НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

ФІЛЯК ЄВГЕН ЗЕНОВІЙОВИЧ

УДК 576.535.2

ПРОТЕОМІКА Т-ЛІМФОЦИТІВ МИШІ ДИКОГО ТИПУ ТА
ЗА ВІДСУТНОСТІ ГЕНА БІЛКА СЕКУРИНУ

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України, м. Львів

Науковий керівник - член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор,

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин і апоптозу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Сибірна Наталія Олександрівна

завідувач кафедри біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка, м. Львів

доктор біологічних наук, професор

Погрібний Петро Васильович,

завідувач відділу біології пухлинної клітини і радіобіології Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Кавецького НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 14.09.2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова 14/16.

Автореферат розіслано 12.08.2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Убийвовк В. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Порушення у функціонуванні регуляторних шляхів, відповідальних за антиген-залежну активацію клітин імунної системи, можуть призводити до важких розладів, таких як алергія, автоімунні процеси, діабет, атеросклероз, системний червоний вівчак, автоімунний тироїдит, алергічна автоімунна астма, та пригнічення резистентності організму до чужорідних чинників або власних трансформованих клітин, що, у свою чергу, призводить до інфекційних захворювань, або до виникнення пухлин. Центральну роль у організації імунної відповіді на антиген відіграють CD4-позитивні лімфоцити, такі як Т-хелпери типу І (Th1) та Т-хелпери типу ІІ (Th2) (Szabo S.J., et al.2003). Конкурентна активація цих двох типів Т-лімфоцитів забезпечує конкурентну активацію переважно клітинного імунітету, спрямованого проти внутрішньоклітинних патогенів (при індукції імунної відповіді Th1 типу), або індукцію переважно гуморального імунітету, спрямованого проти позаклітинних патогенів та паразитарних організмів (при індукції імунної відповіді Th2 типу). Основними цитокінами, які регулюють конкурентну активацію цих двох типів імунної відповіді, є інтерферон-гамма та інтерлейкін-4 (Szabo S.J., et al. 2003, Murphy K. M., et al. 2000). Порушення продукції або рецепції одного з цих цитокінів зумовлювали порушення регуляції конкурентної активації Th1 та Th2 клітин та посилення імунної відповіді одного типу при одночасному пригніченні імунної відповіді другого типу. У таких випадках проявляється підвищена сприйнятливість організму до вірусних інфекцій, або до паразитарних уражень, що, у свою чергу, призводить до прискореного протікання хвороби та загибелі організму (Boehm U., et al. 1997, Murphy K. M., et al. 2000). У той же час надмірна продукція інтерлейкіну-4 супроводжується розвитком автоімунних захворювань за типом автоімунної астми, тоді як при гіперпродукції інтерферону-гамма має місце активація автоімунних процесів, пов’язаних із активацією клітинного імунітету, що призводить до пошкодження непатологічних тканин організму (Szabo S.J., et al. 2003). Відомо, що певну роль у регуляції імунної системи ссавців відіграє білок PTTG.

Pituitary tumor transforming gene (pttg, секурин) – це онкоген, який з експресується у деяких нормальних тканинах ссавців (яєчка, товстий і тонкий кишечнику, та ін.) та надекспресується майже у всіх досліджуваних лініях пухлинних клітин (Pei L., et al. 1997).
У нормальних периферичних Т-лімфоцитах людини синтезу мРНК PTTG (секурину) не виявлено, тоді як після антиген-залежної (CD3-опосередкованої) активації Т-лімфоцитів спостерігали залежну від часу індукцію синтезу мРНК цього білка (Stoika R., et al. 2002). За відсутності гену pttg (секурину), у мишей спостерігається гіперплазія тимусу та гіпоплазія селезінки. Окрім того, нокаут по гену pttg зумовлює порушення синтезу імуноглобулінів класів М та G1a (Wang et al., 2001).

Незважаючи на те, що існуючі дані опосередковано свідчать про можливість участі білка PTTG (секурину) у регуляції активації Т-лімфоцитів, регуляції диференціації та підтриманні життєдіяльності клітин імунної системи, проте молекулярні механізми реалізації такого впливу залишаються недослідженими. Для з’ясування ролі білка PTTG в активації Т-лімфоцитів, індукованій CD3/TCR-залежною стимуляцією та для пошуку білків, які можуть бути залучені до PTTG-залежної регуляції цих процесів, нами проведено дослідження, результати якого представлені у даній дисертаційній роботі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу було виконано у відділі регуляції проліферації клітин і апоптозу Інституту біології клітини НАН України у рамках теми “Механізми індукції антипроліферативної і цитотоксичної активності у нормальних і трансформованих клітин” упродовж 2003-2005 років, (номер державної реєстрації №0103U001404) та теми “Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії” упродовж 2006-2007 років, (номер державної реєстрації №0106U002599). У 2006-2007 роках роботу було підтримано грантами Західно-Українського біомедичного дослідницького центру (WUBMRC), наданими здобувачу. Окремі розділи дисертаційної роботи було виконано за підтримки фонду INTAS, у межах індивідуального гранту, присудженого дисертанту.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясувати роль нокауту гену білка PTTG у функціональній активації Т-лімфоцитів.

Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:

1. Дослідити продукцію білка PTTG та його мРНК в інтактних та активованих
Т-лімфоцитах людини та миші.

2. Встановити вплив нокауту гену pttg на бласттрансформацію Т-лімфоцитів миші.

3. Визначити вплив відсутності гену pttg на проліферацію Т-лімфоцитів миші та експресію гену c-myc у цих клітинах.

4. Дослідити роль нокауту гену pttg на залежне від трансформуючого фактора росту бета-1 пригнічення активації Т-лімфоцитів.

5. Дослідити вплив відсутності гену pttg на апоптоз Т-лімфоцитів миші.

6. Із використанням підходів протеоміки, виявити та ідентифікувати білки, експресія яких змінена в активованих Т-лімфоцитах мишей, нокаутних по гену білка PTTG, у порівнянні із активованими Т-лімфоцитами мишей дикого типу.

7. Дослідити кількісні зміни продукції окремих білків, ідентифікованих за допомогою підходів протеоміки, іншими методами, такими як ELISA чи Вестерн-блот аналіз.

Об’єкт дослідження. Функціонування внутрішньоклітинних та цитокінових регуляторних систем, відповідальних за активацію Т-лімфоцитів.

Предмет дослідження. Вплив відсутності гену pttg (секурину) на активацію
Т-лімфоцитів та на продукцію цими клітинами деяких цитокінів запалення.

Методи дослідження. Для досягнення мети та виконання завдань, поставлених у роботі, було використано такі методи: виділення ДНК, метод полімеразної ланцюгової реакції (PCR), електрофорез ДНК у гелі агарози, виділення Т-лімфоцитів за допомогою імуномагнітної селекції, активацію Т-лімфоцитів, метод двомірного електрофорезу білків у поліакриламідному гелі, ензиматичне розщеплення білків та сорбційну хроматографію пептидів, ідентифікацію білків за допомогою мас-спектрометрії MALDI-TOF, Вестерн-блот аналіз, проточну цитофлуорометрію, Нозерн-блот аналіз, метод радіоактивних ізотопів, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі було вперше показано, що нокаут гену pttg (секурину) спричиняє пригнічення бласттрансформації
Т-лімфоцитів та затримку проходження стадії S клітинного циклу активованими
Т-лімфоцитами. Вперше показано, що відсутність гену pttg в активованих Т-лімфоцитах миші зумовлює зміну експресії цими клітинами 18-ти білків, серед яких: транскрипційний фактор Mlr1, білок цинкового пальця mkr5, білок Ccn1, кальпаїн-9, пірофосфатаза, гістондеацетилаза-11, бета-ізоформа білка-транспортера фосфоінозитолу (Pitpnb білок), жовчний глікопротеїн (biliary glycoprotein), лектин, який зв’язує галактозу 1 (Lectin, galactose binding, soluble 1), гетерогенний ядерний рибонуклеопротеїн А1, два білки цитоскелету, диметиланілін монооксигеназа, інтерферон-гамма та інтерлейкін-4, а також три білкові продукти із невідомою функцією.

Вперше показано, що відсутність гену pttg спричинює посилення продукції інтерферону-гамма та пригнічення продукції інтерлейкіну-4 активованими Т-лімфоцитами миші.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені у дисертаційній роботі, дозволяють краще зрозуміти роль PTTG у регуляції функціонування клітин імунної системи ссавців. Ці результати можуть бути використані для розробки нових, більш ефективних методів модуляції імунної відповіді при порушеннях, пов’язаних із гіперактивацією чи гіпоактивацією імунної відповіді організму на патогени та власні непатогенні тканини.

Одержані результати і теоретичні узагальнення, які стосуються впливу відсутності гену pttg на активацію Т-лімфоцитів та на продукцію цими клітинами цитокінів запалення, використовуються при викладанні спецкурсу “Молекулярні механізми регуляції проліферації і диференціації клітин” на кафедрі біохімії, біологічного факультету Львівського національного університету ім. Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину і провів статистичний аналіз отриманих результатів досліджень. Частина результатів, які отримано із використанням підходів “протеоміки” було виконано дисертантом у Людвіг інституті дослідження раку (м. Уппсала, Швеція) у межах співпраці, підтриманої фондом INTAS (індивідуальний грант для молодих науковців, INTAS, № 04-83-3862). Здобувач самостійно сформулював основні висновки та підготував до друку матеріали за результатами дисертаційної роботи. Аналіз і обговорення отриманих даних проведено спільно із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблено доповіді на 6-ій Міжнародній Парнасівській конференції (м. Краків, Польща 30 травня – 2 червня 2007р.), на 9-му з’їзді Українського біохімічного товариства (м.Харків, 24-27 жовтня 2006 р., презентацію наукової роботи дисертанта відзначено першою премією). Окрім того, результати, дисертаційної роботи, були представлені на щорічних конференціях молодих науковців Інституту біології клітини НАН України (м. Львів, 2006 та 2007р.) та на засіданні Наукового Товариства імені Т. Шевченка (Львів, 28 березня 2007 р.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, з них 4 – у фахових періодичних виданнях і 2 – у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 161 сторінці комп’ютерного набору, і містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз та обговорення результатів досліджень, висновки та список цитованої літератури. Дисертаційна робота містить 34 рисунки та 7 таблиць (загалом 23 сторінки). Бібліографічний список складає 278 джерел, з них 275 латиною, розташований на 29 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проаналізовано сучасну інформацію щодо регуляції активації
Т-лімфоцитів. Наведено інформацію про будову гену pttg та білку PTTG (секурину) у ссавців. Висвітлено роль білка PTTG у регуляторних системах нормальних та пухлинних клітин.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на: 1) Т-лімфоцитах периферичної крові людини, 2) ізольованих Т-лімфоцитах мишей дикого типу та мишей із нокаутом гену pttg. Периферичні лімфоцити крові людини виділяли за допомогою реактивів “Lymphoprepтм” (“Nycomed Pharma AS”, Норвегія). Т-лімфоцити миші ізолювали за допомогою негативної селекції клітин імуномагнітним методом із використанням реактивів набору Dynal® Mouse T cell Negative Isolation Kit від компанії Dynal Biotech ASA (Осло, Норвегія). Клітини вирощували у середовищі RPMI (“Sigma”, США)у присутності 10% сироватки ембріонів великої рогатої худоби (FCS, “Sigma”, США) і 50 мкг/мл гентаміцину (“Sigma”, США).

Визначення генотипу мишей проводили методом полімеразної ланцюгової реакції. Усі дослідження проводили згідно із Хельсінським біоетичним протоколом, про що свідчить відповідне експертне рішення біоетичної комісії.

Визначення кількості живих і мертвих клітин здійснювали проточною цитофлуорометрією та шляхом зафарбування мертвих клітин 0,1% розчином трипанового синього.

Концентрацію білку у лізатах визначали за методом Бредфорда. Кількість білку PTTG у лізатах клітин визначали методом Вестерн-блот аналізу, а кількість мРНК PTTG – методом Нозер-блот аналізу. Концентрацію інтерлейкіну-4, інтерлейкіну-6 та інтерферону-гамма у кондиціонованому середовищі визначали імуноферментним методом із використанням реактивів від компанії “eBiosciences” (Сан-Дієго, США).

Вплив відсутності гену pttg на проліферацію Т-лімфоцитів досліджували за їх здатністю змінювати інтенсивність включення 3Н-тимідину (Amersham Biosciences). Вплив нокауту гену pttg на бласт-трансформацію Т-лімфоцитів визначали шляхом підрахунку кількості Т-бластів у гемоцитометричній камері.

Пошук білків із зміненою експресією в активованих Т-лімфоцитах без гену pttg у порівнянні із активованими Т-лімфоцитами дикого типу проводили із використанням методів протеоміки. Лізати активованих Т-лімфоцитів розділяли методом двомірного електрофорезу. Білки зафарбовували сріблом і 2D гелі піддавали вакуумному високотемпературному сушінню. Гелі аналізували з метою пошуку білкових плям із різною інтенсивністю забарвлення у різних групах гелів. Білкові плями ідентифікували методом мас-спектрометрії MALDI-TOF.

Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel 2003.

Результати досліджень та їх обговорення

Вміст білка PTTG та його мРНК в активованих Т-лімфоцитах людини та миші. Щоб перевірити, чи зміни у кількості мРНК білка PTTG (секурину) в активованих Т-лімфоцитах призводять до змін у кількості білка PTTG у цих клітинах, нами було проведено Вестерн-блот аналіз. Лейкоцити периферичної крові людини інкубували протягом 24, 48 та 72 год у присутності фітогемаглютиніну (5 мкг/мл), а білкові лізати цих клітин використовували для Вестерн-блот аналізу. Встановлено, що в інтактних лейкоцитах, виділених із периферичної крові людини (0 год, рис. А), відсутній білок PTTG. При культивуванні даних лейкоцитів за відсутності активуючих агентів протягом 24, 48 та 72 год не спостерігали присутності білку PTTG. При активації Т-лімфоцитів протягом 48 та 72 год, виявили індукцію синтезу білка PTTG (рис. А).

Для перевірки, чи виявлена у людини активація експресії мРНК та білка PTTG властива також Т-лімфоцитам миші, було досліджено експресію мРНК білка PTTG у спленоцитах миші. Детекцію мРНК PTTG в активованих протягом 72 год спленоцитах мишей дикого типу лінії BL6/С57 проводили методом Нозерн-блот аналізу із використанням міченого специфічного зонду кДНК. Встановлено, що у контрольних спленоцитах мРНК PTTG майже відсутня, у той час як після активації Т-лімфоцитів фітогемаглютиніном має місце зростання рівня експресії мРНК PTTG у 7-25 разів, порівняно із неактивованими клітинами (рис. 1Б)

Вплив відсутності гену pttg на активаціюТ-лімфоцитів. Для з’ясування ролі білка PTTG (секурину) в активації Т-лімфоцитів було проведено інкубацію цих клітин із різними активуючими чинниками за відсутності гену pttg (нокаут гену pttg). Встановлено, що відсутність гену pttg зумовлює статистично достовірне пригнічення бласт-трансформації ізольованих Т-лімфоцитів, індукованої різними концентраціями фітогемаглютиніну, конканаваліну А, а також лектину виділеного із Lens culinaris. Окрім того, нами було проведено активацію Т-лімфоцитів моноклональними активаційними антитілами проти Т-клітинного рецептора (TCR) та проти е-субодиниці CD3 поліпротеїнового комплексу (CD3e).

Показано, що відсутність гену pttg призводить до статистично-достовірного пригнічення бласт-трансформації Т-лімфоцитів, індукованої іммобілізованими анти-TCR або анти-CD3e антитілами поодинці та сумішшю іммобілізованих анти-TCR і анти-CD3e антитіл (рис.2). Подібні результати було отримано і при використанні лектинів в якості мітогенів для активації Т-лімфоцитів. Оскільки зв’язування використаних нами антитіл із молекулами-мішенями не залежало від рівня вуглеводної складової молекул TCR та CD3e, можна стверджувати, що пригнічення активації
Т-лімфоцитів не зумовлене змінами у структурі вуглеводної детермінанти поверхневих молекул Т-лімфоцитів.

Якщо вплив нокауту гену pttg на бласт-трансформацію Т-лімфоцитів був зумовлений зміною рівня експресії CD3e та TCR, при активації Т-лімфоцитів сумішшю двох досліджуваних антитіл цей інгібувальний ефект повинен сумуватися (адитивний ефект) і відносна різниця між кількістю активованих (бласт-трансформованих) Т-лімфоцитів із нокаутом по гену pttg та Т-лімфоцитів дикого типу повинна зростати у порівнянні з активацією цих клітин лише одним із досліджуваних видів антитіл. Проте, оскільки не було виявлено описаного вище, можливого збільшення відносної різниці (акумуляції ефекту) між активацією Т-лімфоцитів без гену pttg та Т-лімфоцитів дикого типу (рис. 2), то отримані дані опосередковано свідчать про те, що інгібувальний вплив нокауту гену pttg на активацію Т-лімфоцитів не зумовлений змінами в експресії TCR та CD3, а, швидше за все, спричинений змінами у сигнальних шляхах Т-лімфоцитів, відповідальних за їх функціональну активацію.

Вплив відсутності гену pttg на залежне від ТФРв інгібування активації Т-лімфоцитів та на апоптоз цих клітин. Для з’ясування чи вплив нокауту по гену pttg є специфічним лише для процесів активації Т-лімфоцитів, було досліджено вплив нокауту гену pttg на викликане ТФРв1 пригнічення активації Т-лімфоцитів (рис.3). ТФРв1 є цитокіном системної дії і вважається природним супресором активації Т-лімфоцитів. Встановлено, що ТФРв1 інгібує не лише активацію Т-лімфоцитів дикого типу, але й активацію Т-лімфоцитів із нокаутом по гену pttg (рис. 3). Встановлено, що при інкубації Т-лімфоцитів у присутності сорбованих анти-TCR та анти-CD3 антитіл і ТФРв1 (6 нг/мл) активація
Т-лімфоцитів дикого типу
не перевищує 4,6%, а
Т-лімфоцитів без гену pttg – 4,4%, у порівнянні із відповідно 21,2% і 15,1% активованих Т-лімфоцитів за відсутності ТФРв1. Отже, нокаут гену pttg пригнічує сигнальні шляхи, відповідальні за активацію Т-лімфоцитів і не впливає на ТФРв-залежні сигнальні шляхи, відповідальні за супресію активації Т-лімфоцитів (рис. 3).

Методом проточної цитофлуориметрії досліджено кількість апоптичних клітин у культурі активованих іммобілізованими анти-TCR та анти-CD3 антитілами спленоцитів, виділених із селезінки мишей дикого типу та мишей із нокаутом по гену pttg. Виявлено, що відсутність гену pttg не спричинює статистично достовірних змін у кількості апоптичних клітин у культурі спленоцитів, а саме, після 24 год інкубації клітин у присутності іммобілізованих антитіл.

Вплив відсутності гену pttg на проліферацію, клітинний цикл та продукцію мРНК гену c-myc Для вивчення впливу відсутності гену pttg на індуковану активацією Т-лімфоцитів проліферацію останніх, досліджено включення ними радіоактивно міченого (3Н) тимідину у контролі та після активації.

Встановлено, що при активації цих Т-лімфоцитів протягом 72 год фітогемаглютиніном, конканаваліном А чи лектином виділеним із Lens culinaris, індукується включення радіоактивно-міченого тимідину в клітини. Проте, статистично достовірної різниці між включенням радіоактивно-міченого тимідину активованими Т-лімфоцитами дикого типу та активованими Т-лімфоцитами без гену pttg, не виявлено.

Методом Нозер-блот аналізу нами досліджено вплив відсутності гену pttg на індуковану активацією експресію мРНК гену c-myc. Показано, що відсутність гену pttg спричинює зростання на 28 % кількості мРНК гена c-myc у активованих Т-лімфоцитів миші, однак ці зміни були статистично недостовірними.

Для вивчення впливу відсутності гену pttg на клітинний цикл Т-лімфоцитів під час їх інкубації протягом 72 год у присутності фітогемаглютиніну, використовували метод проточної цитофлуориметрії із зафарбовуванням ДНК клітин пропідіюйодидом (рис. 4).

Встановлено, що нокаут по гену pttg призводив до порушення клітинного циклу як у неактивованих, так і у активованих Т-лімфоцитах. Зокрема, методом проточної цитофлуорометрії показано, що за відсутності гену pttg має місце суттєве зростання кількості клітин на стадії S клітинного циклу (0,84 % Т-лімфоцитів дикого типу проти 11,07 % для Т-клітин без гену pttg). Проте, не дивлячись на більш, ніж 13-кратне зростання кількості
Т-лімофцитів на стадії S клітинного циклу за відсутності гену pttg, через велику індивідуальну варіабельність результатів визначення кількості Т-лімфоцитів на цій стадії в окремих мишей без гену pttg, ця різниця виявилася статистично недостовірною (р=0,08, рис. 4). При активації Т-лімфоцитів фітогемаглютиніном спостерігали збільшення кількості Т-лімфоцитів (як дикого типу, так і без гену pttg) на стадії S клітинного циклу за рахунок зменшення кількості клітин, що перебувають на стадіях G0/G1 та G2/M (рис. 4). Незважаючи на зумовлене активацією збільшення кількості Т-лімфоцитів, які перебувають на стадії S клітинного циклу до рівня 13,62 %, при активації фітогемаглютиніном Т-лімфоцитів без гену pttg спостерігали статистично достовірно (p <0,05) вищий рівень (28,74%) кількості клітин на стадії S клітинного циклу (рис. 4). Зростання кількості клітин на стадії S у контрольних та активованих Т-лімфоцитів без гену pttg відбувається за рахунок зменшення кількості клітин як на стадії G0/G1, так і на стадії G2/M клітинного циклу.

Визначення білків, кількість яких змінюється в активованих Т-лімфоцитах за відсутності гену pttg. Оскільки отримані нами результати опосередковано свідчать про те, що відсутність гену pttg впливає на сигнальні шляхи клітини, відповідальні за активацію
Т-лімфоцитів та клітинний цикл, проведено базований на методах протеоміки пошук білків сигнальних шляхів клітини, що можуть бути залучені до pttg-залежної регуляції активації Т-лімфоцитів. Ізольовані Т-лімфоцити активували протягом 72 год сумішшю іммобілізованих анти-CD3 та анти-TCR антитіл. Після закінчення культивування, клітини лізували, а лізати розділяли методом двомірного електрофорезу. Отримано 48 двомірних гелів високої якості із зафарбованими сріблом білками. Гелі сканували та аналізували на предмет виявлення білкових плям, інтенсивність яких статистично-достовірно (р >0,05) змінюється у різних групах гелів. Було виявлено 36 таких білкових плям, які ідентифікували методом мас-спектрометрії MALDI-TOF. Ідентифіковано 20 білкових поліпептидів, які є 18-ма різними білками (Таблиця 1).

Таблиця 1.

Список білків, інтенсивність яких була змінена більше, ніж у 2,8 рази (при порівнянні гелів різних груп), і які було ідентифіковано методом мас-спектрометрії MALDI-TOF. Порядковий номер у таблиці (колонка І) відповідає номеру білкової плями, наведеному на рисунку 5. У колонці “Перекриття” (колонка V) вказано, скільки відсотків первинної послідовності ідентифікованого білка “перекривається” з детектованими методом мас-спектрометрії пептидами. У колонках VI та VII (колонки рІ та мол. маса (kDa)) наведено теоретично обчислену ізоелектричну точку та мол. масу ідентифікованого білка.

І | ІІ | ІІІ | IV | V | VI | VII

# п/п |

Назва білку | Ідентифікаційний № первинної послідовності білка | Достовірність ідентифікації (за ProFound) |

Перекриття |

рI | Mол.

маса

(kDa)

1. | 9130022A01Rik білок | AAH61228.1 | 100 % | 10 % | 4,8 | 41,96

2. | Білок цинкового пальця mkr5 | AAA37120.1 | 95 % | 7 % | 9,9 | 72,76

3. | Печінкова флавін-вмісна монооксигеназа 3 (FMO3), Диметилаланін оксидаза 3 |

BAC34077.1 |

100 % |

13 % |

9 |

32,29

4. | Білок, подібний до гетерогенного ядерного рибонуклеопротеїну А1 (Спіраль-дестабілізуючий білок, hnRNP core protein A1, HDP) |

XP_356697.1 |

100 % |

27 % |

6,5 |

20,54

5. | Транскрипційний фактор Mlr 1 (Mblk1-related protein-1) | AAH66151.1 | 100 % | 28 % | 4,7 | 24,97

6. | Лектин, який зв’язує галактозу 1 | AAH02063.1 | 100 % | 21 % | 5,3 | 15,2

7. | Жовчний глікопротеїн | CAA47695.1 | 100 % | 18 % | 5,5 | 30,48

8. | Невідомий білковий продукт | BAB26620.1 | 99 % | 13 % | 9,2 | 38,28

9. | Ccn1 білок | AAH07177.1 | 100 % | 17 % | 7,1 | 18,89

10. | Пірофосфатаза | AAH10468.1 | 99 % | 14 % | 5,4 | 33,11

11. | Альфа субодиниця “Кемпінг”-білку (в актинових філаментах), альфа-1 м’язовий білок Z-лінії | AAC00566.1

AAH16232.1 |

100 % | 42 % | 5,3 | 32,9

12. | Pitpnb білок, бета ізоформа білку-транспортера фосфоінозитолу | AAH34676.1

AAA87593.1 | 72 % | 18 % | 6 | 31,94

13. | Calpain 9 | Q9D805 | 100 % | 9 % | 5,1 | 79,59

14. | Невідомий білковий продукт | BAC37121.1 | 100 % | 15 % | 4,5 | 27,16

15. | Гістондеацетилаза 11 | AAH16208.1 | 99 % | 15 % | 6,6 | 39,37

16. | Білок, подібний до цитоплазматичного гамма-актину | XP_134663.2 | 100 % | 15 % | 5,6 | 41,34

17. | Інтерферон-гамма | NP_032363.1 | 100 % | 50 % | 9,3 | 18,12

18. | Інтерлейкін-4 | NP_067258.1 | 100% | 31% | 8.8 | 16,2

Усі ідентифіковані білки володіли молекулярною масою від 15,2 до 79,6 кДа та ізоелектричною точкою від 4,5 до 9,9 (рис. 5). Серед ідентифікованих білків виявили 2 транскрипційні фактори (zinc finger protein mkr та Transcription factor Mlr 1 protein), 2 цитокіни (Interferon gamma та IL4), 6 білків, залучених до регуляції проліферації, диференціації, апоптозу та міграції клітин (Histone deacetylase11, HDP, Pitpnb, Calpain 9, Pyrophosphates, Capping protein alpha subunit), та 2 білки, залучені до регуляції імунної відповіді (Lectin, galactose binding, soluble 1 та biliary glycoprotein). Встановлено, що відсутність гену pttg значно пригнічує експресію білка із молекулярною масою 17 кДа та ізоелектричною точкою близько 8,5, ідентифіко-ваного як інтерлейкін-4 (NP_067258.1), при цьому зміна інтенсивності забарвлення цієї білкової плями, що була ідентифікована методом мас-спектрометрії як інтерлейкін-4, становила зниження на 372 %.

Білкову пляму, із молекулярною масою 18,5 кДа, та ізоелектричною точкою близько 9, інтенсивність забарвлення якої змінювалося на 285 % у різних групах гелів, було ідентифіковано як інтерферон гамма.

Продукція інтерлейкіну-4, інтерлейкіну-6 та інтерферону гамма Т-клітинами дикого типу та з відсутнім геном pttg

Зафарбовування білків сріблом не завжди є лінійним і залежить від структури білку, рівня його глікозилювання та інших пост-трансляційних модифікацій. Тому для підтвердження отриманих нами результатів щодо зміни експресії ідентифікованих білків необхідно провести дослідження кількості білка за допомогою альтернативних методів, таких як Вестерн-блот аналіз або імуноферментний аналіз (ELISA). Для визначення продукції інтерлейкіну-4 та інтерферону гамма активованими Т-лімфоцитами із нокаутом гену pttg у порівнянні із Т-лімфоцитами дикого типу проведено активацію ізольованих Т-лімфоцитів

шляхом культивування останніх протягом 72 год у присутності фітогемаглютиніну, або іммобілізованих анти-TCR та анти-CD3е антитіл. Концентрацію цитокінів у кондиціонованому середовищі визначали методом ELISA.

Встановлено (рис. 6), що рівень продукції інтерферону-гамма (ІФН-г) неактивованими
Т-лімфоцитами дикого типу та без гену pttg був нижчим за поріг чутливості методу (15 пг/мл). Однак при активації Т-лімфоцитів фітогемаглютиніном або активаційними антитілами, спостерігали значну індукцію продукування ІФН-г активованими
Т-лімфоцитам дикого типу та із відсутнім геном pttg. Виявлено (рис. ), що при активації,
Т-лімфоцити із нокаутом по гену pttg продукують достовірно більше ІФН-г (10245 пг/мл на 107 клітин), ніж активовані Т-лімфоцити дикого типу (6089 пг/мл на 107 клітин). ТФРв1 зумовлював зниження рівня продукування ІФН-г приблизно до одного рівня обома культурами Т-лімфоцитів, як дикого типу, так і без гену pttg (до рівня 120-240 пг/мл на 107 клітин, достовірність різниці між клітинами дикого типу та Т-лімфоцитами без гену pttg становила p > 0,05).

Дослідження впливу відсутності гену pttg на продукування інтерлейкіну-4 активованими Т-лімфоцитами показало (рис. 7), що у випадку інкубації нокаутних за геном pttg Т-лімфоцитів протягом 72 год у присутності іммобілізованих анти-TCR та анти-CD3e антитіл ці клітини продукують достовірно менше інтерлейкіну-4, у порівнянні із активованими Т-лімфоцитами дикого типу (106 пг/мл на 107клітин у порівнянні із 366 пг/мл на 107клітин, відповідно).

Дія ТФРв1, як супресора CD3/TCR-залежної активації Т-лімфо-цитів, викликала достовірне зниження рівня продукування інтерлейкіну-4 (рис. 7). Зокрема, інкубовані у присутності ТФРв1 та іммобілізованих антитіл Т-лімфоцити дикого типу продукували інтерлейкін-4 на рівні 23 пг/мл на 10 млн клітин, у той час, як ТФРв1 знижував продукування інтерлейкіну-4 культивованими у присутності іммобілізованих активаційних антитіл Т-лімфоцитами без гену pttg до 22,6 пг/мл на кожні 10 млн клітин (рис. 7). Отже, нами показано, що активовані Т-лімфоцити без гену pttg продукують достовірно більше ІФН-г, проте менше ІЛ-4. При дослідженні концентрації ІФН-г та ІЛ-4 у плазмі крові здорових мишей дикого типу та мишей із нокаутом по гену pttg, нами не виявлено достовірної різниці у концентрації цих двох цитокінів у плазмі крові досліджуваних типів мишей. Досліджуючи рівень продукції інтерлейкіну-6 (ІЛ-6), який як і ІФН-г та ІЛ-4 бере участь у регуляції конкурентної активації СD4+ лімфоцитів Th1 та Th2 типу, нами не було виявлено статистично достовірної різниці у продукуванні цього цитокіну активованими Т-лімфоцитами без гену pttg у порівнянні із активованими Т-лімфоцитами дикого типу.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вперше отримано неопосередковані дані щодо ролі білку PTTG (секурину) у регуляції активації Т-лімфоцитів та контролю імунної відповіді організму на антиген. Вперше вивчено вплив нокауту по гену pttg на активацію Т-лімфоцитів, зокрема на регуляторні шляхи цих клітин, відповідальні за їх активацію. Показано, що відсутність гену pttg призводить до порушення балансу конкурентної продукції інтерферону гамма та інтерлейкіну-4, відповідальних за активацію імунної відповіді Th1 та Th2 типу. На основі отриманих даних, сформульовано наступні висновки:

1. Нокаут по гену pttg пригнічує CD3/TCR-залежну бласттрансформацію Т-лімфоцитів.

2. Відсутність гену pttg зумовлює зростання на 28 % рівня продукції мРНК білка c-Myc активованими Т-лімфоцитами.

3. Відсутність гену pttg спричинює до затримки Т-лімфоцитів на стадії S клітинного циклу за рахунок зменшення відносної кількості клітин, які перебувають у фазах G0/G1 та G2/M клітинного циклу.

4. Відсутність гену pttg у Т-лімфоцитах не викликала статистично достовірних змін у кількості апоптичних клітин.

5. Нокаут по гену білка PTTG достовірно змінює кількість принаймні 36 білків у активованих Т-лімфоцитах. Ідентифіковано 18 білків, експресія яких була змінена в активованих Т-лімфоцитах мишей, нокаутних по гену pttg, у порівнянні із активованими
Т-лімфоцитами мишей дикого типу.

6. Активовані Т-лімфоцити мишей із нокаутом гену pttg, продукують підвищену кількість інтерферону-гамма (10245 пг/мл на 107 клітин) у порівнянні із активованими
Т-лімфоцитами мишей дикого типу (6089 пг/мл на 107 клітин).

7. Нокаут по гену pttg спричинює статистично достовірне пригнічення продукції Інтерлейкіну-4 (106 пг/мл на 107 клітин) активованими Т-лімфоцитами без гену pttg у порівнянні із Т-лімфоцитами дикого типу (366 пг/мл на 107 клітин).

8. Трансформуючий фактор росту бета-1 викликає пригнічення продукції інтерферону-гамма як активованими Т-лімфоцитами дикого типу (до рівня 240 пг/мл на 107 клітин), так і активованими Т-лімфоцитами без гену pttg (до 120 пг/мл на 107 клітин). Трансформуючий фактор росту бета-1 зумовлював також пригнічення продукції інтерлейкіну-4 активованими
Т-лімфоцитами дикого типу та активованими Т-лімфоцитами із нокаутом по гену pttg (до рівня 22,6 пг/мл на 107 клітин і 23 пг/мл на 107 клітин, відповідно).

Основні публікації за темою дисертації

1. Дефіцит гену білка секурину (PTTG) знижує рівень активації Т лімфоцитів, індукованої лектином / Філяк Є.З., Філяк О.С., Афанасьєв С.В., Стойка Р.С. // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. – 2006. – №4. – С. 51-55 (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду, проведення активації Т-лімфоцитів, проведення досліджень, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

2. Філяк Є.З., Філяк О.С., Стойка Р.С. Дослідження впливу дефіциту гену pttg на продукцію інтерлейкіну-6 активованими Т-лімфоцитами миші // Клінічна та експериментальна патологія. – 2007. – Т. VI, № 1. – С. 148 - 150. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду, проведення активації Т-лімфоцитів, проведення досліджень, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

3. Втрата гену білка секурину (PTTG) веде до пригнічення активації Т лімфоцитів / Філяк Є.З., Держко І.О., Філяк О.С., Стойка Р.С. // Медична хімія. – 2007. - № 1. – С. 101 - 104. (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду, проведення активації Т-лімфоцитів, проведення досліджень, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

4. Протеоміка активації Т лімфоцитів мишей, позбавлених гена pttg / Філяк Є.З., Філяк О.С., Сушельницький С. І., Стойка Р.С. // Доп. НАН України. – 2007. - № 5. – С. 172-179. (Дисертанту належить підготовка зразків для дослідів, проведення досліджень, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

5. Filyak Ye., Filyak O., Souchelnytskyi S. Proteomics-based study of mechanisms for TGF-beta1-induced inhibition of T-lymphocyte functions // 9-ий з’їзд Українського біохімічного товариства. – Харків. – Жовтень 24-27, 2006. – С. 189 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез, презентував роботу на конференції. Дана доповідь була відзначена першою премією.)

6. Proteomics-based search of proteins involved in PTTG-dependent regulation of
T-lymphocyte activation / Ye. Filyak, O. Filyak, S. Souchelnytskyi, R. Stoika // 6th International Parnas Conference. – Krakow, Poland. – May, 30 – June, 2 2007. – P. 43 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез, презентував роботу на конференції.)

Анотація

Філяк Є. З. Протеоміка Т-лімфоцитів миші дикого типу та за відсутності гена білка секурину. – Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія, Інститут біології клітини НАН України, м.Львів, 2007.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню впливу відсутності гену pttg на активацію Т-лімфоцитів миші та на регуляторні системи клітини, відповідальні за індукцію імунної відповіді органіму на патоген. Встановлено, що нокаут по гену pttg зумовлює зниження рівня бласт-трансформації Т-лімфоцитів миші у відповідь на активацію мітогенами та затримку цих клітин на стадії S клітинного циклу. За допомогою методів протеоміки ідентифіковано 18 білків, експресія яких достовірно змінена в активованих Т-лімфоцитів без гену pttg у порівнянні із активованими Т-лімфоцитами дикого типу. Показано, що активовані
Т-лімфоцити із нокаутом по гену pttg продукують достовірно більшу кількість інтерферону-гамма, та достовірно меншу кількість інтерлейкіну-4, що у свою чергу може призводити до порушення балансу активності імунної відповіді типів Th1 та Th2.

Ключові слова: протеоміка, активація Т-лімфоцитів, секурин, PTTG, генний нокаут, цитокін.

Аннотация

Филяк Є. З. Протеомика Т-лимфоцитов мыши дикого типа и за отсутсвия гена белка секурина. – Рукопись

Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология, Институт биологии клетки НАН Украины, г.Львив, 2007.

Диссертация посвящена исследованию влияния отсутствия гена pttg на активацию
Т-лимфоцитов мыши и регуляторные системы клетки, ответственные за индукцию иммунного ответа организма на антиген. Показно, что нокаут по гену pttg приводит к снижению уровня бласт-трансформации Т-лимфоцитов мыши в ответ на активацию и задержку этих клеток на стадии S клеточного цикла. С помощью методов протеомики идентифицировано 18 белков, экспрессия которых достоверно изменена у активированных Т-лимфоцитов без pttg в сравнении с активированными Т-лимфоцитами дикого типа. Показано, что активированые
Т-лифоциты с нокаутом по гену pttg продуцируют достоверно большее количество интерферона-гамма и достоверно меньшее количество интерлейкина-4, что, в свою очередь, может приводить к нарушению баланса иммунного ответа по типу Th1 та Th2.

Ключевые слова: протеомика, активация Т-лимфоцитов, секурин, PTTG, генный нокаут, цитокин.

Summary

Filyak Ye. Z. Proteomics of murine wild type T-lymphocytes and T-lymphocytes lacking gene coding for securing protein. – Manuscript.

Thesis for a Candidate’s degree in the field of biological sciences in specialty 03.00.11 – cytology, cell biology, histology, Institute of Cell Biology NAS of Ukraine, Lviv, 2005.

The thesis is devoted to investigation of the effect of the lack of pttg gene on activation of
T-lymphocytes and on functionality of cell signalling systems responsible for immune response induction.

It was shown that knock-out of pttg gene (pttg-KO) caused an inhibition of activation-induced blast-transformation of murine T-lymphocyte. That effect was found when phytohemaglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), lectin derived from Lens culinaris, anti T-Cell Receptor (anti-TCR) and anti-CD3e monoclonal antibodies were used for activation of T-lymphocytes. The obtained results suggest expression and glycosylation of CD3 and TCR in pttg-KO T-lymphocytes. TGFв1 inhibited activation of both pttg-KO and wild type (pttg-WT) murine T-lymphocytes to the same level. Besides, the same level of proliferation and apoptosis was shown in intact and activated pttg-KO and pttg-WT T-cells. That suggests a specific effect of pttg-KO on signaling pathways, responsible for T-cell activation, while an intact signaling responsible for proliferation, inhibition of T-cell activation and apoptosis, pttg-KO caused an interruption in intact and activated T-lymphocytes in S phase of the cell cycle.

To detect specific proteins involved in PTTG-dependent regulation of T-cell activation, proteomics-based technology was used. T-lymphocytes were activated by immobilized anti-TCR and anti-CD3e antibodies and cultured for 72 hours. Then, cells were collected, lysed and subjected to 2D electrophoresis. More than 45 high-quality gels were generated and scanned. The gels were transferred into Image Master Analysis Platinum software, normalized, protein spots were detected and analyzed for statistically significant (p<0.05) differences in their intensity (protein amount) in separate groups of gels. Selected protein spots were cut off and identified by means of MALDI-TOF mass-spectrometry. 20 protein spots were identified corresponding 18 specific proteins. Some of them belong to “regulatory” proteins, such as: a) transcriptional factors - 2, b) cytokines – 2, c) proteins, involved in regulation of proliferation and differentiation and migration – 6, d) proteins, involved in the immune response regulation – 2. The changes in production of Interferon-gamma and Interleukine-4 were validated by ELISA. It was shown that activated pttg-KO T-lymphocytes produced for 64% more Interferon-gamma (10245 pg/ml per 107cells comparing to 6089 pg/ml per 107cells) and for 71% less Interleukine-4 (106 pg/ml per 107cells comparing to 366 pg/ml per 107cells) comparing to activated pttg-WT T-lymphocytes. TGFв1 inhibited Interferon-gamma and Interleukine-4 production by activated pttg-KO and pttg-WT. Activated pttg-KO and pttg-WT T-cells in the presence of TGFв1 (6ng/ml) produced 120-240 pg/ml per