Міністерство охорони здоров’я України

Національний Медичний Університет
імені О.О. Богомольця

Євтушенко Олександр Іванович

УДК 616.9-092.9-092:578.835.1:618.33

ЕНТЕРОВІРУСИ В патології плода
та новонароджених

03.00.06 – вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені
О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий консультант

доктор медичних наук, професор,

академік НАН України,

член-кореспондент АМН України,

заслужений діяч науки і техніки України

Широбоков Володимир Павлович,

Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця, завідувач кафедри
мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри вірусології;

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський державний медичний університет, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології;

доктор медичних наук, професор Лакатош Володимир Павлович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, професор кафедри акушерства та гінекології №1.

Провідна установа

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В.Громашевського, лабораторія поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій, АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться “ 7 ” червня 2007 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.01 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця, Київ, пр-т. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія №2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий “ 4 ” травня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Войцеховський В.Г.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Актуальною проблемою охорони здоров’я є зниження перинатальної і ранньої дитячої захворюваності та смертності. За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я близько 20% ембріонів і плодів людини гине у внутрішньоутробному періоді або народжується з вадами розвитку. Участь інфекційних агентів у формуванні патології вагітності, плода та новонароджених вивчається вже багато десятиріч. В авторитетних дослідженнях зазначається, що 10% вагітностей супроводжується внутрішньоутробним інфікуванням. Клінічно виражені форми захворювання при внутрішньоутробному інфікуванні становлять 0,5-1% серед доношених дітей та 3,5-16% – у випадку передчасних пологів. Частота ж ранньої неонатальної захворюваності та смертності коливається від 5,3% до 27,4%, а мертвонароджуваність сягає 16,8% (Сенчук А.Я. и др., 2005).

Феномен вертикальної передачі вірусів вперше описав у 1941 році N.M. Greeg при вивченні вроджених вад серця та катаракти у новонароджених після перенесеної жінками краснухи під час вагітності. Нині відомо, що більшість вірусних агентів здатна долати плацентарний бар’єр. Вірусні захворювання вагітних являють серйозну небезпеку через здатність викликати передчасні пологи, аборти, загибель плода або вроджені захворювання новонароджених. Вважається, що вірусні інфекції під час вагітності призводять до появи на кожні 1 тис. пологів 25 новонароджених з клінічно вираженими ознаками захворювання (Сидорова И.С. и др., 2006).

Навіть у разі народження живої дитини негативні інфекційні впливи, які вона зазнавала внутрішньоутробно на етапі формування, диференціації та росту клітин, як правило, досить неефективно компенсуються за рахунок власних можливостей новонародженого та не підлягають подальшій корекції (Гриноу А. и др., 2000).

Свого часу вивчення патогенезу, закономірності участі у внутрішньоутробних інфекціях вірусів краснухи, герпесу, гепатиту дозволили розробити ефективні засоби профілактики, оптимальні схеми ведення вагітності, що у сукупності призвело до різкого зменшення репродуктивних втрат при цих інфекціях (Фризе К. и др., 2003; Чайка В.К., 2006; Кузьмин В.Н., 2001).

У світовій літературі є відносно невелика кількість публікацій щодо можливої участі ентеровірусів у розвитку патологій плода та новонароджених (Abzug M.J. et al., 1993; Dettmeyer R. et al., 2002; Лозовская Л.С. и др., 1995; Jenista J.A. et al., 1984). Перші повідомлення про внутрішньоутробне зараження плода вірусами Коксакі А та Коксакі В датуються 60-ми роками ХХ сторіччя. В подальшому у новонароджених з ураженнями мозку, серцево-судинної системи, легенів були виділені різні штами вірусів Коксакі та ЕСНО (Dahlquist G. et al., 1995). У робо-тах вітчизняних та закордонних дослідників лише окреслено підходи до експериментального вивчення патогенезу ентеровірусних інфекцій плода та новонароджених (Лозовская Л.С. и др. 1993; Ритова В.В., 1976; Соловьев В.Д. и др., 1970). Ці захворювання вивчалися тільки на рівні макроорганізму. Відсутні відомості щодо особливостей ентеровірусних інфекцій на рівні клітин плода.

Запровадження масової профілактики поліомієліту із застосу-ванням живої поліовірусної вакцини сприяло насиченню довкілля та людської популяції вірусами зі зміненою вірулентністю. Однак будь-які дані про взаємодію вакцинних штамів вірусів поліомієліту з організмом вагітної та плода взагалі відсутні.

Вірусні інфекції вагітних – мабуть, найскладніший варіант інфекційного процесу у людини. У нерозривному зв’язку опиняються одразу два організми, які протягом певного часу зазнають суттєвих змін. Для гетерогенної популяції ентеровірусів з’являються оптимальні можливості реалізації потенціалу формування або гострого, або ж хронічного чи персистентного інфекційного процесу. При подоланні плацентарного бар’єру ентеровіруси опиняються у середовищі ембріональних клітин, що перебувають на різних етапах диференціації та росту, загалом в ізольованому від материнських захисних впливів просторі.

Які ж чинники визначають особливості перебігу ентеровірусних інфекцій у вагітних та плодів, наскільки поширені внутрішньоутробні ентеровірусні інфекції, чи можливе їх попередження та лікування? Усвідомлення необхідності пошуку відповідей на поставлені запитання як умови розв’язання проблеми інфекційної патології плода та новонароджених обумовило зміст, логіку та актуальність проведення досліджень з вивчення закономірностей ентеровірусних інфекцій в антенатальному та перинатальному періоді.

Зв’язок роботи із науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт МОЗ України та Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Результати досліджень (1986-2006 років) увійшли до НДР: “Біологічні властивості ентеровірусів на рівні віріону та популяції” 2005-2006 рр., номер держреєстрації – 0106U000326; “Изучить роль энтеровирусов и вирусо-бактериальных ассоциаций в патологии плода и новорожденных” 1987-1990 рр.

Мета і завдання дослідження. Мета: встановити закономірності ураження плода та новонароджених ентеровірусами.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

1.  

2.  

3.  

4.  

5.  

6.  

Об’єкт дослідження: ентеровірусна інфекція в анте- та постнатальному періоді.

Предмет дослідження: ентеровіруси різних типів, вагітні миші, ембріони та плоди експериментальних тварин, клінічний матеріал: абортивний, від плодів та новонароджених.

Методи дослідження: вірусологічні методи, включаючи культивування, титрування вірусів, отримання бентонітових генетичних варіантів, моделювання вірусної інфекції з використанням експериментальних тварин, виділення вірусів із клінічного матеріалу в клітинних культурах, їх ідентифікація в реакції віруснейтралізації та визначення вірулентності in vitro; серологічні методи для виявлення антитіл до різних типів вірусів у вагітних жінок; біохімічні методи визначення рівня жирних кислот в мембранах еритроцитів і сироватці крові тварин та в культурі фібробластів ембріону людини; генетичні методи визначення хромосомних аберацій у плодів мишей; молекулярно-біологічні методи з використанням полімеразної ланцюгової реакції для виявлення вірусних нуклеїнових кислот.

Наукова новизна отриманих результатів В результаті проведених досліджень встановлені закономірності внутрішньоутробної ентеровірусної інфекції. Доведено, що вагітність підвищує чутливість до ентеровірусної інфекції. Вперше встановлено, що провідна роль у патогенезі експериментальної інфекції вагітних належить біологічним властивостям збудника. Характер перебігу ентеровірусної інфекції у вагітних також визначається стадією гестації, генетичними особливостями макроорганізму, віком тварин та інфікуючою дозою. Виявлено, що атенуйовані віруси поліомієліту, віруси Коксакі В та ЕСНО здатні до вертикальної передачі та призводять до загибелі плода, появи нежиттєздатного потомства, порушення процесів розвитку, формування імунологічної толерантності. Факторами, що визначають особливості перебігу експериментальної ентеровірусної інфекції плода є біологічні властивості збудника, ступінь зрілості зародка, інфікуюча доза. Вперше показано, що віруси Коксакі В та поліомієліту в клітинах плода спричиняють виникнення хромосомних аберацій. В експерименті вперше встановлено, що в організмі вагітних при ентеровірусній інфекції мають місце порушення обміну ліпідів. Експериментально доведено, що чутливість вагітних і плодів до ентеровірусної інфекції та вираженість хромосомних порушень зростає зі збільшенням терміну вагітності, досягаючи максимуму наприкінці гестації. Вперше на патогенетичних засадах експериментально обґрунтовано можливість успішної специфічної профілактики внутрішньоутробної Коксакі В вірусної інфекції та медикаментозної корекції порушень метаболізму ліпідів. Параклінічними дослідженнями показана здатність різних типів ентеровірусів спричиняти внутрішньоутробну патологію. Вперше виявлено здатність поліовірусів з різною вірулентністю долати плацентарний бар’єр та уражати плід на всіх етапах гестації.

Практичне значення одержаних результатів. Визначені законо-мірності внутрішньоутробних ентеровірусних інфекцій можуть бути використані для встановлення факторів ризику вагітності та розробки раціональних схем ведення вагітності в умовах внутрішньоутробного інфікування. Отримані дані щодо перманентного виділення вірусів поліомієліту від ембріонів та плодів людини можуть бути використані при удосконаленні програм специфічної профілактики поліомієліту в Україні. Враховуючи експериментально доведену на патогенетичних засадах можливість корекції порушень метаболізму ліпідів, що мають місце при ентеровірусних інфекціях вагітних і плода, можна рекомен-ду-вати застосування лікарських засобів, що містять поліненасичені жирні кислоти для попередження або лікування негативних проявів в акушер-ській практиці у разі внутрішньоутробних ентеровірусних інфекцій.

Отримані результати застосовані при виданні методичних рекомендацій “Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде”, у педагогічному процесі на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету, Буковинського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. У дисертації представлені результати експериментальних та параклінічних досліджень, проведених автором переважно особисто. Обмін жирних кислот вивчався на базі науково-дослідного лабораторного центру Національного медичного університету імені О.О. Богомольця разом з провідним науковим співробітником лабораторії газової хроматографії, к.т.н. Брюзгіною Т.С. Деякі дослідження – генетичні, серологічні реакції, ПЛР проводили
за участю співробітників кафедри мікробіології, вірусології та імунології НМУ к.б.н. Павленко Л.В., д.б.н. Корнюшенко О.М., к.б.н. Ахрамєєвої Н.В., к.мед.н. Ніколаєнко І.В. В Інституті поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова (Москва) д.мед.н В.Б. Сейбілем проводилася диференціація виділених штамів вірусів поліомієліту за вірулентністю з використанням внутрішньотипової серодиференціації у реакції віруснейтралізації, методом олігонуклеотидного картування та полімеразної ланцюгової реакції. Автор самостійно проаналізував отримані результати та написав всі друковані матеріали. Усі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору.

Апробація результатів дисертації. Положення дисертації були представлені на XVII з’їзді Всесоюзного товариства епідеміологів, мікробіологів та паразитологів ім. І.І. Мечнікова (Алма-Ата, 1989); VII з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989); VIIІ міжнародному конгресі з вірусології (Берлін, 1990); Всесоюзній конференції “Энтеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты” (Київ, 1991); ХІІ Українському республіканському з’їзді мікробіологів, епідеміологів і паразитологів (Харків, 1991); IV конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Харків, 1992); науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження
С.С. Дяченко (Київ, 1998); науковій сесії Російської Академії медико-технічних наук (Москва, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 21 стаття у періодичних наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України, 18 робіт в інших виданнях, глава в монографії, методичні рекомендації.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 7 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел та додатку. Роботу викладено на 302 сторінках друкованого тексту, ілюстровано 73 таблицями та 28 рисунками. Бібліографія складається з 489 джерел.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. Головним об’єктом дослідження була ентеровірусна інфекція в анте- та постнатальному періоді.

Для проведення досліджень були використані отримані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів АМН СРСР в 1983 році вакцинні штами вірусу поліомієліту (далі – ВПМ): І тип – LSс2аb, ІІ тип – P-712, ch 2аb, ІІІ тип – Leon12 аb; віруси групи Коксакі: Коксакі А4 штам Highpoint, Коксакі В1 штам Connecticut, Коксакі В2 штам Ohio, Коксакі В3 штам Nancy, Коксакі В4 штам Powers; Коксакі В5 штам Faulkner, Коксакі В6 штам Hammon; віруси ЕСНО: ЕСНО 4 штам Du Toit, ЕСНО 9 штам Vispo, ЕСНО 11 штам Gregory, ECHO 19 штам Burke, ЕСНО 21 штам Farime, ЕСНО 33 штам Toluca-3.

При вірусологічних дослідженнях використовували перещеплю-вані, диплоїдні та первинні культури клітин людського і тваринного походження: Vero, HEp-2, НеLa, RD, КВ, L-41, СПЕВ, М-19 та ФЕЛ. Культивування клітин проводили за класичними методиками із використанням середовищ 199 та Ігла.

Культивування вірусів здійснювали шляхом інфікування вищенаведених клітинних культур.

Концентрування вірусів проводили за методикою В.П. Широбо-кова (Широбоков В.П., 1977) із застосуванням природного сорбенту бентоніту. Принцип методу полягає у використанні властивості ентеро-вірусів сорбуватися на бентоніті при кислих рН та десорбуватися в елюючий розчин при лужних рН за відсутності двохвалентних катіонів.

Титр вірусів визначали двома методами: за бляшкоутворенням під бентонітовим покриттям та мікрометодом за ЦПД. Титри вірусів виражали в бляшкоутворюючих одиницях (БУО) чи в ТЦД50.

Отримання генетичних бентонітових варіантів (Абент+ та Абент) здійснювали за методикою В.П. Широбокова, заснованою на селективній адсорбції на бентоніті при різних значеннях рН певних частин популяції ентеровірусів.

Виділення вірусів із органів і тканин експериментальних тварин, а також із матеріалів, отриманих в ході параклінічних досліджень, проводили шляхом підготовки суспензії в середовищі 199 з наступним триразовим заморожуванням-розморожуванням для вивільнення вірусів з клітин, центрифугуванням, обробкою надосадової рідини діетиловим ефіром для деконтамінації та визначенням наявності вірусів шляхом інфікування відповідних культур клітин. Кількість вірусів визначали описаним вище методом титрування та виражали в ТЦД50 або БУО на
1 грам тканини.

Визначення типової належності вірусів, виділених із клінічного матеріалу, проводили в реакції нейтралізації вірусів із використанням діагностичних сироваток до вірусів поліомієліту І-ІІІ типів, вірусів Коксакі В 1-6 типів та ЕСНО 1-34 типів (виробництва Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова РАМН).

Визначення вірулентності поліовірусів, виділених із клінічного матеріалу, здійснювали за допомогою наступних генетичних маркерів вірулентності: rct40, t, S та Абент, використання яких засновано на різній здатності атенуйованих та вірулентних штамів розмножуватись при температурі 40С; зберігати життєздатність при 50С, а також утворювати різні за розміром бляшки в культурі клітин та неоднаковій адсорбції на бентоніті при різних значеннях рН. Отримані результати порівнювали із даними, одержаними в Інституті поліомієліту і вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова РАМН, де диференціація виділених штамів на вірулентні, атенуйовані та проміжні проводилася з використанням внутрішньотипової серодиференціації у реакції віруснейтралізації з перехресно виснаженими сироватками, методами олігонуклеотидного картування та полімеразної ланцюгової реакції.

Виявлення ентеровірусів в секційному матеріалі від плодів та новонароджених за допомогою полімеразної ланцюгової реакції проводили з використанням комерційної тест-системи виробництва АмплиСенс ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ.

Серологічна діагностика Коксакі В вірусної інфекції у вагітних жінок проводилась шляхом дослідження парних сироваток в реакції віруснейтралізації мікрометодом.

Модулювання експериментальної ентеровірусної інфекції у вагітних та у плода здійснювали з використанням різних ліній мишей: CBA, BALB/c, C57BL/6, C57BL/6 x CBA (гібриди 1-го покоління), AKR і безпородних білих мишей.

Виявлення хромосомних аберацій, проводили за методом Курінного А.І. (Куринной А.И., 1969): для цього ембріональний матеріал обробляли трипсином і культивували в присутності колхіцину, суспензію клітин відмивали, обробляли фіксатором, висушували на предметних скельцях, фарбували орсеном та за допомогою мікроскопії проводили облік і підрахунок аберантних метафаз.

Визначення жирних кислот (далі – ЖК) в мембранах еритроцитів та сироватці вагітних мишей, а також в фібробластах ембріонів людини проводили методом газової хроматографії в хроматографі серії “Цвет-500” з полум’яно-іонізаційним детектором в ізометричному режимі. Екстракцію ліпідів здійснювали хлороформно-етанольною сумішшю за методом Синяка К.М. (Синяк К.М., 1976); для гідролізу та метилювання жирних кислот використовували метод Фолча (Folch J., 1957). В жирнокислотному складі ліпідів ідентифікували піки найбільш інформативних жирних кислот за допомогою референс-стандартів фірми Merck. Кількісну оцінку спектру ЖК проводили за методом нормування площин та визначали вміст кислот в %.

Інактивовану Коксакі В3 вірусну вакцину виготовляли шляхом обробки вірусів Коксакі В3 0,009% формальдегідом протягом 12 днів при температурі 37С, рН 7,0 (Лашкевич В.А., 1973).

Методи статистичної обробки результатів. Усі отримані кіль-кісні результати підлягали статистичній обробці загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з визначенням середнього арифметичного (М), помилки середнього арифметичного (m), критерію Ст’юдента (t), рівня значущості (Р) з використанням програмних продуктів фірми Microsoft.

Експериментальна ентеровірусна інфекція у вагітних мишей. Дослідження особливостей перебігу ентеровірусної інфекції у вагітних мишей було розпочато з вибору чутливої моделі, що здійснювалось шляхом інфікування п’яти різних генетичних ліній та безпородних білих мишей вірусом Коксакі В3. Найбільш чутливими за показниками смертності та захворюваності виявились миші лінії С57Bl/6, які і використовувались в подальших експериментальних дослідженнях.

В порівняльних дослідженнях з’ясовували вплив вагітності на розвиток ентеровірусної інфекції. При інфікуванні мишей на ІІІ тижні вагітності та невагітних тварин показано, що вагітність суттєво підвищує чутливість до ентеровірусів (табл. 1).

Таблиця 1

Порівняльна чутливість вагітних та невагітних мишей різних ліній
до вірусу Коксакі В3

Лінії мишей | Наслідки інфікування | Смертність | Ознаки захворювання | Без змін | невагітні | вагітні | невагітні | вагітні | невагітні | вагітні | C57BL/6 |

22,70,99 |

54,40,99

Р30,01 | 13,60,5 |

36,40,5

Р30,01 | 63,60,99 |

9,10,99

Р30,001 | СВА

0

Р10,001 | 13,60,99

Р20,001

Р30,01 | 4,50,49

Р10,01 | 22,70,49

Р20,01

Р30,01 | 95,50,49

Р10,01 | 63,70,99

Р20,001

Р30,01 | BALB/c |

13,70,5

Р10,01 | 45,50,49

Р20,02

Р30,01 | 22,70,5

Р10,01 | 36,40,99

Р20,05*

Р30,01 | 63,60,5

Р10,05* | 18,10,99

Р20,01

Р30,01 | C57BL/6 х СВА

9,10,5

Р10,01 | 18,20,99

Р20,01

Р30,01 | 9,10,49

Р10,02 | 22,70,5

Р20,01

Р30,01 | 81,80,5

Р10,01 | 59,10,99

Р20,01

Р30,01 | AKR |

4,60,49

Р10,001 | 27,30,5

Р20,01

Р30,01 | 22,70,99

Р10,01 | 31,80,5

Р20,05*

Р30,01 | 72,70,99

Р10,02 | 40,90,5

Р20,001

Р30,01 | Безпородні

13,60,5

Р10,02 | 40,90,99

Р20,02

Р30,01 | 27,30,5

Р10,01 | 36,40,99

Р20,05*

Р30,02 | 59,10,5

Р10,02 | 22,70,99

Р20,01

Р30,01 |

Примітки:

1. Цифрами в таблиці позначена середня частота виявлення ознаки у %.

2. Р1 – достовірність різниці показників в групі невагітних мишей різних ліній в порівнянні із показниками для мишей лінії C57BL/6 за наслідками інфікування.

3. Р2 – достовірність різниці показників в групі вагітних мишей різних ліній в порівнянні із показниками для мишей лінії C57BL/6 за наслідком інфікування

4. Р3 – достовірність різниці показників в групі вагітних мишей в порівнянні із невагітними в межах відповідної лінії.

5. * – різниця показників статистично не достовірна.

В середньому смертність серед вагітних мишей перевищувала таку в групі невагітних більше ніж в 3 рази. У найбільш чутливої лінії мишей – C57BL/6, смертність серед вагітних мишей досягала 54,4%; кількість невагітних тварин без ознак захворювання перевищувала кількість здорових вагітних майже в 7 разів (при інфікуючій дозі 1Ч107 БУО). У мишей лінії BALB/c загибель вагітних та невагітних становила 45,5% та 13,7% відповідно. Схожі цифри були і у безпородних мишей. Навіть у найменш чутливих самок лінії СВА вагітні тварини гинули в 13,6% випадків, а ознаки захворювання у них проявлялись в п’ять разів частіше, ніж у невагітних.

Встановлено, що віруси Коксакі В у вагітних мишей, порівняно з невагітними, накопичуються в усіх органах і тканинах в більш високих концентраціях та довше циркулюють в організмі (табл. 2).

У невагітних тварин віруси впродовж 3 діб виділялись із легень, печінки, нирок, головного мозку і тонкої кишки. В серці, підшлунковій залозі, селезінці та м’язовій тканині віруси знаходились найдовше і виявлялись впродовж 7 діб. В найбільшій кількості вони накопичувались в підшлунковій залозі та м’язах кінцівок, максимальна концентрація їх становила 6,5Ч104 та 1,3Ч104 БУО в грамі відповідно.

В легенях та тонкому кишечнику розмноження і накопичення Коксакі В3 майже не відбувається (показники першої доби практично не змінюються) і віруси із них елімінують найшвидше, вже після 7-ї доби повністю відсутні. У більшості органів невагітних тварин (серці, печінці, підшлунковій залозі, селезінці, головному мозку) максимальна концентрація вірусів припадала на першу добу після інфікування. У вагітних самок вірус в найбільшій концентрації накопичується на третю добу після інфікування. Найвищі титри відмічаються в печінці (1,5Ч105), м’язах кінцівок (3,7Ч105), підшлунковій залозі (5,2Ч105). В максимальному титрі вірус впродовж всього терміну спостереження виділяється саме із підшлункової залози, де його кількість навіть через 10 днів після введення становить 8,2Ч102 БУО в грамі. В той же час в інших органах вірус зберігається в титрі на 1-2 lg нижче. Найменш активно вірус накопичується в легенях, але термін його виділення у інфікованих на останньому триместрі вагітності найдовший. В той час як перебування вірусів Коксакі В3 в органах невагітних мишей обмежується сьомою добою, з організму вагітних вони виділяються ще на десятий день. Через 20 діб в жодному органі самок вірус виявлено не було.

Таблиця 2

Порівняльна динаміка репродукції вірусів Коксакі В3 в організмі невагітних самок та мишей, інфікованих на ІІІ тижні вагітності

Органи інфікова-них мишей | Стан вагітності | Термін після інфікування | 1 доба | 3 доби | 7 діб | 10 діб | 20 діб | Серце | невагітні | (9,4±1,1)х103 | (6,1±0,55)х102 | 0,9±0,11 | 0 | 0 | вагітні | (1,2±0,05)х104

Р0,05 | 3,3±0,12)х105

Р?0,001 | (8,4±0,9)х102

Р?0,01 | (2,1±0,1)х101

Р?0,01 | 0 | Легені | невагітні | (8,3±0,34)х101 | (9,1±1,4)х101 | 0 | 0 | 0

вагітні | (1,3±0,25)х102

Р0,05 | (3,9±0,1)х102

Р?0,02 | 4,3±0,09

Р?0,01 | 0 | 0 | Печінка | невагітні | (7,2±0,9)х103 | (9,0±1,8)х102 | 0 | 0 | 0 | вагітні | (6,6±0,33)х103

Р0,05 | (1,5±0,16)х105

Р?0,01 | (3,3±0,12)х102

Р?0,001 | (4,3±0,2)х101

Р?0,01 | 0 | Підшлун-кова залоза | невагітні | (6,5±0,17)х104 | (4,1±0,24)х103 | (7,4±0,25)х101 | 0 | 0 | вагітні | (2,1±0,3)х104

Р?0,02 | (5,2±0,34)х105

Р?0,001 | (9,2±0,77)х103

Р?0,01 | (8,2±0,7)х102

Р?0,001 | 0 | Нирки | невагітні | (5,8±0,16)х101 | (3,2±0,31)х102 | 0 | 0 | 0 | вагітні | (2,1±0,22)х102

Р?0,02 | (9,4±0,8)х103

Р?0,01 | (0,5±0,02)х101

Р?0,01 | 0 | 0 | Селезінка | невагітні | (7,1±0,09)х103 | (7,7±1,5)х102 | 3,3±0,11 | 0 | 0 | вагітні | (3,3±0,14)х103

Р?0,02 | (9,4±0,6)х104

Р?0,001 | (9,6±0,3)х101

Р?0,01 | 5,6±0,6

Р?0,01 | 0 | Головний мозок | невагітні | (4,9±0,12)х103 | (3,7±0,54)х102 | 0 | 0 | 0 | вагітні | (5,6±0,55)х103

Р0,05 | (8,4±0,71)х104

Р?0,01 | (9,4±1,2)х102

Р?0,001 | (7,7±0,43)х101

Р?0,01 | 0 | М’язи кінцівок | невагітні | (2,2±0,11)х103 | (1,3±0,07)х104 | (7,1±0,14)х101 | 0 | 0 | вагітні | (9,6±0,6)х103

Р0,05 | (3,7±0,33)х105

Р?0,01 | (2,2±0,33)х104

Р?0,001 | (7,2±0,3)х101

Р?0,001 | 0 | Тонкий кишечник | невагітні | (8,2±0,7)х100 | (6,1±0,6)х101 | 0 | 0 | 0 | вагітні | (1,9±0,2)х102

Р?0,01 | (4,1±0,5)х102

Р?0,02 | (7,1±0,8)х101

Р?0,01 | 0 | 0 |

Примітки:

1.  Цифрами в таблиці позначена кількість вірусів в 1 грамі тканини в БУО.

2.  Р – достовірність різниці показників порівняно із контрольною групою (невагітними тваринами).

Найважливішим фактором, що обумовлює характер перебігу інфекції у вагітних мишей, є біологічні властивості збудника (табл. 3).

Таблиця 3

Порівняльна чутливість вагітних мишей до ентеровірусів різних типів

Вірус | Наслідки інфікування | Смертність | Ознаки захворювання | Без змін | Коксакі В3 | 29,40,7 | 52,91,5 | 17,70,5 | Коксакі В1 | 33,31,1

(Р0,02) | 60,00,9

(Р0,02) | 6,70,2

(Р0,02) | Коксакі В5 | 31,31,7

(Р0,05) | 50,02,1

(Р0,05) | 18,70,1

(Р0,05) | ВПМ ІІ типу | 0

(Р0,01) | 0

(Р0,01) | 100

(Р0,01) | ВПМ ІІІ типу | 0

(Р0,01) | 0

(Р0,01) | 100

(Р0,01) | ЕСНО 19 | 0

(Р0,01) | 12,50,3

(Р0,01) | 87,52,0

(Р0,01) |

Примітки:

1.  Цифрами в таблиці позначена середня частота виявлення ознаки у %.

2.  Р – достовірність різниці показників порівняно із тваринами, інфікованими вірусом Коксакі В3.

Найвищий рівень захворюваності (60,0%) і смертності (33,3%) у вагітних самок спричиняє вірус Коксакі В1. Натомість введення вакцинних штамів поліовірусів не викликало жодних негативних наслідків. 100% мишей, інфікованих як вірусом поліомієліту ІІ типу, так і ВПМ ІІІ типу, залишились живими та без жодних ознак захворювання. Інфікування тварин вірусом ЕСНО 19 зумовило появу ознак захворювання у 12,5%. Чутливість вагітних до ентеровірусної інфекції відрізняється не тільки для різних типів ентеровірусів, але й певним чином пов’язана із генетичними особливостями в межах одного типу.

Популяція ентеровірусів гетерогенна, під час репродукції вона закономірно дисоціює на генетичні варіанти, що відрізняються за рядом властивостей, зокрема, за характером адсорбції на бентоніті (варіанти Абент+ та Абент). В свою чергу, бентонітові варіанті мають різні фізико-хімічні та біологічні властивості. Генетичний варіант Абент є значно більш вірулентним для вагітних мишей у порівнянні із варіантом Абент+, спричиняючи більш важкий перебіг захворювання, що закінчується летально для 68,7% вагітних самок, тоді як варіант Абент+ того ж вірусу обумовлює загибель лише 6,3% тварин (табл. 4).

Таблиця 4

Порівняльна чутливість вагітних мишей до бентонітових варіантів вірусу Коксакі В3

Вірус | Наслідки інфікування | Смертність | Ознаки захворювання | Без змін | Коксакі В3
вихідна популяція | 31,33,2 | 43,70,9 | 25,01,4 | Коксакі В3 варіант Абент+6,30,1

Р0,01 | 25,00,99

Р0,01 | 68,72,2

Р0,01 | Коксакі В3 варіант Абент 68,74,1

Р0,01 | 31,31,1

Р0,02 | 0

Р0,001 |

Примітки:

1.  Цифрами в таблиці позначена середня частота виявлення ознаки у %.

2.  Р – достовірність різниці показників порівняно із тваринами, інфікованими вірусом вихідної популяції.

При інфікуванні варіантом Абент гине в 2 рази більше мишей, ніж при інфікуванні вірусами вихідної популяції, і в 11 разів більше, ніж при введенні варіанту Абент+. В групі вагітних мишей, інфікованих вірусами Абент, не було жодної тварини, що не захворіла. Варіант Абент+ вірусу Коксакі В3 майже в 3 рази рідше викликає захворювання, ніж віруси вихідної популяції. Так, смертність тварин була в 5 разів, а ознаки захворювання – майже в 2 рази рідше.

Другим за значимістю фактором, що визначає особливості перебігу ентеровірусної інфекції у вагітних, є термін гестації, під час якого відбувається зараження. Із збільшенням терміну вагітності зростає рівень смертності та захворюваності, збільшується накопичення та тривалість персистенції вірусів в органах вагітних самок. При інфікуванні мишей на І тижні вагітності вірусом Коксакі В3 симптоми хвороби розвиваються у 23,5% тварин (при 0% загибелі). Зараження на ІІ тижні призводить до загибелі 5,9% і розвитку захворювання у 35,3%. На ІІІ тижні гине більше 29,4% і симптоми з’являються у 52,9% тварин (інфікуюча доза 1Ч106 БУО). Вміст вірусів в різних органах самок, інфікованих на ІІІ тижні гестації в середньому на порядок перевищує такий для мишей на І тижні вагітності. Така ж тенденція зберігається щодо тривалості персистенції вірусів в організмі. На сьомий день після інфікування на І тижні вагітності вірус виявляли лише в печінці, підшлунковій залозі, селезінці та м’язах кінцівок, тоді як на ІІІ тижні вагітності – в усіх органах. Ще через 3 дні в першій групі тварин віруси виділяли лише із печінки і підшлункової залози, в другій – із усіх органів, крім легень, нирок та тонкого кишечника.

Певне значення має інфікуюча доза, впливаючи на рівень смертності та захворюваності мишей. Збільшення інфікуючої дози на один порядок супроводжується зростанням смертності тварин в 2-2,5 рази.

Із віком резистентність мишей до вірусів Коксакі В зростає. Це проявляється як у зниженні в 2,5 рази смертності серед мишей, старших одного року в порівнянні із 2-3 місячними, так і зменшенні втричі захворюваності.

Основу ліпідного матриксу клітин складають фосфоліпіди, зміни у їх кількісному і якісному складі призводять до змін функціональних властивостей мембран та, зокрема, їх рецепторів. Як один із важливих механізмів ентеровірусної інфекції у вагітних, з яким пов’язана підвищена чутливість клітин до вірусної інфекції, досліджувались особливості метаболізму жирних кислот у вагітних мишей при зараженні вірусом Коксакі В3. Виявлено, що в мембранах еритроцитів утворюється дефіцит ПНЖК (зменшення загальної суми ПНЖК в 1,3 рази, суми
-3 ПНЖК в 1,4 рази), головним чином, за рахунок довголанцюгових
-3 ПНЖК: ейкозапентаєнової, докозагексаєнової та докозапентаєнової (табл. 5).

Натомість, у сироватці крові вагітних мишей, інфікованих Коксакі В3 вірусами, збільшується загальна сума ПНЖК (від 23,4% до 42,5%), сума -3 ПНЖК (від 9,3% до 20,2%), сума -6 ПНЖК (від 14,1% до 22,3%) (Р0,01), порівняно з контрольною групою здорових вагітних мишей. Підвищення загального рівня ПНЖК відбувається за рахунок лінолевої кислоти (від 11,9% до 17,4%), ліноленової (від 2,2% до 12,1%), ейкозатрієнової ПНЖК (від 1,5% до 4,9%). Ліпідний баланс підтримується за рахунок зменшення вмісту насичених та мононенасичених ЖК: пальмітинової (від 45,5% до 39,1%), стеаринової (від 11,6% до 7,1%), олеїнової (від 19,5% до 10,5%).

Таким чином, характер перебігу ентеровірусної інфекції у вагітних закономірним чином пов’язаний із біологічними властивостями збудника, терміном гестації, генетичними властивостями макроорга-нізму, інфікуючою дозою і віком тварин.

Таблиця 5

Вплив Коксакі В3 вірусної інфекції на вміст ПНЖК (%)
у мембранах еритроцитів вагітних мишей

Назва та код жирної кислоти | Вагітні миші

(контрольна група) | Вагітні миші, інфіковані вірусом Коксакі В3 | Р | Пальмітинова С 16:024,50,6 | 25,10,6 | Р0,05 | Стеаринова С 18:019,30,7 | 19,91,3 | Р0,05 | Олеїнова С 18:121,50,2 | 291 | Р0,01 | Ліноленова С 18:3

-3 ПНЖК | 0,20,7 | 6,60,3 | Р0,01 | Ейкозапентаєнова С 20:5 -3 ПНЖК | 1,9 0,1 | 0,20,12 | Р0,01 | Докозапентаєнова С 22:5 -3 ПНЖК | 2,70,2 | 0,10,04 | Р0,01 | Докозагексаєнова С 22:6 -3 ПНЖК | 5,80,4 | 0,70,08 | Р0,01 | Лінолева С 18:2

-6 ПНЖК | 12,90,3 | 10,90,1 | Р0,05 | Ейкозатрієнова С 20:3

-6 ПНЖК | 0,50,03 | 5,10,3 | Р0,01 | Арахідонова С 20:4

-6 ПНЖК | 10,70,1 | 1,90,02 | Р0,01 | Сума насичених ЖК | 442 | 451 | Р0,05 | Сума ненасичених ЖК | 560,5 | 552 | Р0,05 | Сума -3 ПНЖК | 10,60,1 | 7,61,3 | Р0,01 | Сума -6 ПНЖК | 24,10,4 | 181 | Р0,01 | Сума ПНЖК | 351 | 261 | Р0,01 |

Примітка. Р – достовірність різниці показників у дослідній та контрольній групах.

Експериментальна ентеровірусна інфекція плода. При моделюванні внутрішньоутробної інфекції всі використані ентеровіруси: поліомієліту, Коксакі В, ЕСНО, виявили здатність до вертикальної передачі. Внутрішньоутробна ентеровірусна інфекція призводить до загибелі плода, мертвонародження, появи нежиттєздатного потомства, порушення розвитку плода, формування імунологічної толерантності. Основним чинником, що визначає особливості перебігу ентеровірусної інфекції плода, є біологічні властивості збудника (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив ентеровірусної інфекції на стан плодів

Віруси | Стан плодів | Внутрішньоут-робна загибель | Загибель після народження | Здорові новонароджені | Контроль (без вірусу) | 2,2±0,2 | 11,7±0,1 | 86,1±0,3 | ВПМ ІІ | 3,5±0,08

Р10,05 | 19,8±0,8

Р1?0,02 | 76,7±0,88

Р1?0,02 | ВПМ ІІІ | 6,4±0,3

Р1?0,02 | 25,5±0,9

Р1?0,01 | 68,1±1,2

Р1?0,02 | ЕСНО 19 | 18,9±1,1

Р1?0,01 | 24,4±2,0

Р1?0,01 | 56,9±3,1

Р1?0,02 | Коксакі В1 | 25,8±2,1

Р1?0,01 | 23,6±1,0

Р1?0,01 | 50,6±3,1

Р1?0,01 | Коксакі В3 (вихідна популяція) | 31,4±0,8

Р1?0,01 | 27,6±4,2

Р1?0,01 | 41,0±5,0

Р1?0,01 | Коксакі В3 Абент73,5±3,2

Р1?0,01

Р2?0,01 | 17,7±1,8

Р1?0,02

Р2?0,02 | 8,8±5,0

Р1?0,01

Р2?0,01 | Коксакі В3 Абент+16,2±1,3

Р1?0,01

Р2?0,01 | 14,1±0,6

Р1?0,02

Р2?0,02 | 69,7±1,9

Р1?0,01

Р2?0,01 |

Примітки:

1.  Цифрами в таблиці позначена середня частота виявлення ознаки в %.

2.  Р1 – достовірність різниці показників в дослідних групах у порівнянні з контролем

3.  Р2 – достовірність різниці показників в дослідних групах у порівнянні з групою тварин, інфікованих вихідною популяцією вірусів Коксакі В3.

Найбільш патогенними для плодів виявились віруси групи Коксакі В. Так, вірус Коксакі В3 призводить до загибелі 59,0% потомства. При цьому майже половина із них народжується мертвими, а інші гинуть в перші дні після народження. Вірус Коксакі В1 призводить майже до аналогічних наслідків, хоча його вірулентність дещо нижча, ніж у КВ3. Найменш фетопатогенними виявились віруси поліомієліту. ВПМ ІІ типу викликав смерть 23,3% плодів (при контрольному рівні 13,9%). ВПМ ІІІ типу загалом обумовив загибель 31,9% потомства.

Відомо, що віруси ЕСНО є суто антропонозними паразитами і в організмі мишей не розмножуються. Але при введенні вагітним самкам мишей вони виявились здатними викликати як мертвонародження (18,9%), так і народження нежиттєздатного потомства (24,4%), займаючи за цією ознакою проміжне положення між вірусами поліомієліту та Коксакі. Привертає увагу чітка відмінність строків загибелі потомства при інфікуванні вагітних самок поліовірусами та вірусами Коксакі і ЕСНО. На фоні поліовірусної інфекції більшість мишенят гине постнатально (19,8% та 25,5% відповідно для ВПМ ІІ та ІІІ типів), на долю антенатальної загибелі припадає відповідно лише 3,5% та 6,4%. При інфікуванні самок вірусами Коксакі В та ЕСНО число мишенят, що померли до та після народження суттєво не відрізняється.

Вивчення впливу генетичних варіантів на розвиток плодів чітко показало різницю їх фетопатогенного потенціалу. При інфікуванні вагітних самок вірусами Коксакі В3 (вихідна популяція) поява здорового потомства спостерігалась в 41,0% випадків. На фоні інфекції, викликаної варіантом Абент, живими залишилось лише 8,8% мишенят. Загибель більшості плодів відбувається ще внутрішньоутробно (73,5%), постнатально гине 17,7%. Інфекція, викликана вірусами вихідної популяції відповідного серотипу, обумовлює майже однаковий рівень анте- та постнатальної смерті потомства. Варіант Абент+ впливає на розвиток плоду незначною мірою, показники загальної смертності, викликаної цим вірусом (30,3%), практично не відрізняються від таких для ВПМ ІІІ типу. Розподіл строків загибелі у випадку варіанту Абент+ залишається характерним для вірусів Коксакі В (16,2% мертвонароджень та 14,1% постнатальної загибелі).

Всі використані в експерименті ентеровіруси здатні спричиняти загибель плодів протягом всього періоду внутрішньоутробного розвитку. Найбільш небезпечним виявився останній період вагітності. Вірогідність появи здорового потомства при інфікуванні на ІІІ тижні гестації коливалась від 76,7% (при поліовірусній інфекції) до 8,8% (при зараженні мишей варіантом Абент Коксакі В3 вірусів). Найменшою чутливістю характеризуються плоди самок, інфікованих на ІІ тижні вагітності, мишенята народжуються без ознак захворювання в 85,8% (ВПМ ІІ) та 22,4% (КВ3 варіант Абент) випадків.

При зараженні на І тижні вагітності анте- та постнатальна смертність складає від 80% для найбільш фетопатогенного варіанту Абент вірусу Коксакі В3 до 18% для вірусу поліомієліту ІІ типу. На ранніх етапах вагітності внутрішньоутробна загибель переважає постнатальну: у випадку ВПМ ІІ – 12,7% та 5,6%; Коксакі В3 – 32,5% та 16,2% відповідно. На останньому тижні частота появи хворих та нежиттєздатних новонароджених збільшується: при поліовірусній інфекції до 19,8%, при Коксакі В – до 27,6%.

Величина інфікуючої дози також є одним із факторів, що обумовлюють особливості перебігу внутрішньоутробної ентеровірусної інфекції. При збільшенні інфікуючої дози вірусу Коксакі В3 з 104 до 106 БУО/мишу анте- та постнатальна смертність зростала з 16,9% до 59%; ВПМ ІІ – з 14,2% до 23,3%; варіанта Абент вірусу Коксакі В3 – з 34,4% до 91,2%.

Внутрішньоутробна інфекція на початку вагітності призводить до порушення ембріогенезу, що проявляється зокрема у зменшенні ваги новонароджених. При зараженні на І тижні вагітності вірусом Коксакі В3 середня маса мишенят становила 0,94 г, варіантом Абент вірусу Коксакі В3 – 0,72 г, варіантом Абент+ – 1,23 г (в контролі – 1,4 г).

Інфікування вагітних мишей невеликими дозами вірусу Коксакі В3 призводило до формування імунологічної толерантності у новонароджених. Ступінь її вираженості та тривалість визначалися біологічними властивостями збудника. При зараженні вірусами вихідної популяції нездатність до антитілоутворення до гомологічного антигену спостерігалась протягом чотирьох тижнів, генетичним варіантом Абент – впродовж восьми тижнів.

Досліджувалась бар’єрна функція плаценти щодо вертикальної передачі ентеровірусів. Здатність до накопичення в тканині плаценти проявляли як атенуйовані штами вірусу поліомієліту ІІ типу, так і вірулентний вірус Коксакі В3. Із зростанням терміну гестації захисні функції плаценти знижуються. При інфікуванні самок на ІІ тижні вагітності плацентарний бар’єр поліовіруси долали у 42% тварин, віруси вихідної популяції Коксакі В3 – у 60,6%, генетичного варіанту Абент – у 94,1%. На ІІІ тижні – у 54,2%; 64,7% та 97,2% відповідно.

Віруси Коксакі В3 здатні проникати до плода вже впродовж доби після інфікування самки. Максимум досягався через 3 доби після інфікування з подальшим поступовим зменшенням концентрації вірусів.

При проведенні досліджень закономірностей експериментальної внутрішньоутробної ентеровірусної інфекції на рівні хромосомного апарату клітин ембріона та плода, цитогенетичну картину у клітинах плода, печінки, селезінки та кісткового мозку вивчали при інфікуванні на різних етапах вагітності вірусами Коксакі В1, Коксакі В3 та його генетичними селекціонованими варіантами, вакцинним поліовірусом ІІ типу.

Усі використані ентеровіруси виявили здатність викликати хромосомні аберації, коефіцієнт перевищення (далі – КП) їх рівня порівняно з контролем становив 1,5-3,1, а подекуди 5 разів (рис. 1). Спостерігались як розриви хромосом, в тому числі наявність поодиноких та парних фрагментів, пробіли хромосом, передчасне розходження хромосом на хроматиди, центромерні асоціації