалії дитини. Для отримання культур МКБ з зобу бджоли комах препарували за методом Є.Н. Павловського [Коваленко, 1991].
Належність ізольованих нами культур до групи молочнокислих бактерій встановлювали шляхом дослідження морфології клітин і колоній бактерій, забарвлення за Грамом, спороутворення, рухливості, каталазної, нітратазної активності, здатності утворювати аміак з аргініну, газ із глюкози, виявлення дихальних систем, що мають цитохроми, росту при різних температурах [Квасников, Нестеренко, 1975; Егоров, 1989].
Ідентифікацію штамів на генетичному рівні проводили методом ПЛР з використанням родоспецифічних праймерів для роду Lactobacillus [Dubernet et al., 2002]. Видову ідентифікацію штама L. рlantarum УКМ В-2705 здійснювали, використовуючи специфічні праймери [Лащевський, 2005]. Виділення ДНК проводили за методом [Maniatis et al., 1982]. Фенотипові ознаки штамів визначали за допомогою АРІ-систем для лактобацил ("BioMerieux", Франція).
26 штамів ентерококів, виділені з ШКТ людей з патологіями кишечника, ідентифікували за основними властивостями цього роду мікроорганізмів, вказаних у визначнику Bergey's. Ідентифікацію штамів до виду проводили за допомогою систем АРІ 20 Strep ("BioMerieux", Франція).
Антагоністичну активність штамів МКБ визначали за методами лунок в агарі та подвійного агару [Егоров, 1986; Ocana et al., 1999, 2004]. Проводилось два типи дослідів з вивчення антагоністичної активності щодо близькоспоріднених видів: а) пошук штамів, що пригнічують ріст тест-культур, без визначення природи антибактеріального фактору; б) скринінг штамів, що показують інгібуючий ефект, не пов’язаний із синтезом молочної кислоти та пероксиду водню.
Первинне дослідження природи антагоністичної речовини, що продукував відібраний штам, проводили шляхом дії на неї ферментами: протеазами (трипсин, хімотрипсин, протеїназа К), б-амілазою, ліпазою, каталазою. Також вивчали вплив різних температур та рН на прояв активності антибактеріального фактору. Лізоцимну активність бактеріоциноподібної речовини вивчали за методом Ленцнера та співав. [цит. Коваленко, Касумова, 1996]. Діапазон молекулярної маси бактеріоцина, в межах якого він знаходиться, було визначено за методикою [Харді, 1989]. Проводили виділення плазміди зі штаму L. plantarum УКМ В-2705 [Харді, 1989]. Проведено досліди з кінетики росту штаму-продуцента та кінетики бактеріоцинопродукції [Ocana et al., 1999, 2004]. З метою одержання більших кількостей бактеріоциноподібної речовини здійснювали індукування штама-продуцента мітоміцином С та налідиксовою кислотою [Харді, 1989]. Для вивченння спектру дії бактеріоциноподібної речовини використовували його нативний та сконцентрований препарат. При концентрації грубого препарата бактеріоцину керувались методами [Reenen et al., 1998; Paynter et al., 1997]. Спектр дії бактеріоциноподібної речовини і штаму-продуцента вивчали на декількох групах тест-культур. Зокрема, як тест-культури слугували референтні штами умовно-патогенних мікроорганізмів: Pseudomonas aeruginosa УКМ (Українська колекція мікроорганізмів)B-900 (ATCC 9027), Staphylococcus aureus УКМ B-904 (ATCC 25923 (F-49)), Proteus vulgaris УКМ B-905 (ATCC 6896), Escherichia coli УКМ B-906 (ATCC 25922 (F-50)), Bacillus cereus УКМ B-908 (ATCC 11778), Mycobacterium smegmatis УКМ В-917 (АТСС 607), Staphylococcus epidermidis УКМ B-919 (ATCC 12228), Klebsiella pneumoniae УКМ B-920 (ATCC 10031), Salmonella enterica ssp. enterica sv. abony УКМ B-921 (NCTC 6017), Candida albicans УКМ Y-1918 (ATCC 885-653). Штами були надані співробітниками відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Крім того, в роботу була взята культура Listeria monocytogenes NCTC 5105, надана співробітником Державної установи “Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського” АМН України к.б.н. Колтуковою Н.В. Також використовували штами Enterococcus faecalis УКМ В-2510, E. faecium УКМ В-2534.
Чутливість L. рlantarum УКМ В-2705 до дії 57 антибіотиків різних класів визначали на середовищі МРС, використовуючи диско-дифузійний метод. Інтерпретацію результатів здійснювали за рекомендаціями [Charteris et al., 1998]. Адгезивну активність штаму L. рlantarum УКМ В-2705 вивчали на клітинах букального епітелію людини розгорнутим методом [Брилис та ін., 1986]. Природу адгезинів досліджували шляхом обробки бактеріальних клітин ферментами перед змішуванням їх з епітеліоцитами [Greene, Klaenhammer, 1994]. Також вивчали вплив фізико-хімічних факторів на процес адгезії, а саме вплив рН середовища (в діапазоні 2,0-8,0) та температури (4°С, 27°С, 37°С, 56°С ) [Брилис та ін., 1986].
Статистичну обробку проводили за традиційними методами варіаційної статистики [Кучеренко та ін., 2001].
ІДЕНТИФІКАЦІЯ ШТАМІВ МОЛОЧНОКИСЛИХ БАКТЕРІЙ З РІЗНИХ ПРИРОДНИХ ЕКОНІШ
Ідентифікацію МКБ проводили за допомогою вивчення морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних властивостей. 12 нових ізолятів ідентифікували на генетичному рівні до роду. Вони віднесені до роду Lactobacillus. 62 колекційні культури також були визначені як представники роду Lactobacillus, з них три культури - 58п, 59п, 1-В - не було ідентифіковано до виду і позначено як Lactobacillus sp. Чотири штами віднесено до роду Leuconostoc та один штам - 4/1(55) - було визначено як Lactococcus lactis. В межах роду Lactobacillus 5 культур було віднесено до групи І - облігатно гомоферментативних видів, 33 культури - до групи ІІ - факультативно гетероферментативних, до групи ІІІ віднесено 21 штам, визначений як облігатно гетероферментативний. Жоден з штамів не утилізував гліцерол, еритрит, L-ксилозу, глікоген, ксиліт, D-ліксозу, D-фукозу, 2-кето-глюконат, 5-кето-глюконат.
Група І включала в себе штами 267Д, 8п, що були ідентифіковані як L.delbrueckii subsp. delbrueckii; культури с161, 10п - які були віднесені до виду L.helveticus; штам Г3/2(11), ідентифікований як L.acidophilus. Всі штами зброджували D-глюкозу, лактозу. “Найактивнішою” в цій групі виявилась культура Г3/2(11) – як субстрат використовувала 14 з 49 цукрів чи їх похідних, тоді як інші чотири культури – від 5 до 8 вуглеводів.
До групи ІІ було віднесено найбільшу кількість штамів МКБ. 22 культури з цієї групи були з колекції, 11 – свіжеізольовані штами. З тридцяти трьох факультативно гетероферментативних культур 27 були ідентифіковані як Lactobacillus plantarum (17 – колекційні, 10 – нові ізоляти). Штами 1825, 2-В були визначені як L. casei subsp. rhamnosus; культури 330, 56 – як L. paracasei; по одному штаму було віднесено до видів L. casei subsp. casei та L. pentosus – культури 33 та 17п відповідно. Цікаво, що нові ізоляти зброджували в середньому більше цукрів, ніж колекційні.
Група ІІІ. Серед облігатно гетероферментативних культур 11 були віднесені до виду L. fermentum, 6 – до виду L. brevis, 4 – L. cellobiosus. Серед штамів L. fermentum всі утилізували лактозу, більшість використовувало як субстрат рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, мальтозу, мелібіозу, сахарозу.
Три штами – 1-В, 58п, 59п - було позначено як Lactobacillus sp. Чотири культури було ідентифіковано як лейконостоки – штами 37п, 87п, 474 було віднесено до Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, а штам 32Т – до Leuconostoc lactis. Культура 4/1(55) була віднесена до виду Lactococcus lactis subsp. lactis.
До одного виду часто відносились штами, виділені з різних природних джерел. До виду L. plantarum (27 культур) належали культури, виділені в основному з ШКТ людей-довгожителів та домашніх тварин, дельфінів, також були штами (по одному), виділені з томатної пульпи, лактобактерину, зобу бджоли та один колекційний. Шосту частину культур було визначено як L. fermentum (11 штамів). Більшість з них свого часу були виділені з ШКТ курчат, інші - з ШКТ довгожителя, качки, теляти. Також шість штамів було віднесено до L. brevis, чотири - до L. cellobiosus, виділених переважно з ШКТ птиці; по два штами - до L. delbrueckii subsp. delbrueckii (ШКТ довгожителя та ШКТ курчати), L. helveticus (колекційний та ШКТ курчати), L. paracasei (колекційний та консервовані овочі), L. casei subsp. rhamnosus (зоб бджоли, колекційний) та по одному - до L. acidophilus (ШКТ гуся), L. casei subsp. casei (з біопрепарату), L. pentosus (з ШКТ курчати). Культури Lactobacillus sp. були виділені з ШКТ птиці та зобу бджоли. Крім того, чотири культури, віднесені до роду Leuconostoc, були з ШКТ курчати, риби та один колекційний. Штам Lactococcus lactis subsp. lactis 4/1 (55) був виділений з кефіру.
Були ідентифіковані також 26 штамів ентерококів, свого часу виділених з ШКТ людей із захворюваннями травного тракту. За АРІ-тестуванням було віднесено 21 штам до виду E. faecium, 5 - до E. durans.
ВИВЧЕННЯ АНТАГОНІЗМУ МІЖ БЛИЗЬКОСПОРІДНЕНИМИ ШТАМАМИ. ПОШУК ТА ВІДБІР ШТАМУ З БАКТЕРІОЦИНОГЕННИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ
Скринінг штамів, що проявляють антагоністичну активність, показав, що більше 90% досліджуваних культур пригнічували ріст хоча б одного з близькоспоріднених штамів. Найактивнішим був штам L. plantarum 64н, ізольований від комах, який інгібував ріст майже 95% всіх тест-мікроорганізмів.
В результаті скринінгу штамів МКБ на бактеріоциногенність було виявлено, що один штам Lactobacillus plantarum УКМ В-2705 проявляв виражену антагоністичну активність щодо 9-ти близькоспоріднених штамів МКБ, серед яких переважали штами L. plantarum; антагонізм спостерігався також щодо двох штамів - Lactobacillus sp. 58п і Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 474. Культура L. plantarum УКМ В-2705 (робочий номер Г3/3 (13) ) свого часу була виділена з ШКТ домашньої птиці. Штам зберігався в Українській колекції мікроорганізмів. Серед 12-ти нових ізолятів жоден не проявив подібної антагоністичної активності.
ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТА СПЕКТРУ ДІЇ БАКТЕРІОЦИНОПОДІБНОЇ РЕЧОВИНИ
Результати досліджень з використанням ферментів вказують на білкову природу досліджуваної субстанції – обробка його протеазами (трипсин, хімотрипсин, протеїназа К) призводила до повного зникнення антимікробної дії досліджуваної речовини. І навпаки – б-амілаза, ліпаза, каталаза абсолютно не впливали на його активность (табл. 1).
Показано, що бактеріоциноподібна речовина втрачала активність після обробки її високими температурами - 100?С та вище. Прогрівання бактеріоциноподібної субстанції в межах 60-80?С протягом 10 хвилин не впливало на прояв дії бактеріоцину (табл.2). Виявлено кислотостійкість антимікробної речовини – активність її не втрачалась при рН в межах 2,0-8,0, тоді як в жодному випадку не спостерігалось активності антагоністичного фактору при рН 9,0.
Одним з факторів антимікробної дії МКБ є здатність деяких штамів продукувати лізоцим. При дослідженні нами лізоцимсинтезуючої активності у штаму Lactobacillus plantarum УКМ В-2705 не було виявлено антагонізму на газоні індикаторної культури Micrococcus luteus 109 ГИСК (2665).
Молекулярна маса бактеріоцинів є одним з критеріїв при їх класифікації [Klaenhammer, 1993]. В експериментах із використанням діалізних мембран з розміром пор 10 кДа було показано, що досліджуваний агент не пригнічував ріст індикаторних культур, а отже, не проходив через пори мембрани. Ці дані в сукупності із результатами про білкову природу субстанції дозволяють
Таблиця 1
Прояв бактеріоциноподібної активності штаму L. plantarum УКМ В-2705 під дією ферментів
Фермент | Активність після обробки, %
Трипсин | 0
Хімотрипсин | 0
б-амілаза | 100
Ліпаза | 100
Каталаза | 100
Протеїназа К | 0
Таблиця 2
Дія високих температур на бактеріоциноподібну активність штаму
L. plantarum УКМ В-2705
Температура, °С | Час дії, хв. | Прояв активності фактору
після дії температури
60 | 10 | +
80 | 10 | +
100 | 10 | -
112 (0,5 атм.) | 20 | -
121 (1 атм.) | 20 | -
припустити, що антагоністична речовина відноситься до групи ІІ або ІІІ, але не до групи ІV (складні бактеріоцини) і не до групи І (пептиди розміром до 5 кДа).
Відомо, що продукція бактеріоцинів може кодуватись мобільними генетичними елементами. В наших дослідженнях плазміда не була виявлена, з чого ми можемо припустити, що бактеріоциноподібна речовина, яку продукує штам Lactobacillus plantarum УКМ В-2705, визначається хромосомними генами.
Продукція бактеріоцинів взаємопов'язана із віком культури-продуцента. При описі в літературі нових бактеріоцинів часто досліджують кінетику їх продукції, визначають, на якій фазі росту відбувається оптимальний синтез в середовище цієї речовини. Титр бактеріоцину позначають в умовних одиницях (УО), які різні автори визначають по-різному. Частіше за все під УО розуміють величину, обернено пропорційну останньому розведенню бактеріоцина, де ще спостерігалась інгібуюча активність [Flynn, 2002; Ocana, 1999; Ryan, 1996]. Нами вивчалась кінетика продукції бактеріоциноподібної речовини в залежності від віку культури L. plantarum УКМ В-2705. Побудована крива росту штаму (рис.1.). Лаг-фаза була практично відсутня, оскільки засівалась фізіологічно молода культура, експоненційна фаза тривала до 10-11 години росту. Фаза уповільненого росту тривала 4-5 годин та на 15-ій годині починалась стаціонарна фаза і крива росту культури виходила на “плато”. Після 30-ї години починалась фаза загибелі культури. Даний період був найдовшим за часом і тривав до 70-х годин росту. Остання, шоста фаза виживання була практично відсутня.
В ході даних досліджень було зафіксовано початок продукування бактеріоцину на сьомій годині росту штаму (рис.2.). На дев’ятій годині – титр бактеріоцину подвоювався (2х103 УО/мл). При експоненційній фазі росту титр стабільно збільшувався, досягаючи свого максимуму в стаціонарній фазі росту культури (16-20х103 УО/мл). При переході штаму в фазу загибелі продукція бактеріоцину відзначалась нестабільністю. В подальшому, активність бактеріоцину взагалі зникла, що дозволяє припустити, що зміни, які відбувалися в середовищі при рості культури, можуть впливати на продукцію антибактеріального агента або власне на сам бактеріоцин, вже виділений в середовище. Крім того, наші попередні дослідження показали, що активність бактеріоцина не змінюється при значеннях рН 2,0-8,0. Спираючись на ці дані, можна виключити факт впливу закислення середовища при культивуванні культури на активність антибактеріального агента.
Як правило, секреція антибактеріальних сполук в середовище може починатися, в одних випадках – при переході культури в стаціонарну фазу розвитку, а в інших – ще раніше,
Рис.1. Крива росту штаму Lactobacillus plantarum УКМ В-2705
Рис.2. Кінетика бактеріоцинопродукції штаму Lactobacillus plantarum УКМ В-2705
в експоненційній фазі росту [Полюдова, 2004; Ocana, 1999]. Нами показано, що продукція бактеріоцину починалася в експоненційній фазі росту. Максимальний титр антибактеріальної речовини спостерігався в стаціонарній фазі, а зникнення бактеріоцину - після переходу культури в стаціонарну фазу.
Для збільшеня виходу бактеріоцину в культуральне середовище була проведена серія дослідів з індукції речовини протягом росту штаму-продуцента. Як індуктори виступали мітоміцин С та налідиксова кислота в різних концентраціях. В жодному випадку не було показано збільшення титру бактеріоцину в порівнянні з контролем. Отже, дана бактеріоциноподібна речовина є неіндуцибельною.
Для одержання більших кількостей бактеріоцину ми застосовували концентрування шляхом ліофільного висушування з послідуючим відновленням ліофілізату у меншому об'ємі дистильованої води - цей метод використовувався для плантарицинів [Paynter, 1997; Reenen, 1998], а також біфідоцинів [Yildirim, 1998, 1999].
Нами було досліджено вплив бактеріоциноподібної речовини, що продукується L. plantarum УКМ В-2705, та самого штаму на ріст умовно-патогенних мікроорганізмів. Показано, що нативний та сконцентрований препарати бактеріоцину, а також сам штам діяли на два представника роду Enterococcus (табл.3). Концентрат пригнічував також ріст представників роду Enterobacteriaceae: Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris. В жодному випадку не спостерігалось пригнічення росту культури грибів Candida albicans, грамнегативних мікроорганізмів - Pseudomonas aeruginosa та грампозитивних - обох штамів роду Staphylococcus, також Bacillus cereus, Mycobacterium smegmatis, Listeria monocytogenes.
При вивченні дії бактеріоциноподібної речовини на штами ентерококів, виділених з ШКТ здорових людей, показано інгібування росту 10 з 57 культур (17,5%) нативним бактеріоцином та 39 штамів, або 68,4% - концентрованим. З 26 штамів ентерококів, виділених з ШКТ людей з хворобами травного тракту, ріст 22-х культур (84,6%) інгібувався нативною речовиною, а 23-х - концентрованою (88,5%). В той же час, бактеріоцин не діяв на ріст двох колекційних NCDO штамів ентерококів. Бактеріоцин діяв значно менше на бактерії, що були виділені від здорових людей, які проживали в екологічно благополучному природному регіоні, ніж на штами, виділені від людей з різною патологією ШКТ. Причому в останньому випадку спектр дії нативного та сконцентрованого бактеріоцину був майже
Таблиця 3
Інгібування росту умовно-патогенних мікроорганізмів бактеріоциноподібною речовиною, що продукується штамом L. plantarum УКМ В-2705
№ | Умовно-патогенний мікроорганізм | Бактеріоцин | Штам
нативний препарат (активність 1х ) | сконцентрований
(активність 10х )
1 | Pseudomonas aeruginosa
УКМ B-900 (ATCC 9027) | - | - | -
2 | Staphylococcus aureus
УКМ B-904 (ATCC 25923 (F-49)) | - | - | -
3 | Proteus vulgaris
УКМ B-905 (ATCC 6896) | - | + | -
4 | Escherichia coli
УКМ B-906 (ATCC 25922 (F-50)) | - | + | -
5 | Bacillus cereus
УКМ B-908 (ATCC 11778) | - | - | -
6 | Mycobacterium smegmatis
УКМ В-917 (АТСС 607) | - | - | -
7 | Staphylococcus epidermidis
УКМ B-919 (ATCC 12228) | - | - | -
8 | Klebsiella pneumoniae
УКМ B-920 (ATCC 10031) | - | +
9 | Salmonella enterica ssp. enterica
УКМ B-921 (NCTC 6017) | - | + | -
10 | Candida albicans
УКМ Y-1918 (ATCC 885-653) | - | - | -
11 | Listeria monocytogenes
NCTC 5105 | - | - | -
12 | Enterococcus faecalis УКМ В-2510 | + | + | +
13 | Enterococcus faecium УКМ В-2534 | + | + | +
однаковий. Подібної інформації в літературі нами не було знайдено.
Таким чином, показана антагоністична дія бактеріоциноподібної речовини, що продукується штамом L. plantarum УКМ В-2705, на мікроорганізми різних таксономічних груп, зокрема, на клінічно значущі умовно-патогенні мікроорганізми, що є важливим фактором в перспективі використання цього штаму в промисловості та медицині.
ВИВЧЕННЯ ПРОБІОТИЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ШТАМА-ПРОДУЦЕНТА LACTOBACILLUS PLANTARUM УКМ В-2705
В останні роки поява великої кількості пробіотиків вимагає всебічного вивчення властивостей пробіотичних мікроорганізмів [Reid, 2006]. Є одиничні дані, які стосуються тестування мікробних продуцентів бактеріоцинів у якості потенційно пробіотичних та, власне, ефект бактеріоциноподібної речовини.
Згідно стандартам Всесвітньої організації здоров’я, існують певні вимоги до потенційно пробіотичних штамів. Зокрема, ми звертали увагу в наших дослідженнях на наступні. Першою є чітка ідентифікація виділених культур з використанням сучасних методів, зокрема, генетичних. Нами було вперше зроблено ідентифікацію цього штаму на генетичному рівні до роду та виду методом ПЛР, з використанням родо- та видоспецифічних праймерів (рис. 3). За одержаними результатами була підтверджена приналежність штаму УКМ В-2705 до виду L. plantarum.
Було вивчено відношення штаму до 57 антибіотиків різних груп та різного механізму дії, при цьому використовувався метод дифузії в агар (диско-дифузійний метод). Не було зон затримки росту біля дисків з оксациліном, цефепімом, ломефлоксацином, поліміксином, налідиксовою кислотою та всіх антифунгальних антибіотиків, що використовувались в дослідах. Серед пеніцилінів була показана резистентність до бензилпеніциліну, до ампіциліну культура була помірно чутливою та чутливою до інших антибіотиків цієї групи. В той же час, до аміноглікозидів всіх поколінь штам проявив резистентність. До макролідів штам був в основному помірно чутливий (до олеандоміцину, азитроміцину) та чутливий (до еритроміцину, рокситроміцину, кларитроміцину). До лінкозамідів та тетрациклінів була показана чутливість, тоді як до фторхінолонів - резистентність. На цефалоспорини культура реагувала по-різному: до дії цефазоліну, цефалотину (І покоління) та цефтазидиму (ІІІ покоління) штам був чутливим, до цефалексину (І), цефуроксиму(ІІ), цефтриаксону та цефтибутену (ІІІ), цефепиму (ІV) - резистентним. Помірна чутливість спостерігалась до цефаперазону (ІІІ) та граничні значення – до цефамандолу та цефотаксиму. По відношенню до нітрофуранів культура також реагувала по-різному: була резистентною до фузидину, помірночутливою - до фуразолідону та чутливою - до фурадоніну. До левоміцетину, ріфампіцину та карбапенемів (іміпенем, меропенем) штам виявився чутливим, та резистентним – до глікопептидного антибіотика ванкоміцину. Найбільші зони затримки росту спостерігались в присутності антисинегнійних напівсинтетичних пеніцилінів - азлоциліну (зона затримки росту була 28,00±1,30 мм), піперациліну (28,30±1,10) та представників карбапенемів – іміпенему (26,33±1,11) і меропенему (30,00±0,00). Останні є антибіотиками надширокого спектру дії.
На думку багатьох дослідників, при лікуванні дисбактеріозів різного походження для сумісного використання з антибіотиками необхідні пробіотики, що конструюються на основі резистентних штамів, стійкість яких контролюється хромосомою з метою її стабільності. Тобто штами-кандидати в пробіотики не повинні містити плазміди, які несуть гени антибіотикорезистентності [Gotcheva, 2002]. Адже неконтрольована передача плазмідних генів антибіотикорезистентності в інші штами небажана і може призвести до збільшення пула антибіотикорезистентних потенційно патогенних бактерій [Лыкова, 2000]. В наших попередніх дослідженнях було показано, що штам L. plantarum УКМ В-2705 взагалі не є носієм плазміди, а значить, виключається факт наявності генів антибіотикостійкості в мобільних генетичних елементах, що дає йому ще одну перевагу для використання.
Важливим для пробіотичних бактерій є здатність до адгезії на клітинах епітелію макроорганізму. Нами було вивчено адгезивний процес культури L. plantarum УКМ В-2705 (рис.4). Дослідження показали, що штам є високоадгезивним (табл.4): СПА коливався в межах 4,62±0,09 - 5,61±0,08; процент клітин, що мали на собі адгезовані бактерії, складав 94,67±0,87-95,33±3,57; індекс адгезивності мікроорганізму був в межах 4,88±0,05-5,92±0,04.
Колонізуюча здатність мікроорганізмів залежить від різних фізико-хімічних факторів. Додатковою причиною вивчення впливу рН на здатність адгезуватись при розробці пробіотиків є різні значення рН в кишечнику, тобто важливо знати, як в умовах ШКТ бактерія зможе колонізувати епітеліоцити.
В умовах кислого рН (2,0-4,5) нами спостерігалось підвищення СПА до 6,9±0,17 – 9,23±0,13; тоді як при умовах слабкокислого та лужного рН було зниження показників
Таблиця 4
Показники адгезивності штаму L. plantarum УКМ В-2705 до клітин букального епітелію людини
№ | Середній показник адгезії (СПА) | Коефіцієнт участі (К), % | Індекс адгезивності мікроорганізма (ІАМ)
1 | 5,21±0,14 | 95,33±3,57 | 5,44±0,07
2 | 5,61±0,08 | 94,67±2,20 | 5,92±0,04
3 | 4,62±0,09 | 94,67±0,87 | 4,88±0,05
адгезії - СПА - 6,73±0,18–5,28±0,19 (рис. 5). Найнижчі показники спостерігались при рН 7,5 (5,28±0,19) та рН 8,0 (5,39±0,03).
Температура інкубації суттєво не впливала на процес адгезії - штам показував високоадгезивні властивості при всіх температурах, що досліджувались (СПА ?4,56±0,04).
Вивчення природи адгезинів шляхом обробки бактеріальних клітин перед змішуванням їх з епітеліоцитами показало зниження адгезивних властивостей
Рис. 5. Вплив рН на показники адгезивності штаму L. plantarum УКМ В-2705
культури в порівнянні з контролем до 41,15% після обробки її ліпазою та до 62,84% - б-амілазою (табл.5). Це свідчить про гліколіпідну природу адгезинів.
В той же час, дії протеаз не знижували показники адгезії, а, навіть навпаки, підвищували. Після обробки бактеріальних клітин трипсином та протеїназою К значення СПА в порівнянні з контролем підвищувались відповідно на 34,53% та 54,44%.
Таблиця 5
Дія ферментів на адгезію штаму Lactobacillus plantarum УКМ В-2705 до клітин букального епітелію людини
Фермент
(Хімічний агент) |
Буфер | Контроль, % | Бактеріальні клітини (після обробки фермента), що адгезувались до епітеліоцитів,
% в порівнянні з контролем
Протеїназа К | Фосфатний буфер рН 7,0 | 100 | 154,44*
Трипсин | Трис·НCl рН 8,0 з додаванням 0,1 М CaCl2 | 100 | 134,53*
Хімотрипсин | Трис·НCl рН 8,0 з додаванням 0,1 М CaCl2 | 100 | 108,47
Ліпаза | Фосфатний буфер рН 7,7 | 100 | 41,15*
Метаперіодат натрія | Ацетатний буфер рН 4,5 | 100 | 97,5
б-амілаза | Фосфатний буфер рН 7,0 | 100 | 62,84*
*р=0,05
ВИСНОВКИ
Вивчена видова приналежність 67 штамів молочнокислих бактерій, ізольованих з різних природних джерел. Проведено цілеспрямований пошук культур, що проявляють специфічну антимікробну активність.
1. Вперше показано, що більше 90% штамів молочнокислих бактерій, ізольованих з різних природних еконіш, проявляють антагоністичні властивості між близькоспорідненими штамами.
2. Виявлено бактеріоциноподібну активність у штама Lactobacillus plantarum УКМ В-2705, який пригнічував ріст 9 тест-культур, в тому числі представників L. plantarum, L. sp., Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris.
3. Встановлено, що антибактеріальний фактор, який продукується штамом L. plantarum УКМ В-2705, білкової природи, термолабільний, активний в діапазоні рН 2,0-8,0, не проходить через пори діалізних мембран. Бактеріоциногенний фактор не кодується плазмідою і є неіндуцибельним.
4. Показано, що початок виділення бактеріоциноподібної речовини відбувається в експоненційній фазі росту культури, максимальне його накопичення – в стаціонарній.
5. Встановлено активність бактеріоциноподібної речовини по відношенню до умовно-патогенних штамів роду Enterococcus, референс-штамів Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella enterica.
6. Виявлена резистентність штаму L. plantarum УКМ В-2705 до антибіотиків: оксациліну, цефепіму, ломефлоксацину, поліміксину, налідиксової кислоти та антифунгальних антибіотиків.
7. Встановлено високоадгезивні властивості бактеріоциногенного штаму L. plantarum УКМ В-2705 на моделі епітеліоцитів людини (середній показник адгезії був в межах 4,6±0,09-5,6±0,08).
8. За виявленими антагоністичними та адгезивними властивостями визначено можливість перспективи застосування штама L. plantarum УКМ В-2705 у складі пробіотиків.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Дімова М.І., Коваленко Н.К. Вивчення деяких властивостей антагоністичного фактора штаму Lactobacillus plantarum Г 3/3 (13) // Мікроб. журн. – 2006. – 68, №2.- С. 84-91. (Здобувачем знайдено та вивчено властивості бактеріоциноподібної речовини зі штаму Lactobacillus plantarum Г 3/3 (13))
2. Дімова М.І. Пробіотичні властивості бактеріоциногенного штаму Lactobacillus plantarum Г 3/3 (13) // Мікроб. журн. – 2006. – 68, №4.-С. 47-54. (Здобувачем здійснено ідентифікацію бактеріоциногенного штаму, вивчено відношення до антибіотиків та адгезивний процес)
3. Дімова М.І., Коваленко Н.К. Ідентифікація лактобацил із застосуванням систем АРІ 50СН / Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. – Вип. 193: Біологія. – Чернівці: “Рута”, 2004. – С. 53-57. (Здобувачем здійснено ідентифікацію лактобацил за допомогою стандартизованого тесту на вуглеводи)
4. Дімова М.І., Коваленко Н.К. Бактеріоцини молочнокислих бактерій // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія “Біологія”. – 2006. - Випуск 18. – С. 109-113. (Здобувачем проведено аналіз літературних даних стосовно питання бактеріоциногенії молочнокислих бактерій)
5. Дімова М.І., Коваленко Н.К. Скринінг та вивчення молочнокислих бактерій, що проявляють бактеріоциноподібну активність // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. – Вип. 297: Біологія. – Чернівці: “Рута”, 2006. – С. 94-99. (Здобувачем проведено пошук серед штамів молочнокислих бактерій тих, що проявляють антагоністичну активність)
6. Дімова М.І., Коваленко Н.К. Ідентифікація молочнокислих бактерій із застосуванням систем АРІ 50СН / Х з’їзд товариства мікробіологів України. Тези доповідей. 15-17 вересня 2004 р., Одеса. – Одеса: Астропринт, 2004. – С. 207.
7. Дімова М.І., Коваленко Н.К. Виявлення бактеріоциноподібної активності у молочнокислих бактерій // Молодь і поступ біології: Тези доповідей І Міжнародної конференції студентів та аспірантів (11-14 квітня 2005 р., м.Львів). - Львів: СПОЛОМ, 2005. – С.163-164.
8. Dimova M. I. Screening and study of lactic acid bacteria strains expressed bacteriocin-like activity / EUPROBIO 2005 – European conference on probiotics and their applications. – 6-8 October 2005, Krakow, Poland.
http://confer.uj.edu.pl/euprobio/plakaty/plakat21.pdf
9. Дімова М.І. Адгезія штаму Lactobacillus plantarum Г 3/3 (13) до клітин букального епітелію людини // Молодь та поступ біології: Збірник тез ІІ Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів (21-24 березня 2006 р., м. Львів). - Львів, 2006. – С. 289-290.
10. Димова М. И. Изучение бактериоциногенных и пробиотических свойств штамма Lactobacillus plantarum Г 3/3 (13) // “Биология – наука ХХІ века”: 10-ая Пущинская школа-конференция молодых учёных, посвящённая 50-летию Пущинского Научного Центра РАН (Пущино, 17-21 апреля 2006 г.). Сборник тезисов. – Пущино, Россия, 2006. - С. 188-189.
11. Дімова М. І., Гармашева І. Л., Житкевич Н. В., Яковлева Л. М., Коваленко Н. К. Інгібуюча дія бактеріоциноподібної речовини штаму Lactobacillus plantarum УКМ В-2705 // Молодь та поступ біології: Збірник тез
