НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗИКИ

ФЕСЕНКО ОЛЕНА МАР'ЯНІВНА

УДК 535.34:539.21

ЕФЕКТИ ТА МЕХАНІЗМИ ПІДСИЛЕННЯ ОПТИЧНИХ

ПЕРЕХОДІВ БІООРГАНІЧНИХ МОЛЕКУЛ

НА МЕТАЛЕВІЙ ПОВЕРХНІ

01.04.05 - оптика, лазерна фізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Київ-2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізики НАН України

Науковий керівник:

кандидат фізико-математичних наук,

старший науковий співробітник

Довбешко Галина Іванівна

Інститут фізики НАН України,

старший науковий співробітник відділу

фізики біологічних систем

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор

Дмитрук Микола Леонтійович

Інститут фізики напівпровідників

ім. В.Є. Лашкарьова НАН України

завідувач відділу поляритонної оптоелектроніки

доктор фізико-математичних наук, професор

Остапенко Ніна Іванівна

Інститут фізики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

фотоактивності

Захист дисертації відбудеться “27” грудня 2007 р. о 14:30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.159.01 при Інституті фізики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-28, проспект Науки, 46.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Інституту фізики НАН України.

Автореферат розіслано “_26_” листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.О. Чумак

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Внаслідок активного розвитку нанотехнологій зараз велика увага приділяється дослідженню оптичних властивостей наноструктур та їх взаємодії з біологічними молекулами. Перспективним є те, що змінюючи розмір та форму наночастинок металів або напівпровідників, можна узгоджувати їхні оптичні характеристики (частоту плазмонних або поляритонних коливань) з оптичними характеристиками (частотою поглинання) біоорганічних молекул, розміщених поблизу цих наноструктур. Для дослідження структури та ідентифікації типів зв'язків молекул використовують різні експериментальні методи. Однак робота з біологічними молекулами часто накладає обмеження на застосування традиційних методик та вимагає специфічних підходів і методів визначення наявності біологічних молекул та їхнього конформаційного стану. Тому нині особливу увагу приділяють розвитку експериментальних методів, за допомогою яких можна досягти збільшення інтенсивності оптичних процесів поблизу шорсткої поверхні або острівцевої плівки металів.

У дисертації досліджується ефект підсилення металевою поверхнею інфрачервоного (ІЧ) поглинання адсорбованих молекул (SEIRA - surface enhanced infrared absorption). Ефект SEIRA відкрито 1980 року Харстейном та його колегами. Вони помітили, що ІЧ поглинання молекул можна підсилити до 10-103 разів, якщо молекули адсорбуються на тонких шорстких або острівцевих плівках Au або Аg. Цей ефект подібний до підсиленого поверхнею комбінаційного розсіяння (SERS - surface enhanced Raman scattering). Осава разом з Ікедою 1991 року назвали підсилення металевою поверхнею ІЧ поглинання адсорбованих молекул ефектом SEIRA по аналогії з ефектом SERS. Через те, що фактор підсилення в ефекті SEIRA менший порівняно з SERS, цей ефект не отримав раніше належної уваги. Досі триває пошук та створення нових SEIRA-підсилюючих поверхонь. З одного боку, існує необхідність створити поверхні, які б забезпечували підсилення лише певних молекулярних груп, що дасть змогу досліджувати структурні особливості макромолекул. Для цього підходять SEIRA-активні поверхні з сильним зв'язком адсорбент-адсорбат, що забезпечать так званий “молекулярний” механізм підсилення. З іншого боку, існує потреба створити універсальні SEIRA-активні поверхні, на яких ефект підсилення не залежав би від властивостей адсорбованих молекул, а був би пов'язаний лише з оптичними характеристиками металевих поверхонь. Підсилення ІЧ поглинання молекул, які знаходяться поблизу таких поверхонь, зумовлене “електромагнітним” механізмом підсилення і не залежить від хімічної природи адсорбента. Такі поверхні можна використати для створення універсальних систем детектування і дослідження надмалих кількостей біологічних молекул. У дисертації експериментально досліджено вплив найважливіших чинників (типу молекулярних груп, товщини та геометрії поверхні металевої плівки, різних методів адсорбції) на ефект SEIRA. Ці дослідження важливі для перевірки існуючих теорій ефекту SEIRA, а також для подальшого його практичного застосування в ІЧ спектроскопії, біології та медицині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до планів наукової діяльності відділів фізики біологічних систем та фізичної електроніки Інституту фізики НАН України в межах тем: “Дослідження структурних особливостей та нелінійної динаміки біологічних макромолекул та утворених ними структур” (2002-2004, № Держреєстрації 0102U000596), “Дослідження фізичних принципів структурної організації та динамічної поведінки біологічних макромолекул” (2005-2007, № Держреєстрації 0105U001136), “Дослідження квантоворозмірних явищ у наноструктурах на основі металів, напівпровідникових і органічних сполук” (2002-2006, № Держреєстрації 0102U006971).

Мета і завдання дослідження. Метою даної дисертаційної роботи є експериментальне вивчення ефекту та механізмів підсилення оптичних переходів біоорганічних молекул поблизу наноструктурованої поверхні металу.

Для досягнення поставленої мети розв'язували такі задачі:

1) розробка чутливої методики на основі ефекту SEIRA для реєстрації і визначення структурних особливостей біологічних молекул;

2) визначення оптимальних параметрів наноструктурованих поверхонь (типу металу, геометрії поверхні, умов нанесення) для отримання максимального підсилення ІЧ поглинання адсорбованими молекулами;

3) комплексні дослідження різних біоорганічних молекул на острівцевій та шорсткій поверхні металу методами: спектроскопії в ІЧ, видимій та ультрафіолетової (УФ) області, поверхневого плазмонного резонансу (ППР), атомної силової мікроскопії (АСМ) та тунельної мікроскопії. Встановлення зв'язку між типом адсорбованої молекули і коефіцієнтом підсилення ІЧ поглинання в ефекті SEIRA;

4) визначення конформаційних станів дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) та альбуміну при їхній адсорбції на наноструктуровану поверхню металу;

5) узагальнення результатів проведених спектроскопічних досліджень для різних біоорганічних молекул.

Об'єктом дослідження були коливальні стани біоорганічних молекул: гуаніну (G), гліцину (a-Gly), бичачого сироваткового альбуміну (БСА), ДНК, пара-нітробензойної кислоти (п-НБК), тріс-дібензоїлметанатобатофенантроліну європію (Eu(DBM)3bath) адсорбованих на метали (Au, Ag, Cu) з різним нанорельєфом поверхні.

Предметом дослідження були ефект та механізми підсилення оптичних переходів біоорганічних молекул тонкими металевими плівками з різною топологією поверхні.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети було застосовано такі методи: ІЧ фур'є-спектроскопія поглинання та відбивання, УФ спектроскопія, метод ППР, аналіз спектрів за допомогою розкладу контуру на компоненти, АСМ та тунельна мікроскопія, статистичний аналіз для вивчення геометричних параметрів наноструктурованої поверхні металів.

Наукова новизна одержаних результатів

1. Досліджено ефект SEIRA і механізми підсилення оптичних переходів для різних біоорганічних молекул (G, a-Gly, БСА, ДНК, п-НБК, Eu(DBM)3bath), адсорбованих на шорсткі поверхні та острівцеві плівки металів (Au, Ag, Cu). Отримано низку результатів щодо конформаційних станів важливих макромолекул (БСА, ДНК) на металевих поверхнях.

2. Вперше проведено систематичне дослідження впливу низки факторів (типу та геометрії шорсткої поверхні металу, способів осадження молекул, pH, типу молекулярних груп) на підсилення ІЧ поглинання біоорганічних молекул поблизу наноструктурованої поверхні металу.

3. Показано, що максимальне підсилення ІЧ поглинання біологічних молекул забезпечують плівки золота товщиною 200-250 Е, з середнім розміром шорсткостей по висоті 10-20 Е, з протяжністю 200-900 Е, еліпсоїдальної форми.

4. Показано, що значне підсилення (більше ніж у 100 разів) вдається зареєструвати лише для плівок товщиною порядку моношару молекул альбуміну та п-НБК. Фактор підсилення поглинання для багатошарових плівок можна збільшити в 3-12 разів у випадку, коли досліджувані молекули знаходяться близько біля металу.

5. Розроблено нову чутливу методику для реєстрації ІЧ-спектрів та визначення структурних особливостей біоорганічних молекул на основі ефекту SEIRA.

Практичне значення одержаних результатів. Застосування ефекту SEIRA дає змогу збільшити ймовірність ІЧ переходів та виявити низку спектральних проявів структурних особливостей біологічних молекул. Знайдено умови для збільшення ефективності ефекту SEIRA. Завдяки цьому вдалося зареєструвати шар близький за товщиною до моношару молекул альбуміну та п-НБК. Встановлено вплив хімічного травлення і термічного відпалу на топологію поверхні металу та на підсилення в ефекті SEIRA. Отримані результати можна надалі використати для створення зручного і чутливого ІЧ-сенсора на основі ефекту SEIRA для детектування малих кількостей речовини та конформаційного аналізу біологічних молекул.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача такий:

у працях [1, 7, 8, 17, 22]: в аналізі літературних джерел по ефектах підсилення оптичних процесів поблизу поверхні металів, проведенні віднесення смуг поглинання до коливань певних молекулярних груп для молекул G, a-Gly, БСА, участь у вимірюванні та опрацюванні експериментальних даних;

у працях [6, 9, 11, 19]: в аналізі експериментальних геометрій застосування ефекту SEIRA, розрахунку коефіцієнта підсилення ІЧ поглинання для різних молекулярних груп в ефекті SEIRA, участь в інтерпретації експериментальних даних;

у працях [3, 4, 16, 20, 21]: у реєстрації ІЧ спектрів поглинання та пропускання, участь в обробці експериментальних даних та обговоренні отриманих результатів;

у працях [10, 13, 15, 23]: участь у виготовленні острівцевих та шорстких поверхонь золота та вивченні їхньої топології, визначенні оптимальних параметрів (товщини напиленого металу, геометрії поверхні, умов нанесення) для ефекту SEIRA, встановленні зв'язку між типом адсорбованої молекули та підсиленням ІЧ поглинання;

у працях [2, 5, 12, 14, 18]: у постановці та проведенні методичного експерименту з вивчення ефекту SEIRA, дослідженні різних біоорганічних молекул на острівцевій та шорсткій поверхнях металу, інтерпретації експериментальних даних.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації було представлено на: ІІІ-му з'їзді Українського біофізичного товариства (2002, Львів); the XVІ and XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals” (ISSSMC) (2003, Sevastopol; 2005, Beregove); 4-th аnd 5-th International Young Scientists Conference “Problems of Optics and high technology material science” (2003, Івано-Франківськ);1-ій та 2-ій Міжнародній науково-технічній конференції “Сенсорна електроніка і мікросистемні технології” (СЕМСТ) (2004, 2006, Одеса); 11-th European conference “Spectroscopy of Biological molecules” (ECSBM) (2005, Aschaffenburg, Germany); VIII-th International Conference on Molecular Spectroscopy, (2005, 2007, Wroclaw); III Internation conference on Hydrogen bonding and Molecular Interactions (2006, Kyiv); the 5-th International conference on Porous semiconductors - science and technology (2006, Sitges-Barcelona); VII-th Міжнародному семінарі “Методологические аспекты сканирующей зондовой микроскопии” (2006, Мінськ).

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковано в 23 працях, серед них 7-м статей у наукових фахових журналах та 16 тез доповідей на міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить вступ, п'ять розділів та висновки. Повний обсяг дисертації складає 168 стор., що містить 74 рисунки, 1 гістограму розподілу, 12 таблиць. Список використаних літературних джерел - 178 найменувань на 19 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертаційної роботи, сформульовано мету та задачі досліджень, показано наукову новизну та практичне значення отриманих результатів.

У першому розділі дисертації зроблено короткий огляд наукових публікацій, в яких описано дві групи ефектів збільшення інтенсивності оптичних процесів поблизу шорсткої поверхні або острівцевої плівки металів. До першої групи явищ, в яких проявляється підсилення оптичних переходів біоорганічних молекул поблизу металевої поверхні, належить гігантське комбінаційне розсіяння (ГКР) світла, підсилене поверхнею ІЧ поглинання (SEIRA), люмінесценція. До другої групи входять процеси, які не залежать від наявності адсорбованої молекули на металі, наприклад, підсилення гіганської другої гармоніки (ДГ). Суттєво, що існує зв'язок між цими явищами, наприклад, між ГКР світла і підсиленням генерації ДГ. Це вказує на існування універсального механізму підсилення оптичних явищ. Із накопиченням експериментальних даних було виявлено один з основних механізмів, який дозволяє найбільш повно і несуперечливо інтерпретувати особливості підсилення оптичних процесів. Цей механізм - локальне підсилення електричного поля зовнішньої хвилі внаслідок збудження локальних (поверхневих) плазмонних коливань у шорсткостях поверхні або в наночастинках металу і визначається структурою неоднорідностей поверхні, діелектричними властивостями металу та оточуючого середовища. Підсилення оптичних явищ має місце для частот, на яких: еґ(щ)<0, еґ(щ)/еґґ(щ)>>1, де е(щ)=еґ(щ)+іеґґ(щ) - комплексна діелектрична проникність металу, що межує з діелектриком. Ці співвідношення є необхідними умовами існування та високої “добротності” поверхневих електромагнітних мод, які виникають в неоднорідностях металевої плівки. Другий механізм підсилення полягає в зростанні дипольного моменту переходу адсорбованих молекул поблизу металевої поверхні (молекулярна складова підсилення).

У розділі описано властивості поверхневих електромагнітних хвиль і локальних плазмонних коливань, які збуджуються на металевій поверхні. Проаналізовано наближення ефективного середовища для опису оптичних властивостей наноструктурованих металевих плівок. Аналіз літератури показав, що структура реальних підсилюючих систем (острівцеві та шорсткі тонкі плівки металу) та її зв’язок з підсиленням оптичних процесів настільки складні, що досі є актуальними системні дослідження впливу морфології поверхні та структури біологічних молекул на підсилення оптичних процесів поблизу металу.

У другому розділі описано метод ІЧ фур’є-спектроскопії, який характеризується високою інформативністю та чутливістю і належить до неруйнуючих експериментальних методів аналізу біоорганічних молекул та дає змогу проводити якісний і кількісний аналіз зразків у будь-якому агрегатному стані, розшифровувати невідому структуру та ідентифікувати речовину. Але дослідження біологічних молекул часто потребують специфічних підходів та методів. Тому нами запропоновано методику реєстрації спектрів на основі ефекту SEIRA, який виникає внаслідок зміни оптичних характеристик молекул при їх адсорбції на поверхню металевих наноструктур, які є акумуляторами та підсилювачами падаючого та відбитого випромінювання. Ефект SEIRA дає змогу збільшити ймовірність ІЧ переходів та виявити структурні особливості біологічних молекул.

Дослідження ефекту SEIRA проводили за допомогою серійного фур’є-спектрометра Bruker IFS-66 (Німеччина) в області 400 - 4000 см-1 у геометрії на відбивання і пропускання. Обробку спектрів здійснено за допомогою програми Opus-5.5, що входить до складу Bruker IFS-66 та програми OMNIC, розклад складних смуг на компоненти здійснювався програмою PeakFit.

Аналіз різних експериментальних геометрій застосування ефекту SEIRA, таких як порушене повне внутрішнє відбивання (ППВВ), пропускання та ІЧ поглинання у відбиванні показав, що всі вони перспективні та взаємодоповнюють одна одну при дослідженні біологічних молекул. Зокрема, геометрію на відбивання можна використовувати для дослідження плівок біологічних молекул, які нанесені на шорсткі поверхні металу. Геометрію ППВВ можна застосовувати як для дослідження порошків, так і для рідин, які нанесені на плоску поверхню металу. Це єдина можлива геометрія, якщо рідина сильно поглинає в ІЧ області. Для збільшення чутливості реєстрації потрібно використовувати призми з багатократним відбиванням. Геометрію на пропускання доцільно використовувати для дослідження тонких плівок біологічних молекул, які осаджені на острівцеву плівку металу. У цьому розділі також описано застосовану методику виготовлення металевих плівок та мікроскопічні методи дослідження топології їхньої поверхні (AСM, електронна мікроскопія).

У третьому розділі подано теоретичні основи та описано механізми підсилення в ефекті SEIRA. Інтерпретація ефекту SEIRA є аналогічною до SERS і містить два основних механізми: електромагнітний, який полягає у підсиленні зовнішнього електромагнітного поля поблизу шорсткої металевої поверхні внаслідок взаємодії з поверхневими або локальними плазмонами, та молекулярний, який пов’язаний із зростанням дипольних моментів переходів та зміною поляризовності адсорбованих молекул біля поверхні металу. Енергія падаючих фотонів збуджує оптичні переходи в адсорбованих молекулах та поверхневі (локальні) плазмонні коливання в острівцях або шорсткостях поверхні металу (Рис.1а). Плазмони - колективні коливання електронної густини є резонансами, частота яких визначається формою границі поверхні та густиною електронних станів. Виходячи з залежності діелектричної функції від частоти для металів та умов, за яких спостерігається явище підсилення, можна говорити про наявність ненульової густини електронних станів у ІЧ області, про збудження світлом цих станів та появу додаткового локального поля. Енергія від плазмонних коливань передається адсорбованим молекулам, що зумовлює збільшення поглинання цими молекулами (Рис.1б).

Рис.1. Схематичне представлення ефекту SEIRA.

Теоретична інтерпретація ефекту підсилення подана у загальному вигляді В.Кособукіним. Ефективний переріз процесу взаємодії світла з молекулою, адсорбованою на металеву поверхню, можна записати:

(r,) ~ (0) g(r,щ)2 h(r)2, (1)

де (0) - переріз для вільної молекули за відсутності металу (E=E0); g(r,щ) - коефіцієнт підсилення електричного поля; h(r) - коефіцієнт підсилення дипольного моменту адсорбованої молекули. Підсилення електромагнітного поля залежить від форми та розміру неоднорідностей металевої плівки, а також діелектричних властивостей металу і довколишнього середовища та визначається, в основному, функцією діелектричної проникності металу: g(щ) ~ |еґ|/еґґ. Тому розрахунковий коефіцієнт підсилення електромагнітного поля в ефекті SEIRA розраховано як відношення дійсної та уявної частини діелектричної проникності металу на відповідній частоті: gроз=|еґ(щ)|/еґґ(щ), використовуючи експериментальні значення оптичних констант для металу. Було розраховано коефіцієнти підсилення електричного поля для таких металів: Ag, Au, Cu, Mo, Pt, Ni, Ir. Розрахунки показали, що Au, Ag та Cu є найбільш вдалими підсилюючими поверхнями в ІЧ області (Рис.2), серед них золото - хімічно інертне, що й зумовило його вибір для подальших досліджень.

Рис.2. Оцінка коефіцієнта підсилення електричного поля поблизу поверхонь різних металів та вуглецю.

Експериментальний коефіцієнт підсилення ІЧ поглинання в ефекті SEIRA знаходився як відношення інтегральної інтенсивності смуги поглинання відповідної молекулярної групи на металевій поверхні до інтенсивності смуги поглинання цієї молекулярної групи на нейтральній підкладці (СаF2, BaF2, LiF) - .

На прикладі молекул a-Gly нами експериментально досліджено прояв двох основних механізмів підсилення в ефекті SEIRA: електромагнітного та молекулярного. Досліджено вплив способу осадження і товщини плівки адсорбованих на золоті молекул на ефект SEIRA. Для цього порівнювали поглинання плівки молекул a-Gly, осадженої з водного розчину і термічно напиленої у вакуумі на CaF2 та поверхню золота з наношорсткістю ~13 нм. Зразки, які осаджували з розчину, перед вимірами ліофільно висушували. Гліцин з порошку термічно напиляли у вакуумі на підкладку зі швидкістю 1-1,5 нм/с при температурі 250-255 0С. Товщина плівки a-Gly, виміряна мікроінтерферометром Лінника МИИ-4, не перевищувала 3855 нм і для напиленої, і для осадженої плівки. Порівнюючи ІЧ спектр поглинання молекул a-Gly, осаджених з розчину, і термічно напилених, можна стверджувати, що при термічному напиленні не відбувається розпаду молекули гліцину (Рис.3).

Рис.3. Спектри ІЧ поглинання плівки a-Gly: осадженої з розчину на Au/SiO2 підкладку (1) та термічно напилених у вакуумі на CaF2 (2) і Au/SiO2 (3) підкладки в області 3300-1800 (а) та 1800-800 см-1 (б).

З Табл.1 видно, що найбільше підсилення ІЧ поглинання спостерігається для NH3+ та COO- груп. Тому можна припустити, що молекули a-Gly просторово орієнтовані так, що наближаються групами NH3+ і COO- до поверхні золота. Враховуючи те, що сусідні молекули a-Gly розміщені у плівці дуже близько одна до одної (на віддалі 2-3 Е), міжмолекулярна взаємодія між ними більша, ніж взаємодія між молекулами a -Gly і золота. Це, можливо, одна з причин малого підсилення ІЧ поглинання для молекул a-Gly, осаджених з розчину на шорстку поверхню золота. Тільки після термічного вакуумного напилення вдається певним чином орієнтувати молекули a-Gly на поверхні золота і досягти підсилення поглинання у 2-13 разів (Табл.1). Електромагнітний механізм підсилення пов'язаний із підсиленням електричного поля біля поверхні металу, яке загасає при віддалені від поверхні. При термічному напиленні молекули a-Gly розташовуються ближче до поверхні золота, ніж при осадженні з розчину. Тому на них діє сильніше електричне поле, що сприяє більшому їхньому поглинанню.

Таблиця 1.

Коефіцієнт підсилення поглинання молекул a-Gly, осаджених різними методами.

Аналізуючи дані наведені в Табл.1 для експериментального коефіцієнта підсилення, можна зробити висновок, що поглинання різних молекулярних груп підсилюється по-різному, тоді як для розрахункового коефіцієнта підсилення величина підсилення монотонно зменшується з частотою світла. Це вказує на те, що крім електромагнітного механізму існує інший механізм, який залежить від типу молекулярних груп та їх просторового розміщення відносно наноструктурованої поверхні золота. Після термічного напилення поглинання молекул a-Gly збільшується в області 3300-1300 cм-1, хоча для цих же молекул, осаджених з розчину, спостерігається зростання підсилення ІЧ поглинання в області 1300-500 cм-1.

Отже, для збільшення підсилення необхідно максимально наблизити молекули до поверхні металу, як це було зроблено за майже одночасного напилення a-Gly і золота на нейтральну підкладку СaF2. При цьому спостерігалось краще розділення смуг поглинання a-Gly та проявилась смуга на 1437 см-1, яка спостерігається також для газової форми молекул a-Gly. Це може вказувати на те, що плівка гліцину розділяється наноструктурами золота, тобто утворюється композитна плівка Au та молекул a-Gly. Молекула a-Gly у конденсованому стані перебуває у цвіттеріоній формі, але при термічному напиленні формується плівка, в якій співіснують молекули a-Gly в цвіттеріоній та молекулярній (нейтральній) формі. Незважаючи на те, що плівки молекул a-Gly при напиленні на золото мали товщину ~300 нм, нам вдалось зареєструвати суттєве підсилення ІЧ поглинання для молекул a-Gly (в 10-12 разів). Тому можна припустити, що підсилюється поглинання не лише для шарів молекул, що розташовані близько до золота (~10-50 нм), але й дальних. Тобто, існує і короткодіюча, і далекодіюча компоненти підсилення. Це дає змогу використовувати ефект SEIRA для чутливих спектроскопічних досліджень як для моношарів так і для багатошарових плівок речовини.

Молекулу a-Gly використано нами також для вивчення молекулярного механізму підсилення ІЧ поглинання в ефекті SЕIRA. Ця молекула містить дві групи з протилежними властивостями: карбоксильну групу (кислотну) та аміногрупу (з основними властивостями). При нейтральному pH молекула a-Gly перебуває в цвіттеріоній формі, при підвищенні чи пониженні pH молекула переходить в моноіонну форму. Усі амінокислоти при pH=4-9 поводять себе одночасно як кислоти (донори протонів) і як основи (акцептори протонів).

При pH=13,5 на золоті спостерігалось зміщення положення та уширення смуги валентного коливання групи NH2 з 3391 до 3385 cм-1, а також зміщення смуги COO- у низькочастотну область. Однак не відбувалось підсилення ні COO- групи, ні інших груп. У цьому випадку можна припустити, що золото впливає на “акцепторні” властивості молекул a-Gly. Тобто, золото впливає на орієнтацію молекул a-Gly на поверхні, притягує до себе електронну оболонку молекулярних груп СОО- і NH2, а також впливає на процес передачі протона з одної молекулярної групи до іншої між молекулами a-Gly у плівці. При pH=2 для молекул a-Gly на золоті спостерігали збільшення інтенсивності смуги COOH валентного коливання на 1745 cм-1 у 10 разів та підсилення водневих зв'язків обох валентних на 3167 cм-1 і деформаційних на 1604 cм-1 NH3+ коливань. Наявність смуги на 1745 cм-1, яка відноситься до валентного коливання C=O у групі COOH, вказує на існування катіонів a-Gly у плівці. Із підвищенням pH ця смуга зникає. При pH=2 можна припустити наявність також деякої кількості молекул a-Gly у цвіттеріоній формі на золоті. Про це свідчить смуга 1424 cм-1, яку відносять до симетричного валентного коливання групи COO-. При цьому вдалось зареєструвати на золоті обертони для тонкої плівки (250-275 нм) a-Gly в області 2200-2800 cм-1, які зазвичай можна зареєструвати лише в товстих монокристалах. Ми припускаємо, що золото при низькому рН впливає на “донорні” властивості молекул a-Gly та на реорганізацію водневих зв'язків.

Отже, золото може впливати на “донорно-акцепторні” властивості молекул a-Gly, тому можна припустити утворення специфічного зв'язку між золотом і молекулами a-Gly. З аналізу наших даних можна зробити висновок, що ця взаємодія є слабка. Максимальний зсув частот, який ми спостерігали для молекул a-Gly на золоті, (вал.N-H) ~10-25 cм-1. Отже, взаємодія між молекулярними групами і золотом менша порівняно з міжмолекулярною взаємодією. E. Крячко вказує на можливість виникнення нетрадиційних специфічних “якірних” водневих зв'язків N-H…Au та O-H…Au. При цьому спостерігається зміщення смуг:(N-H)=199-221 cм-1 та (O-H) = 453-520 cм-1.

Для амінокислот є характерним утворення мідних солей, що мають специфічний синій відтінок. Ці речовини є внутрішніми комплексними солями: у них атом Cu зв'язаний не лише з атомами кисню, але й з атомами азоту аміногруп. При осадженні молекул a-Gly на поверхню Cu змінювався колір зразка, набуваючи голубого відтінку та з'явились нові смуги у спектрі поглинання, тобто утворились комплекси a-Gly з Cu. Внаслідок хімічної адсорбції молекул a-Gly на поверхню Cu зростав коефіцієнт підсилення ІЧ поглинання в ефекті SEIRA.

Крім вивчення ефекту SEIRA на шорстких поверхнях металу (Au, Cu) було проведено дослід з негативно зарядженими колоїдними частинками Au діаметром 315-4000 Е. При адсорбції молекул a-Gly на колоїдне золото з'являється характерна смуга на 1269 см-1, яку можна віднести до коливання групи NH2. Коефіцієнт підсилення у цьому випадку становив 2-3 рази для різних молекулярних груп. Поява смуги на 1269 см-1 дає підставу припустити, що відбувається електростатична взаємодія між позитивно зарядженою групою NH3+ та від'ємно зарядженим колоїдним золотом. Внаслідок цієї взаємодії молекула a-Gly переходить у монойонну форму.

У четвертому розділі представлено результати аналізу топології поверхні тонких металевих плівок та її вплив на ефект SEIRA. Досліджено серію плівок золота різної товщини (170-450 Е), отриманих за різних умов напилення і відпалу (T=120 та 240-250 оС), що дозволило охопити різні топології поверхні. Плівки одержували термічним випаровуванням Au чистотою 99,999 % у вакуумі при тиску 10-6-10-7 Торр на прозорі скляні пластини при кімнатній температурі зі швидкістю осадження ~ 1-2 нм/с. У процесі осадження Au товщину плівок контролювали за допомогою кварцового резонатора і характеризували так званою “масовою” товщиною. Проведено виміри спектрів поглинання, відбивання та пропускання золотих плівок за допомогою спектрофотометра СФ-2000 у діапазоні довжин хвиль від 300 до 1000 нм. Для цих плівок золота різної товщини було розраховано спектри відбивання та поглинання у видимій області. Використовуючи узагальнене симетричне наближення Бруггемана для ефективного середовища, отримано добре узгодження експериментальних та розрахованих спектрів для цих плівок, що підтверджує точність визначення їхньої товщини. Морфологію поверхні вивчали за допомогою АСМ типу NanoScope ІІІа, Digital Instrument. Як підкладки використовували пластини скла двох типів: Ф1 (n=1,62) та К8 (n=1,52), які відрізнялись способом і якістю полірування поверхні. На них напиляли золоті плівки різної товщини (170, 250, 350, 450 Е) з адгезійним шаром Сr товщиною 50 Е та золоті плівки товщиною 250, 350, 450 Е без адгезійного шару Сr.

Виявлено різний вплив відпалу на тонкі, майже острівцеві (170, 250 Е) та суцільні плівки золота (350, 450 Е). Наприклад, у тонких плівках золота відпал при Т=250 оС призводить до збільшення геометричних розмірів шорсткості, а в товстих плівках відпал зменшує кількість шорсткостей та їхні розміри - нанорельєф стає плавним і згладженим. Прояв відпалу залежить не лише від товщини плівки, але й від температури і часу впродовж якого він відбувається.

Для визначення середньо-статистичних геометричних параметрів шорсткості (або острівців) профіль поверхні отримано нами з АСМ вимірів, проведених в режимі періодичного контакту, скануванням на ділянці 2х2 мкм (256х256 точок). Статистичні геометричні параметри можна описати автоковаріаційною (або автокореляційною) функцією (AКФ):

AКФ(k) = , (2)

де N - кількість точок в одному перерізі. AКФ є вимірюванням “самоподібності” профілю. Якщо поверхня випадкова, АКФ швидко прямує до нуля. Для поверхонь із Гаусівською шорстістю AКФ(0)=д=RMS2. Довжина кореляції у - довжина вздовж осі Х, де функція автоковаріації вперше перетинає нуль. Вихідна поверхня скла достатньо гладка, тому рельєф утворений переважно напиленими на поверхню індивідуальними острівцями або шорсткістю плівки золота. Тому розрахувавши АКФ поверхні, можна отримати усереднені геометричні параметри індивідуальних нерівностей поверхні металу.

Використовуючи АСМ зображення поверхонь золота, виділяли 50 зерен на кожній поверхні, через них проводили переріз, з якого також визначали висоту і ширину виступів рельєфу, які потім усереднювали. Наприклад, на Рис.4 наведено АСМ зображення та переріз, який проведений через зерна відпаленої при T=240 оC плівки Au товщиною 250 Е з адгезійним шаром хрому. Для цієї підкладки середня висота шорсткості золотої поверхні - 12 Е та діаметр - 801 Е, що добре корелює з параметрами д=11,2 Е та у=844,2 Е, визначеними з аналізу АКФ (Табл.2). Аналіз топології поверхні показав, що окремі нерівності рельєфу (або острівці) мають еліпсоїдальну форму з розмірами півосей значно меншими довжини хвилі світла. Наші оцінки показують, що для таких шорсткостей (частинок золота еліпсоїдальної форми), величина електричного поглинання більша, ніж магнітного. Водночас, для шорстких металевих поверхонь спостерігається неоднорідне уширення їхньої смуги поглинання. Це пов'язано з відхиленням індивідуальних форм виступів рельєфу від сферичної форми та розкидом співвідношення півосей еліпсоїдів, до яких наближається форма неоднорідностей поверхні. Тому на таких поверхнях можуть збуджуватись декілька локальних поверхневих мод, частоти яких визначаються анізотропією осей еліпсоїда через фактор деполяризації.

Рис.4. АСМ зображення (а) та переріз (б) відпаленої при T=240 оC плівки Au товщиною 250 Е з адгезійним шаром хрому.

Таблиця 2.

Середні геометричні параметри (д, у) шорсткості (або острівців) золотої поверхні та коефіцієнт підсилення ІЧ поглинання (g) молекул a-Gly для групи NH.

Нами досліджено вплив топології поверхні золота на підсилення ІЧ поглинання молекул a-Gly. Для цього молекули a-Gly з водного розчину концентрацією 0,5 мг/мл по 5 мкл осаджували на різні поверхні золота. У Табл.2 подано значення коефіцієнта підсилення ІЧ поглинання g молекулами a-Gly для частоти NH валентного коливання на 3169 cм-1 та середні параметри шорсткості поверхні золота. З Табл.2. видно, що найкраще підсилюють ІЧ поглинання молекул a-Gly острівцеві та шорсткі поверхні золота товщиною 170-250 Е, відпалені при T=240-250 оC впродовж 30 хв. Оскільки, внаслідок термічного відпалу змінюється гранулярна структура металевих плівок, а відповідно, і оптичні константи металу. Зокрема, зменшується еґґ, тому зростає |еґ|/еґґ, до якого пропорційне g. Після відпалу нанорельєф плівки характеризується середньою висотою шорсткості (або острівця) 10-20 Е і протяжністю 200-900 Е.

У п'ятому розділі подано результати дослідження підсилення ІЧ поглинання біоорганічних молекул (БСА, G, ДНК, п-НБК, комплексу Eu(DBM)3bath), адсорбованих на металеву поверхню. Для багатошарових плівок БСА на золоті спостерігається незначне підсилення поглинання порівняно з багатошаровими плівками молекул a-Gly. Основна маркерна смуга, амід І підсилюється в 2,2 рази при адсорбції молекул БСА на колоїдне золото і в 1,3 рази при адсорбції БСА на шорстку поверхню золота, що узгоджується з дослідами Kухне, в яких зареєстровано коефіцієнт підсилення для аміду І майже 1,4 рази. Використовуючи поверхні золота після хімічного травлення, внаслідок чого нанорельєф поверхні згладжувався, спостерігали зменшення і ППР сигналу, й інтенсивності смуги поглинання аміду І для молекул БСА в ефекті SEIRA. Водночас ефект SEIRA дає змогу на шорсткому золоті зареєструвати шар БСА, який за товщиною близький до моношару (Рис.5, крива1). У цьому випадку коефіцієнт підсилення ІЧ поглинання ~100 разів для смуги амід І. Слід зазначити, що неможливо зареєструвати аналогічний шар БСА на підкладці CaF2 за відсутності ефекту підсилення (Рис.5, крива 2).

Рис.5. Спектри поглинання БСА: 1 - шар, який близький до моношару на Аu, 2 - на СaF2; 3 - багатошарова плівка на СaF2.

Рис.6. Розклад контуру на компоненти смуги амід І для шару молекул БСА близького до моношару.

Молекула БСА має розірвані дисульфідні зв’язки, тому внаслідок Ван-дер-Вальсової, ковалентної і електростатичної взаємодії частіше формується на золоті щільно упакований моношар молекул БСА, а не полішари. Однак, наприклад, немає можливості створити моношар ДНК без хімічної функціоналізації золотої поверхні чи без приєднання до молекул ДНК додаткових молекулярних груп або молекул, які формують зв'язки із золотом. Тому всі експерименти з молекулами ДНК ми проводили для багатошарових (товстих) плівок ДНК.

У роботі показано, що ефект SEIRA можна також ефективно застосовувати для визначення конформаційного стану складних макромолекул - білків та ДНК. Виявлено, що шорстка поверхня золота не впливає на конформацію БСА та ДНК на противагу колоїдному золоту, яке змінює структуру молекул ДНК, що спричиняє виникнення конформації молекули з переважним вмістом А та Z форми. По площі під смугами, які відповідають сумарним вкладам коливань б-спіралі (1650-1655 см-1), поворотів (1665-1680 см-1), в-форми (1620-1624, 1640-1645, 1680-1690 см-1), невпорядкованої структури (1658-1667 см-1), коливань бічних ланцюгів амінокислот (1600-1610, 1680-1720 см-1) визначали їх внесок у смугу аміда І. Розрахунки показали, що домінуючою конформацією в усіх випадках є б-спіраль (40±5%), що відповідає даним рентгеноструктурного аналізу та ЯМР для молекул БСА. Аналіз спектрів поглинання плівки БСА за товщиною шару близького до моношару на золотій поверхні вказує на деякі відмінності конформаційного складу (Рис.6). Це пов'язано із значним впливом золотої поверхні: у цій плівці краще виділяються коливання бічних амінокислотних ланцюгів. За допомогою SEIRA методу також досліджено зв'язування БСА з одностінними вуглецевими нанотрубками (ВНТ). Виявлено, що під час взаємодії молекул БСА з ВНТ відбуваються конформаційні зміни в структурі білка, які характеризуються зменшенням вмісту б-спіралі, води і збільшенням вмісту бічних ланцюгів і поворотів.

Як показано у дисертації, поглинання не всіх молекулярних груп підсилюється однаково. Це залежить від типу, заряду, дипольного моменту і орієнтації молекули відносно поверхні металу. Найкраще підсилюється поглинання молекул з р-системами (бензольні та інші кільця), групи з неподіленою парою електронів, полярні групи. Високе значення коефіцієнта підсилення поглинання для надтонких шарів має місце внаслідок сильної взаємодії молекул з металом. Поглинання таких макромолекул як БСА і ДНК у багатошарових плівках підсилюється слабше порівняно з малими молекулами a-Gly і G (рис.7). Можливо це пов’язано з тим, що при адсорбції молекула ДНК має декілька точок дотику із шорсткою поверхнею золота. Хоча, для плівки молекул БСА, близької за товщиною до моношарової, коефіцієнт підсилення поглинання досягає 100 разів. Максимальний коефіцієнт підсилення (близько 200 разів) спостерігали при адсорбції молекул п-НБК на металеву поверхню (Рис.8). Зазвичай, цю молекулу використовують для вивчення ефекту SEIRA у геометрії на пропускання та ППВВ, оскільки молекула п-НБК здатна хімічно адсорбуватись на металі, формуючи тонкі та однорідні плівки. Наприклад, Осава та Ікеда спостерігали підсилення поглинання хімічно адсорбованих молекул п-НБК на металі для симетричного валентного коливання NO2 більше, ніж у 600 разів у геометрії на пропускання. Для багатошарових плівок (G, a-Gly, ДНК, БСА, комплексу Eu(DBM)3bath), осаджених на металеву поверхню, коефіцієнт підсилення ІЧ поглинання в ефекті SEIRA зменшується із збільшенням кількості шарів молекул і в середньому досягає значень у діапазоні 2-7 разів для різних молекулярних груп.

Коефіцієнт підсилення поглинання для багатошарових плівок може збільшитись у 3-10 разів, коли молекули знаходяться ближче до металу. Це показано на плівках молекул a-Gly та комплексу Eu(DBM)3bath, отриманих термічним вакуумним напиленням у порівнянні з плівками осадженими з водного розчину.

Рис.7. Експериментальний коефіцієнт підсилення поглинання для багатошарових плівок різних молекул.

Рис. 8. SEIRA спектри плівки п-НБК,осадженої з розчину на шорстку поверхню Au та СaF2 підкладку.

Підсумовуючи наші експериментальні результати та літературні дані, можна сформулювати умови для отримання максимального підсилення в ефекті SEIRA:

1. Молекули потрібно осаджувати на острівцеву плівку чи шорстку поверхню золота тонкими та однорідними шарами, близькими до мономолекулярних. Адсорбовані молекули мають взаємодіяти з шорсткою поверхнею металу, зокрема, внаслідок виникнення хімічного зв’язку.

2. Потрібно використовувати шорстку наноструктуровану або острівцеву плівку золота, біля поверхні якої виникає підсилення локального електромагнітного поля внаслідок збудження локальних чи поверхневих плазмонів. Зокрема, у наших експериментах у геометрії на відбивання максимальне підсилення досягається на плівках золота товщиною 170-250 Е, із середньою висотою шорсткості 10-20 Е та протяжністю 200-900 Е. Завдяки еліпсоїдальній формі наночастинок металу та широкому діапазону значень співвідношення їх довжин півосей, поверхневі (локальні) плазмони в них можуть збуджуватись у широкому спектральному діапазоні - від 0,5 мкм до кількох мікрометрів. Для геометрії на пропускання оптимальна товщина золота становить 40-140 Е.

3. Для SEIRA і SERS ефектів необхідне використання однорідного профілю металевої наношорсткої поверхні або регулярних металевих структур.

4. Необхідне використання спеціальних методів осадження молекул на поверхню металу. У деяких випадках досягається високе підсилення при використанні термічного вакуумного напилення біоорганічних молекул або їх осадження на функціоналізовану поверхню золота з розчину чи у проточній кюветі у ППР методі. Для функціоналізації золотої поверхні зазвичай використовують молекули, які здатні хімічно зв’язуватись із золотом та формувати самоорганізовані моношари, зокрема алкілтіоли або олігоетилени, які спонтано формують плівки внаслідок втрати H у групі SH і утворюють зв’язки S-метал. Наприклад, завдяки використанню функціоналізованих поверхонь досліджують реакцію тіло-антитіло методом SEIRA .

5. Найбільший коефіцієнт підсилення реалізується в геометрії багатократного ППВВ. Для цього на призму напилюють острівцеву плівку золота товщиною 20-70 Е.

Отже, ефект SEIRA можна ефективно використовувати для детектування малої кількості речовини та визначення конформаційних станів макромолекул. Межа детектування - 10 пг/cм2 (6x10-14 М/cм2) для молекул п-НБК для ефекту SEIRA у геометрії багатократного ППВВ, що вказує на високу чутливість цього методу. Внаслідок використання шорсткої золотої поверхні вдається розширити спектральний діапазон досліджень, який обмежений поглинанням традиційних ІЧ підкладок (СаF2, BaF2, SiO2). До переваг методу SEIRA можна також віднести можливість визначати орієнтацію молекул в орієнтованих зразках та реєстрацію додаткових коливальних станів завдяки порушенню правил відбору на межі метал-молекула. Останнє можна вважати і одним із недоліків цього методу, тому що окремі коливальні стани можуть зменшувати свою інтенсивність,