НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ФЕДОРЕНКО ОЛЕНА АНДРІЇВНА

УДК 577.352.5:577.353

БІОФІЗИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ІОННИХ КАНАЛІВ

МЕМБРАН ЯДЕРНОЇ ОБОЛОНКИ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2007

Київ – 2007 Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім.. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Марченко Сергій Михайлович

Інститут фізіології ім.. О.О.Богомольця НАН України

провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи

академік НАН України, доктор біологічних наук

Магура Ігор Сильвестрович

професор Кафедри молекулярної фізіології і біофізики

Фізико-технічного навчального-наукового центру НАН України

кандидат біологічних наук

Любанова Ольга Петрівна

старший науковий співробітник Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України

Захист відбудеться 30.10. 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

за адресою: 01024, м. Київ, вул.. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул.. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 29.09.2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В еукаріотичних клітинах генетичний апарат відокремлений від решти цитоплазми ядерною оболонкою, яка складається з двох окремих мембран, зовнішньої та внутрішньої, між якими знаходиться порожнина - перинуклеарний простір. Транспортну функцію крізь ядерну оболонку виконують числені комплекси ядерної пори, через які здійснюється пасивна дифузія іонів та молекул з малою молекулярною масою, а також високоселективний активний транспорт макромолекул ( Allen et al., 2000; Marelli et al., 2001; Jaggi et al., 2003). Окрім пор, на ядерних мембранах було виявлено багато іонних каналів різних типів з відмінними біофізичними властивостями (Franco-Obergon et al., 2000; Guihard et al., 2000; Mazzanti et al., 2001; Marchenko et al., 2005). Досить суперечливим залишається питання щодо функції іонних каналів ядерної оболонки. Вважають, що вони відповідають за підтримання сталої концентрації різних іонів у перинуклеарному просторі. Крім того, припускають, що деякі канали можуть брати участь у функціонуванні ядерної облонки як кальцієвого депо, з якого Са2+ потрапляє всередину ядра (Nicotera et al., 1990; Stehno-Bittel et al., 1995; Marchenko et al., 2005; Marchenko & Thomas, 2006). Збільшення концентрації кальцію в ядрі призводить до змін у активності генетичного апарату клітини, запускаючи транскрипцію генів через активацію нуклеарних Са2+-чутливих кіназ та фосфатаз, або через пряму взаємодію з Са2+-залежними факторами транскрипції (Bading, 2000; et al., 2002). Але через свою важкодоступність для прямих експериментів ці канали залишаються мало вивченими.

Було показано, що мембрана і люмен ендоплазматичного ретикулуму морфологічно сполучені та мають спільні біохімічні властивості з зовнішньою мембраною і перинуклеарним простором ядерної оболонки, тому останню можна розглядати як специфічну частину ендоплазматичного ретикулуму ( Baumann & Walz, 2001; Berridge, 2002).

Отже, дослідження ядерної оболонки являє інтерес у декількох відношеннях. По-перше, ядерна оболонка може брати активну участь y регуляції транспорту між цитоплазмою та нуклеоплазмою і регуляції генетичного апарату клітини. По-друге, зовнішня ядерна мембрана є частиною ендоплазматичного ретикулуму, тому іонні канали ядерної оболонки можна розглядати як канали ендоплазматичного ретикулуму.

На цей час мало відомо про регуляцію Са2+ в ядрі нейронів. Тому, основним об’єктом наших досліджень були ядра нейронів різних відділів нервової системи. Для порівняння іонних каналів, які експресуються на ядерних мембранах клітин різних типів були також проведені досліди на ядрах Т-лімфоцитів.

Підгрунтям для даної роботи стали попередні дослідження С.М.Марченка та його співробітників з вивчення іонних каналів на ізольованих ядрах нейронів Пуркін’є мозочка (Marchenko et al., 2005). Розроблена ними методика отримання ізольованих ядер цих клітин дала змогу реєструвати ядерні іонні канали у їх природньому оточенні. Проте безліч питань потребують пояснення, наприклад чи входять іонні канали, які реєструють від мембран ядерної облонки, до складу комплексу ядерної пори; чи відрізняються набори іонних каналів, які експресуються в ядрах клітин різних типів; які можуть бути функціональні особливості іонних каналів ядерних мембран; які властивості необхідні для механізмів регуляції внутрішньоклітинних Са2+ сигналів тощо. Відповіді на ці запитання дадуть змогу краще розуміти принципи функціональної активності клітини.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах наукових тем Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.

Мета та завдання дослідження. Метою нашого дослідження було визначити які іонні канали експресуються на мембранах ядерної оболонки клітин різних типів та описати їх основні біофізичні властивості. Для досягнення даної мети було поставлено наступні завдання:

1. з’ясувати відношення між катіонними каналами великої провідності, які були зареєстровані в ядерних мембранах нейронів Пуркін’є мозочка, і каналами для пасивної дифузії комплексу ядерної пори;

2. дослідити іонні канали та їх біофізичні властивості (провідність, селективність, кінетику роботи) в ядерних мембранах пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа;

3. вивчити іонні канали та їх основі властивості в мембранах ядер гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа;

4. описати основні біофізичні властивості іонних каналів, які експресуються в ядерних мембрнах Т-лімфоцитів;

5. на підставі отриманих даних зробити припущення щодо можливого фізіологічного значення іонних каналів ядерних мембран клітини.

Наукова новизна одержаних результатів. Усі експериментальні дані, що представлені в роботі, отримано вперше: показана наявність та описані основні властивості іонних каналів, які експресуються в ядерних мембранах Jurkаt клітин, пірамідних нейронів ділянки СА1 та гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа; представлені данні, що відкидають гіпотезу про зв’язок каналу для пасивної дифузії комплексу ядерної пори та катіонного каналу великої провідності ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка; описаний новий можливий механізм регуляції Са2+ сигналу в ядрі клітини.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають насамперед велике теоретичне значення, оскільки сприяють більш глибокому розумінню механізмів внутрішньоклітинної регуляції, зокрема передачі клітинних сигналів всередину ядра, що спричиняє зміни у активності генетичного апарату. Дані дослідження дають підставу для подальших досліджень властивостей ядерної оболонки та її зв’язку з фізіологічними явищами в клітині, таких, наприклад, як апоптоз, нейродегенерація тощо.

Особистий внесок здобувача. Всі дослідження та обробка експериментального матеріалу було виконано здобувачем особисто. Електрофізіологічні реєстрації поодиноких іонних струмів від ядер пірамідних нейронів ділянки СА1 та гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа було проведено разом із молодшим науковим співробітником Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України к.б.н. Дужим Д.Є. Культивування клітин лінії Jurkаt проводилося науковим співробітником Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України Волковою Т.М. Планування експериментів, обговорення результатів досліджень та формулювання висновків проводилися спільно з науковим керівником - провідним науковим співробітником Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України д.б.н. Марченком С.М.

Апробція результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на низці конференцій, зокрема: з’їзді FEPS (Мюнхен, березень, 2006), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства (Чернівці, травень, 2006 р.), Міжнародній конференції "Механізми функціонування фізіологічних систем" (Львів, жовтень, 2006 р.), IV з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, грудень, 2006 р.), IIІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології" (Львів, квітень, 2007 р.).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 4 статті та тези 6 доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел із 215 найменувань. Робота викладена на 115 сторінках, містить 6 таблиць і 38 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Отримання ізольованих ядер нейронів. Всі експериментальні процедури проводилися відповідно до біоетичних норм законодавства України. Для дослідів брали щурів-самців лінії Вістар або Фішер віком 2-3 тиждні. Щури були декапітовані, після чого виділяли їх мозочок або великі півкулі головного мозку, які клали у посуд з охолодженим (1 – 4°C) розчином, що містив (ммоль/л): NaCl - 120, KCl – 2,5, MgSO4 – 1,3, CaCl2 - 1, NaH2PO4 – 1,3, NaHCO3 - 26, глюкоза – 10; рН 7.3. Робили зрізи мозочка або гіпокампа завтовшки до 400 мкм, які поміщали у розчин, що містив (ммоль/л): глюконату-калію – 150, HEPES – 2,5, HEPES-К – 2,5; рН 7.3. До цього розчину додавали суміш протеїнових ігнібіторів (“Roche Diagnostics”, Велика Британія) у концентраціях, зазначених виробником. Зразки тканини були гомогенізовані шляхом пропускання через металеву голку розміром 0.64 мм. Отриманий гомогенат розміщували на робочій камері під інвертованим мікроскопом Leica DMIRB (“Leica Microsystems”, Німеччина). Через деякий час ядра осідали та щільно прикріплювалися до дна робочої камери, після чого залишки інших органел та ушкоджені ядра відмивали розчином, що містив (ммоль/л): KCl – 150; HEPES – 2,5; HEPES-K – 2,5; pH 7.3. В результаті описаних операції, ядра ставали придатними для петч-клемп реєстацій від зовнішньої мембрани.

Отримання ізольованих ядер Jurkat-клітин. У дослідах використовували лейкемічні Т-лімфобласти людини лінії Jurkat (субклон JMP). Клітини культивували у живильному середовищі RPMI 1640 при наявності таких компонентів: 2 ммоль/л глутаміну, 10% ембріональної телячої сироватки, пеніциліну 100 од/мл і стрептоміцину 50 мкг/мл (усі реактиви фірми “Sigma”, США). Клітинну культуру вирощували при 37оС в атмосфері 5% СО2 і 95% повітря. У дослідах використовували Т-лімфобласти зі щільністю 3-9105 клітин/мл у стадії утворення клітинних агрегатів. Клітини культури центрифугували протягом 7 хв при швидкості обертання 1500 хв-1 і поміщали в розчин, що містив (ммоль/л): глюконату-калію – 150, HEPES – 2,5, HEPES-К – 2,5; рН 7.3. До цього розчину додавали суміш протеїнових ігнібіторів. Подальші процедури проводилися так само, як у випадку з нейронами.

Метод усунення зовнішньої ядерної мембрани. Для петч-клемп відведень від внутрішньої мембрани ядра інкубувалися в 1%-ому розчині цитрату натрію з додаванням 5 ммоль/л діетилтритолу протягом 20-30 хвилин, повільно перемішуючись. Було показано, що дана процедура призводить до усунення зовнішньої ядерної оболонки, не пошкоджуючи внутрішню (Humbert et al., 1996). Подальші процедури проходили так само, як і для дослідів із зовнішньою мембраною.

Петч-клемп реєстрації поодиноких іонних каналів від ядерних мембран. Реєстрація поодиноких іонних каналів проводилася з використаням методу петч-клемп в конфігурації “nucleus-attached” або “excised patches” в режимі фіксації потеніалу. Досліди проходили при температурі 18-20°C. Петч-піпетки були виготовлені з боросілікатного скла (“Sutter Instruments”, США). Їх опір варіював від 5 до 12 МОм. Внутрішньопіпетковий розчини змінювався в залежності від завдання дослідів. Індиферентний електрод Ag-AgCl був сполучений з робочою камерою через агаровий місток. Робочу камеру заповнювали розчином, що містив (ммоль/л): KCl – 150; HEPES – 2,5; HEPES-K – 2,5; pH 7.3, проте від міг змінюватися під час дослідів. Реєстрацію даних проводили за допомогою підсилювача Visual Patch VP-500 (“Bio-Logic”, Франція). Сигнали з підсилювача фільтрували низькочастотним фільтром Бессела (2 кГц), оцифровували з частотою 10 кГц і зберігали на жорсткому диску комп’ютера. Отримані результати були проаналізовані за допомогою аналітичних програмних продуків, а саме pClamp 9.0 (“Axon Instruments”, США) та OriginPro 7.0 (“Microsoft Software”, США). В усіх реєстраціях потенціал розчину в робочій камері приймався за 0 мВ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Властивості та топологія катіонних каналів великої провідності мембран ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка. Петч-клемп реєстрації від мембран ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка показали наявність декількох типів іонних каналів з різними біофізичними властивостями. Проте більшість мембранних петчів містила катіонні канали великої провідності, які мали повільний характер роботи.

Канали цього типу були зареєстровані як у зовнішній, так і у внутрішній ядерних мембранах.

У симетричному базовому розчині провідність катіонних каналів у внутрішній ядерній мембрані дорівнювала 198 ± 27 пСм (n=58), а у зовнішній - 199 ± 17 пСм (n=5). Отже, канали в обох ядерних мембранах мають ідентичну провідність.

Для того, щоб визначити селективність цих каналів до інших катіонів, К+ у розчині в робочій камері був заміщений на Na+, Rb+, Cs+, Li+, Са2+ і Ва2+. Результати показали, що данний тип каналів є

малоселективним для одновалентних катіонів і практично непроникним для двовалентних. Селективність каналів у зовнішній та внутрішній мембранах ядерної оболонки була однаковою.

Активність катіонних каналів великої провідності залежала від мембранного потенціалу, при зміні якого змінювалась вірогідність їх відкритого стану (Po).

Канали, які були зареєстровані в зовнішній ядерній мембрані, при негативних потенціалах майже весь час були відкриті (Po>0.8), а при позитивних потенціалах їх активність різко зменшувалась. У випадку з каналами у внутрішній ядерній мембрані, ми спостерігали цілком протилежну залежність вірогідності відкритого стану від мембранного потенціалу.

Цей факт, а також однакові провідність та селективність катіонних каналів зовнішньої та внутрішньої ядерних мембран, вказує на те, що в обох мембранах ядерної оболонки експресуються ідентичні іонні канали, які інгібуються негативним потенціалом у перинуклеарному просторі.

Дослідження іонних каналів ядерної оболонки пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа. При дослідженні зовнішньої мембрани ядер пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа ми виявили іонні канали з швидкою кінетикою та чітко вираженою потенціалзалежністю. При позитивних потенціалах канал мав дуже низьку Ро. При від’ємних потенціалах активність каналу значно збільшувалась.

У симетричному розчині 150 ммоль КСІ вольт-амперна характеристика цього каналу мала лінійний характер та його провідність дорівнювала 156 ± 4 пСм (n=6).

Для визначення селективності каналу ми замінили розчин 150 ммоль КСІ у

робочій камері на розчин, який містив (ммоль/л): КСІ – 20, глюканат-К – 130, HEPES-KOH – 2.5, pH-7.3. За таких умов значно зсувався потенціл реверсії струму. За нашими підрахунками потенціал реверсії для іонів хлору за таких умов дорівнював 50,9 мВ, а для іонів калію – 0 мВ. Дані отримані під час експерименту більше відповідають першій величині. Отже даний канал був проникним для іонів СІ? та практично непроникним для іонів К+.

У внутрішній мембрані ядерної оболонки пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа ми зареєстрували іонні канали з дуже характерним типом активності. Канал мав повільну кінетику та сильно флуктуював.

Вірогідність відкритого стану каналу залежала від потенціалу. При позитивних потенціалах він майже весь час був відкритий, а при негативних потенціалах вірогідність

його відкритого стану суттєво зменшувалась. При великих негативних потенціалах (нижче - 40 мВ) канал повністю закривався. Провідність каналу в симетричному розчині 150 ммоль/л КСІ становила

248 ± 6 пСм (n=8).

Для того, щоб визначити селективність цого каналу, ми замістили стандартний

розчин КСІ в робочій камері на розчин тріс-Cl, внаслідок чого на всіх потенціалах в діапазоні від +80 до -80 мВ спостерігався виключно вхідний струм. Ці дані підтверджують те, що даний канал був селективний до катіонів.

У внутрішній ядерній мембрані також були зареєстровані інозитолтрифосфатні рецептори, рецепторні локуси яких були спрямовані в нуклеоплазму. Вони мали дуже швидкий характер роботи. Час їх відкритого стану дорівнював лише 1,1 ± 0,15 мс. Активність цих каналів з’являлася при 0,1 мкмоль інозитолтрифосфату в розчині, проте насичуюча концентрація ІР3 становила 1 мкмоль. Це дає підстави припускати, що IP3Rs, які ми зареєстрували на ядрах пірамідних нейронів, належать до типу І.

У симетричному розчині 150 ммоль КСІ інозитолтрифосфат-активовані канали мали лінійну вольт-ампарну характеристику та провідність 366 ± 5 пСм (n=6).

Нам не вдалося зареєструвати будь-які інші іонні канали в мембранах ядер пірамідних нейронів. Тому можна припустити, що рианодинові рецептори відсутні на ядерній оболонці цих клітин, або ж їх щільність настільки мала, що вони не можуть бути зареєстровані електрофізіологічними методами.

Іонні канали ядерних мембрани гранулярних нейронів зубчастої звивини гіпокампа. При дослідженні поодиноких іонних каналів від мембран ядерної оболонки нейронів зубчастої звивини гіпокампа було виявлено декілька їх типів з різними біофізичними властивостями.

На зовнішній ядерній мембрані ми зареєстрували іонний канал, який демонстрував досить повільну кінетику роботи та не мав чіткої потенціал залежності. Цей канал був з високою провідністю, середнє значення якої у симетричному розчині 150 ммоль КСІ дорівнювало 329 ± 16 пСм (n=5). Для визначення іонної селективності цього каналу ми змінили стандартний базовий розчин у робочій камері на розчин тріс-Cl. За таких умов на всіх потенціалах в діапазоні від + 40 до - 80 мВ ми спостерігали як вхідний, так і вихідний струми. Потенціал реверсії змінювався несуттєво. Це свідчить про те, що даний канал був селективний для іонів хлору і практично непроникний для К+.

У внутрішній ядерній мембрані було виявлено канали двох типів. Вони мали майже однакову провідність, проте різко відрізнялися за характером своєї роботи.

Характер роботи каналів першого типу був досить повільним та залежав від потенціалу мембрани. На позитивних потенціалах канал майже весь час був відкритий та сильно флуктуював, а на негативних потенціалах його активність зменшувалась. Перший тип каналів у розчині 150 ммоль КСІ мав провідність 179 ± 15 пСм (n=6).

Для того, щоб визначити селективність цого каналу, ми замістили стандартний розчин 150 ммоль КСІ у робочій камері на еквімолярний розчин глюконату - калію. В цих умовах спостерігали як вхідні, так і вихідні струми, що свідчить про непроникність цього каналу для іонів Сl?. Потім розчин у робочій камері замінили на тріс-Cl, внаслідок чого на всіх потенціалах у діапазоні від + 80 до - 80 мВ реєстрували виключно вихідний струм.

Отримані результати підтверджують те, що цей канал був селективний до катіонів.

Канали другого типу мали зовсім інший характер роботи. Вони часто та швидко флуктуювали між двома рівнями провідності. Значення максимального рівня провідності у розчині 150 ммоль КСІ було 157 ± 9 пСм (n=5). Провідність другого рівеня становила 84 ± 8 пСм (n=5), що дорівнює приблизно половині значення максимального рівня. Для визначення селективності цього каналу розчин у робочій камері замінили на еквімолярний розчин глюконату – калію. У піпетці залишився стандартний розчин 150 ммоль КСІ. За таких умов на всіх потенціалах в діапазоні від – 60 мВ до + 60 мВ спостерігався виключно вхідний струм, що свідчить про селективність цього каналу до іонів хлору.

Нам не вдалося зареєструвати рианодинові чи інозитолтрифосфатні рецептори в зовнішній і внутрішній мембранах ядерної оболонки гранулярних нейронів гіпокампа.

Дослідження іонних каналів ядерних мембран Jurkat-клітин. Реєстрації поодиноких каналів від зовнішньої ядерної мембрани показали наявність іонних каналів з дуже характерним типом активності. В усіх без винятку випадках канал демонстрував два чітко виражених підрівня. В жодній реєстрації ми не спостерігали каналів з одним рівнем провідності.

У симетричному розчині 150 ммоль КСІ провідність максимального рівня складала близько 70 ± 2 пСм (n=18). Провідність підрівня становила рівно половину цієї величини, а саме 35 ± 1 пСм (n=18).

Для того, щоб визначити селективність цього каналу ми заміщали стандартний розчин 150 ммоль КСІ в робочій камері на еквімолярний розчин глюконату-калію. В цих умовах ми спостерігали на всіх потенціалах в діапазоні від -80 мВ до +80 мВ виключно вхідний стум. Це свідчить про те, що канал був селективний для іонів СІ? і практично непроникний для К+.

На внутрішній мембрані ядер Т-лімфобластів ми зареєстрували два типи спонтанно активних каналів, які відрізнялися за своєю провідністю, селективністю та кінетикою роботи.

Перший тип каналів за характером активності дещо нагадував хлорні канали, які ми зареєстрували в зовнішній ядерній мембрані. Так само як і хлорні канали в зовнішній мембрані, цей канал у внутрішній мембрані завжди демонстрував наявність двох рівних підрівнів. Кінетичні характеристики каналу суттєво залежали від потенціалу. При позитивних потенціалах спостерігалась порівняно повільна робота каналу. При негативних потенціалах кінетика роботи каналу різко прискорювалась. Але при будь-яких потенціалах канал ясно демонстрував наявність двох рівних за амплітудою підрівнів. Проте провідність максимального рівня каналу у внутрішній ядерній мембрані у симетричному розчині 150 ммоль КСІ складала близько 382 ± 3 пСм (n-12), що більш ніж в 5 разів перевищувало провідність каналу в зовнішній мембрані. Для визнчення селективності каналу іони К+ у розчині в робочій камері ми замістили на NMDG. Концентрація іонів СІ? була ідентична з обох боків мембрани. За даних умов спостерігались як вхідні, так і вихідні струми і вольт-амперна характеристика змінювалась не суттєво. Тому можна стверджувати, що даний канал є селективним для іонів хлору.

Другий тип каналів, які ми зареєстрували у внутрішній ядерній мембрані Т-лімфобластів, різко відрізнявся за характером своєї активності від хлорного каналу і очевидно являв собою інший тип іонного каналу. Канал мав повільну кінетику та сильно флуктуював. У симетричному розчині 150 ммоль КСІ цей канал мав провідність 152 ± 4 пСм (n=14) та характеризувався незначним вхідним випрямленням.

Для визначення селективності каналу ми замістили іони К+ у внутрішньопіпетковому розчині на NMDG, у робочій камері залишався стандартний розчин 150 ммоль КСІ. За таких умов, реєструвалися поодинокі канали вхідного струму, які не реверсували в діапазоні від

-80 мВ до +80 мВ. Це дало нам підставу стверджувати, що досліджений нами іонний канал є селективним для іонів К+. Він однаково пропускав й інші одновалентні катіони, наприклад натрій. Високі концентрації Са2+, які необхідні для визначення селективності каналу пригнічують його активність. Вірогідність відкритого стану цього каналу залежала від мембранного потенціалу. При позитивних потенціалах він майже весь час був відкритий, а при негативних потенціалах вірогідність відкритого стану суттєво зменшувалась. При значних негативних потенціалах (нижче -60 мВ) канал повністю, але зворотньо, блокувався.

Залежність властивостей іонних каналів ядерних мембран пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа та нейронів Пуркін’є мозочка від потенціалу мембрани. У цій роботі ми вивчали властивості іонних каналів внутрішньої мембрани ядерних оболонок нейронів Пуркін’є мозочка та пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа. Раніше було показано, що внутрішня мембрана ядер цих клітин, навідміну від зовнішньої, містила катіонні канали великої провідності та інозитолтрифосфатні рецептори (Marchenko et al., 2005).

Інозитолтрифосфатні рецептори ядер обох типів нейронів мали однаковий характер роботи. Імовірно, обидва IP3Rs належать до одного типу (ІР3R1). Як вже було зазначено, IP3R пірамідних нейронів у симетричному розчні 150 ммоль КСІ мали провідність 366 ± 5 пСм (n=6). Провідність IP3-рецепторів ядер нейронів мозочка становила 356 ± 4 пСм (n=7). Провідності каналів практично співпадали та їх різниця була недостовірною (Р > 0.05).

Активність каналів IP3-рецепторів внутрішніх мембран ядер центральних нейронів залежела від мембранного потенціалу. Вірогідність відкритого стану каналів була значно вищою на позитивних потенціалах, та суттєво зменшувалась на негативних. При чому залежність Ро IP3Rs ядер нейронів гіпокампа від мембранного потенціалу була дещо крутішою, аніж IP3Rs ядер нейронів мозочка. Зміни у вірогідності відкритого стану каналів при швидкому перемиканні з

одного потенціалу на інший відбувалися за дуже короткий проміжок часу. Наприклад, в ядрах пірамідних нейронів гіпокампа при змінні потенціалу з +80 мВ на -80 мВ за першу секунду Ро зменшувалась більш ніж в два рази. При більш тривалому часі (від 1,5 с і більше) на потенціалі -80 мВ та нижче інозитолтрифосфатні рецептори ядерної мембрани пірамідних нейронів гіпокампа цілком інгібувалися. Але таке інгібування не спостерігалося у випадку із ядрами нейронів Пуркін’є мозочка, хоча їх активність також спадала до найменших значень.

Катіонні канали великої провідності, які були зареєстровані у внутрішній ядерній мембрані нейронів Пуркін’є мозочка, та катіонні канали ядерних мембан пірамідних нейронів

ділянки СА1 гіпокампа мали подібні основні біофізичні властивості. Зокрема, канали мали однакову дуже повільну кінетику. Вони були малоселективними для одновалентних катіонів та не потребували жодної стимуляції для своєї активації. Проте провідність каналів дещо відрізнялась. У симетричному розчині 150 ммоль КСІ катіонні канали великої провідності ядерних мембран пірамідних нейронів гіпокампа мали провідність 248 ± 16 пСм (n=21), а провідність катіонних каналів ядер нейронів Пуркін’є мозочка становила 198 27 пСм (n=58), що на 20% менше, ніж у каналів з ядер пірамідних нейронів гіпокампа.

Активність катіонних каналів великої провідності, також як і ІР3-рецепторів, була потенціалзалежною. На позитивних потенціалах вони майже весь час були відкриті, а при негативних потенціалах їх Ро різко зменшувалась. При більш негативних потенціалах, а саме при ? - 40 мВ для каналів ядерних мембран пірамідних нейронів, та ? - 80 мВ для каналів ядер нейронів Пуркін’є, канали повністю блокувалися. Для обох каналів таке інгібування було цілком зворотнє.

Стала часу інгібування каналу ядерної оболонки нейронів Пуркін’є негативними потенціалами при перемиканні з 60 мВ на -60 мВ наближувалася однією експонентою та становила 1.88 с.

ОБГОВОРЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

Чи є катіонний канал великої провідності, який ми реєструємо, дифузійним каналом ядерної пори? Щільність пор на ядерній оболонці клітин різних типів варіює від одиниць до декількох десятків пор на 1 мкм2 (Garcia-Segura et al., 1989). Така висока щільність дає підстави припускати, що під час реєстрацій у петч-піпетці може міститися велика кількість ядерних пор. Таким чином, можна очікувати, що опір під час петч-клемпу буде дуже низьким. Проте, насправді з ядерною мембраною може бути встановлений щільний гігаомний контакт (Mazzanti et al., 1990), завдяки чому низка іон-селективних каналів була описана в ядерній оболонці клітин різних типів (, 1996; Draguhn et al., 1997; Franco-Obergon et al., 2000; Guihard et al., 2000; Mazzanti et al., 2001; Nagasawa et al., 2001; Marchenko et al., 2005). Для того щоб пояснити ці розбіжності у даних, було запропоновано, що катіонні канали великої провідності (декілька сотен пСм), що були знайдені в мембранах ядерних оболонок різних типів клітин, являють собою канали комплексів ядерної пори для пасивної дифузії, які, маючи воротні механізми, можуть поводити себе як звичайні іонні канали (детальний огляд – Mazzanti et al., 2001). На користь цієї гіпотези виступають декілька груп вчених (Innocenti et al., 1993; Assandri et al., 1997; , 1999; Bustamante et al., 2000; Bustamante, 2006), проте їх дані викликають деякі сумніви.

У даній роботі ми досліджували біофізичні властивості катіонних каналів великої провідності, які являли собою основний тип спонтанно активних іонних каналів, що були зареєстровані в мембранах ядерної оболонки нейронів Пуркін’є мозочка. Їх щільність була дуже високою та становила 7 ± 3 каналів на один петч (n=372). Опір петч-піпеток у наших дослідах дорівнював 10 - 15 МОм. Такий опір відповідає площі мембрани в піпетці близько 1 мкм2 (Sakmann & Neher, 1998). Отже, щільність катіонних каналів великої провідності в ядерних мембранах нейронів Пуркін’є становила приблизно 7 каналів на 1 мкм2. Електронномікроскопічні дослідження показали, що щільність ядерних пор в ядерній оболонці цих клітин дорівнює 22 ± 3 пори на мкм2 (Garcia-Segura et al., 1989). Проте не всі дифузійні канали комплексів ядерної пори одночасно перебувають у відкритому стані, деяка їх кількість може бути закритою під час реєстрацій. Отже, рівень щільності каналів великої провідності в мембранах ядер нейронів Пуркін’є відповідає рівню ядерних пор у цих клітинах.

Катіонні канали великої провіності були єдиним типом серед інших іонних каналів, зареєстрованих у ядерних мембранах нейронів Пуркін’є, які відповідають характеристикам, зокрема провідності, діфузійного каналу пори. Декілька інших типів спотнанно активних каналів, які були зареєстровані на тих самих клітинах, мали дуже низьку щільність та провідність (<70 пСм) (Marchenko et al., 2005), щоб бути ядерною порою (Mazzanti et al., 2001).

Ми показали, що катіонні канали великої провідності можуть бути зареєстровані як у зовнішній, так і внутрішній ядерній мембрані. В обох випадках канали мали ідентичну провідність, селективність, кінетику, але дуже відрізнялися за свєю потенціалзалежністю. Канали в зовнішній ядерній мембарні інгібувалися позитивними потенціалами в петч-піпетці, а у внутрішній – негативними. Ці дані швидше узгоджуются із локалізацією даних каналів у мембранах, аніж з їх асоціацією із комплексом ядерної пори. Топологічна орієнтація каналів відносно до ядерних мембран була ідентична для обох каналів. Ці канали інгібувалися негативним потенціалом всередині люмену ядерної оболонки, що вказує на знаходження сенсорної ділянки їх молекули у перинуклеарному просторі.

Отримані результати вказують на те, що катіонні канали великої провідності не пронизують подвійну ядерну оболонку, а забезпечують прямий контакт між нуклеоплазмою або цитоплазмою та перинуклеарним простором. Ми припускаємо, що катіонні канали великої провідності можуть належати до іонних каналів ендоплазматичного ретикулуму та необхідні для його специфічних функцій. Наприклад, вони можуть брати участь у регуляції вивільнення Са2+ з депо.

Біофізичні властивості іонних каналів мембран ядерної оболонки клітин різних типів. У даній роботі були досліджені іонні канали ядерних мембран пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа щурів, гранулярних клітин зубчастої звивини гіпокампа щурів та Т-лімфоцитів людини. Припускають, що cпонтанно активні аніонні та катіонні канали в ядерній оболонці необхідні для підтримання між цитоплазмою та перинуклеарним простором іонного балансу, який може суттєво змінюватися під час певних фізіологічних явищ, наприклад звільнення Са2+ з ядерної оболонки.

З літературних джерел відомо, що серед хлорних каналів на внутрішньоклітинних мембранах експресуються представники родини CLIC та деяки з родини СІС. Молекулярна структура цих каналів була досліджена завдяки клонуванню їх генів (Tonini et al., 2000; Debska et al., 2001; Jetsch et al., 2001). Всі СІС канали є гомодимерами. Вони демонструють два чітких рівних за аплітудою рівня провідності, що свідчить про наявність у молекулі каналу двох ідентичних пор. Більшість СІС характеризуються чіткою потенціалзалежністю, крім того мають подвійний воротній механізм: по-перше, кожна з пор каналу може закриватися незалежно, по-друге, є механізм, який одночасно закриває обидві пори (Jetsch et al., 2001). Воротні механізми каналів залежать від мембранного потенціалу, а також модулюються концентрацією аніонів та рН цитоплазми (Kourie, 1999). СІС були знайдені у саркоплазматичному ретикулумі, в ендосомах та синаптичних везикулах, ендоплазматичному ретикулумі, лізосомах (Kourie, 1999; Tonini et al., 2000; Guihard et al., 2000; Debska et al., 2001; Jetsch et al., 2001; Mazzanti et al., 2001), проте, імовірно, вони можуть бути локалізовані й в інших внутрішньоклітинних мембранах.

Іншою родиною хлорних внутрішньоклітинних каналів є CLIC. Вони були знайдені на мембранах ядерної оболонки, де спричиняють рух аніонів крізь неї (Jetsch et al., 2001).

Всі іонні канали, які були досліджені вперше в наших дослідах, та їх основні біофізичні властивості представлені у табл.1.

Таблиця 1.

Іонні канали ядерних мембран клітин різних типів

Тип каналу | Тип клітини | Ядерна мембрана | Провідність

Катіонні канали великої провідності | ПН | Внутрішня | 248

ГН | Внутрішня | 179

ТЛ | Внутрішня | 152

Хлорні канали родини СІС | ТЛ | Зовнішня | 70

ТЛ | Внутрішня | 382

ГН | Внутрішня | 157

Невизначені хлорні канали | ПН | Зовнішня | 156

ГН | Зовнішня | 329

Кальцієві канали | ПН | Внутрішня | 366

ПН - пірамідні нейрони СА1 ділянки гіпокампа; ГН - гранулярні нейрони зубчастої звивини гіпокампа;

ТЛ - Т-лімфобласти.

Спираючись на вище наведені літературні дані, ми можемо припустити, що частина хлорних каналів, які ми зареєстрували, належить до родини СІС, адже вони демонстрували два однакових за значенням рівня провідності. Ці канали мають подібну кінетику, але суттєво відрізняються за провідністю. Тому можна стверджувати, що ми маємо справу з різними типами іонних каналів, але зі схожою молекулярною будовою.

Іншу частину хлорних каналів ми не змогли віднести до будь-якої групи вже відомих каналів, оскільки таке завдання не вдається вирішити електрофізіологічними методами. Вони можуть належати до CLIC, ажде вони мали лише один рівень провідності. Проте, ці канали також можуть належати до іншої (ще неописаної) родини внутрішньоклітинних хлорних каналів.

З таблиці 1 видно, що у внутрішній мембрані ядерних оболонок всіх трьох типів клітин, які були об’єктами наших досліджень, присутні катіонні канали великої провідності. Ці канали мають однакові характери роботи та селективність. Всі вони демонструють потенціалзалежність, проте, у каналів ядер різних клітин вона має різні ступені вираженості. До того ж, ці три канали суттєво відрізняються за провідністю. Тому можна припустити, що в ядерних мембранах пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа, гранулярних нейронів зубчастої звивини та Т-лімфобластів присутні не ідентичні, але близькі за своєю молекулярною структурою іонні канали. На цей час є низка робіт, в яких, використовуючи електрофізіологічні методи, були описані малоселективні катіонні канали на внутрішніх мембранах ядер клітин. Проте, вони не були виділені та клоновані, адже досі не знайдено їх блокатори, чи інші молекули, за допомогою яких ці канали можна було б ідентифікувати поза мембраною.

Також ми показали наявність у внутрішній ядерній мембрані пірамідних нейронів СА1 ділянки гіпокампа кальцієвих каналів, які за своїми біофізичними властивостями можуть бути віднесені до інозитолтрифосфатних рецепторів типу І (Humbert et al., 1996; Bezprozvanny, 2005; Berridge, 2007). Наші дані вказують на те, що ядерна оболонка цих нейронів може виконувати роль кальцієвого депо, з якого під час певних фізіологічних станів вивільнюється Са2+ у нуклеоплазму клітини. Було чітко показано, що збільшення внутрішньоядерної концентрації Са2+ призводить до запуску ряду фізіологічних явищ, зокрема до активації факторів транскрипції (наприклад, CREB або DREAM) (Bading, 2000; Chawla, 2002; & Nguyen, 2005; Marchenko & Thomas, 2005). У клітинах хребетних CREB має критичне значення для формування довготривалої потенціації в нейронах гіпокампа (Bading, 2000; Limback-Stokin et al., 2004; & Nguyen, 2005)роте, ми не можемо відкидати можливість наявності Са2+ каналів і в ядерних оболонках цих клітин, оскільки ми могли їх не зареєструвати через низку щільність у тих мембранах.

Потенціалзалежність активності іонних каналів ядерних мембран може бути механізмом регуляції тривалості кальцієвого сигналу. У даній роботі ми досліджували залежність властивостей катіонних каналів великої провідності та IP3-активованих Ca2+-каналів внутрішньої мембрани ядерних оболонок нейронів Пуркін’є мозочка та пірамідних нейронів ділянки СА1 гіпокампа від мембанного потенціалу. Активність обох типів каналів на позитивних потенцалах була значно вищою, ніж на негативних. Ми припускаємо, що потенціалзалежне інгібування ІР3-рецепторів може бути одним з механізмів обмеження тривалості Са2+ сигналу в ядрі.

Механізми активації ІР3-рецепторів їх агоністами (ІР3 та Са2+) добре досліджені, проте механізми термінації кальцієвого сигналу залишаються не до кінця з’ясованими. Є декілька гіпотез щодо припинення вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо. По-перше, блокування руху іонів Са2+ може відбуватися за рахунок зменшення електрохімічного градiєнту для Са2+ за рахунок спустошення кальцієвого депо. По-друге, є роботи, автори яких припускають, що інгібування IP3Rs відбувається за рахунок підвищення концентрації Са2+ біля зовнішньої частини рецептора, де, як вважають, знаходиться його інгібуючий центр (Bezprozvanny, 2005). Ми не відкидаємо можливість того, що ці явища дійсно беруть участь у регуляції кальцієвого сигналу. Крім того, ми пропонуємо ще один можливий механізм термінації вивльнення Са2+.

Вивільнення Са2+ із внутрішьоклітинних депо, наприклад ядерної оболонки, спряжене з перенесенням великого електричного зряду крізь її мембрану та спричиняє появу негативного потенціалу в перинуклеарному просторі (Yamashita et al., 2006). Як показали наші дослідження, при негативних потенціалах активність катіонних каналів великої провідності у внутрішній мембрані ядер пірамідних нейронів гіпокампа та нейронів Пуркін’є мозочка значно зменшується, і вони поступово інгібуються. Досі відсутні наглядні результати дослідження функцій цих каналів, але ми припускаємо, що вони необхідні для регуляції тривалості активності ІР3-рецепторів. Струм одновалентних катіонів, який спрямований в протилежний бік від струму іонів Са2+ при вивільненні з депо, перешкоджає дуже різкому зниженню потенціалу в люмені і таким чином збільшує тривалість кальцієвого сигналу.

Блокування негативним потенціалом струму К+ призводить до ще більшого зниження потенціалу в перинуклеарному просторі. При досягненні значних негативних значень мембранного потенціалу починається зниження активності з поступовим повним блокуванням ІР3-рецепторів, припиняючи вивільнення Са2+ з депо. Зважаючи на те, що в мембранах ендоплазматичного рекулуму, який вважається основним кальцієвим депо клітини, також присутні ІР3-рецептори та катіонні канали великої провідності, то можна припустити, що в ендоплазматичному ретикулумі діє подібний механізм регуляції привалості вивільнення Са2+.

Тривалість елементарних подій у Са2+ сигналізації становить 1-5 с (Berridge, 1997; Bootman et al., 2001), причому стадія активації одного IP3R чи їх групи триває 12 та 19 мс відповідно