Автореферат In silico дизайн інгібіторів протеїнкінази СК2

Автореферат - In silico дизайн інгібіторів протеїнкінази СК2

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

ГОЛУБ АНДРІЙ ГРИГОРОВИЧ

УДК 577.322

In silico дизайн інгібіторів протеїнкінази СК2

03.00.03 – молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі комбінаторної хімії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор
Ярмолюк Сергій Миколайович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу комбінаторної хімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Тукало Михайло Арсентійович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора інституту з наукової роботи,

завідувач відділу ензимології білкового синтезу;

доктор хімічних наук

Качковський Олексій Дмитрович,
Інститут органічної хімії НАН України,

провідний науковий співробітник
відділу кольору та будови органічних сполук.

Провідна установа: Київський національний університет імені Т. Г. Шевченка, біологічний факультет, м. Київ.

Захист відбудеться 19 червня 2007 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 17 травня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Передача сигналу шляхом фосфорилювання/дефосфо-рилювання білків є загальновідомим механізмом, що забезпечує більшість фізіологічних та патологічних процесів у клітині. З огляду на те, що процес фосфорилювання каталізують ферменти протеїнкінази, вони є важливими регуляторами клітинних функцій. Одним з таких ферментів, що належить до класу серин-треонінових протеїнкіназ, є протеїнкіназа СК2, яка контролює значну кількість клітинних процесів, включаючи клітинний ріст та проліферацію. СК2 є плейотропною, конститутивною кіназою, що локалізується у цитоплазматичних та ядерних компартментах відповідно до її клітинних функцій (Ahmed et al., 2002).

Хоча СК2 є об’єктом інтенсивного вивчення протягом останніх 50 років, її біологічна роль та способи регуляції активності залишаються не до кінця зрозумілими (Battistutta et al., 2005). Одним із підходів, який застосовують для вивчення функцій протеїнкіназ, а також сигнальних шляхів, у яких вони беруть участь, є використання специфічних низькомолекулярних інгібіторів. Такі інгібітори є особливо ефективними у випадку конститутивно активних протеїнкіназ, які не активуються у відповідь на специфічні стимули та існують у клітині лише в активній формі (Sarno et al., 2005). Отже, у випадку протеїнкінази СК2 використання специфічних інгібіторів є однією із найперспективніших стратегій для вивчення її функціональних особливостей.

Якщо активність протеїнкінази або її підвищення за певних умов призводить до патологічних змін (Cohen, 2002; Noble et al., 2005), то інгібітори такої протеїнкінази є потенційними попередниками фармацевтичних препаратів. Щодо СК2, то значна кількість експериментальних даних вказує на те, що вона бере участь у розвитку низки патологічних станів. СК2 функціонує як загальний антиапоптотичний агент (Wang et al., 2005), який сприяє виживанню клітини в умовах, коли клітинна смерть є необхідною. Експресія СК2 значно підвищена в більшості пухлин та у швидко проліферуючих тканинах (Tawfic et al., 2001). СК2 використовується багатьма вірусами для фосфорилювання власних білків (Meggio et al., 2003), а також бере участь у розвитку запальних процесів (Yamada et al., 2005). Таким чином, СК2 є перспективною мішенню для розробки протипухлинних, противірусних та протизапальних препаратів.

Разом із тим, поки що жоден з відомих інгібіторів СК2 не використовують у клінічній практиці. Отже, пошук нових специфічних інгібіторів СК2, що мали б високу активність, є нині актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась за конкурсною тематикою “Розробка інгібіторів протеїнкіназ CDK2 та CK2 як потенційних ліків проти онкологічних захворювань” в рамках проекту “Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини”, договори №№ 3/2004, 3/2005, 3/2006, затверджено президією НАНУ від 25.11.03.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи була розробка нових низькомолекулярних інгібіторів СК2 людини та дослідження їхньої взаємодії з амінокислотними залишками активного центру СК2 методами комп’ютерного моделювання. Для досягнення цієї мети було поставлено та вирішено такі завдання:

1. Провести рецептор-орієнтований віртуальний скринінг бібліотеки малих органічних сполук та перевірити активність in vitro перспективних сполук.

2. Дослідити молекулярну динаміку (МД) СК2 та її комплексів із найактивнішими інгібіторами.

3. Розробити модель взаємодії отриманих низькомолекулярних інгібіторів із СК2.

4. Встановити кореляцію “хімічна структура - біологічна активність” в низці розроблених інгібіторів.

5. Дослідити специфічність розроблених інгібіторів СК2 в ряду протеїнкіназ.

6. Спрогнозувати структуру інгібіторів СК2 з більш високою активністю.

Об’єкт дослідження: інгібіторна активність низькомолекулярних органічних сполук щодо СК2 людини.

Предмет дослідження: комплекси “СК2-інгібітор”, молекулярна динаміка комплексів “СК2-інгібітор”; механізми взаємодії інгібіторів з активним сайтом СК2, які обумовлюють їхню інгібіторну активність; специфічність інгібіторів СК2 щодо різних протеїнкіназ.

Методи дослідження: гнучкий молекулярний докінг, метод молекулярної динаміки, метод термодинамічної інтеграції, біохімічне тестування активності протеїнкіназ in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Розроблено та охарактеризовано два нові класи високоактивних специфічних інгібіторів СК2 людини – тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли та 3_карбокси-4-(1Н)-хінолони.

2. Уперше проведено розрахунок та дослідження молекулярної динаміки СК2 людини та її комплексів з низькомолекулярними інгібіторами.

3. Уперше побудовано модель взаємодії нових інгібіторів з амінокислотними залишками активного сайту СК2 та визначено міжмолекулярні контакти, що обумовлюють активність нових інгібіторів. Встановлено залежність хімічної структури розроблених інгібіторів від їхньої біологічної активності.

4. Уперше вивчено специфічність нових інгібіторів СК2 в ряду протеїнкіназ.

5. Передбачено хімічну структуру потенційно більш активних інгібіторів протеїнкінази СК2.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті цієї дисертаційної роботи отримано 2 нових класи високоактивних специфічних інгібіторів протеїнкінази СК2 та охарактеризовано їх взаємодію з ферментом. Ці дані можуть бути використані:

1. Для вивчення особливостей функціонування СК2 в сигнальних шляхах, у яких вона бере участь.

2. Для вивчення низки патологічних процесів, зокрема механізмів пухлиноутворення, інфекційних та запальних процесів, які протікають за участі СК2.

3. Розроблені інгібітори СК2 є потенційними попередниками терапевтичних препаратів, на основі яких через подальшу оптимізацію можуть бути розроблені ліки для терапії онкологічних, інфекційних та запальних захворювань.

4. Запропонована модель взаємодії нових інгібіторів із СК2 дає змогу глибше зрозуміти молекулярну картину функціонування протеїнкіназ та структурні особливості комплексів СК2 із низькомолекулярними інгібіторами. Ця модель може бути використана для подальшої розробки та структурної оптимізації інгібіторів СК2.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором власноручно проведено експерименти, пов’язані з молекулярним моделюванням. Виконано віртуальний скринінг бібліотек низькомолекулярних сполук, розраховано молекулярну динаміку СК2 та її комплексів з інгібіторами, визначено різницю вільної енергії зв’язування методом термодинамічної інтеграції, здійснено параметризацію програм молекулярного докінгу та молекулярної динаміки. Здобувачем особисто проведено аналіз та порівняння результатів МД, аналіз молекулярних комплексів, що отримані гнучким докінгом.

Постановку наукових завдань дослідження та подальшу інтерпретацію отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником д.х.н., проф. С. М. Ярмолюком та членами групи молекулярного моделювання відділу комбінаторної хімії ІМБіГ НАНУ. Аналіз результатів біологічного тестування in vitro та встановлення кореляційних залежностей “хімічна структура-біологічна активність” у низці досліджуваних хімічних сполук проводили спільно з к.х.н. В. Г. Бджолою. Параметризацію молекулярних топологій досліджуваних лігандів та налагодження системи віртуального скринінгу проведено спільно з О. Я. Яковенком.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на Конференції молодих вчених в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України (Київ, Україна, 2003), Конференції “CNCH-2003” (Харків, Україна, 2003), 3-й Міжнародній конференції “Інгібітори протеїнкіназ 2003” (Варшава, Польща, 2003), Міжнародній конференції “Wold Conference on Magic Bullets” (Нюрнберг, Німеччина, 2004), XX Українській конференції з органічної хімії (Одеса, Україна, 2004), 4-й Міжнародній конференції “Інгібітори протеїнкіназ 2005” (Варшава, Польща, 2005), 5-й Міжнародній конференції “Протеїнкінази” (Цюріх, Швейцарія, 2006), Міжнародній конференції “Новітні досягнення органічної хімії” (Судак, Україна, 2006).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у 3 статтях у наукових фахових журналах, а також представлені на 8 наукових конференціях у вигляді усних доповідей, постерних презентацій та тез. За результатами роботи було отримано 2 деклараційних патенти на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, які викладено у двох розділах, аналізу та узагальнення результатів роботи, висновків, списку використаних джерел, який нараховує 134 найменувань, та додатків. Дисертація містить 38 рисунків та 13 таблиць. Загальний обсяг дисертації складає 139 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження.

Віртуальний скринінг. Для віртуального скринінгу просторову структуру каталітичної субодиниці СК2 (рецептор) було взято з бази даних RCSB Protein Data Bank (ID: 1JWH). Сфери активного сайту (точки докінгу) розраховано програмами sphgen (пакет DOCK) та Connolly MS. Обертальні зв’язки та якірні елементи молекул лігандів ідентифікували програмою DOCK в автоматичному режимі. Множинні якірні елементи у структурі ліганду були дозволені. Орієнтаційний пошук здійснено із застосуванням автоматичного збігу. Було дозволено локальну мінімізацію та ре-мінімізацію енергії орієнтацій та конформацій ліганду і його якірних елементів. Параметри мінімізації енергії взято за умовчанням.

Молекулярна динаміка комплексів СК2-інгібітор у водному середовищі. Розрахунок молекулярної динаміки комплексів СК2-інгібітор (рецептор-ліганд) у водному середовищі проведено з використанням пакета програм GROMACS. Топології лігандів (формат файлів gro та itp) будували за допомогою програми TOPBUILDER. Часткові атомні заряди лігандів розраховували програмою GAMESS. Стартову позицію лігандів в активному сайті рецептора генерували за допомогою пакета програм DOCK. Структуру комплексу “ліганд-рецептор” розміщували в центрі кубічного боксу, після цього бокс заповнювали молекулами води (модель SPC216). Далі проводили мінімізацію енергії комплексу у водному оточенні. Фінальні координати системи рецептор-ліганд-розчинник, отримані в результаті мінімізації енергії, було використано для розрахунку “обмеженої” молекулярної динаміки протягом 40 пс, яка включала гармонічну прив’язку позицій важких атомів рецептора та ліганду до вихідних координат. Систему “білок-ліганд-вода”, отриману в результаті “обмеженої” динаміки, брали як вихідну для розрахунку “повної” динаміки протягом 2 нс.

Термодинамічна інтеграція. Перехід (пертурбацію) системи зі стану Х в стан Y здійснювали шляхом поступової мутації параметрів, що описують систему X, в набір параметрів системи Y. Для проведення мутацій будували відповідні файли топологій, які описували початкову (X) та кінцеву (Y) структуру ліганду. Для інтерполяції ван-дер-ваальсових та електростатичних взаємодій застосовували помірний потенціал (soft-core potential), реалізований у програмі GROMACS.

Вільну енергію ДFbX–Y для усіх випадків розраховували з використанням 21 л-точки, тобто під час аналізу системи при л = 0…л = 1 інкремент дорівнював 0,05. Розрахунок Н(л)/ л проводили протягом 400 пс. Середнє значення похідних обчислювали при кожному значенні л, отриманий профіль вільної енергії було проінтегровано з використанням трапеційного методу. Оціночну похибку розраховано за допомогою методу блочного усереднення.

Результати досліджень та обговорення.

Пошук інгібіторів протеїнкінази СК2 серед похідних 4-амінохіназоліну. На першому етапі досліджень пошук інгібіторів СК2 проводили серед похідних
4-амінохіназоліну (рис. 1). Пригнічення активності CK2 похідними 4-амінохіназоліну до цього часу практично не вивчали. Проте відомо, що амінохіназоліни є найпоширенішими інгібіторами протеїнкіназ, зокрема циклін-залежних та тирозинових. З огляду на це проведено рецептор-орієнтований віртуальний скринінг бібліотеки 1000 похідних 4-амінохіназоліну. В результаті скринінгу відібрано 75 сполук для біологічного тестування in vitro.

R1=H, Ar, COOAlk

R2=H, Alk

R3=Alk, Ar, Het

R4=H

R5=H, Alk, Hal

R6=H

R7=H |

4.57

IC50 = 7,7 мМ | Рис. 1. Структура та активність 4-амінохіназолінів; а – загальна хімічна структура похідних 4-амінохіназоліну; б – структура найактивнішої сполуки 4.57а | б | Після проведення in vitro тестування виявили, що 26 сполук даного класу в концентрації 33 µM пригнічують активність СК2 більш як на 50 %. Значення IC50 для найактивнішої сполуки 4.57 (рис. 1) склало 7,7 мМ.

З метою вивчення взаємодій, які забезпечують інгібіторну активність 4-амінохіназолінів, досліджено комплекси активних сполук з СК2, отримані методом молекулярного докінгу. Під час аналізу виявлено, що взаємодія сполук із активним сайтом СК2 переважно відбувається за рахунок гідрофобних контактів (рис. 2). Очевидно, основний внесок в стабілізацію комплексу вносить хіназолінове ядро, яке має гідрофобні контакти з вісьмома амінокислотними залишками АТФ-зв’язувального сайту. Найважливішими серед цих контактів є взаємодія ліганду з Phe113, Ile174, Val66 та Met163. Хіназоліновий гетероцикл щільно фіксується між залишками Phe113 та Ile174, причому його контакт із Phe113 реалізується за типом стекінг-взаємодії. Докінг не виявив утворення водневих зв’язків між лігандом та рецептором. Але у природних умовах існування комплексу можна припустити формування міжмолекулярних водневих зв’язків ліганду з залишком Val116 (так, як це показано на рис. 2).

Сприятливим є гідрофобний контакт карбоксифенілу в позиції R3 найактивнішої сполуки 4.57 із залишком Val66. Серед тестованих похідних 4-амінохіназоліну найбільшу інгібіторну активність стосовно СК2 виявляють сполуки з R3 = 4- або 3-карбоксифеніл. Амінохіназоліни з R3 = 4-карбоксифеніл виявляють вищу інгібіторну активність порівняно зі сполуками, які мають у цій позиції 3_карбоксифеніл. Можливо, це спричинено додатковою, крім контактів з Val66 та Val116, взаємодією 4-карбоксигрупи з His115, яка не спостерігається у випадку сполук з R3 = 3-карбоксифеніл.

Замісник R1 у другій позиції 4-амінохіназоліну (на рис. 2 R1 = 3_метилфеніл), має слабкі гідрофобні контакти з Ile174 і переважно експонується у розчинник. Тому, згідно з просторовою структурою розрахованого комплексу, наявність у цій позиції гетероциклу розгалужених гідрофобних замісників знижує інгібіторну активність похідних 4-амінохіназоліну щодо СК2 в біологічних тестах.

Пошук інгібіторів протеїнкінази СК2 серед похідних 4-амінохіноліну. Аналізуючи результати, отримані при дослідженнях взаємодій похідних 4-амінохіназоліну з активним сайтом СК2, ми звернули увагу на хімічний клас 4-амінохінолінів (рис. 3). Дотепер ці сполуки не досліджували як інгібітори СК2, а їхня загальна хімічна структура є дуже подібною до 4-амінохіназолінів. З огляду на це клас 4-амінохінолінів було обрано для наступного етапу пошуку інгібіторів СК2 та вивчення особливостей будови їхніх комплексів. Для цього провели віртуальний скринінг наявної бібліотеки 1565 похідних 4-амінохіноліну і відібрали 52 сполуки для біологічного тестування.

19 похідних 4-аміно-3-карбетоксихіноліну в концентрації 33 µM пригнічували активність CK2 більш як на 50 %. Найактивнішими виявились сполуки 1.14 (IC50 = 19 µМ), 1.15 (IC50 = 17 µМ), 1.16 (IC50 = 19 µМ), 1.32 (IC50 = 9 µМ). Їхню хімічну структуру наведено в табл. 1.

За допомогою методу молекулярного докінгу показано, що всі перелічені активні сполуки мають схожий тип зв'язування (рис. 4), який подібний до зв’язування амінохіназолінів з СК2 (описано вище). Основний внесок у стабілізацію комплексу робить хінолінове ядро, яке має гідрофобні контакти з сімома амінокислотними залишками активного центру. Було також виявлено фіксацію хінолінового ядра між залишками Phe113 і Ile174, та стекінг-взаємодію з Phe113. Докінг ідентифікував водневий зв'язок між карбетоксигрупою ліганду та залишками Lys68 (рис. 4). Атом Оксигену карбонільної групи ліганду та атом Нітрогену б-амідної групи Asp175 знаходяться на відстані 3,04 Е. Тому можна очікувати, що між ними також утворюється водневий зв'язок, коли комплекс існує у природних умовах.

Комплекси сполук із CK2, отримані in silico, зіставлено з даними біологічного тестування з метою з’ясування впливу хімічної природи замісників на біологічну активність 4-аміно-3-карбетоксихінолінів. На їхню активність найбільший вплив має замісник R3. Активність найвища за умови, коли R3 = СOOEt. Карбетоксигрупа ліганду має гідрофобні контакти з Leu45, Val66, Val116, Asn118 та Met163, заміна в ній етилу на метил, очевидно, спричинює втрату додаткових контактів з Leu45, Val116 та Asn118 і значно зменшує інгібіторну активність сполук. Біологічні тести показали,

Таблиця 1

Хімічна структура та інгібіторна активність сполук 1.14, 1.15, 1.16, 1.32

№ | 1.14 | 1.15 | 1.16 | 1.32

Структура

IC50, µM | 19 | 17 | 19 | 9

що на активність 4-аміно-3-карбетоксихінолінів значно впливає варіація замісника R1. У всіх комплексах активних сполук 1.14, 1.15, 1.16, 1.32 цей замісник має гідрофобні контакти із трьома амінокислотними залишками АТФ-зв’язувального сайту Met163, Ile174 та Asp175. Значно більша активність сполуки 1.32 (R1 = 4-ацетамідофеніл), можливо, пояснюється тим, що навколо ацетамідної групи ліганду розташовані амінокислотні залишки ферменту Asp175 та His160, які можуть утворювати з нею водневі зв'язки. Отже, на наш погляд, збільшення інгібіторної активності лігандів можна досягти варіацією радикала в позиції R1 за рахунок утворення ним додаткових водневих зв'язків.

Розробка нових інгібіторів СК2
на основі 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів. Ґрунтуючись на аналізі взаємозв’язку хімічної структури та біологічної активності 4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів, для наступного етапу дослідження взяли структурно подібний хімічний клас 4-(1Н)-хінолонів. Окрім структурної подібності до 4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів, цей клас цікавий тим, що для нього відсутні літературні дані щодо інгібіторної активності стосовно протеїнкіназ. Тому провели віртуальний скринінг наявної комбінаторної бібліотеки 1045 похідних 4-(1Н)-хінолону (рис. ). Із 81 похідних 4-(1Н)-хінолону, відібраних за результатами докінгу, 4 сполуки (3.7, 3.9, 3.55 та 3.67) виявили високу активність у біологічних тестах (табл. 2). Кінетичні експерименти показали, що ці сполуки є АТФ-конкурентними.

Для визначення селективності інгібіторів 3.7 та 3.9 (далі ІР7 та ІР9) стосовно СК2 їхню інгібіторну активність перевірили на п’яти серин/треонінових та двох тирозинових протеїнкіназах (табл. 3). Як видно з таблиці, знайдені інгібітори виявляють високу специфічність інгібування СК2. Єдиним винятком є протеїнкіназа DYRK1а, залишкова активність якої при додаванні інгібітора ІР7 складає 35 %. Варто зазначити, що найбільш специфічні інгібітори СК2, відомі на даний момент з літератури, – ТВВ та IQA – також суттєво пригнічують активність DYRK1а в дослідах на 31 протеїнкіназі (їхні значення IC50 складають 1 µМ та 6 µМ відповідно). На сьогодні розроблені нами 3_карбокси-4-(1Н)-хінолони є новими й одними з найактивніших інгібіторів СК2 людини.

Таблиця 2

Хімічна структура та інгібіторна активність сполук 3.7, 3.9, 3.55, 3.67

№ | 3.7 (ІР7) | 3.9 (ІР9) | 3.55 (ІР55) | 3.67 (ІР67)

Структура

Ki, µM | 0,06 | 0,28 | 0,48 | 0,15

IC50, µM | 0,3 | 1,0 | 0,8 | 2,0

Таблиця 3

Залишкова активність низки протеїнкіназ після додавання
інгібіторів ІР7 та ІР7 у концентрації 10 µМ

CK2

JNK3

ROCK-I

p56 LCK | 11

87 | 25

80 | DYRK1a

MSK1

GSK3

CDK5 | 35

>50

>50 | 85

>50

Дослідження молекулярної динаміки комплексів СК2-ІР7 та СК2-ІР9, побудова моделі взаємодії 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів з АТФ-зв’язувальним сайтом СК2. Для аналізу типів зв’язування інгібіторів ІР7 та ІР9 із СК2 нами вперше було проведено розрахунок молекулярної динаміки (МД) комплексів СК2–інгібітор у часовому діапазоні 2 нс. У результаті розрахунків отримано стабільні траєкторії МД для комплексів СК2 – ІР7, СК2 – ІР9 та не зв’язаної з АТФ чи інгібітором молекули СК2. Отримані траєкторії МД використано для вивчення типів зв’язування інгібіторів ІР7 та ІР9 з ферментом, а також для експериментів з термодинамічної інтеграції. |

Рис. 6. Інгібітори ІР7 та ІР9 в АТФ-зв’язувальному сайті СК2. Відмічено водневі зв’язки, які потенційно можуть формуватись між лігандом та рецептором, вказано їхні довжини (в ангстремах). Типи зв’язування інгібіторів ІР7а) та ІР9 (б) в активному сайті СК2 отримані в результаті розрахунку МД. в – стартові позиції ІР7 та ІР9 взяті для розрахунку МД.
г – суперпозиція типів зв’язування інгібіторів ІР7 та ІР9 в активному сайті СК2, що розраховані МД

Аналіз траєкторій МД показав, що загалом сполуки ІР7 та ІР9 мають подібний тип зв’язування з СК2 (рис. 6, а, б). Вони розміщуються в АТФ-зв’язувальному сайті СК2, взаємодіють з гідрофобними залишками амінокислот С- та N-кінцевого доменів і утворюють водневі зв’язки з амінокислотними залишками Lys68 та Asp175. Для сполуки ІР7 спостерігали ще один водневий зв’язок між карбоксильною групою ліганду і г-карбоксильною групою Glu81.

Сполуки ІР7 та ІР9 утворюють гідрофобні контакти із низкою амінокислотних залишків АТФ-зв’язувального сайту СК2 (рис. 6, а, б). Контакти із залишками Phe113, Val66 і Ile174 є ключовими. Для сполуки ІР9 спостерігали слабку гідрофобну взаємодію з Phe113 порівняно із сполукою ІР7 (рис. 6, б).

Позиції лігандів у активному сайті СК2, розраховані програмою DOCK і взяті як стартові для розрахунку МД, є майже ідентичними для ІР7 та ІР9 (рис. 6, в).

У процесі МД такий тип зв’язування зазнає певних змін. Протягом перших 20 пс динаміки, карбоксильна група інгібітора ІР7, обертаючись, формує додатковий зв'язок з Glu81, і до кінця розрахунку МД спостерігали довготривалі водневі зв’язки з Lys68, Asp175 та Glu81. Навпаки, інгібітор ІР9 зміщується відносно початкової позиції в напрямку шарнірної ділянки АТФ-зв’язувального сайту і втрачає стекінг-взаємодію з залишком Phe113, але посилює контакт хінолонового ядра та конденсованого по грані Н бензенового кільця з Leu45, Val53, Val66 та Ile174, зберігаючи водневі зв’язки з Lys68 та Asp175рис. 6, г).

Аналіз співвідношення “хімічна структура-біологічна активність” у ряду 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів. На основі даних біологічного скринінгу та запропонованого нами типу зв’язування похідних 4-(1Н)-хінолону з СК2 проаналізовано вплив замісників у хімічній структурі цих сполук на їхню біологічну активність (рис. 7). Найважливішим замісником у структурі похідних 4-(1Н)-хінолону є 3-карбоксигрупа. На відміну від похідних із 3-карбоксигрупою, похідні із 3-карбетоксигрупою мають значно нижчу активність. Відповідно до запропонованого типу зв’язування це можна пояснити формуванням стабільних водневих зв’язків 3-карбоксигрупи з амінокислотними залишками АТФ-зв’язувального сайту – Lys68 та Asp175.

Значний вплив на інгібіторну активність сполук має варіація замісників у позиціях R4 та R5 4-(1Н)-хінолону. Найбільшу активність виявляють сполуки, які в цих позиціях мають гідрофобні замісники. Варіація замісників у позиціях R2 та R3 4-(1Н)-хінолону менше впливає на біологічну активність сполук, що пояснюється незначною взаємодією замісників у цьому регіоні АТФ-зв’язувального сайту з амінокислотними залишками.

Визначення відносної енергії зв’язування нових інгібіторів СК2 методом термодинамічної інтеграції. Для розрахунку відносної вільної енергії нових інгібіторів СК2 – 3_карбокси-4-(1Н)-хінолонів, а також для передбачення їх більш активних похідних використано метод термодинамічної інтеграції (ТІ).

ТІ розраховано як для інгібіторів зі встановленою нами активністю, так і для “віртуальних сполук”, отриманих за рахунок варіацій позицій атомів Хлору в гетероциклі ліганду. Напрямок проведених мутацій X > Y та результати розрахунків наведено в таблиці 4.

Результати розрахунків ТІ показали, що підвищення активності нового класу інгібіторів СК2 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів можна досягти через уведення до їхньої структури додаткових гідрофобних замісників, наприклад атомів Хлору. Причому, такі групи повинні локалізуватись у сприятливих зонах активного сайту СК2 (позиції R5, R4, R3 гетероциклу). Очевидно, що ефект буде зростати пропорційно величині гідрофобності замісників, тому вірогідно, що бромо- та йодо-заміщені похідні 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів будуть мати більшу активність, ніж хлоропохідні. У процесі розрахунку ТІ IP7 > ІР9 для ІР9 показано зміну типу зв’язування. При значенні параметра л = 0,75 на 85 пс розрахунку стартова позиція, що відповідала розрахованому типу зв’язування інгібітора ІР7, починала змінюватись на таку, що відповідає типу зв’язування інгібітора ІР9 (описано вище), і остаточно сформувалась протягом наступних значень л. Таким чином, отримані результати розрахунку загалом підтверджують експериментальні дані з біологічної активності інгібіторів ІР7 та ІР9, а також ще раз вказують на існування відмінностей у типах зв’язування інгібіторів ІР7 та ІР9.

Таблиця 4

Напрямок проведених мутацій

та відповідні значення Ki та ДДFb

Х | ДДFb, кДж/моль-1 | Y

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

11,45853 |

ІР9

Ki = 0,28 мM

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

6,78941 |

ІР67

Ki = 0,48 мM

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

6,83869 |

ІР55

Ki = 0,70 мM

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

2,05721 |

ІРВ

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

-4,34568 |

ІРТ

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

-0,28738 |

ІРТ2

ІР7

Ki = 0,06 мM | >

9,42026 |

ІРТ3

Пошук інгібіторів СК2 серед похідних тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолу. Для пошуку нових інгібіторів CK2 проводили також рецептор-орієнтований віртуальний скринінг великої бібліотеки низькомолекулярних органічних сполук, яка налічувала понад 70000 структур. Комбінаторна бібліотека мала значну диверсійність (різноманітність), оскільки складалася з багатьох хімічних класів. Серед сполук, відібраних за даними розрахунків, виявились три
похідні тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолу (TID) (рис. 8). Цей клас сполук раніше не досліджувався як інгібітори CK2. Але з літератури відомо, що галогеновані похідні інших класів сполук – бензотріазолу та бензімідазолу – є селективними інгібіторами CK2. У зв’язку з цим було вирішено ретельніше вивчити галогеновані 1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли.

Біологічне тестування показало, що ці сполуки значно пригнічують активність CK2. В табл. 5 наведено дані біологічного тестування для цього класу сполук. Як видно з таблиці, найактивнішим інгібітором є сполука 2.46 (IC50 = 0,15 мM).

Для дослідження механізму дії знайдених інгібіторів 2.43 та 2.46 проведено кінетичні експерименти при різних концентраціях інгібітора та АТФ, константи інгібування склали 0,2 мM та 0,1 мM відповідно. Отримані дані вказують на те, що ці інгібітори конкурують із АТФ за сайт зв’язування СК2.

Для перевірки селективності дії знайдених інгібіторів досліджено вплив сполук 2.43, 2.45, 2.46 та 2.58 на активність протеїнкіназ DYRK1a, MSK1, GSK3 та CDK5. Результати тестів показали, що ці сполуки в концентрації 10 мM незначно пригнічують активність цих кіназ.

Таблиця 5

Хімічні структури активних похідних
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолів та їхні значення IC50

2.43 | 0,3 | 2.48 | 0,75

2.45 | 1 | 2.58 | 0,6

2.46 | 0,15 | 2.59 | 1,5

За даними докінгу, всі активні похідні TID мають однаковий тип зв’язування з СК2 (рис. 9). Тетрагалоген-заміщений гетероцикл сполук розташовується в АТФ-зв’язувальному сайті СК2 аналогічно до місцерозташування тетрабромо-заміщеного кільця 4,5,6,7-тетрабромобензотріазолу (ТВВ) у комплексі ТВВ–СК2, структура якого визначена методом рентгеноструктурного аналізу. Найважливішою є взаємодія TID з Val53, Val66, Ile174 та Phe113. Слід зазначити, що TID може утворювати два водневі зв’язки, які формуються між карбоксильною групою ліганду й атомами Нітрогену б-амідної групи Trp176 і е-аміногрупи Lys68. ТВВ, у свою чергу, утворює два водневі зв’язки із амінокислотними залишками Lys68 та Glu81 за допомогою містка з двох молекул води.

На основі даних біологічного скринінгу та запропонованого нами типу зв’язування похідних TID проаналізовано вплив їхніх хімічних замісників на інгібіторну активність. Інгібіторні властивості цих сполук суттєво зменшуються у ряду тетраІ >> тетраBr > тетраCl. З цього можна зробити висновок, що гідрофобні взаємодії є найважливішими для інгібіторної активності TID.

На інгібіторну активність сполук значно впливає варіація замісника R, за участю якого утворюються два водневі зв’язки. Найбільш оптимальним замісником R є 2-іл-пропіонова кислота (сполука 2.46, IC50 = 0,15 мM). Заміна 2-іл-пропіонової кислоти на ацетил дещо зменшує активність (сполука 2.43, IC50 = 0,3 мM). Запропонована нами модель пояснює цей факт зменшенням гідрофобної взаємодії ліганду 2.43 з амінокислотними залишками Phe113, Ile95 через відсутність метильної групи (порівняно з лігандом 2.46). З іншого боку, збільшення об’єму замісників, що локалізуються в цій ділянці активного сайту, очевидно, спричинює стеричні ускладнення, дестабілізує комплекс в цілому та, як наслідок, зменшує активність інгібіторів (сполуки 2.47, 2.49 та 2.44, IC50 = 1,25 мM, 2 мM та 6,5 мM відповідно). Подовження карбонного ланцюга замісника R ізоіндолу (рис. 8) також зменшує активність сполук (R = ацетил, IC50 = 0,3 мM; R = 3-іл-пропіонова кислота, IC50 = 0,75 мM).

Інгібіторна активність похідних TID стосовно СК2 на сьогодні є однією з найвищих. Ці інгібітори можуть бути використані для подальшої структурної оптимізації та біологічних досліджень.

Рис. 10. Схематичне зображення спільних ознак інгібіторів СК2. HA – акцептор водню, HD – донор водню. Вказано ключові хімічні групи “оптимального” інгібітора СК2

Характеристика “оптимального” інгібітора СК2. Підсумовуючи отримані результати та опираючись на дані із структури раніше відомих інгібіторів СК2, можна зробити висновок, що для активного сайту СК2 найбільш “сприятливими” є сполуки, які характеризуються низкою спільних ознак (рис. 10). По-перше, це наявність жорсткого ароматичного ядра, що локалізується між гідрофобними залишками Phe113, Ile174 та Val66. Ароматичне ядро, як мінімум, повинно складатися з двох конденсованих кілець. По-друге, у ділянці локалізації кластера залишків Lys68, Asp175, Glu81 повинні бути донорно-акцепторні групи ліганду, за рахунок чого можуть утворюватись міжмолекулярні водневі зв’язки. По-третє, кількість обертальних зв’язків у структурі інгібітора повинна бути обмеженою до 2-3, інгібітор не повинен мати розгалужених та об’ємних замісників. По-четверте, з огляду на сприятливу орієнтацію донорно-акцепторних груп амінокислотних залишків шарнірної ділянки (таких як Val116 та Glu114) вони можуть утворювати міжмолекулярні водневі зв’язки. Отже є перспективним уведення відповідних замісників у структуру ліганду для того щоб ініціювати утворення водневих зв’язків у цій ділянці активного сайту.

ВИСНОВКИ

Використовуючи методи гнучкого докінгу та молекулярної динаміки, знайдено нові інгібітори протеїнкінази СК2 людини та досліджено особливості їхньої взаємодії з амінокислотними залишками активного центру ферменту. Запропоновано моделі зв’язування цих інгібіторів в активному центрі СК2, вироблено рекомендації для подальшої оптимізації їхньої структури.

1. На основі молекулярних комплексів, розрахованих методом гнучкого докінгу, запропоновано модель взаємодії похідних 4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів з сайтом зв’язування АТФ протеїнкінази СК2. Згідно моделі, зв’язування інгібіторів цих класів сполук з СК2 відбувається в основному за рахунок гідрофобних взаємодій із залишками Phe113, Val66, Ile174 активного центру.

2. Використовуючи методи молекулярного докінгу та молекулярної динаміки, для нових класів інгібіторів СК2 – 3_карбокси-4-(1Н)-хінолонів та тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолів розроблено моделі їхньої взаємодії з активним центром ферменту. Показано, що ці класи інгібіторів взаємодіють з CK2 формуючи водневі зв’язки з амінокислотними залишками Lys68, Asp175, Glu81, Trp176, та утворюючи гідрофобні контакти з залишками Phe113, Val66, Val53, Ile174.

3. Для отриманих інгібіторів СК2 – 4-амінохіназолінів, 4-амінохінолінів, 3_карбокси-4-(1Н)-хінолонів та тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолів встановлена залежність “хімічна структура – біологічна активність”.

4. За допомогою методу термодинамічної інтеграції спрогнозовано структуру та активність низки похідних 3_карбокси-4-(1Н)-хінолонів in silico. Показано, що похідні з вищою інгібіторною активністю in vitro можна отримати за рахунок варіації числа та положень атомів Хлору хінолонового ядра.

5. Запропоновано критерії структури “оптимального” інгібітора СК2, основними з яких є наявність жорсткого ароматичного ядра, присутність донорно-акцепторних груп у ділянці локалізації кластера залишків Lys68, Asp175, Glu81 та обмежена кількість ротабельних зв’язків. Розроблені критерії можуть бути використані для дизайну нових інгібіторів СК2.

6. Ідентифіковано низку нових інгібіторів СК2 серед комбінаторних бібліотек 4-амінохіназолінів (ІC50 = 7,7 мМ) та 4-амінохінолінів (ІC50 = 9 мМ), а також два нових специфічних класи інгібіторів СК2 – тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли (ІC50 = 0,15 мМ) та 3_карбокси-4-(1Н)-хінолони (ІC50 = 0,3 мМ). На основі цих інгібіторів можуть бути створені біологічно активні сполуки для використання в молекулярно-біологічних дослідженнях та медичній практиці.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сапелкін В.М., Голуб А.Г., Яковенко О.Я., Бджола В.Г., Ярмолюк С.М. Пошук інгібіторів казеїнкінази 2 серед похідних 4-амінохіназоліну // Ukrainica Bioorganica Acta. – 2004. – Т. 1, № 1-2. – С.74-79.

Особистий внесок здобувача - віртуальний скринінг похідних 4-амінохіназоліну, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”, власноруч написано основну частину статті.

2. Сапелкін В.М., Голуб А.Г., Яковенко О.Я., Бджола В.Г., Ярмолюк С.М. Пошук інгібіторів протеїнкінази CK2 серед похідних 3-карбетокси-4-амінохіноліну // Ukrainica Bioorganica Acta. – 2005. – Т. 2, № 1. – С.28-32.

Особистий внесок здобувача - віртуальний скринінг похідних 3-карбетокси-4-амінохіноліну, розробка моделі їхнього зв’язування в активному сайті СК2, аналіз залежності активності 3-карбетокси-4-амінохінолінів від їх структури.

3. Golub A.G., Yakovenko O.Y., Bdzhola V.G., Sapelkin V.M., Zien P., Yarmoluk S.M. Evaluation of 3-Carboxy-4(1H)-quinolones as Inhibitors of Human Protein Kinase CK2 // J. Med. Chem. – 2006. – Vol. 49, № 22. – P.6443-6450.

Особистий внесок здобувача - параметризація програм докінгу та молекулярної динаміки, докінг та розрахунок молекулярної динаміки похідних 3-карбоксихінолонів, побудова моделі їхнього зв’язування в активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна структура – біологічна активність”, власноруч написано основну частину статті.

4. Сапелкін В.М., Лукашов С.С., Голуб А.Г., Бджола В.Г., Яковенко О.Я., Ярмолюк С.М., Дубініна Г.Г. Застосування 4-заміщених 3-карбоксихінолінів як інгібіторів протеїнкінази СК2. Пат. UА68984 А, C07D215/00, 2004-08-16.

Особистий внесок здобувача - планування стратегії пошуку інгібіторів СК2, віртуальний скринінг похідних 3-карбоксихінолінів, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

5. Приходько А.О., Голуб А.Г., Яковенко О.Я., Бджола В.Г., Дубиніна Г.Г., Ярмолюк С.М. Застосування 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів як інгібіторів протеїнкінази СК2. Пат. UA69165 А, С07D215/00, 2004-08-16.

Особистий внесок здобувача - віртуальний скринінг похідних тетрагалогеноізоіндолів, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

6. Sapelkin V.M., Lukashov S.S., Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G., Dubinina G.G., Yarmoluk S.M. Search of protein kinase CK2 inhibitors among combinatorial library of quinasoline and quinoline derivatives // Conference for students, PhD students and young scientists, Institute of Molecular Biology and Genetics. – Kyiv (Ukraine), 2003. – P. 206.

Особистий внесок здобувача - віртуальний скринінг похідних амінохіноліну та амінохіназоліну, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

7. Sapelkin V.M., Lukashov S.S., Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G., Dubinina G.G., Yarmoluk S.M. Development of protein kinase CK2 inhibitors among the combinatorial libraries of quinazoline and quinoline derivatives // CNCH-2003. – Kharkiv (Ukraine), 2003. – P. 257.

8. Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G., Yarmoluk S.M. Study of Casein kinase II inhibitory activity of 4-aminoquinoline and 4-aminoquinazoline derivatives by combined docking-molecular dynamics approach // 3rd International conference “Inhibitors of Protein kinases 2003”. – Warsaw (Poland), 2003. – P. 584.

9. Kostenko O.M., Yakovenko O.Y., Golub A.G., Bdzhola V.G., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M. 3-Carboxy-4-(1H)-quinolones as inhibitors of Human Casein Kinase 2 (CK2) // Wold Conference on Magic Bullets. - Nurenberg (Germany), 2004.– P. 273.

Особистий внесок здобувача - параметризація програми докінгу, докінг похідних 3-карбоксихінолонів, аналіз особливостей їхнього зв’язування в активному сайті СК2.

10. Sapelkin V.M., Lukashov S.S., Makovenko I.E., Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G., Kostenko A.M., Yarmoluk S.M. Search of CK2 kinase inhibitors among quinoline and quinazoline derivatives // XX Українська конференція з органічної хімії. – Одесса (Україна), 2004. – С. 563.

Особистий внесок здобувача - докінг похідних амінохіноліну та амінохіназоліну, побудова моделі їхнього зв’язування в активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

11. Golub A.G., Bdzhola V.G., Yakovenko O.Ya., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M. Evaluation of 3-carboxy-4-(1H)-quinolones as inhibitors of human protein casein kinase // 4rh International conference ”Inhibitors of Protein kinases-2005”. – Warsaw (Poland), 2005. – P. 102.

Особистий внесок здобувача - віртуальний скринінг та розрахунок молекулярної динаміки похідних 3-карбоксихінолонів, розробка моделі їхнього зв’язування в активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

12. Golub A.G., Bdzhola V.G., Yakovenko O.Ya., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M. Evaluation of 3-carboxy-4-(1H)-quinolones as novel inhibitors of human protein kinase CK2 // International Symposium on Advanced Science in Organic Сhemistry. – Sudak (Ukraine), 2006 – C-200.

13. Golub A.G., Bdzhola V.G., Yakovenko O.Y., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M. Evaluation of 3-carboxy-4-(1H)-quinolones as novel inhibitors of human protein kinase CK2 // The 5th Annual IIR Protein Kinases Congress. – Zurich (Switzerland), 2006.

АНОТАЦІЯ

Голуб А. Г. In silico дизайн інгібіторів протеїнкінази СК2. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики, Київ, 2007.

Метою дисертаційної роботи була розробка нових низькомолекулярних інгібіторів СК2 людини та дослідження їхньої взаємодії з амінокислотними залишками активного центру СК2 методами комп’ютерного моделювання. За допомогою методу гнучкого докінгу знайдено низку нових інгібіторів СК2 серед комбінаторних бібліотек 4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів, а також два нових класи високоактивних специфічних інгібіторів СК2 – 3_карбокси-4-(1Н)-хінолони та тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли. На основі результатів гнучкого докінгу та розрахунків молекулярної динаміки, для отриманих інгібіторів розроблено моделі їхньої взаємодії з активним сайтом СК2 та пояснено вплив хімічних замісників їхньої структури на біологічну активність. Досліджена специфічність нових інгібіторів щодо СК2. Проведено порівняльний аналіз їхніх типів зв’язування

Сторінки: 1 2