національна Академія наук України

Інститут молекулярної біології ТА генетики

Дибков Михайло Васильович

УДК 577.2:616-006

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ЗМІНИ ПРИ Ph'-ПОЗИТИВНИХ ЛЕЙКЕМІЯХ ТА ЇХНЯ ДІАГНОСТИКА

03.00.22 — молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник:

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Телегеєв Геннадій Дмитрович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Лукаш Любов Леонідівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач відділу генетики людини;

кандидат біологічних наук,

Завелевич Михайло Петрович,

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є.Кавецького НАН України,

старший науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем.

Захист відбудеться “27” листопада 2007 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150, актова зала).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150).

Автореферат розіслано “_24_” жовтня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д .237.01 О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На нинішній час онкопатології за рівнем захворюваності й смертності посідають одне з перших місць у світі. За даними МОЗ України 2005 року в Україні новоутворення займають друге місце серед причин смертності населення (близько 15%). Захворюваність на лейкемії складала 8,0 на 100 тис. чоловік (9,4 для чоловіків та 6,9 для жінок), що становить 2,5% всіх новоутворень. Зростання даного показника в порівнянні з 2003 роком склало 1,3%.

Ph'-позитивні лейкемії — різнорідна за природою та клінічними проявами група лейкемій, яку поєднує маркер — філадельфійська хромосома (Ph'- хромосома), результат реципрокної транслокації t (9;22)(q34; q11). Вона виявляється переважно у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію (ХМЛ) та гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) (разом до 4 випадків на 100 тис. населення). Клінічна картина, що спостерігається при ХМЛ та ГЛЛ, суттєво різниться. Так, для ГЛЛ притаманний переважно одностадійний гострий перебіг захворювання. Для ХМЛ, навпаки, характерний трьохстадійний перебіг з різним за тривалістю періодом ремісії. Однак на термінальній стадії ХМЛ картина захворювання стає подібною до ГЛЛ (зменшення ступеню диференціації, зростання кількості бластних клітин тощо).

Іншою особливістю Ph'-позитивних лейкемій є гетерогенність химерних білків, що є продуктами гена bcr/abl. Відомо три основних типи злитих білків BCR/ABL — p190BCR/ABL, p210BCR/ABL та p230BCR/ABL. Показано, що різні типи білка асоціюються з певним типом лейкемії. Так, найменший білок p190BCR/ABL виявляють переважно у хворих на гостру лімфобластну лейкемію, а білки p210BCR/ABL і p230BCR/ABL -- — на хронічну мієлоїдну лейкемію. І хоча білок p210BCR/ABL переважно виявляють (до 95%) у хворих на ХМЛ (хронічний перебіг захворювання), однак цей білок виявляють і у хворих на ГЛЛ (гострий перебіг, як і в разі виявлення білка p190BCR/ABL).

Дослідженню ділянки, що кодує dbl-гомологічний домен (DH), за яким різняться p190BCR/ABL та p210BCR/ABL, у хворих на ХМЛ та ГЛЛ і присвячено дану роботу.

Іншим важливим питанням є проблема діагностики даної групи патологій. Своєчасна диференційна діагностика, особливо діагностика на ранніх стадіях, дозволяє завдяки новим схемам лікування значно підвищити шанси на одужання або перевести захворювання в стадію ремісії (при ХМЛ). Діагностика має також важливе значення для контролю залишкових патологічних клітин на стадії ремісії для своєчасного реагування на патологічні зміни в перебігу захворювання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках плану науково-дослідних робіт відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за темами: “Розробити методи молекулярної діагностики неопластичних захворювань крові (лейкемій і лімфом)", шифр — 01.01.01/072-92 (01.01.03/003к-95), № держ-реєстрації 0195U019260 (1992–1997 рр.); “Мінливість молекулярно-генетичних маркерів у процесах пухлинної трансформації клітин” № 2.2.4.7, шифр 2.34.6.1, № держреєстрації 0199U000579 (1998–2003 рр.), а також в рамках пpоекту Деpжавного фонду фундаментальних дослiджень “Вивчення молекулярно–генетичних основ бластної трансформації у хворих на ХMЛ та ГЛЛ”, реєстраційний номер 5/4.64 (1997–1999 рр.); Міжнародного гранту CRDF Cooperative Grants Program “Investigation of molecular-genetics mechanism of blast transformation in patients with chronic myelocytic leukemia (CML)", реєстраційний номер UB1–294 (1997–1999 рр.) та гранту Президії НАН України для молодих вчених “Роль bcr доменів при Ph'-позитивних лейкеміях” (2003–2004 рр.).

Мета і завдання дослідженя. Метою даної роботи було дослідження dbl-гомологічного (DH) регіону bcr/abl кДНК у хворих із різним перебігом Ph'-позитивних лейкемій та розробка методів молекулярно-генетичної діагностики даної групи захворювань.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:–

розробити підходи до молекулярно-генетичного виявлення химерного гена bcr/abl у хворих на лейкемії;–

порівняти первинні послідовності dbl-гомологічного регіону мРНК bcr/abl у хворих на ХМЛ та ГЛЛ (на різних стадіях захворювання) та в здорових донорів;–

проаналізувати можливі наслідки виявлених змін в DH домені;–

модифікувати систему молекулярної діагностики Ph'-позитивних лейкемій з урахуванням можливих змін в bcr ділянці гена bcr/abl.

1.

Об’єкт дослідженя даної роботи — виявлення химерного гена bcr/abl та змін в DH домені цього гена у хворих на ХМЛ та ГЛЛ на різних стадіях захворювання.

Предмет дослідження — bcr ділянка химерного гена bcr/abl і, зокрема, DH домен у хворих на ХМЛ та ГЛЛ на різних стадіях захворювання.

Методи дослідженя: виділення РНК і ДНК, добір олігонуклеотидних праймерів, зворотно-транскриптазна полімеразна ланцюгова реакція — ЗТ-ПЛР, ПЛР, створення рекомбінантної ДНК, трансформація бактерій, виділення й рестрикційний аналіз плазмідної ДНК, гібридизація за Саузерном, секвенування ДНК, порівняльний аналіз послідовностей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що у хворих на ГЛЛ та ХМЛ з p210BCR/ABL мРНК на гострій стадії захворювання відбувається втрата різних за протяжністю ділянок DH домену. Було виявлено 7 нових варіантів химерної BCR/ABL мРНК. На основі аналізу потенційної білкової послідовності, яка відповідає виявленим варіантам, обгрунтовано їхню можливу функціональну подібність із білками p190BCR/ABL. Вперше запропоновано новий підхід до виявлення та диференційної діагностики Ph'-позитивних лейкемій, який дозволяє виявляти як класичні, так і можливі неканонічні типи перебудов у bcr ділянці химерного гена bcr/abl.

Практичне значення одержаних результатів. На основі проведеного аналізу послідовностей химерного гена bcr/abl було розроблено методичні рекомендації, щодо використання молекулярно-генетичного аналізу для виявлення Ph'-хромосоми в клінічній практиці.

Оскільки в результаті проведених досліджень було показано, що в деяких хворих на гострій стадії лейкемій з Ph'-хромосомою відбуваються зміни в DH ділянці химерної мРНК, запропоновано модифіковану тест-систему для виявлення та диференційної діагностики Ph'-позитивних лейкемій з використанням методу ЗТ-ПЛР, яка дозволяє виявляти як класичні, так і можливі неканонічні типи перебудов у bcr ділянці химерного гена bcr/abl. Дані дослідження лягли в основу деклараційного патенту.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені в дисертації, отримано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно виділено ДНК та більшу частину зразків РНК із крові хворих на ХМЛ, ГЛЛ та здорових донорів. За допомогою ЗТ-ПЛР відібрано зразки РНК хворих на ХМЛ та ГЛЛ з p210BCR/ABL. Проаналізовано первинну структуру DH домену у пацієнтів із вищенаведеними патологіями на різних стадіях захворювання, а також у здорових донорів, для чого було проведено добір праймерів, умов ЗТ-ПЛР, клоновано та секвеновано ампліфікати. Зроблено порівняльний аналіз отриманих послідовностей із міжнародними базами даних та внесено до них послідовності, які не було описано раніше. Підібрано праймери та умови проведення ЗТ-ПЛР для нової тест-системи і перевірено їх на зразках крові хворих на ГЛЛ та ХМЛ та здорових донорів.

Виявлення філадельфійської хромосоми методом блот-гібридизації зі специфічними зондами проведено спільно з к.б.н. ТелегеєвимГ.Д. Частину зразків РНК для перевірки модифікованої тест-системи виділено Дубровською Г.М. та Мірошниченко Д. О. Обробку і аналіз отриманих результатів виконано під керівництвом к.б.н., ст.н.сп. Телегеєва Г.Д. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Дисертант щиро вдячний за зонди до M-bcr ділянки гена bcr, які було люб'язно надано Dr. (University of Ulm, Німеччина). Автор щиро вдячний д.б.н., професорові, член-кор. НАН України Малюті С.С. за всіляке сприяння проведенню досліджень та обговорення результатів даної роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), а також на науково-практичній конференції “Сучасний стан медичної генетики в Україні” (Київ, 1999), I-й Конференції для молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001), на IV З’їзді гематологів та трансфузіологів України (Київ, 2001) та на наукових семінарах відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано в 7 статтях, з них 4 у фахових наукових журналах, деклараційному патенті, методичних рекомендаціях та тезах 4 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, які викладено в трьох розділах, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаної літератури, який нараховує 184 найменування. Роботу викладено на 122 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 37 рисунками та таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. Виділення ДНК із клітин крові. Зразки крові та кісткового мозку для молекулярно-генетичного аналізу надавались Київським НДІ гематології та переливання крові МОЗ України в рамках виконання спільної науково-дослідної роботи. Також було проаналізовано зразки крові, що надавались за направленнями гематологічних відділень лікувальних установ України.

Виділення ДНК із клітин крові проводили за методом (Mathew, 1984), який модифіковано на стадії депротеїнізації (фенольна очистка замінена на висолювання). Вихід ДНК складав 100–500 мкг із 5 мл крові.

Електрофорез в агарозному гелі. Проводили згідно (Маниатис и др., 1984) в 0,5х буфері. У разі потреби гель фотографували на плівку “Мікрат–300” або на цифрову фотокамеру з використанням жовтогарячого світлофільтра.

Блот-гібридизація зі специфічними зондами. Гібридизацію проводили з використанням зондів, які несуть ділянки гена bcr. Зонди були люб'язно надані Dr. (University of Ulm, Німеччина). Використовували 10 мкг тотальної ДНК розщепленої фер-ме-н-тами Bgl II, BamHI, HindIII. Препаративне розділення рестриктів проводили в 0,9%ага-ро-з-ному гелі довжиною 20см та товщиною 4–5мм. Електрофорез проводили в 0,5хТБЕ бу-фе-рі 18 год (3–4В/см). Перенесення ДНК на нейлонові мембрани проводили модифікованим методом капілярного перенесення за Саузерном із використанням розчину 0,4М NaOH або за допомогою електроперенесення (в 0,0125М фосфатному буфері, pH 6,5; 1,5 год при 1 А). Фіксували ДНК на ме-м-б-ра-ні за допомогою про-г-рі-ва-н-ня при температурі 80 оС про-тя-гом 2 год у ва-куу-мі. Мічення геномних зондів pUC18/5'-bcr та pSV2/3'-bcr (0,1–0,3мкг відповідного зонда) здійснювали за допомогою реакції синтезу з розсіяною затравкою з використаннямCi -32Р. Зонд очищували в 8% поліакриламідному гелі в присутності 7М сечовини з наступною елюцією з геля. Мічення олігонуклеотидних зондів 2-II, 3-II та I-II проводили за допомогою  _32P ATP (5’–кінцеве мічення). Гібридизацію фільтрів із фіксованою на них ДНК здійснювали в 0,25 M фосфатному буфері pH ,5, що містив 7% SDS, 0,5 мМ EDTA та 0,2% BSA з 10 мл буфера на 400 см2 фі-ль-т-ру. Прегібридизація тривала 18 год при 60 оС. Після додавання очищеного зонду проби інкубували ще 24год. Фільтри відмивали від надлишку зонда 4хSSC, 0,1% при кі-м-на-т-ній тем-пе-ра-ту-рі і експонували з ре-н-т-ге-ні-в-сь-кою плі-в-кою в ме-ди-ч-них ре-н-т-ге-ні-в-сь-ких ка-се-тах із посилюю-чи-ми ек-ра-на-ми 0,5–2 доби.

Виділення РНК. Дану процедуру проводили за (Chomczynski et al., 1987) із деякими модифікаціями. Вихід РНК з 108 клітин складав 5–25 мкг. Також використовували комерційні набори для виділення РНК "Mammalian Total RNA Miniprep Kit" (Sigma, EU), "RNeasy Mini Kit" (Qiagene Inc., USA), "UltraClean™ Tissue RNA Kit" (Mo Bio Laboratories, Inc., USA).

Підбір праймерів для проведення ПЛР. Добір праймерів проводили за допомогою програми Generuner 3.05 (freeware). Первинні послідовності ДНК та мРНК було отримано з банків нуклеотидних послідовностей GenBank. У разі підбору праймерів для двоетапної ПЛР добір проводили згідно послідовності, яка мала бути отримана в результаті першого етапу, а потім перевіряли відібрані праймери на повній послідовності, яку аналізували. Окрім того, для нівелювання можливого неспецифічного синтезу всі праймери перевірялись шляхом пошуку гомологій у базах даних нуклеотидних послідовностей за допомогою BLAST2 server. Послідовності олігонуклеотидних праймерів, які використовували при виконанні роботи: (dNTP)6; (dT)12; pUC/M13 Forward 5'-CGCCAGGGTTTTC CCAGTCACGAC–3', pUC/M13 Reverse 5'–TCACACAGGAAACAGCTATGAC–3' A1 5'–TGATTATAGCCTAAGACCCGGA–3'; B1 5'–GAAGTGTTTCAGAAGCTTC TCC–3'; A3 '–TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC–3'; B2 '–GGAGCTGCAGAT GCTGACCAAC–3'; Ia 5'–ATCTGCCTGAAGCTGGTGGGCT–3'; Ib 5'–GCAGCAG CCTGGAAAAGTACTT–3'; BI1 5'–CGCATGTTCCGGGACAAAAGC–3'; BI2 5'–ACCATCGTGGGCGTCCGCAAGA–3'; 3-II5'–GCTGAAGGGCTTTTGAACTCT GCTTA–3'; 2-II '–GCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGATG–3'; I-II '–GCTGAA GGGCTTCTGCGTCTCCAT–3'; Ext1 dbl5'–GGCTGCCCTACATTGATGACTC GC–3'; Ext1 rev dbl 5'–GATGTTGGGCACTGCCTCCAGTTC–3'; Extdbl5'–AAGC TTGCCCTGGAGTCCACTAAAG–3'; Ext dbl '–GAATTCTGCCTCCAGTTC ATCCAC–3'; 3dblf '–CTGGAGTCCACTAAAGCGAGTGAGC–3'; 3dblr 5'–CAC CATCTGGAAGCTGAGATCCG–3'; ser–5' dbl 5'_GCATCTTTGTTGCTTCTGGC–3'; ser–3' dbl 5'–CCAGAAGCAACAAAGATGCC–3'. Склад праймерів Ph1-f, Ph1-r, Ph-f та Ph-r —захищено “Деклараційним патентом на корисну модель UA № 10385” (Малюта і співавт., 2005).

Проведення зворотної транскрипції. кДНК от-ри-мували за допо-мо-гою зворот-ніх тра-н-с-к-ри-п-та-з AMV та M_MLV. Реакцію здійснювали в об'ємі 40 мкл, що містив 1–3 мкг тотальної РНК, 5–10од. РНа-зі-ну, 1 мМ ко-ж-но-го з dNTP, 20 праймера (dT)12 чи 10 pmol специфічного пра-й-ме-ра А1, бу-фе-р для зворотної транскриптази фірми-виробника та 5–10 од. фе-р-ме-н-ту AMV чи 200 од. M_MLV (Promega, USA). Синтез кДНК про-во-дили на водяному термостаті LKB 1 год., 5 мкл реа-к-ці-й-ної суміші ви-ко-ри-с-то-вували для ПЛР.

Полімеразна ланцюгова реакція. Реа-к-цію ам-п-лі-фі-ка-ції здійснювали з використанням ферментів Taq для діагностичних процедур або ж Pfu — у разі необхідності подальшого клонування продуктів ПЛР. Реакційна суміш загальним об'ємом 30–50 мкл складалась з відповідного 1хПЛР буфера, суміші 200мкМ за кожним із чотирьох dNTP, матриці (кДНК чи продукт першого етапу ПЛР), 2мМ MgCl2, 10 кожного з праймерів та 1–3 одиниці ферменту. Умови ПЛР підбирались (особливо температура “відпалювання”) залежно від складу праймерів (згідно умов, рекомендованих програмою GeneRuner) та довжини фрагмента, який очікувалось отримати. ПЛР реакцію проводили впродовж 30 ци-к-лів ампліфікації за та-ких умов: 92–94 ОС — 30–45 с, 55–60 ОС — 30–45 с, 72 ОС— 1–1,5хв. ПостПЛР добудова фрагментів не проводилась. Якщо фрагменти планувалось використовувати для клонування, кількість циклів зменшували до 23–26. У разі двораундової ПЛР на другий етап відбирали 1 мкл продукту першого етапу, а в окремих випадках розводили суміш 1:100 і брали 1–10 мкл суміші після розведення. Про-ду-к-ти ам-п-лі-фі-ка-ції ана-лі-зу-ва-ли в 1–2% ага-ро-з-но-му чи 7–10% поліакриламідному гелі.

Клонування продуктів ПЛР. Продукти ПЛР клонували у вектор pUC19, розщеплений за сайтом Hinc II, по тупих кінцях. Для цього 2–3 мкг продуктів ПЛР переосаджували етанолом і розчиняли в 10 мкл води та обробляли фрагментом Кленова в присутності dNTP 30 хв при 37 ОС. Суміш прогрівали 5 хв за температури 65 ОС і переосаджували етанолом. Далі проводили фосфорилювання 5’–OH кінців отриманих фрагментів полінуклеотидкіназою фага Т4 у присутності 1 мМ АТФ. Оброблені ампліфікати очищали за допомогою фенол-хлороформної суміші згідно (Маниатис и др., 1984), переосаджували етанолом і розчиняли в 10–20 мкл стерильної води. Для лігування брали 100–150 нг вектора та 200–600 нг вставки (у співвідношенні 1:10 за вільними кінцями). Реакцію проводили в об'ємі 20 мкл з 1од. лігази фага Т4 (Promega, США) 2 год при 22 ОС.

Отримання компетентних клітин та трансформація. Отримання і трансформацію компетентних клітин JM109 та XL1-Blue проводили з використанням CaCl2 згідно (Mandel et al., 1970) із деякими модифікаціями. Селекцію клонів проводили за допомогою біло-блакитної селекції з подальшою перевіркою відібраних клонів за допомогою ПЛР та рестрикційного аналіза.

Виділення плазмід. Процедуру проводили за допомогою методу лужного лізису згідно (Birnboim et al., 1979) з модифікаціями.

Секвенування рекомбінантних клонів. Секвенування здійснювали як за допомогою набору для секвенування “Т7SequencingТМ Kit” (“Amersham Pharmacia Biotеch, Inc.", США) згідно інструкцій виробника з використанням праймерів pUC/M13 Forward і Reverse, ser–5' dbl, ser–3' dbl, так і у спеціалізованих фірмах з секвенування. У цьому разі ABI файли з послідовностями було проаналізовано за допомогою програми BioEdit (freeware). Аналіз первинної структури рекомбінантних клонів згідно отриманих секвенаційних картин було зроблено за допомогою програм Gene Runner, BioEdit, а також e-mail сервера BLAST (ver. 2) та вебсервера BLAST2.

Результати дослідження та їх обговорення.

Виявлення філадельфійської хромосоми за допомогою молекулярно-генетичних методів. Оскільки група Ph'-позитивних лейкемій є гетерогенною, а метою роботи є вивчення зразків крові хворих на ХМЛ та ГЛЛ, які характеризуються e13a2 чи e14a2 типом перебудови, і в яких, відповідно, експресується білок p210BCR/ABL, на першому етапі роботи було необхідно відібрати зразки з даною перебудовою.

Виявлення химерного гена за допомогою геномних зондів. Виявлення химерного гена bcr/abl за допомогою геномних зондів є можливим завдяки тому, що перебудови розриви в гені bcr відбуваються переважно в 3-х ділянках — M-, m- та -BCR. e13a2 та e14a2— це перебудови, які спричинені розривами в M-BCR ділянці гена bcr/abl.

При розщепленні геномної ДНК рестрикційними ферментами BglII, BamHI, HindIII з подальшим розділенням в агарозному гелі і проведенні гібридизації за Саузерном зі специфічними зондами до M-BCR можливо як ідентифікувати химерний ген, так і встановити тип перебудови. Як зонд нами було використано зонди pUC18/5'-bcr та pSV2/3'-bcr (Bartram, 1988), які люб'язно надав автор. Ці зонди гібридизуються відповідно з 5’ та 3’ ділянками M-BCR. Так, наявність нормальної 22-ї хромосоми при аналізі BglII рестриктів тотальної ДНК після проведення гібридизації з зондом pSV2/3'-bcr зумовлює появу одного фрагмента ДНК розміром 4,8 т.п.н., який відповідає BglII/BglII фрагменту нормального MВ той же час при розщепленні ДНК хворого на ХМЛ окрім фрагмента 4,8 т.п.н виявляється додатковий фрагмент розміром 5,6 т.п.н. (рис. ).

При необхідності диференціювати перебудови e13a2 та e14a2 використовують гібридизацію з обома зондами — при використанні зонда pUC18/5'-bcr гібридизаційний сигнал від химерного гена буде як за e13a2, так і за e14a2 типу перебудови, а pSV2/3'-bcr зонд буде гібридизуватись лише з химерним геном з e14a2 типом перебудови. Даний метод хоч і дозволяє діагностувати ХМЛ і відбирати необхідні зразки, його застосування як в умовах молекулярно-біологічної лабораторії і, особливо, при рутинних обстеженнях у клінічній практиці, є вкрай обмеженим, оскільки для впевненої детекції необхідно, щоб клітини, які несуть химерний ген, складали не менш ніж 1від загальної кількості клітин — тобто виявлення залишкових клітин на стадії ремісії є неможливим.

Встановлення типу перебудови методом зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції. Даний метод забезпечує надзвичайно високу чутливість і дозволяє виявляти навіть слідові кількості химерної мРНК. Він базується на виявленні молекул з bcr/abl перебудовою за допомогою ЗТ-ПЛР зі специфічними праймерами. На стадії апробації та оптимізації умов реакцію проводили з використанням мРНК, яку виділяли з культури клітин К562 (Ph'- позитивна культура клітин), а також крові пацієнтів із діагнозом ХМЛ, який підтверджено цитогенетично та за допомогою гібридизаційних зондів.

На першому етапі отримували кДНК за допомогою або специфічного праймера А1 до ділянки мРНК abl, яка також присутня і в химерній мРНК bcr/abl, або полі-Т праймера. В подальшому отриману кДНК використовували як матрицю для проведення двораундової реакції ампліфікації (“гніздова” або nested ПЛР). Перший раунд ПЛР проводили (дві окремі реакції) з використанням праймерів A1, B1 (для виявлення перебудов e13a2 та e14a2) та A1, BI1 (для виявлення перебудови e1a2). Оскільки кількість продукту ПЛР після першого етапу незначна, прямо її можна було виявити лише за допомогою радіоактивно мічених олігонуклеотидних зондів 2-II, 3-II та I-II. Так, при позитивному сигналі з використанням зонду 2-II перебудова ідентифікується як e13a2 (b2a2 за старою номенклатурою). Зонд 3-II виявляє e14a2, а I-II e1a2 перебудову. Однак до методу мічення продуктів ПЛР вдавались лише в окремих випадках на етапі апробації методики ЗТ-ПЛР задля перевірки специфічності отриманих продуктів. Зазвичай же після першого етапу ЗТ-ПЛР проводили другий із використанням 1:20 – :200 частини реакційної суміші першого етапу. ПЛР проводили із праймерами A3, B2 (для виявлення перебудов e13a2 та e14a2) та A3, BI2 (для виявлення перебудови e1a2). Продукти ПЛР розділяли в 2% агарозному гелі. За e13a2 типу транслокації (b2/a2 за старою номенклатурою) синтезується ампліфікат розміром 125 п.н., e14a2 — 200 п.н., у разі e1a2 перебудови — 247 п.н. Як внутрішній позитивний контроль використовували мРНК нормального гена abl, який функціонує як у хворих на Ph'-позитивні лейкемії, так і у здорових донорів. Для цього використовували специфічні праймери — Ia, Ib та A1 (1й етап ПЛР) та Ia, Ib та A3 (2й етап). Використання трьох праймерів обумовлено наявністю двох ізоформ мРНК abl. Ампліфікат розміром 118 п.н. характерний для Ia ізоформи abl, а 176 п.н. — для Ib. Для кожної серії діагностичних реакцій проводили також одну реакцію негативного контролю, яка містила всі реакційні компоненти й дублювала всі стадії діагностики за винятком процедури додавання мРНК перед синтезом кДНК. Таким чином, використання методу ЗТ-ПЛР дозволяє виявити химерну bcr/abl мРНК і встановити тип перебудови. Окрім того цей метод є чутливим, і дозволяє виявляти залишкові патологічні клітини. За результатами проведених досліджень розроблено методичні рекомендації “Моніторинг хронічного мієлолейкозу за допомогою молекулярно-біологічних методів”. З використанням наведених методів для подальших досліджень відібрано зразки хворих з перебудовою p210 bcr/abl.

Аналіз dbl ділянки кДНК bcr/abl хворих на ХМЛ, ГЛЛ і у здорових донорів. Оскільки нами було зроблено припущення, що в деяких випадках у ділянці білка p210BCR/ABL, яка відсутня в білка p190BCR/ABL, можливі зміни, які призводять до функціональної подібності цих химерних білків, проаналізовано структуру даного регіону у хворих на Ph'-позитивні лейкемії на різних стадіях захворювання і у здорових донорів. Для цього використовували двоетапну зворотно-транскриптазну полімеразну ланцюгову реакцію з підібраними нами праймерами Ext1 dbl — Ext1 rev dbl та Extdbl — Ext dbl до цієї ділянки (рис. ). Отримані ампліфікати було клоновано й секвеновано.

На першому етапі проаналізовано 3 клони, які отримано при аналізі РНК культури клітин К562 (позитивний контроль). При цьому не було виявлено будь-яких відмінностей між послідовностями, які було клоновано, та відомими послідовностями з GenBank. Аналогічні результати отримано при аналізі первинної структури восьми клонів, що містили dbl регіон химерного гена від чотирьох хворих на ХМЛ та двох хворих на ГЛЛ.

Однак при подальшому аналізі у деяких хворих на ГЛЛ та ХМЛ (на розгорнутій стадії захворювання) було виявлено окрім повнорозмірного продукту менші за розміром фрагменти (рис. 3).

Так, при аналізі ампліфікатів пацієнта Я. (гостра лімфобластна лейкемія) окрім повнорозмірного продукту ЗТ-ПЛР виявлено також 3 додаткових фрагменти (рис. , А). Для додаткової перевірки специфічності отриманих фрагментів підібрано ще одну пару праймерів (3dblf та 3dblr), яка є внутрішньою для обох пар праймерів (Ext1 dbl – Ext1 rev dbl та Ext dbl – Ext rev dbl), котрі використовували для ампліфікації dbl-регіону. Їх використання підтвердило специфічність фрагментів (рис. 3, А). Окрім того, для перевірки специфічності цих фрагментів проведено ряд змін в умовах проведення ЗТ-ПЛР — збільшення температури реасоціації праймерів (до 61 ОС замість 56 ОС), зменшення кількості кДНК та ампліфікатів, що синтезуються після першого етапу ПЛР, додавання до 10% ДМСО. Всі ці зміни умов проведення ЗТ-ПЛР частково впливали на кількісне співвідношення відмінних за розміром ампліфікатів, але не на сам їхній розмір. Для подальшого аналізу отримані ампліфікати було клоновано, аналогічно до повнорозмірних ампліфікатів, без попередньої елюції отриманих фрагментів із гелю, щоб не дискримінувати можливі мінорні послідовності. При скринуванні трансформантів за допомогою рестрикційного аналізу виявлено тільки клони, розмір яких відповідав ампліфікатам, які наведено на рис. , А. При аналізі послідовності клону CL7, що містив повнорозмірний продукт ЗТ-ПЛР, не було знайдено будь-яких відмінностей від канонічної послідовності. При аналізі ж клонів із меншим розміром було встановлено, що дані послідовності дійсно є фрагментами dbl-гомологічної ділянки мРНК bcr/abl- із делетованими ділянками різної протяжності. Так при аналізі послідовності клону CL6 виявлено делецію ділянки, яка відповідає п’ятому екзону гена bcr/abl (локалізація делеції 2241–2348 п.н., протяжність 108 п.н.). Дана делеція не призводить до порушення рамки зчитування. На рівні білка зазначена делеція повинна призводити до втрати 36 амінокислотних залишків (585–620) і, відповідно, до утворення білка меншого за вагою на 4 кДа у порівнянні з p210BCR/ABL. Дану послідовність було внесено до GenBank під номером AY533677. Результати аналізу первинних послідовностей цього та інших клонованих ампліфікатів хворого Я., а також хворого К. (рис. 3, Б) з діагностованою хронічною мієлогенною лейкемією на стадії акселерації та пацієнта Л.рис. , В) із клінічними проявами мієлопроліферативного захворювання зі стрімким агресивним перебігом наведено в таблиці. Для виявлення можливих змін, подібних до наведених вище, в dbl-гомологічній ділянці нормальної мРНК bcr за допомогою ЗТ-ПЛР було додатково проаналізовано 7 зразків крові здорових донорів. Окрім цього у 6 хворих на ГЛЛ із перебудовою e1a2 було проаналізовано DH ділянку мРНК bcr, яка наявна в нормальному гомолозі гена bcr. Як праймер для отримання кДНК використовували (dT)12 (оскільки з праймером А1 можна отримати необхідну кДНК, що включає DH домен, лише на химерній мРНК при e13(14) a2 перебудові гена bcr/abl). При аналізі даних зразків у жодній з електрофореграм продуктів ЗТ-ПЛР не було виявлено додаткових ампліфікаційних фрагментів.

Отже, показано, що в деяких випадках у хворих на ГЛЛ та ХМЛ із p210BCR/ABL мРНК на гострій стадії захворювання відбувається втрата різних за протяжністю ділянок DH домену.

Таблиця

Результати секвенування клонів, які містили ампліфікати dbl-домену та апроксимація отриманих даних на послідовність химерного білка

Клон | Локалізація делетованої ділянки (розмір), п. н.; екзони | Локалізація змін на рівні білка (кількість втрачених), а. з. | Зменшення ММ білка, кДа | Номер, присвоєний GenBank

Хворий Я. (гостра лімфобластна лейкемія)

CL6 | 2241–2348 (108); 5 екзон | 585–620 (36) | 4 | AY533677

115 | 2154–2537 (384);

частково 4 і 8, повністю 5–7 екзони | 556–683 (128) | 14 | AY536248

CL2 | 2031–2690 (660);

частково 4 і 9, повністю 5–8 екзони | 514–733 (220) | AY536250

Хворий К. (ХМЛ на стадії акселерації)

2К10 | 2161 – 2625 (465); частково 4 і 9, повністю 5–8 | 558–712 (155) | 17 | AY536247

2К19-2 | 1959 – 2462 (503); частково 3 і 7 екзони, повністю 4–6 | 493–660 (168) | 18 | AY536244

2К23 | аналогічно до 2К19-2

2К19-1 | 2038–2207 та 2228–2689, (636); частково 3—9 екзони. | 517–573, 581–734 (212) | 18 | AY536246

Хворий Л. (мієлопроліферативне захворювання з агресивним перебігом)

2Л1 | 2233 – 2676 (444); частково 4 і 9 екзони, 5–8 — повністю | 582–729, (148) |

16 | AY536245

Дотепер показано цілий ряд субмікроскопічних делецій різної протяжності як на 9-й (ген abl), так і на 22-й (ген bcr) хромосомі. У більшості випадків ці зміни є несприятливим прогностичним фактором перебігу захворювання.

На молекулярному рівні було описано ряд транскриптів із перебудовами, які різняться від класичних — e6a2 e2a2. Також описано випадки з точкою розриву всередині екзонів — e8a2, e13a2, e15a2. Дані транскрипти утворювались внаслідок неканонічних транслокацій, які відбувались в ділянках, відмінних від ділянок M–, m– та m–BCR химерного гена bcr/abl.

Описані нами зміни носять інший характер, і раніше не були описані. Основною відмінністю від наведених вище випадків є те, що зміни відбуваються не за рахунок аномального типу транслокації, оскільки класичний тип транслокації було підтверджено ЗТ-ПЛР на етапі добору зразків для аналізу. Як видно з отриманих результатів, у всіх хворих було виявлено різні зміни первинної послідовності мРНК в DH домені. Однак, можна відзначити й спільні риси цих змін:

- у всіх випадках делеції в мРНК не призводили до порушення рамки зчитування;

- окрім аномальних варіантів функціональних доменів у вищезазначених хворих виявлялись також і повнорозмірні DH домени;

- подібні зміни було виявлено тільки у пацієнтів з агресивним характером перебігу захворювання — ГЛЛ, з ХМЛ на стадії акселерації та мієлопроліферативного захворювання зі стрімким, агресивним перебігом.

Було б марно очікувати, що прогресія захворювання може бути обумовлена якимось одним фактором. Однак, цілком вірогідно, що молекулярні зміни в ділянці 3–12 екзонів химерного гена bcr/abl, яка і відрізняє білки p190BCR/ABL та p210BCR/ABL, призводять до утворення білків, які мають інший характер взаємодій з білками, що беруть участь у розвитку неопластичного процесу. Так, Dbl гомологічні домени, кодують фактори обміну гуанінів (GEFs) і є ланкою зв'язку між поверхнево-клітинними рецепторами до цитокінів, факторів росту, G-білків, рецепторами адгезії тощо та активацією Rho-подібних ГТФаз. Білки p210BCR/ABL та p190BCR/ABL по-різному взаємодіють з деякими Rho ГТФазами (Harnois et al., 2003). Так, білок p210BCR/ABL взаємодіє з Rho ГТФазами RhoA, Rac1 та Cdc42. А p190BCR/ABL може активувати Rac1 та Cdc42, але не RhoA. Rac1 та Cdc42 є переважно коактиваторами активності білків BCR/ABL, а RhoA — регулятором. Тому p190BCR/ABL і спричиняє більш агресивний перебіг захворювання. Виходячи з характеру виявлених нами змін у функціональному DH домені у хворих на гострій стадії захворювання, ці порушення можуть призводити до аналогічних наслідків.

Іншим можливим механізмом прогресії внаслідок змін в DH функціональному домені є вплив даного явища на процеси репарації. Показано, що DH домен білка BCR/ABL відповідає за взаємодію з білком XPB (xeroderma pigmentosum group B protein), який бере участь у ексцизійній репарації ДНК (NER, nucliotide excision reparation) (Takeda et al., 1999; Canitrot et al., 2003). Так, експресія білка p210BCR/ABL в мієлоїдних клітинних лініях людини та мишей, а також у стовбурових клітинах кісткового мозку призводила до 2–4 кратного зростання ексцизійно–репараційної активності і, відповідно, стійкості до ультрафіолетового опромінення. Причому даний ефект повністю усувався в разі додавання STI571 — специфічного інгібітору тирозинкінази BCR/ABL. А ось експресія білка p190BCR/ABL чи білка TEL/ABL, які не містять DH домену, у тих же клітинах не призводить до таких ефектів. Тому комплекс p210BCR/ABL – XPB є важливим для запуску механізму ексцизійної репарації. Така репарація, з одного боку, призводить до виведення клітин з апоптозу, а з іншого, внаслідок накопичення помилок при репараційних процесах, до утворення вторинних мутацій у цих клітинах. Оскільки описані нами зміни в DH домені, призводять до втрати ділянки взаємодії білка XPB із химерним білком BCR/ABL можна зробити припущення, що білки p210BCR/ABL (DH) будуть виявляти властивості подібно до химерних білків p190BCR/ABL чи білка TEL/ABL.

Вдосконалення системи виявлення філадельфійської хромосоми у хворих на ХМЛ та ГЛЛ. Оскільки своєчасне виявлення і, в свою чергу, своєчасний початок лікування дозволяє значно підвищити ефективність лікування ХМЛ та ГЛЛ, то створення тест-систем, розробка методичних рекомендацій та впровадження молекулярно-генетичних методів виявлення філадельфійської хромосоми в клінічну практику є вкрай важливим завданням. Переважна більшість систем для виявлення злитого гена bcr/abl базується на виявленні трьох “класичних” перебудов — e1/a2, e13(e14)/a2, e19/a2. Однак, з урахуванням можливості змін в bcr ділянці гена bcr/abl, які було описано вище, а також неканонічних транслокацій (таких як e6a2, e8a2 тощо) для діагностики Ph'-позитивних лейкемій необхідно створити систему, яка б дозволяла максимально уникнути хибнонегативних результатів. Оскільки праймери, які використовували для діагностики згідно (Телегеєв та ін., 1997) не дозволяють гарантовано відслідковувати зміни (внаслідок значної протяжності даного регіону) на всій протяжності bcr ділянки, яка бере участь у формуванні злитого гена bcr/abl нами було додатково підібрано і запропоновано для використання при діагностиці дві додаткові пари праймерів до центральної частини bcr ділянки: Ph1-f, Ph1-r — для першого етапу ПЛР та Ph-f, Ph-r — для другого (рис. 4).

Обидві пари праймерів було перевірено в зворотно-транскриптазній полімеразній ланцюговій реакції на зразках РНК хворих на ХМЛ та ГЛЛ. Електрофоретичні картини, які отримано в результаті такого аналізу, відповідали очікуваним. Використання даних праймерів дозволяє проводити перший етап ПЛР за допомогою пари праймерів Ph1-f, Ph1-r, а другий — як із використанням праймерів Ph-f, Ph-r (розміри ампліфікатів 515  п.н. (при перебудові e13/a2) та 590 (при перебудові e14/a2)), так і з використанням на другому етапі праймерів A3–B2, які застосовують згідно методичних рекомендацій (Телегеєв та ін., 1997) (розміри ампліфікатів 125 та 200 п. н.) (рис. ).

На рис. показано результати такого аналізу РНК хворого Є. (ГЛЛ, 1й гострий період). Як видно з електрофореграми продуктів ЗТ-ПЛР, на доріжках 3 та 4 виявлено маркерні смуги розміром (відповідно) 590 та 200 п.н., що відповідає перебудові e14/a2.

Загалом запропоновані праймери було апробовано на 41 зразку крові пацієнтів гематологічних відділень клінічних лікарень м. Києва. Не було виявлено жодних проблем, що утруднювали б інтерпретацію результатів, отриманих із використанням запропонованих специфічних праймерів.

Особливо слід підкреслити, що даний діагностичний набір дозволяє виявляти не тільки “класичні” варіанти химерного гена, але й альтернативні варіанти перебудов, оскільки запропоновані праймери були підібрані таким чином, щоб забезпечувалось повне перекриття ділянок гена bcr (рис. 4), на відміну від більшості тест-систем, у яких праймери підібрані на ділянки, які безпосередньо прилягають до класичних місць транслокації. Так, відстань між місцями посадки праймерів на химерну кДНК BI1 та Ph1-f — близько 1102п. н., між Ph1-f та B1 – близько 417 п. н. Тому при проведенні ЗТ-ПЛР даним набором праймерів можна виявити порушення, пов'язані як зі зміною довжини в регіоні 2–12 екзонів мРНК bcr/abl, так і неканонічні транслокації. І хоча немає повного розуміння ролі таких неканонічних мРНК у розвитку захворювання, їхнє виявлення й подальший аналіз як на молекулярному, так і на інших рівнях дослідження — біохімічному, цитогенетичному та, звичайно, аналізу клінічного перебігу захворювання у таких хворих, дозволить отримати нові дані про механізми прогресії захворювання.

Таким чином, нами запропоновано та апробовано на клінічних зразках тест-систему для виявлення та диференційної діагностики Ph'-позитивних лейкемій методом ЗТ-ПЛР, яка дозволяє встановлювати як класичні, так і можливі альтернативні типи перебудов в bcr ділянці химерного гена bcr/abl.

ВИСНОВКИ

Виявлено ряд змін в dbl-гомологічному (DH) домені bcr/abl кДНК у хворих на ХМЛ (на другій і третій стадії) та ГЛЛ. Створено систему для молекулярно-генетичної діагностики даної групи лейкемій.

1. Проведено аналіз послідовностей химерного гена bcr/abl, які відмінні у хворих на різні форми Ph'-позитивних лейкемій та з різним характером перебігу захворювання, на основі якого розроблено і впроваджено в клінічну практику молекулярно-генетичні підходи до виявлення та встановлення конкретного типу перебудови даного гена, що є важливим для вибору схеми лікування та прогнозування розвитку захворювання.

2. Показано, що в деяких випадках у хворих на ГЛЛ та ХМЛ з p210BCR/ABL мРНК на гострій стадії захворювання відбувається втрата різних за протяжністю ділянок DH домену.

3. Проаналізовано наслідки виявлених змін на характер функціонування білка.

4. Запропоновано та апробовано на клінічних зразках тест-систему для виявлення та диференційної діагностики Ph'-позитивних лейкемій методом ЗТ-ПЛР, яка дозволяє встановлювати як класичні, так і можливі неканонічні типи перебудов в bcr ділянці химерного гена bcr/abl.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.