МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ДАНИЛІШИНА МАРИНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 616.142-008.64-036.12-085.22:57.086.3:611.018.63

МОРФОГЕНЕЗ ТА МЕДИКАМЕНТОЗНА КОРЕКЦІЯ ПЛАСТИЧНОЇ НЕДОСТАТНОСТІ МІОКАРДА
ПРИ ХРОНІЧНІЙ ГІПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМІЇ

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному інституті кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України та на кафедрі патологічної анатомії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Гавриш Олександр Семенович,

Національний інститут кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України,

керівник відділу патоморфології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Колєсова Надія Арнольдівна,

НДЛЦ Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідуюча лабораторією метаболічного і структурного аналізу

доктор медичних наук, професор

Сільченко Валерій Петрович,

кафедра патологічної анатомії Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України,

завідувач кафедри

Захист відбудеться “_15_” _11_ 2007 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця (03057, м. Київ, пр. Перемоги, 34)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1)

Автореферат розісланий “ 9 ” 10 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор О.М.Грабовий

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За сучасними уявленнями одним з провідних чинників ішемічної хвороби серця та пов’язаної з нею хронічної серцево-судинної недостатності вважається атеросклеротичне ураження вінцевих артерій та обумовлене цим процесом порушення коронарної гемоперфузії, що в свою чергу може стати причиною загибелі або інвалідізації хворих (В.С. Жданов, А.М. Вихерт, Н.Г. Стернби, 2002; Р.С. Карпов, В.А. Дудко, 1998).

Численними епідеміологічними, клінічними та експериментальними дослідженнями було неодноразово продемонстровано прямий зв’язок між порушеннями ліпідного обміну, розвитком атеросклерозу, захворюваністю та смертністю від ішемічної хвороби серця (О.В. Бодрова, Н.П. Ларионова, 2000; Lee John A., 1995). Хоча атеросклероз є багатофакторним захворюванням, сьогодні цілком доведено, що одне з центральних місць у процесі атерогенезу займають порушення обміну ліпідів і, насамперед, холестерину та тригліцеридів (В.А. Нагорнев, 1991; А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева, 1999).

Як відомо, розвиток багатьох патологічних процесів у живих клітинах пов’язаний з порушенням бар’єрної та структурної функції їх мембран. Холестерин є одним з найбільш важливих структурних компонентів плазматичної мембрани, який забезпечує стабільність її фізичних властивостей – мікров’язкості, проникності, електричних параметрів, сталі параметри яких вкрай необхідні для нормальної життєдіяльності клітини (А.Н. Климов, 1992; Б.М. Липовецкий, В.О. Константинов, 1993). Порушення обміну холестерину, звичайно, не може бути ізольованим, воно завжди супроводжується дисліпопротеїдемією та гіпертригліцеридемією. Тому при моделюванні експериментальної гіперхолестеринемії (ГХЕ) одним з основних аспектів морфологічних змін мембран стає перекисне окислення ліпідів, яке поєднується з деструктивною дією фосфоліпаз, механічним розтягненням мембран, обумовленим порушеннями осмотичного балансу клітин і адсорбцією на мембранах поліаніонів, полікатіонів (Ю.М. Лопухин, А.И. Арчаков, 1991; В.З. Ланкин, 1980).

Разом з тим, експериментальні та клінічні дослідження присвячені переважно вивченню змін судинної стінки або формених елементів крові. При цьому поза увагою дослідників до сьогоднішнього дня залишається патогенетична роль змін в міокарді, обумовлених первинним патологічним впливом гіперхолестеринемії як фактора погіршення його функціональних потенцій та розвитку серцевої недостатності.

В наукових джерелах зустрічаються лише поодинокі дані про прямий пошкоджуючий вплив гіперхолестеринемії на скоротливий міокард, в яких констатується, що надходження в клітину холестерину в надлишковій кількості викликає суттєві структурно-функціональні зміни в першу чергу мембран кардіоміоцитів (КМЦ), насамперед сарколеми. Зміни, що за цих умов відбуваються в ядерно-рибосомальному та контрактильному апараті кардіоміоцитів, визначаються як ознаки пластичної недостатності м’язових клітин міокарда (Л.М. Непомнящих, Л.А. Семенова, 1985; В.Г. Хаджинський, О.С. Гавриш, В.В. Вербицький, 1993). Проте кількість публікацій, що містять відомості про перебудову клітин при хронічній гіперхолестеринемії та відносно механізмів цієї перебудови, спричиненої безпосередньою дією холестерину, дуже обмежена.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає науковим пріоритетам Національного інституту кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України і Національного медичного університету (НМУ) імені О.О. Богомольця, зокрема НДР кафедри патологічної анатомії НМУ: “Наукове обґрунтування та розробка тестових завдань зі спеціальної патологічної анатомії на основі морфологічних досліджень секційного та біопсійного матеріалів” (№ державної реєстрації 0105 U 001313).

Мета і задачі дослідження. Мета ? вивчити динаміку структурної перебудови скоротливого міокарда при моделюванні хронічної гіперхолестеринемії та визначити роль пластичної недостатності як фактора її негативного впливу на морфофункціональний стан вентрикулярних кардіоміоцитів.

Задачі дослідження:

1. Вивчити морфологічні зміни скоротливого апарату, електролітного метаболізму, енергетичного та пластичного забезпечення функції КМЦ при гіперхолестеринемії різної тривалості (2-8-16 тижнів).

2. Провести скринінг різнолігандних координаційних сполук, синтезованих на основі АТФ (РКС-1) та АМФ (РКС-2) з метою визначення більш ефективного з них щодо впливу на пластичні процеси в міокарді.

3. Проаналізувати обумовлені хронічною гіперхолестеринемією морфофункціональні зміни органел, які відповідають за пластичне забезпечення міокарда.

4. Цілеспрямовано обмежуючи негативний вплив гіперхолестеринемії на пластичне забезпечення функції кардіоміоцитів, визначити роль його недостатності як патогенетичного фактора розвитку серцевої недостатності при атерогенному порушенні ліпідного метаболізму.

Об’єкт дослідження – скоротливий міокард кролів.

Предмет дослідження – морфологічні зміни вентрикулярних кардіоміоцитів при моделюванні хронічної гіперхолестеринемії та її корекції препаратом РКС-2.

Методи дослідження. Використано системний підхід, який передбачає застосування комплексу гістологічних, гістохімічних, електронномікроскопічних та морфометричних методів. Для обєктивізації отриманих даних проведена їх обробка за допомогою статистичного пакету Microsoft Excel.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше при моделюванні хронічної гіперхолестеринемії за допомогою сучасних морфологічних (гістологічних, гістохімічних, електронної мікроскопії, електронногістохімічних та морфометричних) методик доведено та систематизовано ознаки прямого пошкоджуючого впливу гіперхолестеринемії на скоротливий міокард. Встановлено вперше важливу роль недостатності пластичного забезпечення як одного з провідних механізмів негативного кардіотропного впливу хронічної гіперхолестеринемії на вентрикулярні кардіоміоцити.

Практичне значення одержаних результатів. Прикладне значення мають виявлені і систематизовані морфофункціональні зміни в мембранах органел кардіоміоцитів при хронічній гіперхолестеринемії. Отримано нові дані про можливість запобігання пошкоджуючого впливу хронічної гіперхолестеринемії на вентрикулярні кардіоміоцити шляхом медикаментозної стимуляції їх пластичного забезпечення. Отримані відомості про сутність механізмів перебудови скоротливого міокарда при гіперхолестеринемії сприятимуть подальшому розвитку патогенетично обгрунтованих підходів до профілактики і лікування ішемічної хвороби серця.

Результати роботи впроваджено у повсякденну діяльність Національного інституту кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України та навчальний процес кафедри патологічної анатомії НМУ імені О.О. Богомольця, Донецького державного медичного університету імені М. Горького, кафедри патологічної анатомії Національної медичної академії післядипломної освіти імені
П.Л. Щупика МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. Дисертант брала безпосередню участь у розробці методології наукового пошуку, аналізу профільної літератури, здійснила експериментальні дослідження. Разом із науковим керівником сформулювала висновки та основні рекомендації роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації обговорені на: ІІІ національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Київ, 2002); науковій конференції “Профілактика і лікування артеріальної гіпертензії в Україні в рамках реалізації національної програми” (Київ, 2002); документовані у матеріалах пленуму правління українського наукового товариства кардіологів “Атеросклероз і ішемічна хвороба серця: сучасний стан проблеми. Артеріальна гіпертензія як фактор ризику ІХС; профілактика ускладнень” (Київ, 2003); об’єднаному пленумі правлінь українських наукових товариств кардіологів, ревматологів і кардіохірургів з міжнародною участю “Серцева недостатність – сучасний стан проблеми” (Київ, 2002).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені у
10 наукових праць: в тому числі – у 6 наукових статтях у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, а також у матеріалах 4 конгресів та наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Основний текст роботи викладено на
164 сторінках принтерного тексту (обсяг тексту основної частини 133 сторінки), дисертація ілюстрована рисунками, 7 таблицями, 7 діаграмами. Складається із вступу і 6 розділів: огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, з розділів результатів власних досліджень, обговорення отриманих результатів та висновків. Список використаної літератури налічує 337 джерела, в тому числі вітчизняних та зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріал та методи дослідження. Хронічну гіперхолестеринемію відтворювали в експерименті на 58 тваринах, яких утримували на атерогенній дієті (холестерин в дозі 0,3 г/кг щодобово) протягом 2, 8 та 16 тижнів. Порушення ліпідного складу сироватки крові контролювали, визначаючи вміст холестерину і тригліцеридів в плазмі крові за Іlca і тригліцеридів за Carlson, Ignatovska.

З метою захисту міокарда від пошкоджуючого впливу хронічної гіперхолестеринемії шляхом стимуляції пластичного забезпечення його функцій використано різнолігандну координаційну сполуку, синтезовану на основі АМФ. Попередньо проведено скринінг препаратів, синтезованих на основі АТФ (РКС-1) та АМФ (РКС-2) на інтактних тваринах з метою визначення найбільш ефективного з них щодо стимулюючого впливу на пластичні функції кардіоміоцитів. Речовини РКС-1 і РКС-2 вводили внутрішньоочеревинно протягом 2 тижнів 1 раз на добу в дозі 5 мг/кг (по 5 тварин у кожній групі). Кардіопротекторну дію препарату РКС-2, що було відібрано на підставі результатів попередніх досліджень, при хронічній ГХЕ вивчали на 10 кролях. Препарат вводили так само і в тій же дозі, що й інтактним тваринам.

Матеріал для морфологічних досліджень отримували з використанням етаміналового наркозу (50,0 мг/кг) із дотриманням вимог гуманного поводження з тваринами.

Для гістологічних досліджень тканину міокарда фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації і заливали у парафінові блоки. Гістотопограми серця забарвлювали гематоксиліном і еозином та пікрофуксином за Ван Гізон (Э.И. Дедков, 1991). Для виявлення дрібновогнищевих пошкоджень міокарда використовували методики Лі та Рего (J. Lie, Holleeeyk, 1971), загальний стан скоротливого апарату КМЦ оцінювали фізикооптичним методом під інтерференційно-поляризаційним мікроскопом МРІ-5 (З. Лойда, Р. Госсрау, 1992). РНК-синтезуючу функцію клітин міокарда визначали за допомогою комплексів азотнокислого срібла за методикою Хауела та Блека в модифікації М.М. Мамаєва зі співавт. (Н.Н. Мамаев, О.В. Ковалева, 1993).

Для електронної мікроскопії зразки тканини лівого шлуночка серця фіксували в 4% ізотонічному за буферному (рН 7,2-7,4) розчині параформа, дофіксовували в 1% ізотонічному розчині OsO4 з додаванням сахарози, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації та просякали епоксидними смолами і заливали у суміш епону з аралдітом (В.Я. Карупу, 1984). Напівтонкі зрізи забарвлювали метиленовим синім та основним фуксином. Ультратонкі зрізи отримували на приладі LKB-8800 (Швеція), контрастували їх солями важких металів (ураніл-ацетат і цитрат свинцю) за Рейнольдсом та вивчали за допомогою електронного мікроскопу ПЭМ-125. Біохімічні тести були проведені у відділі біохімії Національного інституту кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України (завідувач – проф. Л.С. Мхітарян).

Електронногістохімічно виявляли розподіл і концентрацію некомпенсованих негативних зарядів глікозаміногліканів (ГАГ) глікокалікса (реакція зв’язування феризоля за Б. Ветцелем) (Г. Гайер, 1974); концентрацію і розподіл Са2+ в КМЦ за допомогою N,N-нафтолоілгідроксиламіна натрію (НГА) (A. Zechmeister, 1978); бар’єрні властивості сарколеми з використанням дрібнодисперсних маркерів таніна (H. Nunes-Duran, 1980) і колоїдного лантана (В.Г. Шаров, 1981), локалізацію та активність сукцинатдегідрогенази (СДГ-ази). Рибонуклеопротеїди (РНП) в міокарді виявляли на парафінових зрізах за методикою Браше з контрольною обробкою рибонуклеазою. На кріостатних зрізах зі свіжезамороженої в рідкому азоті тканини визначали: глікоген (за Мак-Манусом), активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ-ази), НАД-, НАДФ-діафораз та цитохромоксідази (ЦХО-ази). Дослідження і фотографування об’єктів, проводили в електронному мікроскопі ПЭМ-125 (Україна).

При морфометричному дослідженні встановлювали об’єми, щільність й об’ємні співвідношення міофібрил, мітохондрій, СПС, Т-системи КМЦ
(Г.Г. Автандилов, 1990), а також визначали коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій (КЕЕМ) (В.С. Пауков, В.Ф. Фролов, 1982). Цифрові дані обробляли з використанням статистичного пакета Microsoft Excel.

Результати власних спостережень і їх обговорення. На першому етапі наших спостережень після двотижневого утримання експериментальних кролів на атерогенній дієті в міокарді на фоні помірного набряку інтерстицію з’являлись поодинокі фокуси альтерації кардіоміоцитів, в деяких з них спостерігалась нечіткість контурів посмугованості.

Вивчення ультраструктури їх показало, що найбільш чутливою до надлишкової кількості холестерину в клітинах скоротливого міокарда є сарколема. Особливо значного впливу зазнавала плазматична мембрана, у якій холестерин накопичувався в найбільшій кількості. Морфологічно це виявлялось електроннощільними потовщеннями плазмолеми внаслідок відкладання в ній холестерину, що підтверджувалось при використанні тесту з дигітоніном.

У більшості вентрикулярних кардіоміоцитів визначались помірні коливання електронної щільності глікокаліксу, що, однак, суттєво не впливало на загальну концентрацію в ньому некомпенсованих негативних зарядів, які виявлялися електрономікроскопічно за умов використання феризолю. За нашими даними, це свідчить про збереження Са2+-зв’язуючого потенціалу цього шару сарколеми на даному етапі її перебудови.

Тести з N,N-нафтолоїлгідроксиламіном натрію підтверджували збереження рівня кальцію в глікокаліксі. Разом з тим, в плазмолемі визначалося нерівномірне відкладання електроннощільного маркеру, що вказувало на зрушення в конформаційному стані її ліпопротеїдних комплексів.

Як відомо, функція сарколеми тісно пов’язана з саркоплазматичною сіткою (СПС), що певним чином позначалось на її морфофункціональному стані. При дослідженні ультраструктури кардіоміоциту нами виявлено помірне розширення її цистерн і канальцевого відділу, а мембрана на цьому фоні втрачала чіткість контурів. На внутрішній поверхні цистерн інколи виявлялись помірні електроннощільні депозити, що за своїми електроногістохімічними даними були обумовлені накопиченням Са2+.

Двотижнева гіперхолестеринемія негативно впливає і на енергетичне забезпечення контрактильної функції міокарда. Порушення енергетичного метаболізму кардіоміоцитів в наших дослідженнях позначалися у вигляді пригнічень тканинного дихання та посилення гліколізу. Так, за гістохімічними даними, активність ЛДГ та СДГ в кардіоміоцитах змінювалась нерівномірно. Було встановлено, що обмеження каталітичної активності одного з маркерних ферментів циклу Кребса (СДГ), йшло паралельно з підвищенням активності ЛДГ та зменшенням глікогенового резерву кардіоміоцитів, тобто з компенсаторним посиленням гліколізу, який завжди був менш ефективний по відновшенню до макроергічних фосфатів у порівнянні з тканинним диханням, зокрема до зниження в міокарді рівня креатинфосфату на 13%.

Основним морфологічним субстратом, що свідчив про обмеження ефективності процесів аеробного відновлення макроергічних фосфатів були ознаки пошкодження мітохондрій. Ці зміни виявлялись у вигляді зон їх вогнищевої фрагментації або гомогенізації з нерівномірним просвітленням матриксу. Окремі мітохондрії зазнавали мієліноподібної трансформації, що свідчило про посилення процесів ПОЛ.

Разом з тим, за умов компенсаторної гіперплазії мітохондрії формували невеликі скупчення навколо ядра, між міофібрилами або під сарколемою. Внаслідок явищ гіперплазії, гіпертрофії та альтерації в клітинах зростав поліморфізм мітохондрій, а коефіцієнт їх енергетичної ефективності прогресивно знижувався на 13% (рис. 1).

Рис. 1. Показник коефіцієнту енергетичної ефективності мітохондрій
на різних етапах хронічної ГХЕ та при медикаментозній корекції

Наші дослідження показали, що зміни енергетичного та електролітного метаболізму кардіоміоцитів призводять до структурних змін скоротливого апарату кардіоміоцитів, що в тій або іншій мірі обмежує їх функціональні можливості. Ознаками цього був мозаїчний дрібновогнищевий лізис протофібрил, а інколи і саркомерів, нерівномірне скорочення та розслаблення міофібрил, тобто ознаки їх десинхронізації.

Таким чином, уже через два тижні спостережень після стабілізації підвищеного рівня холестерину та тригліцеридів в плазмі крові піддослідних тварин в енергозабезпечуючому апараті кардіоміоцитів і системах регуляції обміну кальцію з’являлися негативні зрушення, обумовлені накопиченням холестерину в мембранах органел, що негативно позначалося на адаптаційних можливостях клітин. Ці зміни відбувались на фоні ознак пластичної недостатності кардіоміоцитів, що, пов’язано з затримкою процесів мобілізації механізмів внутрішньоклітинної регенерації.

Не дивлячись на багаточисельні ознаки погіршення морфофункціонального стану скоротливого міокарда за умов двотижневої експериментальної гіперхолестеринемії, завдяки компенсаторному напруженню механізмів самовідновлення незворотня деструкція виникала лише в окремих клітинах.

Пролонгація гіперхолестеринемії до восьми тижнів характеризувалась прогресуванням структурно-функціональної перебудови кардіоміоцитів, основу якої становили процеси як патологічного, так і компенсаторного характеру. При дослідженні гістотопограмм серця в міокарді виявлялись дрібні дисеміновані вогнища фуксинофілії та вираженого чорного забарвлення при використанні методики Рего, майже відсутні в попередній серії досліджень.

Можна вважати, що однією із важливих обставин, яка давала можливість скоротливому міокарда адаптуватись до змінених умов функціонування та ліквідувати фактори пошкодження органел, була постійна мобілізація пластичних реакцій, які не тільки підтримували стан гіперфункції, але й забезпечували гіпертрофію значної кількості кардіоміоцитів. При цьому зростала гетерогенність кардіоміоцитів, яка характеризувалась поєднанням явищ атрофії і альтерації одних клітин, що частково або повністю втрачали свої функціональні властивості, та ознаками гіпертрофії інших.

Подовження терміну ГХЕ до двох місяців призводило до збільшення кількості холестерину в мембранних структурах, про що свідчили електроннощільні потовщення в плазмолемі вільної поверхні клітин і в
Т-канальцях, що виявлялися нами при використанні дигітоніну. В інтерстиції міокарда спостерігалось накопичення аморфно-фібрилярних мас, до складу яких, за даними тесту з феризолем, входили глікозаміноглікани. Осідання цих мас на базальній мембрані кардіоміоцитів сприяло її потовщенню.

Зміни даного компоненту сарколеми були неоднаковими: в одних клітинах базальна мембрана ущільнювалась, в інших, навпаки, ставала тонкою, оголюючи плазмолему. Це супроводжувалось коливаннями концентрації некомпенсованих негативних зарядів глікозаміногліканів глікокаліксу, що поєднувались зі змінами характеру специфічного контрастування при тестах з N,N-нафтолоїлгідроксиламіном натрію та з іонізованим лантаном.

За нашими даними, незважаючи на перевантаження кальцієм окремих відділів СПС, спостерігалось загальне зниження її Са2+-зв’язуючої здатності.
В той же час, пригнічення її функції поєднувалось з нерівномірними порушеннями здатності елімінувати Са2+, створюючи передумови до дискоординації елементів контрактильного апарату кардіоміоцитів.

Важливим фактором обумовленої гіперхолестеринемії дисфункції СПС і обміну Са2+ були зміни енергетичного забезпечення КМЦ. Нерівномірність метаболічних порушень в різних кардіоміоцитах ставала більш помітною. Так, при гістохімічному дослідженні зміни активності ЛДГ та СДГ, були неоднаковими і, рівень КФ в міокарді знижувався ще на 8% і становив 79%.

Альтеративні зміни мітохондрій набували більш розповсюдженого характеру. Разом з тим, явища компенсаторної гіперплазії мітохондрій та їх поліморфізм також посилювались, що зрештою призводило до достовірного збільшення їх об’ємної щільності (рис. 2). Новоутворені органели часто формували вогнищеві скупчення, були невеликими за розмірами, з незначною кількістю крист. Незважаючи на збільшення об’ємної щільності мітохондрій, коефіцієнт їх енергетичної ефективності знижувався на 20%, що свідчило про структурну й функціональну неповноцінність органел (рис. 1).

Рис. 2. Показники об’ємної щільності мітохондрій та міофібрил на різних етапах хронічної ГХЕ та при медикаментозній корекції

Формування мітохондріями надто великих скупчень призводило до атрофії міофібрил з перетворенням їх у тонкі релаксовані смужечки. При цьому об’ємна щільність скоротливих ультраструктур міокарда достовірно знижувалась на користь мітохондріального апарату (рис. 2).

Таким чином, 8-тижневий термін гіперхолестеринемії позначався поглибленням структурних змін. Разом з більш глибокими та поширеними проявами альтерації посилювались також і пластичні процеси. Причому, у ядрах кардіоміоцитів з переважним вмістом еухроматину на 21,5% у порівнянні з контролем збільшувалась і кількість ядерцевих організаторів, виявлених за допомогою аргентафінної реакції (рис. 3). Ядра набували неправильної форми, мали фестончаті контури, з ознаками гіпертрофії та гіперплазії ядерець, в яких гранулярний компонент домінував над фібрилярним. Показником інтенсифікації пластичних процесів було також значне збільшення в саркоплазмі кількості вільних моно- та полірибосом.

Разом з тим, в деяких клітинах нуклеоплазма була просвітлена, ядра деформовані, розташовувались на периферії кардіоміоцитів. Кількість ядерцевих організаторів у таких клітинах була зменшеною, в саркоплазмі різко збільшувалась кількість рибонуклеопротеїдів. Ці зміни поєднувались з прогресуючою деструкцією органел. В кардіоміоцитах з ознаками атрофії виявлялися ознаки зниження відновлюючих процесів. Поява цих змін відображала один з аспектів подальшої перебудови скоротливого міокарда.

Рис. 3. Показники кількості ядерцевих організаторів на різних етапах хронічної ГХЕ та при медикаментозній корекції

Збільшення тривалості гіперхолестеринемії до чотирьох місяців призводить до зростання кількості дисемінованих пошкоджень міокарда та поліморфізму його клітин. Дрібні вогнища фуксинофілії та позитивної реакції з залізним гематоксиліном свідчать про перманентне виникнення нових деструктивних змін в міокарді. Явища гіпертрофії або атрофії кардіоміоцитів та дифузного кардіосклерозу також помітно зростали. Набряк інтерстицію та повнокрів’я судин набували стабільного характеру. На гістотопограммах серця ознаки незворотного пошкодження кардіоміоцитів типу зернисто-грудчастого розпаду з заміщенням загиблих клітин сполучною тканиною значно поступались футлярному міоцитолізу, що свідчить про їх пластичну недостатність. В свою чергу дисеміновані пошкодження міокарда характеризувались локальними порушеннями оптичної активності в поляризованому світлі, що свідчить про погіршення контрактильної функції кардіоміоцитів.

Найбільш суттєві зміни спостерігаються в плазматичній мембрані кардіоміоцитів. Надмірна кількість холестерину посилює гідрофобні властивості мембрани, змінюючи концентрацію полярних речовин, які впливають на її фізико-хімічні властивості: зростає мікров’язкість, модулюється іонна проникність, модифікується електричний профіль мембрани.

Холестерин, як відомо, належить до відносно нестійких органічних речовин, здатних до самоокислення. За умов хронічної ГХЕ це стає важливим фактором ініціації процесу перекисного окислення ліпідів, що ще більш поглиблює зміни фізико-хімічних властивостей мембран, спричинених надлишковим надходженням холестерину. Перекисне окислення ліпідів створює передумови для розвитку оксидантного стресу, внаслідок чого відбувається атака мембран вторинними продуктами ПОЛ, порушується їх проникність, втрачається мембранний потенціал та знижується ефективність всіх енергозалежних процесів, що відбуваються на їх поверхні. Включення в біліпідний шар продуктів ПОЛ призводить до руйнування гідрофобної зони мембрани, внаслідок чого вона стає вразливішою до дії фосфоліпаз і протеаз. Це погіршує такі важливі функції сарколеми, як здатність до депонування Са2+ та селективної проникності, що підтверджується отриманими нами даними при використанні тестів з використанням НГА та іонізованого лантану.

Зміни кальцієвого гомеостазу кардіоміоцитів у сукупності з активацією ПОЛ стимулюють прогресуючі деструктивні зміни мембранних структур, що особливо важливо для функції мітохондрій. На субклітинному рівні ознаки пошкоджень органел набувають розповсюдженого характеру, що характеризується зниженням активності СДГ, тісно асоційованої з їх внутрішньою мембраною, а за морфометричним аналізом – зменшенням КЕЕМ на 30%. Обов’язкове за цих умов роз’єднання процесів окислювального фосфорування та утилізації кисню призводить до надлишкового утворення його активних форм, що стає додатковим стимулом для оксидантного стресу.

Констатовані нами дезінтеграційні явища в мітохондріях, що є наслідком посилення ПОЛ, під дією фосфоліпаз стають передумовою для електричного пошкодження мембрани, який виникав внаслідок якісних і структурних змін та дефектів їх ліпопротеїдної основи. Ці явища становили безпосередню причину втрати мембранами їх бар’єрної функції та здатності до створення різниці потенціалів, необхідної для генерації АТФ. Найбільш маніфестним морфологічним проявом ліпопротеїдної модифікації мембранних структур мітохондрій за цих умов стає розповсюдження явищ їх мієліноподібної трансформації. Разом з тим, важливим фактором, що призводив до погіршення функції і незворотного пошкодження мітохондрій, ставало надмірне та неконтрольоване надходження кальцію в їх матрикс. Перебудова енергетичного метаболізму багатьох органел на цьому етапі досягала критичних меж.

Зниження здатності мітохондрій до синтезу АТФ поєднується з порушеннями електролітного гомеостазу кардіоміоцитів і призводить до розладів їх контрактильної функції та компенсаторної гіперфункції здатних до неї міофібрил, яка спричиняє їх прискорене зношення. Однією з вірогідних ознак виключення міофібрил з механічного циклу була встановлена в наших дослідженнях їх релаксація та звивистість. При цьому поряд з деформацією зустрічались ознаки десинхронізації, фокуси надмірного скорочення та явища розплавлення, які за розповсюдженням значно перевищували подібні на попередніх етапах спостережень.

Тривала гіперфункція кардіоміоцитів значно підвищує також вимоги до їх регенераторних механізмів, що проявлялось у вигляді пригнічення активності пластичних процесів в клітинах. Ядра більшості клітин з мінімальними пошкодженнями органел були з ознаками помірного набряку, хроматин їх представлений у вигляді дрібних гранул, дифузно розташованих в слабкоосміофільній нуклеоплазмі. Ядерця часто збільшені за розмірами, гранулярний компонент переважав над фібрилярним. При прогресуючому пошкодженні ядра зазнавали пухирцеподібної трансформації, в ядерцях спостерігалась дисоціація їх гранулярного та фібрилярного компонентів, підвищено осміофільна нуклеолема була з ознаками фрагментації, іноді набувала кільцеподібної форми або ознак колапсу. Кількість ядерцевих організаторів зменшувалась у порівнянні з контролем на 23%. Таким змінам відповідало різке зменшення концентрації вільних полі- та монорибосом, а при гістохімічному дослідженні за методом Браше спостерігалось зниження інтенсивності піронінофілії саркоплазми кардіоміоцитів.

Ознаки погіршення морфофункціонального стану ядерно-рибосомального апарату клітин поєднувались з іншими проявами їх пластичної недостатності: утворенням метаболічно інертних форм глікогену, поширеним лізисом міофібрил, вогнищевим пошкодженням мембран СПС, деструкцією мітохондрій.

Результати проведених нами досліджень дають всі підстави стверджувати, що патологічні зміни в міокарді при атеросклерозі та хронічній ішемічній хворобі серця не є наслідком тільки циркуляторних порушень, обумовлених стенозом атеросклеротично уражених вінцевих судин, які були відсутні у піддослідних тварин. Нами встановлено, що пошкодження кардіоміоцитів були прямим наслідком метаболічних порушень, викликаних хронічною гіперхолестеринемією. В першу чергу це визначалось модифікуючим впливом гіперхолестеринемії на цитомембрани кардіоміоцитів та здатністю її порушувати відновлювальні процеси в міокарді і, як результат, погіршенням їх енергетичного забезпечення та кальцієвого гомеостазу. Все це дає нам підстави вважати, що стимуляція пластичних процесів в міокарді є патогенетично обґрунтованим підходом до стабілізації мембранних структур кардіоміоцитів та морфофункціонального стану міокарда в цілому за умов надлишкового надходження холестерину, що має значення для профілактики атеросклерозу та ішемічної хвороби серця.

З метою об’єктивізації значення пластичної недостатності як фактора пошкодження міокарда при хронічній гіперхолестеринемії нами була проведена спроба зменшити її негативний вплив шляхом цілеспрямованої корекції механізмів внутрішньоклітинної регенерації кардіоміоцитів. З цією метою були досліджені дві різнолігандні координаційні сполуки (РКС) нового класу препаратів з мембранопротекторними властивостями для відбору серед них найбільш ефективного.

Використані нами препарати синтезовані на основі аденозинтрифосфату (РКС-1) та аденозинмонофосфату (РКС-2) і містять у своєму складі амінокислоту гістидин та біометали. За результатами скринінгу на інтактних тваринах для подальших досліджень за умов хронічної ГХЕ був відібраний препарат РКС-2, що в більшій мірі, ніж відомий фармакопейний препарат АТФ-ЛОНГ (РКС-1), стимулював пластичні процеси в міокарді. За нашими даними це проявлялось, по-перше, збільшенням кількості ядерцевих організаторів на 24% у порівнянні з ефектом РКС-1, що дає зростання їх на 87%. Крім того, для РКС-2 було характерним також значне підвищення функціонального потенціалу саркоплазматичної сітки: зростання Са2+-депонуючої спроможності СПС, причому специфічне контрастування цистерн посилювалось в більшій мірі, ніж канальців. Активність Са2+-АТФ-ази мембран СПС і швидкість поглинання іонів кальцію її везикулами зростали.

Враховуючи вище зазначене, для підтвердження ролі пластичної недостатності міокарда як одного з провідних чинників пошкодження кардіоміоцитів при хронічній гіперхолестеринемії нами було обрано препарат РКС-2 з більш значним впливом на зазначені процеси. При його використанні з метою профілактики пошкоджень міокарда пластично-стимулюючий ефект проявлявся у вигляді значного зростання кількості ядерцевих організаторів (майже в 2,5 рази порівняно з контролем) в той час, як у нелікованих тварин
16-тижнева гіперхолестеринемія призводила до зниження цього показника на 23% у порівнянні з контролем. Заслуговує на увагу також факт значного збільшення концентрації рибонуклеопротеїдів в саркоплазмі. Ядра містили
2-3 гіпертрофованих ядерця з ознаками підвищеної пластичної активності, середня кількість їх перевищувала контрольну (рис.3).

Після використання препарату РКС-2 негативні зміни, що відбувалися на тканинному рівні, а також кількість дисемінованих мікрофокусів альтерації кардіоміоцитів, яку ми виявляли за допомогою відповідних гістологічних тестів, була значно меншою, ніж при хронічній гіперхолестеринемії без корекції. Явища дифузного кардіосклерозу, гіпертрофії та атрофії клітин, нечіткість їх природної посмугованості, перинуклеарний набряк були менш вираженими.

Використання РКС-2 показало, що критичне порушення бар’єрних властивостей сарколеми, які виявлялися з використанням таніну, спостерігалось лише в поодиноких клітинах, незважаючи на наявність в плазмолемі вогнищевих дигітонін-позитивних ущільнень, а електронногістохімічний тест з феризолем свідчив лише про помірні коливання в глікокаліксі концентрації вільних аніонних груп. Завдяки цьому Са2+-зв’язуюча здатність сарколеми під впливом препарату помітно зростала, наближаючись до контрольного рівня.

Оптимізація пластичного забезпечення функції міокарда під впливом препарату РКС-2 за нашими даними проявляється також зниженням інтенсивності перекисного окислення ліпідів і зменшенням явищ мієліноподібної трансформації мітохондрій, що в свою чергу призводить до зростання Са2+-зв’язуючої здатності плазмолеми та інших органел.

Нами встановлено, що зміни СПС при використанні РКС-2 на фоні хронічної ГХЕ, визначалися певною мозаїчністю. Зони підвищеної спорідненості до Са2+ та його іммобілізації в СПС кардіоміоцитів або порушень її Са2+-зв’язуючої здатності помітно зменшувались у порівнянні з експериментами без використання препарату. Якщо за умов хронічної гіперхолестеринемії активність Са2+-АТФ-ази і Са2+-поглинаюча здатність СПС помітно знижувалась, то ці показники під коригуючим впливом препарату вже вірогідно не відрізнялись від контрольної групи.

Гіперпластична активність мітохондрій за умов прийому препарату дещо знижувалась, мало місце формування окремих скупчень компактно розташованих органел з ознаками гіпоплазії, а їх об’ємні співвідношення проявляли чітку тенденцію до нормалізації (рис. 2). Коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій після використання препарату у порівнянні з
16-тижневою гіперхолестеринемії підвищувався на 21%, а їх інтегральна
Са2+-зв’язуюча здатність зростала, практично досягаючи контрольного рівня.

Частково збережений дефіцит енергетичного забезпечення функції кардіоміоцитів та порушення обміну Са2+, не дивлячись на стимуляцію внутрішньоклітинної регенерації використаним нами препаратом, іноді обумовлювали десинхронізацію елементів контрактильного апарату, а в деяких клітинах і їх альтеративні зміни. Проте глибокі порушення стану контрактильних структур (їх тотальне розплавлення або формування субсегментарних контрактур) спостерігалися лише в окремих клітинах.

При використанні препарату РКС-2 у піддослідних тварин спостерігалось зменшення кількості первинних, і, особливо, вторинних лізосом. На наш погляд, обмеження росту субпопуляції аутофаголізосом свідчить про зниження інтенсивності процесів внутрішньоклітинного катаболізму, що за умов ГХЕ стимулюється прискореним зношенням та альтерацією ультраструктур КМЦ.

Таким чином, проведені дослідження показали, що гіперхолестеринемія є кардіотропним агентом, який, порушуючи метаболізм та структуру кардіоміоцитів, знижує функціональний потенціал міокарда і стає одним з факторів, що сприяє розвитку серцевої недостатності при ішемічній хворобі серця. Отримані результати свідчать про ефективність профілактики негативного впливу хронічної гіперхолестеринемії на міокард шляхом медикаментозного стимулювання механізмів внутрішньоклітинної регенерації кардіоміоцитів. Оптимізація пластичної функції, що за нашими даними є важливим чинником пошкодження міокарда при хронічній гіперхолестеринемії, за допомогою препарату РКС-2 призводить до часткового відновлення ультраструктурних змін та кальцієвого гомеостазу клітин міокарда, і тим самим підтверджує важливість негативного кардіотропного ефекту гіперхолестеринемії як фактора ризику серцевої недостатності.

Отримані нами дані підтверджують, що стимулювання репаративних процесів в кардіоміоцитах при хронічній гіперхолестериенемії завдяки їх мембраностабілізуючому ефекту здатне оптимізувати енергетичне забезпечення функції та сприяти нормалізації обміну кальцію в цих клітинах. В той же час, використання препаратів з кардіопротектроними властивостями, подібних до використаного нами препарату РКС-2, сприяє зниженню інтенсивності катаболічних процесів в кардіоміоцитах та підвищує їх резистентність до дестабілізуючого впливу гіперхолестеринемії.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне обґрунтування та наукове вирішення актуальної задачі ? вивчення морфології вентрикулярних кардіоміоцитів при моделюванні хронічної гіперхолестеринемії і визначення ознак пластичної недостатності в них за допомогою препаратів, здатних оптимізувати пластичні функції міокарда.

2. Структурні зміни в скоротливому міокарді при атеросклерозі та ішемічній хворобі серця обумовлені не тільки гемодинамічними факторами (коронарна недостатність), але й є результатом негативного впливу надлишкового вмісту холестерину в кардіоміоцитах.

3. Хронічна гіперхолестеринемія, що призводить до електронногістохімічно підтвердженого накопичення холестерину в плазмолемі кардіоміоцитів, має прямий пошкоджуючий вплив на робочі клітини міокарда, зумовлений порушеннями фізико-хімічних властивостей цитомембран. Наслідком даних змін стає підвищення інтенсивності внутрішньоклітинного катаболізму, пов’язаного з порушеннями енергетичного забезпечення функції і електролітного гомеостазу.

4. Важливими факторами прогресуючих альтеративних змін в кардіоміоцитах є активація їх лізосомального апарату та надмірне посилення процесів перекисного окислення ліпідів. Перебіг дезінтеграційних процесів у скоротливому міокарді характеризується численними дрібними пошкодженнями контрактильного апарату, в окремих випадках набуваючих незворотного характеру.

5. Альтеративні зміни, що виникають в скоротливому міокарді, за умов хронічної гіперхолестеринемії обмежують функціональну спроможність пошкоджених клітин з перерозподілом функціонального навантаження між ними. Прямий негативний вплив дисліпопротеїдемічної модифікації на цитомембрани кардіоміоцитів та посилене “зношування” їх органел різко підвищують вимоги до механізмів внутрішньоклітинної регенерації, зумовлюючих їх неадекватність реальним потребам клітин.

6. Морфологічними ознаками пластичної недостатності кардіоміоцитів є надмірна гідратація їх нуклеоплазми, перехід еухроматину в гетерохроматин, дисоціація гранулярних структур ядерець з оголенням їх фібрилярного компонента, явища каріопікнозу, зменшення кількості аргентафінних ядерцевих організаторів, а в саркоплазмі ? гранул рибонуклеопротеїдів та лізисні пошкодження органел, що сприяє поступовому розвитку серцевої недостатності.

7. Профілактично-лікувальне використання засобів, що стимулюють процеси пластичного забезпечення функції скоротливого міокарда при порушеннях ліпідного гомеостазу організму, оптимізуюють енергетичне забезпечення, метаболізм Са2+, і, відповідно, функцію кардіоміоцитів. Це дає можливість визначити пластичну недостатність їх як важливий компонент негативного кардіотропного впливу хронічної гіперхолестеринемії ? одного з важливих факторів серцевої недостатності при ішемічній хворобі серця.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гавриш А.С., Вербицкий В.В., Данилишина М.В. Цитохимия окислительно-восстановительных ферментов вентрикулярных кардиомиоцитов в норме и при острой коронарной недостаточности / Вісник морфології. – 2002. – № . – С. 305-308. Здобувачем був проведений фрагмент дослідження щодо вивчення морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин в умовах гострої коронарної недостатності.

2. Гавриш А.С., Вербицкий В.В., Шульц Н.В., Данилишина М.В. Морфофункциональные аспекты кардиопротекторного действия пропранолола при моделировании хронической ишемической болезни сердца / Лікар. справа. 2002. – № . – С. 85-89. Здобувачем був проведен люмінесцентно мікроскопічний аналіз морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин. Здобувачем був проведений аналіз морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин.

3. Гавриш А.С., Шульц Н.В., Вербицкий В.В., Данилишина М.В. Влияние длительного введения финоптина на морфофункциональное состояние рабочих клеток интактного миокарда при моделировании хронической коронарной недостаточности / Лікар. справа. 2002. – № . – С. 107-110. Здобувачем був проведений люмінесцентно мікроскопічний аналіз морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин.

4. Гавриш А.С., Хаджинский В.Г., Шульц Н.В., Вербицкий В.В., Данилишина  М.В. Рациональная технология исследования морфофункционального состояния сократительного миокарда / Вісник проблем біології і медицини. – 2003. – Вип. 2. – С. 22-23. Здобувачем був проведений фрагмент дослідження щодо вивчення морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин в умовах стресу.

5. Гавриш О.С., Вербицький В.В., Кравець С.О., Данилішина М.В. Порушення інтермедіарного обміну та морфогенез дифузного кардіосклерозу при хронічній ішемічній хворобі серця / Галицький лікарський вісник. – 2003. – Т. , № . – С. . Здобувачем був проведений фрагмент дослідження щодо вивчення морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин в умовах моделювання ішемії.

6. Гавриш А.С., Благодаров В.Н., Вербицкий В.В., Данилишина М.В. Структурно-метаболические аспекты гетерогенности вентрикулярных кардиомиоцитов при коронарной недостаточности / Лікарська справа. – 2003. – № . – С. . Здобувачем був проведений фрагмент дослідження щодо вивчення морфофункціонального стану кардіоміоцитів експериментальних тварин в умовах коронарної недостатності.

7. Трунина И.В., Гавриш А.С., Благодарова Е.В., Данилишина М.В. Морфофункциональные аспекты перестройки сократительного миокарда при субмаксимальной физической нагрузке / Матеріали української науково-практичної конференції “Профілактика і лікування артеріальної гіпертензії в Україні в рамках реалізації національної програми”. – Київ, 2002. – С. 110.

8. Вербицкий В.В., Кравец С.А., Данилишина М.В. Структурные варианты очагов постинфарктного кардиосклероза / “Актуальні питання морфології”: Наукові праці ІІІ національного конгресу анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України. – Київ, 21-23 жовтня 2002 р. – С. 50.

9. Гавриш А.С., Шульц Н.В., Вербицкий В.В., Данилишина М.В. Морфофункциональное состояние миокарда при использовании пропранолола для профилактики сердечной недостаточности в условиях хронического нарушения коронарного кровотока / “Серцева недостатність – сучасний стан проблеми”. Матеріали об’єднаного пленуму правлінь українських наукових товариств кардіологів, ревматологів та кардіохірургів з міжнародною участю. – Київ, 2002. – С. 41-42.

10. Гавриш О.С., Благодаров В.М., Щульц Н.В., Вербицький В.В., Данилішина М.В. Морфофункціональні особливості кардіоміоцитів при моделюванні хронічної ішемічної хвороби серця та ії корекція антагоністами кальцію і в-адреноблокаторами / “Атеросклероз і ішемічна хвороба серця: сучасний стан проблеми”. Матеріали пленуму правління українського наукового товариства кардіологів. – Київ, 2003. – С. 48.

АНОТАЦІЯ

М.В. Данилішина. Морфогенез та медикаментозна корекція пластичної недостатності міокарда при хронічній гіперхолестеринемії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.02 – патологічна анатомія. – Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, Київ, 2007.

Дисертація присвячена вивченню структурних змін міокарда при моделюванні хронічної гіперхолестеринемії, визначенню ролі пластичної недостатності як фактора її негативного впливу на морфофункціональний стан кардіоміоцитів. Проведені дослідження показали, що патологічні зміни в міокарді при атеросклерозі та хронічній ішемічній хворобі серця не є наслідком тільки циркуляторних порушень, обумовлених стенозом атеросклеротично уражених вінцевих судин, але є й прямим наслідком метаболічних порушень, викликаних хронічною гіперхолестеринемією. В першу чергу це визначалось модифікуючим впливом гіперхолестеринемії на цитомембрани та здатністю порушувати відновлювальні процеси в міокарді і, як результат, погіршенням енергетичного забезпечення та кальцієвого гомеостазу кардіоміоцитів.

Наші дослідження довели, що активна стимуляція пластичних процесів в міокарді при хронічній гіперхолестеринемії завдяки мембраностабілізуючому ефекту здатна оптимізувати енергетичне забезпечення функції клітин та сприяти нормалізації обміну кальцію в них. В той же час, використання препаратів з кардіопротектроними властивостями, подібних до використаного нами, сприяє зниженню інтенсивності катаболічних процесів в кардіоміоцитах та підвищує їх резистентність до дестабілізуючого впливу гіперхолестеринемії.

Ключові слова: кардіоміоцит, міокард, хронічна гіперхолестеринемія, пластична недостаність.

АННОТАЦИЯ

М.В. Данилишина. Морфогенез и медикаментозная коррекция пластической недостаточности миокарда при хронической гиперхолестеринемии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.02 – патологическая анатомия. – Национальный медицинский