АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ

ФІЛЬЧАКОВ ФЕОДОСІЙ ВІКТОРОВИЧ

УДК: 616-006.04-097: 615.37

ІНІЦІАЦІЯ, ПОСИЛЕННЯ ТА ПЕРЕНОС ПРОТИПУХЛИННИХ ІМУННИХ РЕАКЦІЙ ПРИ ЗЛОЯКІСНИХ НОВОУТВОРЕННЯХ

(експериментальне та клініко-імунологічне дослідження)

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті онкології АМН України.

Науковий консультант: |

доктор медичних наук, професор

Гріневич Юрій Якимович,

Інститут онкології АМН України, керівник відділу клінічної імунології;

Офіційні опоненти: |

доктор медичних наук, професор

Савцова Зоя Дмитрівна,

Національний університет “Києво-Могилянська академія”, професор кафедри біології; |

доктор медичних наук

Коровін Сергій Ігорович,

Інститут онкології АМН України, головний науковий співробітник відділу пухлин опорно-рухового апарату; |

доктор медичних наук, професор

Лісяний Микола Іванович,

Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова

АМН України, керівник відділу нейроімунології. |

Провідна установа – | Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупіка МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться 16.05.2007 р. о 13 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.560.01 в Інституті онкології АМН України (03022, Київ, вул. Ломоносова 33/43).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту онкології АМН України (03022, Київ, вул. Ломоносова 33/43).

Автореферат розісланий 14.04.2007 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, |

С.О. Родзаєвський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Показники захворюваності населення на злоякісні новоутворення і смертності від них у більшості економічно розвинутих країн посідають друге після серцево-судинних захворювань місце. За даними Міжнародної агенції дослідження раку у 2000 році в світі зареєстровано більше 10,0 млн. нових випадків раку, а за прогнозом на 2020 рік очікується 16,0 млн. первинних хворих на рак (Заридзе Д.Г., 2004). На Україні у 2004 році показник захворюваності на рак сягнув 328,5, смертності – 184,0 на 100 тис. населення відповідно (Федоренко З.П. та співавт., 2005). Разом з тим, впродовж останніх 10 років результати лікування хворих на злоякісні новоутворення залишаються майже незмінними, про що свідчать показники смертності та індекс накопичення контингентів. Вдосконалення існуючих методів основного лікування онкологічних хворих, на жаль, не призводить до суттєвого покращання наслідків лікування (Мосиенко В.С., 2001; Бондарь Г.В. и др., 2004; Чисов В.И., 2004).

Останнім часом відбуваються помітні зміни у підходах до терапії при злоякісних новоутвореннях. Активно розвивається так звана цілеспрямована терапія (target therapy); визнано, що основний акцент має бути зроблений на індивідуалізації лікування з використанням комплексу протипухлинних заходів, який включав би різноманітні методи біотерапії (зокрема, імунотерапії) (Чехун В.Ф., 2006). Водночас, досягнення імунотерапії в онкологічній клініці залишаються досить скромними, а погляди різних авторів на цей метод протипухлинного лікування не співпадають. Широке застосування традиційних методів імунологічних досліджень виявило зниження кількості і функціональної активності імунокомпетентних клітин, що сприяло створенню в значній мірі хибного уявлення про розвиток імунодепресії у більшості онкологічних хворих. Результатом цього стало домінування принципів активації імунної системи різними імуностимуляторами, які здебільшого призначають без достатнього обгрунтування. Певно, з цієї причини застосування методів неспецифічної активної імунотерапії (НАІ) не дає значних результатів, а в деяких випадках може погіршувати ефективність лікування (Rosenberg S., 1997; Новиков В.И. и др., 1999; Гриневич Ю.А., 2001). Разом з тим, доведено, що дисфункція імунної системи організму при злоякісних новоутвореннях перш за все пов’язана з порушеннями в її клітинній ланці (Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я., 1986; Hadden J.W., 2003), і саме ця ланка відповідає за формування специфічних протипухлинних імунних реакцій.

Систематизація накопичених за останні роки даних по застосуванню в онкологічній клініці високотехнологічних методів генної і клітинної інженерії, а також імунотропних препаратів, що більш спрямовано посилюють протипухлинну резистентність організму, дозволили сформулювати уявлення про біологічну терапію хворих на злоякісні солідні новоутворення (Rosenberg S., 1997). Вважається, що підвищення ефективності імунотерапії при злоякісних новоутвореннях може бути досягнуто шляхом патогенетично обгрунтованого активного впливу на механізми формування специфічного протипухлинного імунного захисту організму з урахуванням особливостей пухлинного процесу на всіх етапах його розвитку; на цій основі можуть бути розроблені нові підходи до імунотерапії цієї категорії хворих (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005). Визначено, що однією з важливих задач є створення умов для індукції специфічної імунної відповіді організму на пухлинний ріст (Гриневич Ю.А., и др., 1991; Хансон К.П. и др., 1996; Rosenberg S., 1999). Перспективні можливості в цьому напрямку пов’язують передусім з використанням методів специфічної імунотерапії, які грунтуються на двох основних підходах: створенні протипухлинних вакцин (Моисеенко В.М. и др., 1999; Потебня Г.П. та співав., 2001; Rains N. et al., 2001) і переносі протипухлинного імунітету за допомогою активованих і розмножених в системі in vitro клітин-ефекторів (КЕ) – так звана адоптивна імунотерапія (АІТ) (Rosenberg S. et al., 1999). В індукції і реалізації специфічного протипухлинного імунітету особливе місце займають біологічно активні фактори тимуса та цитокіни (Гриневич Ю.А. и др., 1989; Возианов А.Ф. и др., 1998; Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2000; Kershaw M.H., Hayakawa Y., 2004).

Основною перевагою АІТ є можливість створення оптимальних контрольованих умов індукції специфічної протипухлинної активності in vitro і отримання достатньої кількості КЕ. В теперішний час такий підхід активно застосовується в деяких клініках (зокрема, в Японії) (Goto S. et al., 2002). Попередні результати вказують на його перспективність, але проблема використання АІТ при злоякісних новоутвореннях ще далека від остаточного вирішення (Киселевский М.В., 2003). Зокрема, потребує експериментального і клінічного дослідження низка питань пов’язаних як з оптимізацією технології одержання in vitro КЕ з урахуванням клінічного статусу пацієнта, так і з розробкою клінічних схем проведення АІТ, які включали б спрямовану корекцію імунологічних зрушень в організмі хворого для створення умов ефективної реалізації протипухлинного потенціалу генерованих in vitro КЕ.

Встановлено, що адоптивний перенос протипухлинного імунітету в ряді випадків вдається відтворити за допомогою субклітинних фракцій, виділених з лімфоцитів, які сенсибілізовані до антигенів пухлини (Pizza G. et al., 1993). Цей феномен може бути обумовлений фактором переносу (ФП) (Lawrence H.S., Borkowsky W., 1996). Вважається, що джерелом ФП є Т-лімфоцити, проте не виключено, що його можуть продукувати всі чи, принаймні, більшість імунокомпетентних клітин. Спроби встановити, які ж саме клітини продукують цей ендогенний фактор, призвели до вивчення діалізованих екстрактів з різних імунокомпетентних клітин, які об’єднують під назвою діалізовані екстракти лейкоцитів (ДЕЛ). З’ясувалося, що ДЕЛ мають властивості, притаманні ФП. Стало відомо, що до складу ФП входять невеликі поліпептиди з молекулярною масою (3,5 – 12,0 кД), які здатні афінно зв’язуватись з молекулами антигену (Kirkpatrick C.H., 1993; 2000; Dwyer J.M., 1996). Продукція клітинами ФП рестриктована головним комплексом гістосумісності (ГКГ), але перенос клітинно-опосередкованої імунної відповіді за допомогою ФП генетично не обмежений (Kirkpatrick C.H., 1993; 2000). Переважна більшість авторів, які вивчали ефективність ФП в імунотерапії онкологічних хворих, застосовували препарати, отримані з лейкоцитарної маси донорів (Fujisawa T., 1985; Kirsh M.M. et al., 1984; Pilotti V. et al., 1996). Ці препарати не мали пухлиноспецифічної активності, але були здатні підвищувати деякі показники клітинної ланки імунної системи онкологічних хворих (Pizza G. et al., 1993). Отримання пухлиноспецифічного ФП є досі невирішеною задачею. В науковій літературі практично відсутні відомості щодо отримання, стандартизації та застосування пухлиноспецифічного ФП.

Таким чином, визначення та використання протипухлинного потенціалу імунної системи самого онкологічного хворого на основі цілеспрямованої корекції зрушень в її окремих ланках та активного формування специфічної імунної відповіді на антигени пухлини за допомогою методів АІТ, які засновані на переносі генерованих в системі in vitro протипухлинних КЕ або їх субклітинних фракцій, є актуальною проблемою, вирішення якої може бути одним з шляхів подальшого підвищення ефективності лікування хворих на злоякісні новоутворення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках 6 планових НДР відділу клінічної імунології Інституту онкології АМН України: “Вивчення механізмів коригуючої дії світлового випромінювання на стан імунітету при пухлинному рості та розробка на цій основі нових методів фотоімунотерапії організму для підвищення ефективності комплексної терапії онкологічних хворих” (№ державної реєстрації – 01910041950); “Розробити метод адоптивної імунотерапії, що покращує результати хірургічного лікування хворих на рак легені та злоякісні пухлини вилочкової залози” (№ державної реєстрації – 0194Н018648); “Розробка та вдосконалення нео- та ад’ювантних методів лікування хворих на злоякісні новоутворення органів черевної порожнини та тазу” (№ державної реєстрації – 0100U002254); “Ендогенні імуномодулятори, що індуковані in vivo із спрямованим механізмом дії” (№ державної реєстрації – 01930008792); “Розробити оптимальні методи лікування літніх людей хворих на злоякісні новоутворення шляхом використання нових способів комбінованого і комплексного впливу на пухлинний процес” (№ державної реєстрації – 0199U002896); “Розробка технології одержання пухлиноіндукованих трансферфакторних білків та експериментальне обгрунтування їх застосування для формування протипухлинної резистентності організму” (№ державної реєстрації – 0103U003013).

Мета дослідження: розробити методи біотерапії для покращання результатів лікування хворих на злоякісні новоутворення на основі патогенетично обгрунтованих підходів до підвищення протипухлинного захисту організму шляхом індукції реакцій клітинно-опосередкованого імунітету.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Об’єкт дослідження: експериментальні тварини з пухлинами, хворі на рак легені, стравоходу, шлунка.

Предмет дослідження: клітини та фактори протипухлинного імунного захисту організму; методи імунотерапії.

Методи дослідження: імунологічні – для вивчення імунних показників у хворих на злоякісні новоутворення або у експериментальних тварин; біотехнологічні – для розробки технології та апаратурного оснащення довготривалого культивування лімфоцитів людини; морфологічні – для вивчення змін в органах імуногенезу при внутрішньоорганній трансплантації пухлин експериментальним тваринам; фізико-хімічні – для виділення та вивчення властивостей низькомолекулярних екстрактів лімфоцитів (НЕЛ); біофізичні – для вивчення електрооптичних характеристик лімфоїдних клітин; клінічні спостереження – для оцінки безпосередньої переносимості та ефекту лікування, а також вивчення віддалених результатів; статистичні – для обробки та аналізу результатів досліджень з метою визначення їх вірогідності.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше на моделях прищеплення пухлин в тканину селезінки і печінки з’ясовані зрушення в імунній системі, які супроводжують внутрішньоорганний ріст пухлин. Встановлено, що інвазія пухлини в лімфоїдну тканину відіграє визначальну роль у формуванні імунореактивності на антигени пухлини. Ці дані розширили уяву про розвиток протипухлинної імунної відповіді організму при безпосередньому контакті пухлиних і лімфоїдних клітин, що є важливою передумовою для розробки методів біотерапії хворих з метастазами в регіонарних ЛВ та пояснює позитивні результати біотерапії у таких хворих.

Встановлено, що екзогенні ІФН індукують вироблення Т-лімфоцитами ендогенних факторів, які впливають на формування та вираженість протипухлинної імунної відповіді організму (патент UA № 25354А опубл. 30.10.1998; патент UA № 48555А опубл. 15.08.2002). Ці, вперше отримані дані, дозволяють глибше зрозуміти механізми ад’ювантної протипухлинної дії ІФН та обгрунтувати доцільність їх використання в імунотерапії хворих на злоякісні новоутворення у комбінації з тимічними препаратами.

Розроблено технологію підвищення біологічної активності тимічних препаратів за допомогою механохімічної модифікації (патент РФ № 2072867 опубл. 10.02.97.) для корекції ендокринної функції тимуса та імунореактивності організму.

Обґрунтовано оптимальні схеми використання тимічних препаратів в ад’ювантному режимі при лікуванні хворих на рак стравоходу, рак шлунка з поширенням на стравохід та рак легені. Встановлено, що тривале введення тимостимуліну покращує віддалені результати комбінованого лікування хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід, але погіршує результати лікування хворих на рак стравоходу. Застосування тимічних препаратів у хворих цієї категорії показано лише на етапах комбінованого лікування в якості імунокоригуючої терапії для нівелювання проявів вторинного імунодефіциту та з метою профілактики післяопераційних гнійно-септичних ускладнень. Застосування тактивіна у сполученні з препаратами, що пригнічують супресорну функцію імунокомпетентних клітин, у хворих на рак легені вірогідно збільшує 5-річну виживаність хворих без метастазів в регіонарних ЛВ.

Розроблено технологію генерації в контрольованих умовах in vitro АЛК з регіонарних ЛВ хворих на злоякісні новоутворення (патент UA № 18627 опубл. 15.11.2006) для застосування в АІТ.

Розроблено оригінальну методику біотерапії на основі комбінованого застосування рекомбінантного -ІФН, тимічних препаратів та адоптивного переносу автологічних АЛК. Вперше встановлено, що проведення АІТ за такою методикою суттєво збільшує медіану виживаності радикально оперованих хворих на рак легені ІІІА стадії.

На основі експериментальної розробки технології одержання пухлиноспецифічного ФП (патент UA № 16938 опубл. 15.09.2006) та визначення його протипухлинної дії на моделях експериментальних пухлин обгрунтована доцільність використання цього напрямку біотерапії для підвищення ефективності лікування хворих на злоякісні новоутворення (заявка № 2005 08976 від 27.09.2005).

Практичне значення отриманих результатів.

Розроблені моделі внутрішньоорганного росту експериментальних пухлин, які можуть бути використані в дослідженнях, спрямованих на розробку та вдосконалення методів біотерапії за наявності метастазів в реґіонарних ЛВ та/або в печінці.

Визначені методичні підходи до сумісного застосування -ІФН та тимічних препаратів при лікуванні хворих на злоякісні новоутворення; з метою імунокорекції обгрунтовано введення препаратів рекомбінантного 2b-ІФН (в дозі 1х106 з інтервалом 48-72 год) на тлі замісної терапії тимічними препаратами, що забезпечує найбільш ефективне формування протипухлинної резистентності організму.

Запропоновано схеми імунотерапії, впровадження яких при лікуванні хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід та рак легені дозволяє покращити його результати. Зокрема, імунотерапія з тривалим використанням тимічних препаратів показана при проведенні комбінованого лікування хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід і не показана хворим на рак стравоходу при такому ж виді лікування. У хворих на рак легені тимічні препарат доцільно застосовувати у сполученні з препаратами, що нівелюють супресорну функцію імунокомпетентних клітин.

Застосування розробленої методики АІТ з введенням генерованих in vitro цитотоксичних лімфоцитів більше, ніж у 2 рази збільшує медіану виживаності радикально оперованих хворих на рак легені ІІІА стадії та майже у 2 рази при N1-2M0. Виходячи з цього Вчена рада Інституту онкології АМН України рекомендувала (протокол № 13 від 24 червня 2004 р.) її для впровадження в якості методу біотерапії хворих на злоякісні новоутворення.

Визначені методичні підходи та розроблена технологія одержання пухлиноспецифічного ФП, які можуть бути використані в біотехнології отримання фармакологічно активних препаратів з імуномодулювальною дією для біотерапії хворих на злоякісні новоутворення.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота являє собою реалізацію творчих ідей автора за участю наукового колективу відділу клінічної імунології Інституту онкології АМН України. Автором розроблені основні напрямки та методологія роботи, здійснена її реалізація в експериментальних і клініко-імунологічних дослідженнях; розроблено технологію генерації in vitro АЛК з реґіонарних ЛВ хворих на злоякісні новоутворення, технологію отримання пухлиноспецифічного ФП з лімфоцитів селезінки за умов росту модельної пухлини в цьому органі; проведено імунологічні дослідження в експерименті та клініці.

Здобувачем особисто проведений аналіз первинного матеріалу, статистична його обробка, особисто проведений аналіз і узагальнення результатів дослідження, сформульовані висновки та підготовлено ілюстративний матеріал.

Морфологічні дослідження патоморфозу пухлини та органів імуногенезу в динаміці внутрішньоорганного росту карциноми Герена (КГ) та в умовах дії ФП, проведені у співавторстві з д.мед.н. Л.І. Бобро; з відділом медичної фізики та біоінженерії ІО АМНУ (керівник – д.б.н., проф. В.Е. Орел) розроблено технологію підвищення біологічної активності тимічних препаратів за допомогою механохімічної модифікації; з відділом торакальної онкології (керівник – член-кор. НАН та АМНУ, проф. В.Л. Ганул) розроблені схеми застосування методик ад’ювантної імунотерапії з використанням тимічних препаратів та -ІФН в комбінованому лікуванні хворих на рак стравоходу, рак шлунка з поширенням на стравохід, рак легені та оригінальну методику біотерапії на основі комбінованого застосування -ІФН, тимічних препаратів та адоптивного переносу автологічних АЛК при хірургічному лікуванні хворих на рак легені; з відділом білкової інженерії ІМБіГ НАНУ (керівник – д.б.н., проф. О.І. Корнелюк) досліджені окремі фізико-хімічні властивості НЕЛ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати дисертації доповідались та обговорювались на II (Київ, 2000), III (Мінськ, 2004) та IV (Баку, 2006) з’їздах онкологів та радіологів СНД; ХІ (Судак, 2006) з’їзді онкологів України; науково-практичних конференціях: “Хіміотерапія в комплексному лікуванні онкологічних хворих” (Чернівці, 1996), “Імунотерапія при лікуванні злоякісних новоутворень” (Київ, 1998), “Лікування онкологічних хворих похилого віку” (Київ, 2002), “Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2003); 18th UICC International Cancer Congress (Oslo, Norway, 2002); засіданні Київського міського та обласного наукового товариства онкологів (Київ, 2005).

Публікації. Основний зміст дисертації викладений у 45 публікаціях, у тому числі в 24 статтях у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 15 – у матеріалах вітчизняних та міжнародних конгресів, з’їздів та конференцій. Отримано один патент Російської Федерації та п’ять патентів України.

Обсяг і структура дисертації.

Дисертаційна робота обсягом 319 сторінок написана українською мовою, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел, до якого входять 420 найменувань, з них 90 – українською і російською мовами, 330 – іноземними мовами. Робота ілюстрована 25 таблицями і 87 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Робота виконана на експериментальних тваринах і клінічному матеріалі з використанням імунологічних, клінічних, морфологічних, біотехнологічних, біофізичних, фізико-хімічних і статистичних методів.

В експериментах використовували мишей ліній СВА (430 шт.), BALB/c (350 шт.), C57Bl/6 (680 шт.), масою (18-20) г, отриманих з розплідника “Столбовая” (Росія) та з віварію ІЕПОР НАНУ; неінбредних мишей (250 шт.) і щурів-самців (400 шт.), масою (110+10) г стадного розведення віварію ІО АМНУ. Дослідження проведено на стандартних моделях пухлинного росту: карцинома легені Льюїс (3LL), меланома В16 і карцинома Герена (КГ). Всі пухлинні штами одержані з лабораторії експериментальних клітинних систем ІЕПОР НАНУ, де вони підтримувались згідно загальноприйнятих методик. В окремому дослідженні, в якості експериментальної моделі пухлинного росту була використана внутрішньоорганна трансплантація КГ в паренхіму селезінки і печінки щурів (Бобро Л.І. та співавт., 1997; 1998). Перебіг росту модельних пухлин характеризували за стандартними показниками (Турусов В.С., Парфенов Ю.Д., 1986). Визначали частоту прищеплення пухлин, латентний період, середню тривалість життя (СТЖ) тварин, розміри (об’єм) первинної пухлини та кількість і розміри метастазів, індекс росту (ІР) (Балицкий К.П., Шмалько Ю.П., 1987; Стуков А.Н. и др., 2001).

Імунологічне обстеження проведено у 915 хворих на злоякісні новоутворення: рак стравоходу – 381, рак легені – 173, рак шлунка з поширенням на стравохід – 316, рак молочної залози – 45, а також у 75 практично здорових людей. В роботі використано операційний матеріал 45 хворих на рак легені, 14 хворих на рак стравоходу, 36 хворих на рак молочної залози.

Препарати природного мишачого - і -ІФН одержували загальноприйнятим методом (Спивак Н.Я. и др., 1982). В деяких дослідах використовували рекомбінантний мишачий -ІФН (“Amgen Biological”, США) та препарати природних - і -ІФН свиней виробництва ІМВ НАНУ.

Пізню тимектомію (ТЕ) у мишей проводили під гексеналовим наркозом з урахуванням рекомендацій М.Haimov і співавт.(1971).

Низькомолекулярні екстракти лімфоцитів (НЕЛ) одержували з тимуса і селезінки експериментальних тварин в такий спосіб: клітини виділяли шляхом механічної дезинтеграції органа і лізису еритроцитів 0,83 % розчином NH4Cl. В якості середовища використовували ЗФР. Після дворазового відмивання (центрифугуванням при 200 g, 10 хв) осад ресуспензували в ЗФР (108 кл/мл). Отримані від кожної тварини клітини поєднували в пул і заморожували при минус 20 оС. Для руйнування клітин робили п'ятиразове заморожування-відтаювання (мінус 20 оС/37 оС). Деполімеризацію всієї позаклітинної ДНК здійснювали панкреатичною ДНК-азою (1 мг/мл) при 37 оС протягом 30 хв у присутності іонів Mg. Потім усі зразки центрифугували (5000 g 20 хв) і ультрафільтрували крізь мембрану Centriflo CF-25 (“Amiсon”, США). Після ультрафільтрації в кожному препараті НЕЛ визначали білок за методом Бредфорда для їхньої стандартизації ( з розрахунку: 1 мкг/108 клітин у 0,3 мл розчинника). НЕЛ селезінки мишей, індуковані ІФН, одержували на 3-ю добу після введення природного гомологічного б-ІФН у дозі 1000 Од / мишу. Тварини контрольної групи в ті ж терміни отримували "псевдо"-ІФН. НЕЛ селезінки свиней одержували на 3-ю добу після введення препаратів гомологічного природного  - і  -ІФН (в дозі: 12000 Од -ІФН, 2000 Од – -ІФН). Виділення клітин, що містили ядра, їх руйнування та деполімеризацію позаклітинної ДНК здійснювали як описано вище. Надосади центрифугували на центрифузі J2-21 (ротор IJ-14, 20000 g 30 хв) і ультрафільтрували у системі тангенціального потоку “Minitan” (“Millipor”, США) через 4 пакети мембран 30 кД. До і після ультрафільтрації в кожній з фракцій визначали білок за методом Бредфорда.

Культивування лімфоцитів людини у вібраційному біореакторі проводили при співвідношенні робочого об’єму до об’єму реактора 7:10; температурі (370,05) оС з поверхневою аерацією культуральної рідини (0,200,05) л/лхв і частоті перемішування 1,5 Гц. Культивування в мембранному біореакторі проводили при співвідношені культурального об’єму до об’єму поживного середовища 1:5. Резервуар поживного середовища містив основне середовище, культуральна ємність – основне середовище з додаванням 10 % автологічної сироватки. Температура, аерація і частота коливань аналогічні вищевикладеному. Статичне культивування проводили у флаконах в об’ємі 20 см3. Використано культуральне середовище RPMI-1640 (“Serva”, Німеччина) з додаванням 2 мМ L-глютаміну, 10 % автологічної сироватки або плазми крові донорів групи АВ (інактивована, тестована на контамінацію вірусами гепатиту і ВІЛ), 40 мкг/мл гентаміцину.

АЛК отримували in vitro на основі стимуляції лімфоцитів живими автологічними пухлинними клітинами в присутності низьких концентрацій рекомбінантного ІЛ-2. У якості джерела лімфоцитів були використані регіонарні ЛВ. Пухлинні клітини обробляли мітоміцином С (“Serva”, Німеччина) у кінцевій концентрації 25 мкг/мл протягом 30 хв при 37 оС. Потім клітини тричі відмивали охолодженим середовищем RPMI-1640 (400 g 10 хв). Спільне культивування пухлинних клітин і лімфоцитів ЛВ проводили у співвідношенні 1:30 у вібраційному біореакторі при співвідношенні робочого об’єму до об’єму реактора 7:10 при температурі 37 oC з поверхневою аерацією культуральної рідини 0,20 л/хв і частоті віброперемішування 1,5 Гц. У роботі використовували препарат рекомбінантного ІЛ-2 (“Биоген”, Латвія) у концентрації 100 Од/мл, який вносили на 2- і 5-у добу культивування суспензії клітин.

Для отримання пухлиноспецифічного ФП була застосована модель внутрішньоорганного росту КГ в селезінці нелінійних щурів. Зразки НЕЛ отримували з пулу клітин неураженої пухлиною частини селезінки (від 5 тварин) в різні строки росту КГ: НЕЛ-7 (на 7-у добу), НЕЛ-14 (на 14-у добу) і НЕЛ-25 (на 25-у добу). Зразок неспецифічного НЕЛ (НЕЛ-Н) отримували в такий же спосіб з пулу лімфоцитів селезінки 5 інтактних щурів. Подальше виділення НЕЛ проводили як описано вище.

Мононуклеари периферичної крові та поліморфноядерні лейкоцити виділяли на двоступінчастому градієнті щільності фікол-верографіна (d=1,077 і 1,12 г/см3 відповідно). Клітини лімфоїдних органів (тимуса, селезінки, ЛВ) одержували шляхом механічної дезинтеграції тканини. Від домішки еритроцитів звільнялися за допомогою їх лізису 0,83 % розчином NH4Cl за звичайним методом. Макрофаги перитонеального ексудату (МФПЕ) отримували згідно методу (Фрейдлин И.С., 1984). Поділ тимоцитів за ступенем їхньої зрілості проводили за допомогою аглютиніну арахісу (PNA) (Reisner Y. et al., 1976). Т- і В-популяції лімфоцитів селезінки розділяли на найлоновій ваті (“Fenwal. Lab”, США), як описано (Лефковитс И., Пернис Б., 1981).

Тест відновлення нітросинього тетразолія (НСТ-тест) проводили у трьох модифікаціях в залежності від завдань експерименту: спектрофотометричним методом (“СФ-26”, =492 нм) (Грачева М.П., 1984), виражаючи результати в одиницях оптичної густини (од. опт. г.) на 106 клітин; мікроскопічним методом (Нагоев Б.С., 1983) у спонтанному і стимульованому (ЛПС Е. сoli, кінцева концентрація 1,0 мкг/мл) варіантах з визначенням функціонального резерву (ФР) клітин як різниці між цими показниками; калориметричним методом (Muller F. et al., 1989) у спонтанному і стимульованому (форболовий ефір 4-форбол-12-мірістат-13-ацетат (ФМА), кінцева концентрація 10 нг/мл) варіантах з визначенням індексу стимуляції (ІС, умов. од.). Фагоцитарну активність нейтрофілів і моноцитів вивчали, використовуючи тест-культуру музейного штаму Staph. aureus 209 і кишкової палички М-17 (Дуглас С.Д., Куи П.Г., 1983). Хемілюмінесцентну відповідь макрофагів в процесі фагоцитозу вивчали за методом (Белоцкий С.М. и др., 1986). Електрофоретичну рухомість (ЕФР) лімфоїдних клітин визначали за допомогою автоматичного мікроскопа “Пармоквант-2” (Німеччина).

Для оцінки клітинно-опосередкованої імунної відповіді в процесі внутрішньоорганного росту пухлини в селезінці і печінці щурів використовували реакцію пригнічення адгезії макрофагів (ПАМ) у присутності клітин КГ (Хаитов Р.М. и др., 1995). Проліферативну активність лімфоцитів визначали на основі МТТ-тесту (Nikc M. et al., 1990). Реакцію гальмування міграції лейкоцитів (РГМЛ) проводили капілярним способом (Фримель Г., 1985). Цитотоксичність лімфоцитів і макрофагів оцінювали за допомогою класичної радіометричної методики (за виходом 51Cr з клітин-мішеней) з визначенням цитотоксичного індексу (ЦІ, %). В деяких експериментах визначення цитотоксичності лімфоцитів проводили мікроскопічним методом, що був розроблений нами (Фильчаков Ф.В. и др., 1998).

Рівень тимічного сироваткового фактора (ТСФ) та тимічну сироваткову активність (ТСА) крові (ультрафільтрованій через мембрану Centriflo CF-50 “Amicon”, США) визначали як описано (Bach J.-F., Dardenne M., 1973). Здатність лімфоцитів секретувати речовини з тимозиноподібною активністю (РТПА) та їх рівень у екстрактах лімфоцитів оцінювали у тому ж тесті. Активність інгібітора ТСФ в крові та екстрактах лімфоцитів визначали згідно методу (Терновой К.С. и др., 1988).

Для вивчення патоморфозу пухлин та органів імуногенезу шматочки тканин фіксували в 10 % нейтральному формаліні з подальшою обробкою матеріалу за загальноприйнятою методикою для гістологічних досліджень. Зрізи забарвлювали гематоксиліном-еозином; мета- та ортохроматичні тканинні базофіли виявляли після забарвлення азур-ІІ-еозином.

Фізико-хімічні властивості НЕЛ вивчали за допомогою спектроскопії з використанням поверхневого плазмонного резонансу (ППР) (Chegel V. et al., 2000). Склад компонентів НЕЛ досліджували методом високоефективної рідинної хроматографії із застосуванням хроматографа високого тиску (“Personal Gold System”, США) на колонці Bio-Sil Sec250 (7,8 х 30,0) см (Японія).

Лікування із застосуванням НАІ було проведено 48 хворим на рак стравоходу і 20 хворим на рак шлунка з поширенням на стравохід. Для порівняльної оцінки віддалених результатів лікування були сформовані контрольні групи, до яких були включені 333 хворих на плоскоклітинний рак стравоходу і 296 хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід, яким у відділенні торакальної онкології в різні роки було проведено тільки комбіноване лікування (передопераційне опромінення і операція). Розподіл хворих за стадіями TNM у основних і контрольних групах був практично однаковим (p>0,05). НАІ із включенням тимічного препарату першого покоління – тимостимуліну в схему комбінованого лікування хворих на рак стравоходу і на рак шлунка з поширенням на стравохід проводили в два етапи: перший охоплював період передопераційної променевої терапії, другий – поширювався на перший рік після операції. У період проведення променевої терапії тимостимулін вводили щодня в дозі 3 мг внутрішньом’язово, всього 6 введень. Після виконання радикальної операції препарат вводили в тій же дозі двічі на тиждень, курсами по 3 тижні. Протягом першого року курси повторювали кожні 3 міс.

Комбіноване лікування хворих на рак легені з використанням ад’ювантної (післяопераційної) імунотерапії проводили згідно трьох протоколів: 1. НАІ із застосуванням тимічних препаратів (59 хворих); 2. ІФН-терапія з використанням вітчизняного рекомбінантного б2b-ІФН (лаферону) (35 хворих) і 3. АІТ (24 хворих). Статистичний аналіз основних показників, що впливають на прогноз і виживаність (вік, стадія, гістологічна форма та обсяг оперативного втручання), показав, що порівнювані групи хворих співставні.

НАІ починали на 2-у добу після радикальної операції на легенях. Призначали циметидин по 0,2 мг (по 1 табл 3 рази на день; 0,6 мг на добу), індометацин 0,025 мг (по 2 табл 3 рази на день; 0,15 мг на добу) протягом 4 діб. Сумарна доза циметидина – 2,4 мг, індометацина – 0,6 мг. З п'ятого дня після призначення індометацина і циметидина хворі одержували тактивін (0,1 % розчин по 1,0 мл внутрішньом’язово) 1 раз на добу протягом 10 днів (сумарно 10,0 мл). Аевіт призначали по 1,0 мл внутрішньом’язово раз на день протягом усього періоду імунотерапії (сумарно – 14,0 мл). ІФН-терапію починали на 4-у добу після операції. Лаферон призначали по 1-2 х106 МО внутрішньом’язово щодня протягом 10 днів (сумарна доза 10-20 х106 МО). Наступні курси ІФН-терапії проводили кожні 3 міс протягом 10 днів по 2 х106 МО лаферону щодня.

Протокол проведення АІТ включав чотири етапи: 1 — ініціація активності КЕ in vivo; 2 — оперативне лікування; 3 — імунокорекція; 4 — перенос генерованих в системі in vitro АЛК. АІТ починали з індукторної фази, що заснована на ініціації активності КЕ імунної системи ендогенними факторами, продукованими Т-лімфоцитами після введення -ІФН. Лаферон вводили в дозі 1106 МО внутрішньом’язово за 48 год до операції (1-й етап). Після оперативного втручання (2-й етап) з метою імунокорекції хворим вводили лаферон у дозі 1106 МО внутрішньом’язово з інтервалом 48 год (сумарна доза 4-5 106 МО) на тлі щоденного введення тактивіну по 1,0 мл внутрішньом’язово (сумарна доза 10,0 мл) (3-й етап). На 9-11-у добу після операції внутрішньовенно крапельно вводили генеровані у системі in vitro автологічні АЛК із протипухлинною цитотоксичною активністю (4-й етап). Кількість АЛК, що отримували хворі всередньому складала 1,74108 і залежала від маси тіла пацієнта.

Оцінку ефективності імунотерапії проводили на основі обліку безпосередніх і віддалених результатів (частота післяопераційних гнійно-септичних ускладнень, 5-річна виживаність) лікування хворих і динаміки змін показників імунної системи. Імунологічні дослідження, які включали визначення кількості основних популяцій лімфоцитів периферичної крові (ЛПК), рівень ТСФ, вміст сироваткових імуноглобулінів (Ig) класів M, G, A, концентрацію циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), з використанням стандартних методів (Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я., 1986) проводили до лікування, після операції, на 3-4-у добу після імунотерапії та через 3, 6, 12 міс (при тривалому застосуванні тимостимуліну) .

Статистичну обробку даних проводили в MS EXCELL 7.0, використовуючи функції описової статистики та t–тест з різними дисперсіями для визначення вірогідності випадкових розбіжностей (p).

Результати досліджень та їх обговорення.

Розвиток клітинно-опосередкованої імунної відповіді на пухлинний ріст в експерименті. Дослідження імунореактивності в умовах внутрішньоорганного росту КГ в селезінці і печінці щурів дозволило визначити закономірності її формування в залежності від безпосередньої взаємодії пухлинних клітин та лімфоїдної тканини. Морфологічними дослідженнями встановлено, що ріст КГ в тканині селезінки призводить до взаємного рекрутування клітинного складу як в пухлині (проліферація), так і в селезінці (бласттрансформація). Первісно індукована пухлиною бласттрансформація клітин селезінки (особливо чутливі клітини в реактивних центрах її первинних лімфоїдних фолікулів) в подальшому призводить до набуття лімфобластами здатності підтримувати проліферацію пухлинних клітин, що може бути обумовлено продукцією відповідних цитокінів в процесі імунної відповіді. Особливістю росту пухлини в паренхімі селезінки є активна реакція фібропродуктивних клітин на межі двох тканин. Проте, реакція фібробластів не завершується формуванням відмежовуючої фіброзної капсули та ангіофіброзом. Навпаки, ця реакція супроводжується активаці-єю клітин з макрофагальною функцією (нейтрофілів, ендотеліоцитів) та розповсюдженням їх в напрямку оточуючої тканини селезінки з руйнуванням цементуючого міжклітинного матріксу та дезорганізацією клі-тин, які складають структуру органа. Аналіз активності реакції гіперчутливості уповільненого типу (ГУТ), проведений за даними ПАМ-тесту, показав, що в процесі росту КГ в селезінці щурів більш, ніж у 60 % випадків формується клітинно-опосередкована відповідь на її антигени. Динаміка формування імунної реакції має двофазовий характер: наявність ГУТ реєструється у 50 % тварин на етапі приживлення трансплантата (7–10-а доба); з початком активного росту (14–18-а доба) у всіх тварин формується ареактивність; після формування розвиненої пухлини (з 22-ї доби) прояви сенсибілізації лімфоцитів відновлюються, досягаючи піка на 25-у добу більш, ніж у 60 % випадків.

Відповідно до результатів морфологічних досліджень, зміни в печінці при інокуляції в неї КГ обумовлені не стільки пухлинними клітинами, скільки контактуючими з ними рекрутованими реактивними клітинами. Особливо виражена деструктивно-літична функція лімфоцитів у взаємодії з купферовськими клітинами, що призводить до порушення печінкових балок, дезорганізації комплексів гепатоцитів з їх наступною дисоціацією. Незавершений характер продуктивної фази запалення на тлі виразної лімфоїдної інфільтрації паренхіми пухлини свідчить про неповноцінний розвиток місцевої імунної відповіді на ріст КГ у паренхімі печінки. При цьому, реакція органів імуногенезу (тимуса, селезінки, мезентеріальних ЛВ) не носить системний характер, а зміни в них розвиваються поступово, в міру прогресування пухлинного процесу. Крім того, ріст КГ в печінці щурів не стримує процес дозрівання бластних клітин в лімфоїдних органах, як це має місце при її трансплантації в селезінку. На відміну від моделі росту пухлини в селезінці, у щурів з трансплантованою в печінку КГ сенсибілізація до її антигенів реєструється у 50 % тварин тільки на стадії приживлення трансплантата (7-а доба). В подальші строки розвивається стійка ареактивність лімфоцитів до антигенів пухлини, що пов’язано з порушенням функціональної активності і лімфоцитів і макрофагів.

Отримані дані дали можливість стверджувати, що імунна відповідь на антигени пухлини має різні механізми реалізації в залежності від органа-реципієнта, ураженого пухлинним процесом. Ріст пухлини в печінці асоціюється з розвитком стійкої анергії Т-лімфоцитів, і, навпаки, ініціація клітинно-опосередкованої імунної відповіді на стадії генералізації пухлинного процесу характерна для її росту в селезінці. Отже, інвазія пухлини в лімфоїдну тканину асоціюється з подоланням анергії Т-лімфоцитів, що пояснює позитивні результати імунотерапії у хворих з метастазами в регіонарних ЛВ.

Різна динаміка формування ареактивності в процесі внутрішньоорганного росту КГ в паренхімі селезінки і печінки щурів припускає різні патогенетичні механізми її реалізації. В цих процесах важливого значення набуває реакція органів імуногенезу і, зокрема, тимуса як центрального органа імунної системи.

При трансплантації КГ в селезінку в усі строки її росту спостерігається активна проліферація лімфобластів не тільки в неураженій частині селезінки, але й на межі з пухлинним трансплантатом та в кірковому шарі тимуса. По мірі руйнування пухлиною тканини селезінки та звуження зони лімфобластної реакції в ній, зростає площина цієї реакції в кірковому шарі тимуса, з розповсюдженням її на мозковий шар, що демаскує його структуру. Гіперплазію тимоцитів можна розглядати як замісну (вікарну) реакцію незрілих імунокомпетентних клітин в тимусі, який перебирає на себе функцію стимуляції проліферації лімфобластів, яку втрачає селезінка під час росту та прогресії пухлини. При цьому, епітеліальний ретикулум тимуса не зазнає суттєвих структурних змін. Певно, цим можна пояснити збереження секреторної активності тимуса, навіть в період генералізації пухлинного процесу, коли реєструється помірний рівень ТСФ у циркуляції (на 25-у добу титр складає – 3,00+0,73 проти 7,50+0,28 log2 до перещеплення, p<0,05).

На відміну від моделі росту КГ в селезінці, зміни в тимусі при трансплантації КГ в тканину печінки пов’язані з порушенням її дезінтоксикаційної функції, що є наслідком заміщення пухлиною функціонуючих гепатоцитів. Інтоксикація організму призводить до змін переважно в мозковому шарі тимуса. Збільшується кількість дрібних тілець Гасаля, що формуються в процесі епідермоїдної метаплазії та подальшої загибелі епітеліальних клітин з медулярною диференцировкою – продуцентів гормонів тимуса. Такі зміни в структурі епітеліального компонента тимуса асоціюються з порушенням його секреторної активності, наслідком чого є зниження рівня ТСФ у циркуляції