НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Єгоров Максим Ігорович

УДК: 57.043:599.742.1-146.311

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН СПЕРМАТОЗОЇДІВ СОБАК В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД УМОВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук

Копєйка Євгеній Федорович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу кріоконсервування системи репродукції, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Жегунов Геннадій Федорович, завідувач кафедри хімії та біохімії Харківської державної зооветеринарної академії МАП України, м. Харків

кандидат біологічних наук

Стегній Марина Юріївна, доцент кафедри мікробіології Національного фармацевтичного університету МОЗ України,
м. Харків

Провідна установа: Харківський національний університет

ім. Каразіна МОН України, м. Харків

Захист відбудеться “ 3 ” липня 2007 р. о “13 30” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків – 15, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків,

вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий “ 26 ” травня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

член-кореспондент НАН України Гольцев А. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Технологія кріоконсервування сперматозоїдів собак затребувана і має практичне застосування в деяких сферах науки і прикладного собаківництва. Створення кріобанков сперми тих порід собак, які опинилися на межі зникнення, є гарантом збереження генофонду і біологічного виду. У племінному собаківництві розробка ефективних методів кріоконсервування сперматозоїдів собак дозволить спростити племінну роботу і підвищити якість племінних тварин. У гуманній медицині технологія низькотемпературного зберігання сперматозоїдів даного виду спростить вивчення генетичних захворювань, оскільки захворювання людей і собак, що передаються у спадок, викликаються ідентичними генами [England G. C. W., 1999].

Проте, технологія кріоконсервування сперматозоїдів собак не набула широкого поширення через високу варіабельність якості розморожених сперматозоїдів [Olar T. T., et. all, 1998; Brooke M. F., 2000; Farstad W., 2000]. Через значне погіршення функціональних характеристик розморожених клітин знижувалася кількість щенят в поносах, одержаних після штучного запліднення самок собак кріоконсервованою спермою [Nothling J. O., et. all, 1995; Pena A., et. all, 1999; Songsasen N., et. all, 2002].

Аналіз наявних робіт по кріоконсервуванню сперматозоїдів собак [England G. C. W., 1993] показує, що основною причиною отримання низьких результатів при використанні технології низькотемпературного зберігання сперматозоїдів собак була недостатня ефективність кріозахисних середовищ. Використання емпіричного підходу при виборі кріопротектора і компонентів середовища без урахування морфофункціональних характеристик сперматозоїдів собак не дозволяло отримувати стабільно високі результати. Таким чином, дослідження, які направлені на розробку ефективнішої технології кріоконсервування сперматозоїдів собак, є актуальними і мають наукове і практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР Інституту проблем кріобіології і кріомедіцини НАН України і теми відділу Кріоконсервування системи репродукції: “Вивчення особливості впливу низьких температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні клітини залежно від стану гамето- і ембріогенезу, розробка середовищ для зберігання, кріоконсервування і репарації нелетальних кріоушкоджень цих об'єктів” (шифр теми 2.2.6.96 № держ. реєстрації 0104U0064441.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є оцінка впливу компонентів кріозахисних середовищ і умов кріоконсервування-відтавання на морфофункціональні властивості сперматозоїдів собак.

Для досягнення мети роботи були поставлені наступні задачі:

1. Визначити вплив нативних і кріоконсервованих фракцій плазми еякулятів собак на виживаність і переживаємість сперматозоїдів собак до і після кріоконсервування.

2. Дослідити вплив вуглеводів (фруктози, глюкози і лактози) у складі кріозахисного середовища на рухливість сперматозоїдів собак до і після заморожування-відтавання клітин.

3. Дослідити вплив кріопротекторів (гліцерину, етиленгліколю, 1,2-пропандіолу, диметилсульфоксиду N,N-диметилформаміду) на ліпосоми з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак і цитоплазматичні мембрани сперматозоїдів собак в кріозахисному середовищі.

4. Вивчити вплив кріопротекторів і яєчного альбуміну на виживаність і переживаємість сперматозоїдів собак до і після кріоконсервування.

Об'єкт дослідження. Кріочутливість сперматозоїдів собак на різних етапах кріоконсервування в залежності від використаних кріозахисних речовин.

Предмет дослідження. Морфофункциональні властивості сперматозоїдів собак до і після кріоконсервування, вплив спермальної плазми на переживаємість сперміїв після заморожування-відтавання.

Методи дослідження. Світлова і флуоресцентна мікроскопія, електрофорез в поліакріламідному гелі, спектрофотометрія, флуоресцентна спектроскопія, кріоконсервування, штучне запліднення заморожено-відталими клітинами.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше було проведене порівняльне дослідження впливу кріопротекторів на штучні мембрани (ліпосоми), сформовані з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак і мембрани сперматозоїдів собак, а також теоретично і експериментально обгрунтована необхідність використання при кріоконсервуванні сперміїв собак N,N-диметилформамиду. Встановлено, що ефективність взаємодії низькомолекулярних кріопротекторів, а саме: гліцерину, етиленгліколю, 1,2-пропандіолу, диметилсульфоксиду, N,N-диметилформаміду, з ліпідним бішаром цитоплазматичних мембран сперматозоїдів собак зумовлена гідрофільно-гідрофобними властивостями молекул даних сполук. Виявлено концентраційно-залежний характер цих взаємовідносин. Найбільш активну взаємодію з ліпідним бішаром за гідрофобним механізмом проявляє N,N-диметилформамід. Для гліцерину та етиленгліколю основна взаємодія з ліпідами мембран клітин полягає в утворенні міжмолекулярних водневих зв’язків. Показано, що з усіх вивчених речовин N,N-диметилформамид робить найменший токсичний вплив на сперматозоїди собак і забезпечує найкращий кріозахист, що дозволяє зберігати життєздатність і морфофункціональну цілісність 30 % клітин через 6 годин після заморожування-відігрівання в середовищі, яке містить фруктозу в концентрації 0,05 М, трісоксіметиламінометан в концентрації 0,2 М та яєчний альбумін в концентрації 1 %. При цьому встановлено, що яєчний альбумін в концентрації 1 % надає ефективніший кріозахист сперматозоїдам собак в порівнянні з жовтком курячих яєць в концентрації 20 % (v/v).

Показано відсутність змін в білковому складі заморожено-відталої плазми суміші першої і другої, а також третьої фракцій еякулятів собак порівняно з нативною плазмою відповідних фракцій.

Досліджено вплив кріоконсервованої і відталої плазми еякулятів собак на рухливість аутологічних сперміїв собак після додавання її до заморожено-відталих клітин. Показано, що чим вища початкова рухливість нативних клітин, тим нижчий негативний вплив, що надається плазмою еякулятів (як нативною, так і заморожено-відталою) на переживаємість сперматозоїдів собак після кріоконсервування і відігрівання.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений спосіб отримання еякулятів собак, що дозволив одержувати їх у будь-який час року і уникнути необхідності стимуляції еяколяції за допомогою естральної самки.

Розроблений новий ефективний метод кріоконсервування сперматозоїдів собак, який розширює можливості селекціонерів в собаківництві і дозволить попередити втрату цінного генетичного матеріалу зникаючих порід собак.

Практична значущість результатів роботи підтверджена одним патентом на винахід та двома патентами на корисну модель.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз літератури по темі дисертації, одержані експериментальні дані, проведено їх аналіз і статистичну обробку, сформульовані висновки роботи, які засновані на експериментальних даних. У опублікованих спільно із співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:

- в роботах [1, 2, 4, 6, 10] у вивченні впливу кріопротекторів і яєчного альбуміну на морфофункціональний стан сперматозоїдів собак на різних етапах кріоконсервування.

- в роботах [3, 8] у вивченні впливу кріопротекторів на зміни спектрів флуоресцентних зондів, локалізованих в ліпосомах, одержаних з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак, і в цитоплазматичних мембранах сперматозоїдів собак.

- в роботі [9] у вивченні впливу кріопротекторів на зміни спектрів флуоресцентної мітки, ковалентно пов'язаної з яєчним альбуміном в кріозахисному середовищі у присутності сперматозоїдів собак.

- в роботі [7] в отриманні еякулятів собак, виділенні плазми його фракцій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи докладалися і обговорювалися на 1 Українській науковій конференції “Проблемі біологічної та медичної фізики” (Харків-2004), міжнародній науково-практичній конференції “Наукові дослідження - теорія та експерімент, 2005” (Полтава), і на щорічній конференції молодих учених ІПКіК НАН України спільно з кафедрою ЮНЕСКО (Харків 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, зокрема 4 статті в наукових фахових виданнях, 3 тези доповідей на наукових конференціях, одержано 1 патент на винахід та 2 патенти на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаної літератури (155 джерел на 17 сторінках). Робота ілюстрована 42 рисунками і 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Матеріалом дослідження були еякуляти собак, які одержували за способом [England G. C. W., 1999] і за розробленою нами методикою. Концентрацію сперміїв в еякулятах визначали за допомогою фотоелектроколоріметра. Рухливість сперматозоїдів обчислювали за формулою і виражали у відсотках:

М = А / S х 100, де М - рухливість сперматозоїдів собак у відсотках; - кількість рухомих клітин в певному числі підрахункових квадратів; - загальна кількість сперміїв в тих же квадратах. Значення рН вимірювали за допомогою рН-метра (Мілівольтметр рН-121). Осмотичність плазми еякулятів і середовищ вимірювали за допомогою осмометра ОМКА-1Ц-01.

У роботі використовували кріопротектори марки “х.ч.” або “ч.д.а.” (“Реахим”, Росія), які додатково очищали за методиками [Вайсбергер А., 1968, Протіва М., 1966]. У експериментах використовували компоненти кріозахисних середовищ виробництва фірми “Sigma” (як буферний компонент трісоксиметіламінометан – “Trizma pH 7,2”, “Sigma”)

Одержані еякуляти центрифугували в ампулах об'ємом 1,5 см3 при 400 g протягом 3 хв.

У серії А дослідів заморожування-відтавання сперматозоїдів проводили у відкритих гранулах об'ємом 10 мкл. Осад сперматозоїдів ресуспендували 1:1 наступною середою: середовище 1 - тріс-фруктозо-жовткове (ТФЖ) - 0,25 М Тріс-буфера; 0,05 М фруктози; 20 % (v/v) жовтка курячих яєць; Середовище 2 - трис-глюкозо-жовткове (ТГЖ) - 0,25 М Тріс - буфера; 0,05 М глюкози; 20 % (v/v) жовтка курячих яєць. Середовище 3 - трис-лактозо-жовткове (ТЛЖ) - 0,25 М Тріс - буфера; 0,025 М лактози; 20 % (v/v) жовтка курячих яєць. Середовища 4 (ТФЖп), 5 (ТГЖп), 6 (ТЛЖп) відповідали ТФЖ, ТГЖ, ТЛЖ, але містили суміш плазм 1-ої і 2-ої фракцій еякуляту, яка була розведена дистильованою водою в співвідношенні 1:1. Концентрація гліцерину (ГЛ) і етиленгліколю (ЕГ) в суспензії сперматозоїдів в серіях А і Б дослідів складала 3 і 7 % відповідно. Заморожування клітин проводили за методикою [Brooke M. F, 2000], відтавання - на термостоліку при 38оС. У серії дослідів Б клітини розбавляли у співвідношенні 1:1 охолодженим до
4оС середовищем ТФЖ з кріопротектором, інкубували 10 або 60 хв. та розфасовували в соломинки типу “СЖ” об'ємом 0,33 см3 і заморожували. Заморожування проводили на установці УОП-1, розробленій в СКТБ ІПКіК НАН України. Використовували два наступних режими заморожування:
1) за першим режимом клітини заморожували в діапазоні від 5оС до -15оС зі швидкістю 3оС/хв, від -15оС до -80оС зі швидкістю 10оС/хв, після чого проводили занурення клітин в рідкий азот; 2) за другим режимом клітини заморожували в діапазоні від 5оС до -15оС зі швидкістю 6оС/хв, від - 15оС до -80оС зі швидкістю 15оС/хв, після чого проводили занурення клітин в рідкий азот. У серії Б, В і Г відтавання проводили через 60 хв. після заморожування на водяній бані при температурі 40оС до появи рідкої фази. У серії В клітини ресуспендували середовищем ТФЖ, в співвідношенні 1:1, або тріс-фруктозним середовищем (ТФ), що містить 0,25 М Тріс - буфера, 0,05 М фруктози в співвідношенні 1:1, або тріс-фруктозо-альбуміновим середовищем (ТФА), що містить 0,25 М Тріс - буфера, 0,05 М фруктози, яєчний альбумін 1 % у співвідношенні 1:1. Осмотичність середовищ у всіх серіях дослідів складала від 309 до 358 мОсмоль, рН 7,2. Для кріозахисту сперматозоїдів використовували кріопротектори ГЛ, ЕГ, 1,2-пропандіол (1,2-ПД), диметилсульфоксид (ДМСО) N,N-диметилформамід (ДМФА), Концентрація кріопротекторів в суспензії клітин складала 1 М. Заморожування проводили без попередньої еквілібрації сперматозоїдів в кріозахисному середовищї відповідно до режиму заморожування 1 серії дослідів А. У серії Г використовували сперматозоїди з початковою рухливістю 50, 60, 70, 80 %. Заморожування проводили в соломинках об'ємом 0,33 см3 в середовищі ТФА під захистом ДМФА (1 М), ЕГ (1 М) або їх суміші (0,5 М кожного) відповідно до режиму 1 серії дослідів А.

Заморожування плазми еякуляту здійснювали у пластикових контейнерах фірми Nunc об’ємом 1,5 см3 прямим зануренням в рідкий азот. Відтавання проводили на водяній бані при температурі 40оС. Аналіз білкового складу плазми еякуляту здійснювали з використанням електрофорезу на пластинах з 7,5 % поліакріламідним гелем (ПААГ), рН 8,9, за стандартною методикою [Остерман Л.А., 1984].Гелі фарбували кумасі G-250. Концентрацію білків в суміші плазм першої і другої, а також окремо третьої фракції плазми еякуляту визначали по спектрах власної флуоресценції білків плазми при довжині хвилі 280 нм [Демченко А.П. 1981].

Ліпіди із сперматозоїдів собак одержували за модифікованою методикою Блайя і Дайера [Кейтс М., 1975].

Ліпосоми одержували за методом Добрецова [Добрецов Г.Е.,1989]. Взаємодію кріопротекторів і яєчного альбуміну зі штучними мембранами (ліпосомами) і цитоплазматичними мембранами вивчали за допомогою флуоресцентного зонда ФМЄ (3-гидрокси-4`-N,N-диметиламінофлавон) і ковалентної мітки (для яєчного альбуміну) Tasman Green 404 (TG-404). Флуоресценцію в сперматозоїдах досліджували за допомогою флуоресцентного мікроскопа “Люмам МП-4” (збільшення х1000) (ЛОМО, Росія) з використанням світлофільтрів марок ВС-8-2, СЗС-24-4, СС-15-2. Спектри флуоресценції вимірювали на спектрофлуориметрі Cary Eclipse (Varian). Концентрація зонда ФМЄ в суспензії клітин при мікроскопічних дослідженнях складала 40-70 мкМ, а при спектральних вимірюваннях - 4-7мкМ. Концентрація сперматозоїдів собак в 1 мл розчину була від 50х104 до 200х106 клітин. Спектри флуоресценції ФМЄ порушували при 405 нм, TG-404 - при 404 нм і реєстрували в діапазоні від 450 до 650 нм. Вхідна і вихідна щілини монохроматорів складали 5 нм. Оптична щільність на довжині збудження флуоресценції не перевищувала 0,1 D. Помилка у визначенні положення максимумів спектрів max K (без кріопротектору), max (в присутності кріопротектору) таутомерних смуг (N* и Т*) флуоресцентного зонда ФМЄ не перевищувала 2 нм, n = 5.

При штучному заплідненні самок застосовувався внутрішньовагінальний спосіб запліднення. Запліднення проводили двократно з інтервалом 2 доби. Об'єм дози суспензії відігрітих клітин, що був введений, складав 3 мл. Кількість рухомих клітин в дозі - 350 млн. Після введення сперміїв в піхву естральної самки вводили по краплях протягом 20 хв. заморожено-відігріту плазму. Об'єм першої і другої фракцій плазми склав 1 мл, об'єм третьої фракції склав 5 мл. Оцінку фізіологічного стану щенят проводили відповідно до встановлених у ветеринарній медицині правил [Кашинцев Б. С., 1975].

Методи математичного планування експериментів і статистичний аналіз одержаних даних. Статистичну обробку експериментальних даних проводили по методу Ст'юдента на IBM PC Pentium-II з використанням пакету програм Microsoft Excel відповідно до затверджених вимог Державної Фармакопеї України, Доповнення 1, 2004 р.

Результати досліджень та їх обговорення.

Розробка способу отримання сперматозоїдів собак. Статевий цикл собак поділяється на два етапи: проеструс, який триває 6-10 місяців і еструс тривалість якого коливається від 22 до 24 діб. Тому можливості отримання еякулятів обмежені необхідністю використання естральної самки для стимуляції статевої активності самця [England G. C. W., 1993]. Для систематичного проведення досліджень в даній роботі нами був розроблений новий спосіб стимуляції еяколяції, що передбачає використання самки в будь-якому періоді статевого циклу з нанесенням на неї розчину, що імітує вагінальні виділення, характерні для естрального періоду статевого циклу самок собак.

Теоретичне та експериментальне обгрунтування вибору кріопротектору для кріоконсервування сперматозоїдів собак. У попередніх роботах [Brooke M. F, 2002, Pena A. et. all,,2002, Solares M. P. et. all, 2002] по кріоконсервуванню сперматозоїдів собак використовувалися низькомолекулярні кріопротектори (ГЛ, ЕГ), які проникали в клітини переважно через “водні” канали, конкуруючи із стрічним потоком води і створюючи надмірну напругу на мембранах. Це призводило до осмотичних пошкоджень клітин. Низький коефіцієнт проникності сперматозоїдів собак для води [Thirumata Sr., et.all., 2003] свідчить про необхідність пошуку кріопротекторів, здатних проникати всередину клітини через ліпідні ділянки мембрани. При цьому може значно збільшитися швидкість насичення клітин кріопротектором, що дозволить поліпшити кріозахист внутріклітинних структур і скоротити час контакту з кріопротектором, а отже, зменшиться його токсичний вплив на клітини. Такими сполуками, на наш погляд, могли бути низькомолекулярні дизаміщені аміди, вплив яких на сперматозоїди собак раніше не досліджувався. В роботах [Лінник Т. П., Гордієнко О. І. 2003, 2004, 2006] було вказано, що дані речовини мають властивості, характерні для сполук, які здатні проникати у внутрішнє середовище клітини переважно через ліпідний бішар цитоплазматичних мембран. Здатність речовини проникати всередину клітин ліпідним шляхом повинна бути тим вище, чим вище його коефіцієнт розподілу (Кр). У ГЛ він складає 0,005, у ЕГ - 0,040, 1,2-ПД - 0,076, ДМФА - 0,233, ДМСО - 0,247 [Лінник, 2003]. З цих даних виходить, що існує висока вірогідність того, що ДМФА та ДМСО володіють властивостями, які дозволяють їм проникати через мембрани ліпідним шляхом. Для вивчення взаємодії кріопротекторів і мембран сперматозоїдів ми досліджували вплив речовин, а саме ГЛ, ЕГ, 1,2-ПД, ДМФА, ДМСО, коефіцієнт розподілу яких поступово збільшується від ГЛ до ДМСО, на штучні мембрани (ліпосоми, отримані з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак) і сперматозоїди собак методом флуоресцентних зондів. Оскільки раніше на сперматозоїдах собак таких досліджень не проводилося, нам необхідно було провести підбір флуоресцентного зонда для вирішення поставленого завдання. Була вивчена можливість використання флуоресцентних зондів ДСМ [Добрецов Г.Е., 1989], Е-176, 3-ДАБ, ФМЄ [Ormson, S. M. et. all, 1994] для отримання інформації про вплив кріопротекторів на плазматичні мембрани сперматозоїдів собак. Отримані результати свідчили про те, що тільки зонд ФМЄ володіє властивостями, необхідними для вивчення дії кріопротекторів на мембрани клітин. За рахунок конформаційної ізомеризації зонда ФМЄ значно підвищується інформативність спектрів випромінювання, які одержуються після дії кріопротекторів на суспензію клітин, що містить зонд. У присутності ФМЄ через 10 хв кількість рухомих клітин не перевищує 35±5 %, тобто цей зонд надає помірну пригноблюючу дію на рухливість клітин. В водневих розчинах кріопротекторів флуоресценція ФМЄ в значній мірі гаситься водою, а спектр флуоресценції представлений однією смугою (рис. 1). При скріпленні з ліпідним бішаром ліпосом або мембран клітин разом з багатократним

Рис. 1. Спектри флуоресценції ФМЄ:

1-середовище суспендування; 2 - середовище + 5 % ЕГ;

3 - середовище + 5 % ДМФА;

4 - сперматозоїди собак (контроль);

5 - сперматозоїди собак + 5 % ЕГ;

6 - сперматозоїди собак + 5 % ДМФА.

Концентрація зонда: ФМЄ – 4,1х10-6 М.

зростанням інтенсивності флуоресценції, спостерігається також зміна форми спектру, з'являються дві смуги з максимумом при 570±2 нм (Т*-смуга) і 515±3 нм (N*-смуга) (рис. 1).

Досліджували спектри флуоресценції зонда ФМЄ в ліпосомах з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак, або в мембранах клітин до і після додавання вказаних кріопротекторів. Отримані результати свідчать про те, що з п'яти вивчених кріопротекторів, ДМФА надає найбільшу дію на ліпідний бішар ліпосом і плазматичні мембрани клітин. Параметри спектрів флуоресценції зонда ФМЄ в тріс-фруктозному середовищі, що містить сперматозоїди у присутності вивчених кріопротекторів показані у табл. 1. Як видно з табл. 1 найбільше зниження інтенсивності флуоресценції смуг (?IN* і ?IT*) щодо контролю (зонд в суспензії клітин без кріопротектору) спостерігається при використанні ДМФА. При цьому у присутності ДМФА падіння інтенсивності флуоресценції Т*-смуги має більш виражений характер. Враховуючи те, що за даними авторів [Ormson, S. M. et. all, 1994] Т*- форма локалізується в неполярних зонах ліпідного бішару мембран, падіння інтенсивності флуоресценції Т*-смуги у присутності ДМФА свідчить про конкуренцію цієї речовини із зондом за місця скріплення на мембранах клітин.

Результати досліджень указують на те, що ДМФА є мембранотропною речовиною, здатною проникати безпосередньо через ліпідний бішар плазматичних мембран сперматозоїдів собак.

Таблиця 1.

Параметри спектрів флуоресценції зонда ФМЄ, пов'язаного з сперматозоїдами собак в середовищі ТФ в присутності кріопротекторів (M±m, n = 5).

Примітка:

?IN* и ?IT* - зниження інтенсивності (в ум. од.) флуоресценції смуг щодо контролю - середовища, що містить зонд, клітини, але не містить кріопротектор.

IN*/IT* K – відношення інтенсивностей смуг флуоресценції зонда за відсутності кріопротектора в середовищі інкубації.

IN*/IT* - відношення інтенсивностей смуг флуоресценції зонда у присутності кріопротектора в середовищі інкубації.

Концентрація кріопротекторів склала 5 %

Дослідження впливу цього кріопротектору на ліпідний бішар ліпосом, сформованих з виділених сумарних ліпідів сперматозоїдів собак, за допомогою методу флуоресцентних зондів, виявили, що підвищення концентрації ДМФА до 8 % помірно впливає на зміну спектрів флуоресценції зонда ФМЄ з ліпосом (рис. 2). Підвищення концентрації ДМФА вище за 8 % призводило до значних змін спектрів флуоресценції зонда ФМЄ з ліпосом. Це свідчить про те, що ДМФА в концентрації 9 % та більше може помітно впливати на структуру ліпідного бішару на початку неполярної області. В свою чергу, це може приводити до надмірного проникнення молекул води в мембрану сперматозоїдів, руйнуванню структури бішару цитоплазматичних мембран. На підставі приведених даних можна припустити, що ДМФА і на сперматозоїдах собак буде ефективним кріопротектором в концентрації не вище за 8 %.

Рис. 2. Вплив підвищення концентрації кріопротекторів на положення N* смуги флуоресценції з ліпосом, сформованих з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак n = 5:

1 – ГЛ;

2 – ЕГ;

3 – ДМФА.

Вплив складу кріозахисного середовища, часу еквілібрації і режимів охолоджування на морфофункціональні властивості сперматозоїдів собак до і після заморожування-відтавання. У серії дослідів А був досліджений вплив плазми еякуляту собак, доданої до кріозахисного середовища, на рухливість сперматозоїдів собак після заморожування-відтавання, вплив заморожено-відталої плазми еякуляту, доданої до суспензії кріоконсервованих і відталих сперматозоїдів. Отримані результати свідчать про те, що додавання плазми еякуляту собак до кріозахисного розчину на етапі підготовки клітин до заморожування робить негативний вплив на рухливість заморожено-відталих клітин. Проте виявлена можливість додавання при штучному заплідненні заморожено-відталої плазми еякуляту в фізіологічних співвідношеннях до суспензії клітин перед заплідненням. При цьому була досягнута мета наблизити умови штучного запліднення заморожено-відталими клітинами до природних. Виявлено, що концентрація трісоксиметіламінометану (буферного компоненту) 0, 15 М та 0,2 М (гіпотонічні умови) негативно впливає на морфофункціональні властивості клітин, призводить до скручування хвостів і втрати рухливості сперматозоїдів. Була визначена оптимальна концентрація буферного компоненту середовища (0,25 М), яким був вибраний трісоксиметіламінометан (р ? 0,05). Також була виявлена краща рухливість заморожених і відталих клітин у присутності фруктози в концентрації 0,05 М (р ? 0,05) у порівнянні з глюкозою у концентрації 0, 05 М та лактозою у концентрації 0,025 М.

Дослідження впливу еквілібрації клітин протягом однієї години у присутності кріопротекторів (ГЛ і ЕГ) і двох режимів заморожування на рухливість відразу після відтавання і переживаємість (рухливість протягом часу) сперміїв собак проводили в серії дослідів Б. Аналіз результатів досліджень показав, що до заморожування після еквілібрації сперматозоїдів з кріопротектором протягом однієї години спостерігалося істотне зниження рухливості сперматозоїдів собак незалежно від концентрації кріопротектора (р ? 0,05).

Збільшення швидкості охолоджування сперматозоїдів під час заморожування (режим 2) як з ГЛ, так і з ЕГ, приводило до більшої загибелі клітин (р ? 0,05). Був вибраний оптимальний режим охолоджування, який дозволяв зберігати відразу після заморожування-відтавання 35 % морфологічно та функціонально цілісних клітин. За цим режимом сперматозоїди собак заморожували на першому етапі від 5оС до
-15оС зі швидкістю 3оС/хв, на другому - від -15оС до -80оС зі швидкістю 10оС/хв, на третьому виконували занурення в рідкий азот.

В наступній серії експериментів (серія дослідів В) був досліджений вплив ряду речовин: ГЛ, ЕГ, 1,2-ПД, ДМСО, ДМФА, на переживаємість сперматозоїдів собак на різних етапах кріоконсервування. Також в даній серії експериментів було проведено дослідження що до можливості створення безжовткового середовища. У використаному безжовтковому середовищі ТФА крім фруктози, тріс-буфера і кріопротектора містився яєчний альбумін. Введення в кріозахисне середовище будь-якого з п'яти вивчених кріопротекторів в концентрації 1 М негативно впливало на переживаємість сперматозоїдів собак до заморожування. Проте, найменше зниження рухливості сперматозоїдів собак спостерігалося у присутності ДМФА в середовищі ТФА (р ? 0,05). Рухомими залишалися 50 ± 6 % клітин через шість годин інкубації в умовах гіпотермії (6оС). В той час, як в присутності ЕГ через шість годин інкубації сперматозоїдів в середовищі ТФА залишалися рухомими 45 % клітин. Рухливість сперматозоїдів у присутності ДМСО і
1,2-ПД через шість годин інкубації у відповідних умовах не перевищувала
20 %, ГЛ - 10 %. Результати статистичного аналізу даного багатофакторного експерименту виявили, що за ступенем негативного впливу на рухливість сперматозоїдів собак вивчені сполуки розташувались у наступний ряд: 1,2-ПД > ДМСО > ГЛ > ЕГ >ДМФА (р ? 0,05).

Після відтавання найкраща рухливість клітин спостерігалася при кріоконсервуванні під захистом ДМФА в концентрації 1 М в середовищі ТФА і складала безпосередньо після відтавання 55 ± 7 %. Через одну годину в середовищі ТФА, що містить ДМФА залишалися рухомими 45 ± 10 % клітин (рис. 3). Рухливість клітин кріоконсервованих під захистом 1,2-ПД в концентрації 1 М та ГЛ в концентрації 1 М не перевищила рівня 30 % безпосередньо після відтавання. Під захистом ЕГ в концентрації 1 М в середовищі ТФА виявилися рухомими 30 % клітин відразу після відтавання. Потім спостерігалося поступове зниження рухливості (рис. 3). Крім того, був виявлений позитивний вплив яєчного альбуміну як чинника середовища розбавлення (р ? 0,05) на рухливість заморожено-відталих клітин.

Експериментальні дані попередніх досліджень [Лінник, 2003] показують, що кріозахисні середовища можуть бути найбільш ефективними

Рис 3. Рухливість сперматозоїдів собак в криозахисних середовищах ТФЖ, ТФА, ТФ в присутності ДМСО, ДМФА, ЭГ, ГЛ, 1,2–ПД в концентрації 1 М через одну, три, шість годин після заморожування-відтавання; t = 6оС, n = 8.

при одночасному використанні суміші кріопротекторів діолів і амідів. Тому в наступній серії експериментів (серія Г) ми порівняли переживаємість сперматозоїдів собак після заморожування-відтавання в середовищі ТФА, що містить ДМФА або ЕГ в концентрації 1 М, або їх суміш при концентрації обох кріопротекторів 0,5 М. Результати переживаємості клітин після заморожування-відтавання показали, що найкраще збереження сперматозоїдів спостерігалося в суспензії, що містить один кріопротектор - ДМФА. У суміші кріопротекторів була відмічена тенденція до кращої переживаємості впродовж перших двох годин, а потім рухливість сперматозоїдів стала нижча, ніж в середовищі з ДМФА. Через 7 год рухливість сперміїв, заморожено-відталих під захистом ДМФА склала 25 %, тоді як суміш дозволяла зберегти тільки 10 % рухомих клітин. Найгірші результати отримані при використанні одного ЕГ
(р ? 0,05).

Результати досліджень свідчать про те, що ДМФА є найменьш токсичним кріопротектором відносно сперматозоїдів собак, проявляє найбільш високий кріозахисний ефект в поєднанні з яєчним альбуміном. Це може бути зумовлено тим, що яєчний альбумін здатний утворювати комплекси в поєднанні з ДМФА і таким чином знижувати токсичну дію кріопротектору на клітини [Туров В.В. та інш., 1994].

Для з'ясування можливого механізму взаємодії альбуміну з мембранами сперміїв був проведений спектральний аналіз флуоресценції яєчного альбуміну ковалентне міченого міткою TG-404 у присутності сперматозоїдів собак або плазми еякуляту до і після додавання ЕГ і ДМФА. Результати експериментів свідчили про те, що яєчний альбумін, не зв'язується з мембраною сперматозоїдів, але можливо зв'язується з плазмою еякуляту з утворенням білок-білкових кон’югатів. У циклі кріоконсервування сперматозоїдів собак в розчинах кріопротекторів і за наявності залишків плазми в суспензії клітин альбумін, мабуть, взаємодіє з кріопротектором (ДМФА) і компонентами плазми (білками) і не локалізується на мембрані сперматозоїдів.

Далі, з метою визначення запліднюючої здатності сперматозоїдів собак, кріоконсервованих за вказаним методом, було проведене запліднення самок заморожено-відталими клітинами. Результати показані в табл. 2.

Таблиця 2.

Характеристики щенят, одержаних після запліднення самок собак заморожено-відталими сперматозоїдами і після природного запліднення (М±m, n=5).

Показники поносів одержаних від дослідних самок після попереднього експерименту запліднення (контрольна група) і показники одержані під час експерименту (дослідна група) були в середньому 9,8 ± 1,25 і 6,3 ± 0,7 щенят в поносі відповідно. У контрольній групі було 6 щенят з масою тіла при народженні менше 0,33 кг. Щенята, що народилися з такою живою масою, мали відставання в розвитку, двоє з них померли. У дослідній групі не було щенят з відхиленнями від середнього значення живої маси. Подібний ефект поліпшення життєвих показників тварин у результаті штучного запліднення заморожено-відталими сперматозоїдами був відмічений в роботах [Копейка, 1982; Савушкина С. И., 1991; Савушкина С. И., 1998] на інших біооб'єктах.

Таким чином в наслідок проведених досліджень був розроблений та запропонований для використання метод кріоконсервування сперматозоїдів собак, який передбачає: центрифугування сперматозоїдів собак при 400 g та розведення осаду клітин середовищем, яке містить 0, 25 М тріс-буферу, 0,05 М фруктози, 1 % яєчного альбуміну у співвідношенні 1:1; охолодження отриманої суспензії протягом 10 - 15 хв до температури 6 оС; розведення охолодженої суспензії середовищем, яке містить 0, 25 М тріс-буферу, 0,05 М фруктози, 1 % яєчного альбуміну, 2 М ДМФА у співвідношенні 1:1 (кінцева концентрація кріопротектору склала 1 М); кріоконсервування клітин в соломинках “СЖ” об'ємом 0, 25 м3 за режимом 1; відтавання сперматозоїдів собак на водяній бані при температурі 40 оС до появи рідкої фази.

ВИСНОВКИ

Практичне використання існуючих методів кріоконсервування сперматозоїдів собак не отримало значного поширення внаслідок їх недосконалості. У дисертаційній роботі наведено теоретичне та експериментальне узагальнення досліджень впливу умов кріоконсервування на морфофункціональний стан сперматозоїдів собак на етапах: до та після заморожування в залежності від доданих кріопротекторів, їх хімічної структури та умов інкубації клітин, до та після заморожування в залежності від складу кріозахисного середовища. Експериментально обґрунтовані підходи до створення кріозахисного середовища з метою підвищення збереження сперматозоїдів собак в процесі кріоконсервування. На підставі цього розроблено метод кріоконсервування сперматозоїдів собак, який дозволяє зберігати високий відсоток функціонально повноцінних клітин після заморожування-відтавання.

1. Встановлено, що відокремлення клітин від фракцій плазми еякуляту на етапі підготовки сперматозоїдів до кріоконсервування позитивно впливає на виживаність гамет після заморожування-відтавання. Виявлено, що заморожування-відтавання відокремлених фракцій плазми еякуляту дозволяє використовувати їх для розбавлення кріоконсервованих і відігрітих сперматозоїдів в процесі запліднення з метою створення умов наближених до природних.

2. Показано, що з досліджених вуглеводів (фруктоза, глюкоза, лактоза) фруктоза у складі кріозахисного середовища у концентрації 0,05 М дозволила зберегти найкращу життєздатність сперматозоїдів собак як до, так і після процесу заморожування-відтавання.

3. Встановлено, що ефект взаємодії вивчених кріопротекторів як з ліпідним бішаром ліпосом, сформованих з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак, так ї з мембранами клітин зумовлений гідрофільно-гідрофобним балансом молекул дослідних сполук. Виявлено концентраційно-залежний характер їх дії на ліпідний бішар. Показано, що збільшення концентрації ДМФА в кріозахисному середовищі, призначеному для кріоконсервування сперматозоїдів собак вище за 8 % може негативно впливати на структуру ліпідних складових біомембран..

4. Виявлено, що у ряді кріопротекторів (гліцерин, етиленгліколь,
1,2-пропандіол, диметилсульфоксид N,N-диметилформамід)
N,N-диметилформамід спричинює найменьше падіння рухливості сперматозоїдів собак на етапі підготовки до кріоконсервування клітин, проявляє найкращий кріозахист при кріоконсервуванні сперматозоїдів собак, що обумовлено його физико-хімічною структурою, а саме гідрофільно-гідрофобним балансом його молекули.

5. Розроблене середовище, що містить N,N-диметилформамід у концентрації 1 М в поєднанні з яєчним альбуміном в концентрації 1 % у тріс-фруктозному розбавлювачі, яке проявляє ефективніший кріозахист в порівнянні із стандартним середовищем, що містить жовток курячих яєць в концентрації 20 % (v/v) і ГЛ в концентрації 1 М і режим кріоконсервування сперматозоїдів собак в запропонованому кріозахисному середовищі, який дозволяє одержати життєздатність даних клітин на рівні 55 % безпосередньо після відтавання і 30 % через 6 годин інкубації в кріозахисному розчині при температурі 6оС.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Егоров М.И., Копейка Е.Ф., Линник Т.П., Кучков И.Н. Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования // Пробл. криобиологии. – 2004. - № 4. - С. 13 – 20

2. Линник Т.П., Егоров М.И., Дюбко Т.С., Белоножко А.П. Влияние компонентов криозащитных сред на жизнеспособность сперматозоидов собак в процессе криоконсервирования // Пробл. криобиологии. – 2005. – Т. 15,
№ 4. - С. 645 – 656

3. Єгоров М.І., Дюбко Т.С., Ліннік Т.П., О. П. Бєлоножко,
Єрмоленко І. Г., Семенова О. Н., Паценкер Л. Д., Пивоваренко В. Г., Поврозін Є.А. Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах // Пробл. криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 1. - С. 13 – 23

4. Кошевой В. П., Фурда И. В., Егоров М. И. Влияние N,N-диметилформамида, этиленгликоля и их смеси на криоустойчивость сперматозоидов собак // Пробл. криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 3. – С. 245-253

5. Пат. № 68172 А (Україна) МПК 7 А 01 N 1/02 Спосіб отримання сперми собак. / Грищенко В.І., Копійка Є.Ф., Єгоров М.І., Кучков І.М., Черкащина І.В. Заявл. 31.10.2003. Публ.15.07.04. Бюл.7, с.4.26.

6. Пат. № 8590 (Україна) МПК 19 А 01 N 1/02 Середовище Єгорова для кріоконсервування сперматозоїдів собаки./ Єгоров М. І., Грищенко В. І., Ліннік Т. П., Новиков О. М. Заявл. 10. 01. 2005. Публ. 15. 08. 2005.

7. Пат. № 13898 (Україна) МПК G 01 N 1/28 Спосіб оцінки змін макроструктури зневоднених білкових розчинів. / Марченко В.С., Дюбко Т.С., Грищенко В.І., Марченко М.В., Ліннік Т.П., Єгоров М.І., Бєлоножко О.П., Соколик О.О. Заявл. 11. 11. 2005. Публ. 17. 04. 2006. Бюл. № 4.

8. Линник Т.П., Егоров М.И., Дюбко Т.С., Титарь В.П., Тишко Т.В., Семенова О.Н., Пивоваренко В.Г. Влияние криопротекторов классов амидов и диолов на сперматозоиды собаки по данным метода флуоресцентных зондов // 1 Укр. наук. конф. „Проблеми біол.. і мед. фізики”, 20-22 вер. 2004 р., Харків. – С. 138.

9. Егоров М.И., Любко Т.С., Линник Т.П., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Єрмоленко И.Г. Изучение влияния связываня флуоресцентно меченого альбумина со сперматозоидами // Міжн. наук.–практ. конф. „Наукові дослідження – теорія та експеримент, 2005”, 16-20 травня 2005 р., Полтава. – С. 18-19.

10. Егоров М.И., Линник Т.П., Дюбко Т.С., Белоножко А.П. Исследование криозащитной активности эндоцеллюлярных криопротекторов в процессе криоконсервирования сперматозоидов собак // Конф. мол. уч. ІПКіК “Холод в біології та медицині - 2005”, Пробл.криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. –С. 736-737

АННОТАЦІЇ

Єгоров М. І. Морфофункціональний стан сперматозоїдів собак в залежності від умов кріоконсервування. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедіцини НАН України, Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченню впливу компонентів кріозахисних середовищ і умов кріоконсервування на збереження морфо-функціональних властивостей сперматозоїдів собак до і після процесу заморожування-відтавання.

Вплив кріопротекторів ГЛ, ЭГ, 1,2-ПД, ДМСО, ДМФА, а також яєчного альбуміну на мембрани сперматозоїдів собак вивчали за допомогою методів флуоресцентних зондів і міток. Використовували флуоресцентний зонд ФМЕ (3-гидрокси-4-N,N-диметиламінофлавон), флуоресцентну мітку Tasman Green-404.

Вивчення впливу компонентів кріозахисних середовищ (тріс-буфера, фруктози, глюкози, лактози, ГЛ, ЭГ, 1,2-ПД, ДМСО, ДМФА, суміші ЭГ і ДМФА) на морфофункціональні характеристики сперматозоїдів собак проводили на етапах до кріоконсервування і після заморожування-відтавання клітин.

Виявлено, що у ряді кріопротекторів (ГЛ, ЕГ,
1,2-ПД, ДМСО, ДМФА) ДМФА є найменьш токсичним кріопротектором для сперматозоїдів собак, в середовищі, що містить тріс-буфер в концентрації 0,25 М, фруктозу в концентрації 0,05 М, проявляє найкращий кріозахист в поєднанні з яєчним альбуміном відносно сперматозоїдів собак (р ? 0,05), що обумовлено його физико-хімічною структурою, а саме гідрофільно-гідрофобним балансом його молекули.

Показано, що збільшення концентрації ДМФА в кріозахисному середовищі, призначеному для кріоконсервування сперматозоїдів собак вище за 8 % може негативно впливати на структуру ліпідних складових біомембран..

Ключові слова: сперматозоїди собаки, кріопротектори, яєчний альбумін, кріоконсервування, флуоресцентні зонди.

Егоров М. И. Морфофункциональное состояние сперматозоидов собак в зависимости от условий криоконсервирования. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. Інститут проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2007.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния