УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

”ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

Грінченко Дмитро Миколайович

УДК 619:616-085.371:578.831.1:636.5:616-097.3

ІМУНОСТИМУЛЯЦІЯ КУРЧАТ ЕКСТРАКТОМ ЛІМФОЇДНИМ ПТАХІВ-РЕКОНВАЛЕСЦЕНТІВ ПРИ ЩЕПЛЕННІ ПРОТИ НЬЮКАСЛСЬКОЇ ХВОРОБИ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового степеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор, заслужений працівник сільського господарства України Апатенко Володимир Максимович, Харківська державна зооветеринарна академія, професор кафедри мікробіології і біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Геннадій Андрійович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, завідувач лабораторії патоморфології;

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Безрукава Інна Юріївна, Інститут птахівництва УААН, завідувач відділу профілактики хвороб птиці.

Провідна установа - Сумський національний аграрний університет, кафедра вірусології, патологічної анатомії, ветеринарно-санітарної експертизи, Міністерство аграрної політики України, м. Суми.

Захист відбудеться “24” квітня 2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “21” березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А.Ф.Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Птахівництво в даний час інтенсивно розвивається і потребує сучасного ветеринарного забезпечення.

Наявність прискорених еволюційних процесів зумовила ускладнення епізоотичної ситуації, підвищення патогенних властивостей збудника, поширення інфекційних захворювань.

Пошук нових імуностимулюючих препаратів продовжується з урахуванням всезростаючих потреб у зв’язку з широким поширенням імунодефіцитів (Андреєва А.В., 2003; Апатенко В.М., 1996; Аріон В.Я, 1994; Басова Н.Ю., 2003; Красніков Г.А., 2003 та ін.).

Проблема імунного захисту є актуальною і пов'язана з імунодефіцитами, які широко поширені в птахівництві. У зв'язку з цим необхідні заходи, спрямовані на підвищення імунного статусу, насамперед, у молодняка.

За такої епізоотичної ситуації необхідним є підвищення природної резистентності із застосуванням імуностимуляторів як із лікувальною, так і з профілактичною метою.

Відомо, що імуностимулятори підсилюють функціональні властивості імунокомпетентної системи та можуть нейтралізувати імунодепресивну дію. Загрозу інфекційних захворювань можна попередити вакцинацією, а для підвищення ефективності вакцин багато дослідників пропонують застосовувати імуностимулятори різного походження та різних форм. (Б.Я.Бірман, И.М.Громов, 2000).

З цією метою застосовується великий арсенал рослинних, тваринних і синтетичних імуностимуляторів різних модифікацій за різних способів застосування.

Пошукові роботи у цьому напрямку тривають. Потрібні високоефективні, доступні та недорогі препарати, які мають бути нешкідливими при застосуванні.

З урахуванням цих вимог лімфоїдні імуностимулюючі препарати мають пріоритет як фізіологічні природні засоби. Саме у цьому напрямку виконувалася дана робота.

У проведених дослідах відпрацьовувалась схема виготовлення та вивчалися імуностимулюючі властивості лімфоїдного імуностимулятору (ЕЛПР), виготовленого з тимусу, бурси Фабриціуса та селезінки. Крім того, досліджувався вплив цього екстракта на результати вакцинації живою вірус-вакциною проти ньюкаслської хвороби.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи є частиною науково-дослідної роботи кафедри мікробіології і біотехнології Харківської державної зооветеринарної академії, що виконується згідно з програмою УААН „Визначення деяких імунологічних показників птиць та вживання імуностимуляторів виготовлених з лімфоїдної тканини” (2004-2006), держреєстрація № 0104U009817.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було розробити спосіб імуностимуляції курчат новим препаратом ЕЛПР, вивчити його імуностимулюючі властивості, спосіб застосування для підвищення імунного статусу птахів, встановити можливий вплив ЕЛПР на посилення імунної відповіді при вакцинації проти ньюкаслської хвороби.

У роботі було поставлено такі завдання: –

обґрунтувати та розробити технологію одержання лімфоїдного екстракту з використанням тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки курчат;–

провести біологічний контроль екстракта на мікробну та вірусну контамінації, нешкідливість, апірогенність та біологічну активність;–

визначити оптимальну дозу, метод і терміни застосування екстракта;–

провести імуноморфологічні дослідження в динаміці та у залежності від віку птиці, схеми застосування і методу вживання.

Об’єкт дослідження – імунна реактивність курчат при стимуляції імунокомпетентної системи.

Предмет дослідження – стимуляція імунітету курчат екстрактом лімфоїдним птахів-реконвалесцентів (ЕЛПР) і підвищення імунної відповіді при щепленні проти ньюкаслської хвороби.

Методи досліджень – робота виконувалася з використанням серологічних, бактеріологічних, вірусологічних, імуноморфологічних, морфометричних і біохімічних методів. Статистичну обробку результатів проводили за програмою Microsoft Еxcel на персональному комп'ютері.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні–

розроблено новий імуностимулятор, виготовлений з пташиних лімфоїдних органів: тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки;–

встановлено, що виготовлений екстракт має імуностимулюючі властивості та підвищує імунний статус курчат при ентеральному введенні;–

при застосуванні даного екстракту разом із щепленням проти ньюкаслської хвороби імунна відповідь значно підвищується.

Наукова новизна одержаних результатів підтверджується трьома патентами:

1. Деклараційний патент 5365 Україна, МКІ A61К39/12, А61К35/74. Спосіб вакцинопрофілактики птиці проти хвороби Ньюкасла / Д.М. Грінченко, В.М. Апатенко. - №2004032289; Заявлено 29.03.2004; Опубл.15.03.2005, Бюл. № 3. – 3с.

2. Деклараційний патент 3753 Україна, МКІ А61К39/12, А61К35/74. Спосіб виготовлення імуностимулятора „ЕЛПР” / Д.М. Грінченко, В.М. Апатенко. - №2004031536; Заявлено 02.03.2004; Опубл. 15.12.2004, Бюл. № 12. – 3с.

3. Деклараційний патент 7403 Україна, МКІ А61К39/12, А61К35/74. Спосіб підвищення іммунної відповіді при вакцинації птиці проти хвороби Ньюкасла / В.М. Апатенко, Д.М. Грінченко, О.І. Сосницький, В.П. Заболотна. - №20041210170; Заявлено 10.12.2004; Опубл. 15.06.2005, Бюл. № 6. – 4с.

Практичне значення отриманих результатів. На основі результатів експериментальних досліджень розроблено „Методичні рекомендації щодо застосування екстракту лімфоїдного птахів-реконвалесцентів (ЕЛПР) для підвищення рівня імунного статусу курчат і для посилення імунної відповіді при вакцинації”, які ухвалені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини від 23 грудня 2005 року, протокол № 3, та затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

Запропонований в умовах господарства новий імуностимулюючий ЕЛПР при введенні курчатам ентерально дає змогу підвищити імунний статус і збереженість молодняка птиці.

Матеріали дисертації використовуються в навчальному процесі у курсах мікробіології, біотехнології та імунології і включені до спецкурсу „Хвороби птиці” для студентів факультету ветеринарної медицини Харківської державної зооветеринарної академії.

Особистий внесок здобувача: автором самостійно проведено весь обсяг експериментальних досліджень, аналіз отриманих результатів і їх статистична обробка та узагальнення. Самостійно опрацьований літературний огляд, освоєно складні методи досліджень, організовано і проведено лабораторні та виробничі експерименти.

Розроблено „Методичні рекомендації щодо застосування екстракту лімфоїдного птахів-реконвалесцентів (ЕЛПР) для підвищення рівня імунного статусу курчат і для посилення імунної відповіді при вакцинації”.

Розроблений імуностимулюючий ЕЛПР запропоновано для виробництва.

Апробація результатів дисертації: Результати досліджень були представлені та обговорені на засіданнях кафедри мікробіології і біотехнології та на науково-практичних конференціях: Наукова конференція за міжнародної участі, присвячена 160-річчю з дня народження І.І.Мєчнікова (Харків, ХДЗВА, І грудня 2005); Міжнародна науково-практична конференція „Ветеринарна медицина – 2005” (м. Ялта, АР Крим, 30 травня – 4 червня 2005); Міжнародна науково-практична конференція „Проблеми птахівництва”(м. Ялта, 26 жовтня 2005р); Курсова науково-теоретична конференція (м. Харків, ХДЗВА, 26 листопада 2005р); VI з’їзд паразитоценологів України за міжнародної участі (11-13 жовтня 2006 року, м. Харків, ХДЗВА).

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи викладено в 10 наукових публікаціях, у тому числі 7 - у фахових виданнях та 2 з них - одноосібні. Крім того, отримано патенти та розроблено методичні рекомендації, затверджені на засіданні науково-методичної Ради Державного департаменту ветеринарної медицини від 23 грудня 2005 року, протокол № 3.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 144 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 8 таблицями, 13 фотографіями та 2 малюнками.

Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, власних досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків, пропозицій виробництву і списку цитованої літератури, який містить 286 найменувань, зокрема 76 іноземних.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Представлена робота виконувалась як самостійний розділ теми ХДЗВА „Визначення деяких імунологічних показників птиць та вживання імуностимуляторів виготовленних з лімфоїдної тканини”

Робота виконувалася на кафедрі мікробіології і біотехнології та на базі кафедри анатомії і гістології Харківської державної зооветеринарної академії, в лабораторії біохімії ННЦ „Інституту експериментальної та клінічної медицини” та в інституті медичної радіології АМН України.

Для виготовлення ЕЛПР застосовували лімфоїдні органи: тимус, бурсу Фабриціуса та селезінку.

Матеріал відбирали під час забою птиці на конвеєрі. Відібраний матеріал зберігали в морозильній камері холодильника як сировинний матеріал.

Для виготовлення ЕЛПР лімфоїдні органи були відібрані в загальній кількості від 900 забитих бройлерів.

При вивченні властивостей отриманого ЕЛПР та при визначенні його імуностимулюючої ефективності проводились експериментальні дослідження в загальній кількості на 151 курчаті.

В умовах виробництва дослідження було проведено на 500 курчатах, вакцинованих проти ньюкаслської хвороби.

Реакцію гемаглютинації (РГА) та реакцію затримки гемаглютинації (РЗГА) проводили за загальновідомими методиками. У РГА визначали титри вірусу, а в РЗГА – титри антигемаглютинінів.

Серологічні дослідження проводили при визначенні рівня поствакцинального імунітету після щеплення вірус-вакциною „Ла-Сота” проти ньюкаслської хвороби.

Визначення імуноглобулінів основних класів (А, М, G) у сироватці крові проводили за методом G. Mancini простої радіальної імунодифузії в гелі. У дослідах використовували Bactoagar typ USY (Німеччина), еталонні та моноспецифічні сироватки проти Ig птахів. Еталонні сироватки відповідали світовим стандартам.

Загальний рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та їхній фракційний склад за молекулярною масою визначали методом преципітації в розчині поліетиленгліколя з молекулярною масою 6000 Дальтон за М.Digeon et al. у модифікації Г. Фримеля (1987).

Рівень серомукоїдів визначали турбідиметричним методом за В.С. Калашниковим.

Бактерицидну активність сироватки крові визначали за оптичною густиною м’ясо-пептонного бульйону (МПБ) при рості в ньому мікробів з додаванням та без додавання досліджуваної сироватки. Для постановки реакції використовували 24-годинні бульйонні культури E. coli штаму 0111. Реакцію ставили за загально прийнятою методикою.

Для визначення лізоцимної активності використовували ацетоновий порошок культури Micrococcus lysodeіcticus, штаму 2665.

Імуноморфологічні дослідження проводилися на макроскопічному та мікроскопічному рівнях.

При макроскопічному дослідженні проводили огляд піддослідних тварин і внутрішніх органів. Розраховували індекси тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки.

На мікроскопічному рівні імуноморфологічні дослідження проводили із застосуванням гістологічних досліджень та морфометричних методів.

Гістологічні дослідження проводили на кафедрі анатомії та гістології ХДЗВА та у відділі морфології Харківського науково-дослідного інституту медичної радіології.

Досліджували тимус, бурсу Фабриціуса та селезінку. У деяких випадках досліджували сліпі відростки кишківника та печінку. Відібраний матеріал фіксували 10%-им нейтральним формаліном та рідиною Карнуа. Готували парафінові зрізи, проводили загальне фарбування гематоксилін-еозином та фарбували за Браше для виявлення РНК.

Морфометричними вимірами бурси Фабриціуса у п’яти найбільш великих лімфоїдних вузликах визначали середню товщину кіркового шару шляхом підрахунку кількості рядів клітин у широкій та вузькій його частинах.

Підраховували морфо-функціональний потенціал (МФП) лімфоїдних вузликів шляхом множення довжини лімфоїдних вузликів на ширину їхнього кіркового шару з подальшим сторазовим зменшенням результату.

При імуноморфологічному дослідженні тимусу враховували розвиненість кіркового шару. Для цього обчислювали співвідношення товщини мозкової речовини з товщиною кіркового шару з обох сторін часточки по її середині. Отримували мозково-кіркове співвідношення (МКС).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНІЙ АНАЛІЗ

Обґрунтування виготовлення ЕЛПР. В умовах широкого поширення імунодефіцитів необхідна імунологічна реабілітація із застосуванням стимуляторів імунокомпетентної системи. У медичній та ветеринарній практиці широко застосовують Т-активін, який готують з лімфоїдної тканини тимусу теляти в умовах складної заводської технології.

Нами було розроблено більш просту технологію виготовлення імуностимулятора пташиного походження не лише з тимусу, а й з бурси Фабриціуса та селезінки.

Технологічна схема виготовлення та біологічного контролю ЕЛПР. Сировину для виготовлення екстракту одержували від клінічно здорових птахів під час забою. Відбирали тимус, бурсу Фабриціуса і селезінку. Відібраний матеріал звільняли від сполучнотканинних капсул, плівок, жирових накопичень і пропускали через електром’ясорубку. Потім додатково подрібнювали гомогенізатором до повної однорідності одержаної маси, яка набувала консистенції пасти. З метою руйнування клітин для одержання більш насиченого екстракту проводили заморожування за мінусової температури (-12-150 С) протягом 8-12 годин та відтавання у термостаті за температури 370 С.

Гомогенат лімфоїдної тканини зважували. До нього додавали виготовлений забуферений фізіологічний розчин рН 7,4 у співвідношенні 1:9, періодично перемішували і витримували у холодильнику 10 – 12 години за t0 +40С. У такий спосіб проводили екстрагування лімфоїдної тканини із одержаних лімфоїдних органів. Для видалення клітинного детриту з одержаної суспензії застосовували центрифугування при 5000 об/хв упродовж 10 хв. у великих центрифужних стаканах. Після цього надосадкову рідину декантирували і використовували далі як екстракт лімфоїдної тканини.

Консервація одержаного екстракту проводилася шляхом додавання формальдегіду з кінцевою концентрацією 0,125%.

Екстракт стерилізували в два етапи. Спочатку піддавали стерилізуючій фільтрації крізь систему предфільтр „Startopor” (порозність 1,2 нм), фільтр „Sartobran” (порозність 0,2 нм), а потім опромінювали ультрафіолетом.

Після стерилізації та консервації екстракт розфасовували у флакони над полум’ям спиртівки в умовах стерильного боксу по 200, 100 або 50 см3.

Укупорені флакони закривали ковпачками з алюмінієвої фольги, закатували та етикетували. Екстракт зберігали в затемненому прохолодному місці за t0 +2–200С. Термін придатності екстракту – 6 місяців.

Виготовлений ЕЛПР піддавали контролю на бактеріальну контамінацію шляхом висіву на поживні середовища. Вірусну контамінацію визначали на курячих ембріонах, яким вводили екстракт і перевіряли на наявність змін.

Крім того, випробовували екстракт на нешкідливість із використанням білих мишей, яким його вводили інтраперітонеально. Пірогенність оцінювали на кролях, яким ЕЛПР вводили внутрішньовенно з урахуванням результатів за показниками температури тіла тварин.

ЕЛПР досліджували на вміст загального білку за методом Біуретта, а також визначали рН та фізичні якості екстракту.

Визначення оптимальної імуностимулюючої дози ЕЛПР. Оптимальну дозу визначали в межах 0,1-1,0 см3 на курчатах двотижневого віку при ентеральному введенні.

Встановлено збільшення показників із збільшенням дозування. Мінімальні дози 0,1 та 0,3 см3 на голову викликали незначні збільшення у вмісті імуноглобулінів і збільшення індексів тимусу, селезінки і бурси Фабриціуса. Доза 0,5 см3 на голову значно відрізнялась у бік збільшення і досягала показників відповідно: рівень IgG сягав 8,03±0,036 мг/см3 (Р<0,001); IgM – 1,64±0,04 мг/см3 (Р<0,001), IgA – 0,52±0,01 мг/см3 (Р<0,001). Збільшення дози до 0,7 та 1,0 см3 на курча викликало подальше підвищення цих показників, відповідно: IgG 8,08±0,05 мг/см3 (Р<0,001) та 8,10±0,03 мг/см3 (Р<0,001); IgM 1,67±0,04 мг/см3 (Р<0,001) та 1,67±0,05 мг/см3 (Р<0,001), та IgA 0,54±0,01 мг/см3 (Р<0,001) та 0,54±0,012 мг/см3 (Р<0,001).

Величина індексів тимусу, бурси Фабриціуса та селезінки також збільшувались пропорційно до дози екстракту. Найбільшими ці показники були відмічені у курчат, які отримували максимальну дозу ЕЛПР. У четвертій та п’ятій групах показники були дещо нижчими, а різниця коливалася в межах статистичної недостовірності.

Проведеними дослідами встановлено позитивний вплив імуностимулятора ЕЛПР на продуктивність курчат. Приріст живої маси піддослідних курчат корелював зі збільшенням дози застосованого імуностимулятора.

Помітне підвищення показників відмічено зі збільшенням дози, починаючи з дози 0,5 см3.

Таким чином, за результатами проведених досліджень встановлено, що при мінімальних дозах 0,1 та 0,3 см3 на голову в показниках імунної системи відмічено лише незначні позитивні зміни у порівнянні з показниками курчат контрольної групи.

Дозу 0,5 см3 слід вважати оптимальною, виходячи з отриманих даних, які представлено в таблиці 1. Що стосується доз 0,7 та 1,0 см3, то вони можуть бути застосовані з метою імуностимуляції за наявності достатньої кількості імуностимулятора.

При порівнянні даних, отриманих при цих дозах, з даними четвертої групи можна відмітити лише невелику перевагу. Тому дозу 0,5 см3 слід вважати оптимальною з урахуванням ефективності та раціонального використання матеріалу.

Таблиця 1

Результати визначення імуностимулюючої дії ЕЛПР

(M±m, n=5)

Критерії оцінки |

Контроль | Доза ЕЛПР в см3

0,1 | 0,3 | 0,5 | 0,7 | 1,0

1 група | 2 група | 3 група | 4 група | 5 група | 6 група

Рівень IgG, мг/см3 | 6,44±0,042 | 7,70±0,042* | 7,81±0,032* | 8,03±0,036* | 8,08±0,05* | 8,10±0,03*

Рівень IgМ,

мг/ см3 | 1,39±0,04 | 1,59±0,02* | 1,61±0,04* | 1,64±0,04* | 1,67±0,04* | 1,67±0,05*

Рівень IgА,

мг/ см3 | 0,35±0,013 | 0,48±0,012* | 0,50±0,015* | 0,52±0,01* | 0,54±0,01* | 0,54±0,012*

Маса тимусу, мг | 1016,4± 0,06 | 1260,4± 0,064* | 1344±0,062* | 1371,28± 0,061* | 1424,4± 0,038* | 1435,1± 0,054*

Індекс тимусу | 4,40±0,012 | 5,48±0,014* | 5,54±0,013* | 5,62±0,016* | 5,63±0,015* | 5,65±0,013*

Маса бурси, мг | 1004,85± 0,05 | 1232,8± 0,045* | 1368±0,041* | 1393,24± 0,024* | 1467±0,05* | 1478,28±

0,025*

Індекс

бурси | 4,35±0,013 | 5,36±0,013* | 5,39±0,01* | 5,71±0,019* | 5,80±0,016* | 5,82±0,017*

Маса селезінки, мг | 295,64± 0,051 | 310,5±0,05* | 326,4±0,03* | 334,28±0,05* | 344±0,02* | 347,98±

0,023*

Індекс селезінки | 1,28±0,02 | 1,35±0,05* | 1,38±0,06* | 1,37±0,05* | 1,36±0,04* | 1,37±0,03*

Жива маса, г | 231±3,19 | 230±2,6 | 235±4,36 | 244±3,52 | 253±4,35 | 254±4,46

Примітка: *-Р<0,001

Вивчення імуностимулюючої ефективності ЕЛПР при вакцинації проти ньюкаслської хвороби. Результати оцінювалися за серологічними, біохімічними та імуноморфологічними дослідженнями.

За результатами РЗГА (таблиця 2) достатньо результативною імуностимулюючою дозою ЕЛПР для курчат є 0,9 см3 на голову, але дози 0,5 та 0,7 см3 теж мають добре виражені імуностимулюючі властивості. Різниця між результатами четвертої, п’ятої та шостої груп є незначною і статистично недостовірною. Що стосується показників контрольної, а також 1-ї і 2-ї груп, де доза дорівнювала відповідно 0,1 та 0,3 см3, то там показники були значно нижчими.

За рівнем накопичення імуноглобулінів усіх класів кращі результати спостерігали при введенні імуностимулятора дозою 0,7 та 0,9 см3, але доза 0,5 см3 є досить ефективною, її можна вважати оптимальною за незначною розбіжністю в показниках цих груп.

Таблиця 2

Визначення оптимальної імуностимулюючої дози ЕЛПР при щепленні вакциною Ла-Сота

(M±m, n=10)

Критерії оцінки | Вірус-вакцина Ла-Сота

Контроль | Імуностимулятор ЕЛПР у см3

0,1 | 0,3 | 0,5 | 0,7 | 0,9

1 група | 2 група | 3 група | 4 група | 5 група | 6 група

Титр анти-гемаглютині-нів, log2. | 5,6±0,01 | 6,66±0,07* | 6,67±0,06* | 7,67±0,07* | 7,68±0,07* | 7,69±0,05*

Рівень IgG, мг/см3 | 8,59±0,01 | 8,61±0,013* | 9,02±0,014* | 9,62±0,016* | 9,63±0,014* | 9,65±0,011*

Рівень IgM, мг/см3 | 1,39±0,05 | 1,51±0,02* | 1,52±0,007* | 1,62±0,014* | 1,62±0,007* | 1,63±0,02*

Рівень IgA, мг/см3 | 0,62±0,014 | 0,640±

0,013* | 0,651±

0,012* | 0,670±

0,016* | 0,67±

0,012* | 0,675±

0,015*

ЦІК, мг/см3 | 0,07±0,002 | 0,08±0,022* | 0,09±0,025* | 0,09±0,03* | 0,10±0,02* | 0,10±0,001*

Серомукоїди, мг/см3 | 2,75±0,025 | 1,1±0,032* | 0,8±0,01* | 0,6±0,02* | 0,4±0,03* | 0,2±0,02*

Бактерицидна активність, % | 60±0,02 | 80±0,021* | 81±0,04* | 81,5±0,03* | 82±0,03* | 82,5±0,04*

Лізоцимна активність,

мкг/см3 | 1,03±0,025 | 1,40±0,02* | 1,41±0,03* | 1,43±0,024* | 1,45±0,02* | 1,46±0,03*

Т–лімфоцити, Е-РОК, % | 43±0,15 | 50±0,25* | 49±0,15* | 54±0,2* | 62±0,1* | 72±0,12*

В-лімфоцити ЕАС – РОК, % | 13±0,15 | 18±0,1* | 20±0,09* | 22±0,12* | 24±0,11* | 27±0,23*

Індекс тимусу | 4,36±0,011 | 4,60±0,012* | 5,60±0,014* | 5,64±0,02* | 5,63±0,012* | 5,65±0,014*

Індекс бурси | 4,42±0,01 | 5,04±0,012* | 5,23±0,013* | 5,74±0,012* | 5,75±0,013* | 5,78±0,01*

Індекс селезінки | 1,28±0,003 | 1,30±0,003* | 1,34±0,002* | 1,34±0,03* | 1,35±0,002* | 1,35±0,01*

Примітка: *-Р<0,001

Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) збільшувався зі збільшенням дози імуностимулятора.

Рівень серомукоїдів у сироватці крові найвищим був у контрольній групі і склав 2,75±0,025 мг/см3 (Р<0,001), а при вживанні імуностимулятора цей показник знижувався.

Фото № 1. Тимус. Збіднення лімфоцитами.

Ок. – 10х; об. – 40х. Фарб. гематоксилін-еозином.

Фото 2. Бурса Фабриціуса. Нерівномірне потовщення коркового шару. Ок. – 10х; об. – 40х. Фарб. гематоксилін-еозин.

Було досліджено бактерицидну та лізоцимну активність сироватки крові у курчат. Так, найбільш виражена бактерицидна активність була у курчат, які отримували ЕЛПР дозою 0,5, 0,7 та 0,9 см3. Кількість Т-лімфоцитів найбільше було виявлено у 6 групі, але збільшення цього показника проходило нерівномірно. При дозі 0,5 см3 кількість Т-лімфоцитів значно збільшувалась порівняно з контрольною групою. Найменша кількість В-лімфоцитів була в контрольній групі – 13±0,15 %, а найбільше значення було виявлено у курчат 6 групи – 27±0,23 % (Р<0,01), але достатньо ефективне підвищення цього показника порівняно з контролем відмічено при дозі 0,5 см3 у курчат четвертої групи (22±0,12%).

Індекси лімфоїдних органів, за даними таблиці 2, підвищувалися зі збільшенням дози імуностимулятора. Відмічено, що дозу 0,5 см3 у курчат 4-ї групи слід вважати оптимальною, тому що подальше збільшення дози було менш ефективним, хоч невеликий приріст цих показників спостерігався у курчат 5-ї та 6-ї груп.

За результатами гістологічного дослідження у курчат контрольної групи, щеплених без імуностимуляції, було виявлено збіднення тимусу лімфоцитами (фото 1), а при застосуванні ЕЛПР у щеплених курчат 4-ї групи в бурсі Фабриціуса спостерігалося нерівномірне потовщення коркового шару лімфоїдних вузликів із набуттям трилистої форми (фото 2).

Таким чином, дозу 0,5 см3 треба вважати оптимальною, виходячи з економного використання матеріалу та отриманих показників імуностимуляції. Дози 0,7 см3 та 0,9 см3 також можуть бути застосовані за умови достатньої кількості препарату.

Порівняльне вивчення методів застосування ЕЛПР. Для визначення оптимального методу введення ЕЛПР було сформовано 3 піддослідних та контрольна групи по 6 курчат двотижневого віку. Другій групі препарат задавали ентерально дозою 0,5 см3, третій – внутрішньом'язово дозою 0,2 см3 та четвертій – інтраперітонеально дозою 0,2 см3. Перша група була контрольною, якій не давали імуностимулятор.

З наведеної таблиці 3 видно, що за показниками серологічних досліджень титр антигемаглютининів в РЗГА був вищий у 4 групі, де в поєднанні з вакциною вводився ЕЛПР інтраперітонеально і становив 7,72±0,07 log2 (Р<0,001), нижчий цей показник виявився у другій групі 7,01±0,07 log2 (Р<0,001) та у третій групі 7,69±0,08 log2 (Р<0,001). У першій групі рівень антигемаглютинінів складав 5,4±0,01 log2.

Підвищення антитіл спостерігалося при парентеральному введенні препарату, але і при ентеральному застосуванні відзначено досить високі показники.

За результатами накопичення імуноглобулінів класів IgG, IgМ та IgА найвищі показники спостерігали у четвертій групі, де разом з обробкою вакциною вводили інтраперітонеально ЕЛПР дозою 0,2 см3.

У курчат цієї групи показники незначно відрізнялися від курчат 3-ї, а також 2-ї групи, де при ентеральному введенні підвищення цих показників порівняно з контролем було достатньо високим.

Що стосується наявності серомукоїдів, то рівень цих показників знижувався за різних методів застосування екстракту, а ЦІК понизилися до однакового рівня у курчат усіх піддослідних груп – до 0,09 мг/см3.

Імунологічними дослідженнями було встановлено, що найкращі показники індексу тимусу 5,61±0,001 (Р<0,001) були при інтраперитонеальному застосуванні ЕЛПР. Дещо нижчим цей показник був у 3-й групі курчат, а при ентеральному введенні індекс тимусу дорівнював 5,60±0,006 (Р<0,001). Цей показник значно відрізнявся від показника в контрольній групі – 4,42±0,02.

Індекс бурси Фабриціуса при ентеральному введенні дорівнював 5,73±0,02 і був найкращим показником у цьому досліді, а в контролі він дорівнював 4,65±0,12.

Індекс селезінки у групі з ентеральним введенням ЕЛПР дорівнював 1,44±0,012 (Р<0,001) і майже такі показники були в інших піддослідних групах при значному відриві від цього індекса в контрольній групі – 1,35±0,003.

Таблиця 3

Порівняльне дослідження методів введення препарату ЕЛПР разом із щепленням проти ньюкаслської хвороби

(M±m, n=6)

Критерії оцінки. | 1 група | 2 група | 3 група | 4 група

Вакцина Ла-Сота

Контроль | Введення імуностимулятора ЕЛПР.

Ентерально дозою

0,5 см3. | Внутрішньо-м’язово дозою 0,2 см3 | Інтраперито-неально дозою 0,2 см3

Титр в РЗГА, log2. | 5,4±0,01 | 7,01±0,07* | 7,69±0,08* | 7,72±0,07*

Рівень IgG, мг/см3 | 8,60±0,01 | 9,02±0,016* | 9,613±0,012* | 9,645±0,012*

Рівень IgА, мг/см3 | 0,63±0,014 | 0,67±0,016* | 0,683±0,011* | 0,699±0,012*

Рівень IgМ, мг/см3 | 1,39±0,05 | 1,62±0,014* | 1,64±0,03* | 1,66±0,008*

ЦІК, мг/ см3 | 0,12±0,002 | 0,09±0,03* | 0,09±0,045* | 0,09±0,04*

Серомукоїди, мг/см3 | 2,75±0,025 | 0,6±0,02* | 0,5±0,05* | 0,4±0,035*

Індекс тимусу | 4,42±0,02 | 5,60±0,006* | 5,59±0,014* | 5,61±0,011*

Індекс бурси Фабриціуса | 4,65±0,012 | 5,73±0,02 | 5,68±0,017 | 5,70±0,12

Індекс селезінки | 1,35±0,003 | 1,44±0,012* | 1,435±0,003* | 1,43±0,013*

МФП | 36,6±7,2 | 37,3±5,4* | 38,1±6,1* | 38,6±8,1*

МКС | 0,92±0,054 | 0,87±0,006* | 0,87±0,005* | 0,86±0,023*

Примітка: *-Р<0,001

Морфо-функціональний потенціал при ентеральному введенні дорівнював 37,3±5,4 (Р<0,001). Цей показник був незначно нижчим, ніж при внутрішньом’язовому та інтраперитоніальному введенні, але значно відрізнявся від показника у контрольній групі – 39,6±7,2, що свідчить про імуностимулюючий вплив препарату ЕЛПР.

Мозково-кіркове співвідношення у піддослідних курчат знижувалось порівняно з контролем з 0,92±0,054 до 0,87±0,006 при ентеральному введенні. За інших методів застосування було одержано майже аналогічні результати.

Таким чином, усі методи введення ЕЛПР мають імуностимулюючі властивості. Найбільш раціональним за доступністю і простотою реалізації є ентеральний метод.

Порівняння схем застосування ЕЛПР при щепленні проти ньюкаслської хвороби. Дослідження проводились на двотижневих курчатах 3-х піддослідних та одній контрольній групі по 6 курчат у кожній. Другій групі екстракт давали разом зі щепленням, третій – за 5 діб до щеплення, а четвертій – через 5 діб після щеплення. Перша група залишалася контрольною.

За даними таблиці 4 у піддослідних групах при застосуванні вакцини та ЕЛПР абсолютна маса тимусу збільшувалась порівняно з контролем. Позитивні зміни відзначено в індексі тимуса, який у 2-й, 3-й та 4-й піддослідних групах дорівнював відповідно 5,76±0,13 (Р<0,001); 5,74±0,2 (Р<0,001), та 5,63±0,11 (Р<0,001). У контролі цей показник був нижчим і відповідав 5,4±0,01.

Індекс бурси Фабриціуса в контрольній групі курчат дорівнював 3,77±0,02, а у піддослідних 2-й, 3-й та 4-й групах він досягав відповідно 4,0±0,01 (Р<0,001); 4,1±0,01 (Р<0,001) та 4,0±0,01 (Р<0,001). Індекси бурси також демонструють перевагу цього показника в піддослідних групах, які одержували імуностимулятор.

Показники маси та індекси селезінки відрізнялись у контрольній та піддослідних групах. Якщо у контрольних курчат цей показник відповідав 422,7±42,1 мг, то у піддослідних в 2-й, 3-й та 4-й групах він збільшувався відповідно до 545,3±13,20 (Р<0,001); 600,6±29,3 (Р<0,001) та 556,4±35,4 (Р<0,001) мг. Така ж тенденція спостерігалась у зміні індексу селезінки.

Проведеними імуноморфологічними дослідженнями на гістологічному рівні було виявлено позитивні зміни при застосуванні ЕЛПР. У другій групі курчат, яким разом із вакцинацією задавали імуностимулятор, площа фабрицієвої бурси після стимуляції незначно зменшувалася. При гістологічному дослідженні це корелювало із зменшенням розмірів лімфоїдних вузликів і деяким зменшенням ширини кори лімфоїдних вузликів.

У третій та четвертій групах, де стимулятор вводився відповідно через 5 днів після вакцинації та за 5 днів до вакцинації, у бурсі Фабриціуса спостерігали незначну тенденцію до збільшення її площі, розмірів лімфоїдних вузликів та ширини кіркової речовини в порівнянні з другою групою. Бурси Фабриціуса курчат контрольної групи були подібні піддослідним, але були з більш пухкою і рівномірно заповненою мономорфними клітинами типу середніх лімфоцитів.

У тимусі піддослідних курчат 2, 3 та 4-ї групи гістологічних ознак ослаблення морфофункціонального стану часточок не встановлено. Як правило, кіркова речовина була чітко визначена і була густо заповнена клітинами. У мозковому шарі відмічено достатню кількість лімфоцитів, які рівномірно розташовувались територією мозкової речовини.

Таким чином, за результатами серологічних та імуноморфологічних досліджень встановлено імуностимулюючу дію ЕЛПР при різних схемах застосування. Найбільш доступним слід вважати метод одночасної дачі імуностимулятора разом зі щепленням курчат.

Таблиця 4

Порівняльні дані при різних схемах імуностимуляції та вакцинації проти ньюкаслської хвороби

(M±m, n=6)

Критерії оцінки | Вакцинація вірус-вакциною Ла-Сота

Контроль | ЕЛПР одночасно з щепленням | ЕЛПР

за 5 діб | ЕЛПР через5 діб

1 група | 2 група | 3 група | 4 група

Титр антигемаглютинінів, log2. | 6,3±0,2 | 7,0±0,12* | 7,1±0,1* | 7,2±0,24*

Абсолютна маса тимусу, мг | 1463±621 | 1653,1±

375,1* | 1641,6±458* | 1666,4±289*

Індекс тимусу |

5,4±0,01 | 5,76±0,13* | 5,74±0,2* | 5,63±0,11*

Абсолютна маса фабрицієвої бурси, мг |

1021,6±452,8 | 1148±371* | 1172,6±264* | 1184±237*

Індекс

бурси Фабриціуа |

3,77±0,02 | 4,0±0,01* | 4,1±0,01* | 4,0±0,01*

Абсолютна маса селезінки, мг | 422,7±42,1 | 545,3±13,20* | 600,6±29,3* | 556,4±35,4*

Індекс селезінки |

1,56±0,001 | 1,62±0,01* | 2,1±0,02* | 1,88±0,025*

Маса тіла, г | 271±20,9 | 287±16,24 | 286±17,32 | 296±20,1

Примітка: Примітка: * -Р<0,001.

Вивчення залежності імуностимулюючої дії ЕЛПР від віку вакцинованих курчат. Експеримент проводили на двох вікових групах – 15- денних та 25 – денних курчатах, крім того, були сформовані дві відповідні контрольні групи (таблиця 5).

Одержані дані серологічних досліджень свідчать про позитивний вплив імуностимулятора, завдяки якому у піддослідних курчат 1–ї та 3-ї груп титри були вищими порівняно із контролем на 0,6 log2 у першій групі та на 0,7 log2 у третій групі.

Встановлено, що для щеплення перевагу має 25 – денний вік. Різниця незначна, але вона свідчить про більшу реактивність імунокомпетентної системи у курчат, старших за віком.

Так, при обробці курчат на 15 добу рівень Ig G при щепленні та імуностимуляції ЕЛПР накопичувався у кількості 6,01±0,023 мг/см3 (Р<0,001), що перевищувало цей показник у контрольній групі, де він дорівнював 5,73±0,01 мг/см3.

В групах курчат, оброблених у 25-денному віці, ці показники були вищими й дорівнювали відповідно 6,54±0,023 мг/см3 (Р<0,001) та 5,74±0,024 мг/см3.

Рівень імуноглобулінів IgM та IgA у курчат, щеплених в 15–денному віці, був вищим при одночасному застосуванні вакцини та імуностимулятора. Він дорівнював відповідно 1,50±0,08 мг/см3 (Р<0,001) та 0,66±0,006 мг/см3 (Р<0,001) і був вищим, ніж при щепленні без імуностимулятора і дорівнював відповідно 1,42±0,008 мг/см3 та 0,62±0,008 мг/см3.

Таблиця 5

Зміни серологічних та біохімічних показників при імуностимуляції курчат різного віку.

(M±m, n=7)

Показники | Обробка в 15 днів | Обробка в 25 днів

Ла-Сота + ЕЛПР | Ла-Сота | Ла-Сота + ЕЛПР | Ла-Сота

Дослід | Контроль | Дослід | Контроль

Титр антигемаглю-тинінів, log2. | 6,8±0,01* | 6,2±0,1 | 7,1±0,23* | 6,4±0,02

Рівень IgG, мг/см3 | 6,01±0,023* | 5,73±0,01 | 6,54±0,023* | 5,74±0,024

Рівень IgМ, мг/см3 | 1,50±0,008* | 1,42±0,008 | 1,52±0,009* | 1,44±0.006

Рівень IgА, мг/см3 | 0,66±0,006* | 0,62±0,008 | 0,69±0,006* | 0,65±0.007

Примітка: *-Р<0,001

При порівнянні одержаних результатів за цими класами імуноглобулінів на курчатах старших за віком визначено більш високий їх рівень. При одночасовому щепленні та імуностимуляції рівень IgM та IgA складав відповідно 1,52±0,009 мг/см3 (Р<0,001) та 0,69±0,006 мг/см3 (Р<0,001). Це перевищувало показники у курчат, яких лише вакцинували без імуностимуляції. Показники в цій групі дорівнювали відповідно 1,44±0,006мг/ см3 та 0,65±0,007мг/см3.

У цілому, за даними 3-ї та 4-ї груп відзначені показники були вищими, ніж у молодших курчат, яких обробляли у 15–денному віці.

Таким чином, за результатами серологічних та біохімічних реакцій очевидно, що застосування імуностимулятора ЕЛПР краще для тих курчат, імунні органи яких досягли більшої морфологічної завершеності. Але при цьому потрібно враховувати епізоотичну ситуацію і доцільність залишати курчат нещепленими від загрозливої інфекції.

ВИСНОВКИ

1. За результатами комплексних досліджень і з урахуванням широкого поширення імунодефіцитів у птахівництві розроблено новий імуностимулятор ЕЛПР.

Одержаний імуностимулятор ЕЛПР виготовляється із лімфоїдних органів: тимусу, бурси Фабриціуса та селезінки клінічно здорових птахів-реконвалесцентів забійного віку із господарств, благополучних щодо небезпечних інфекційних захворювань.

При застосуванні курчатам він підвищує імунний статус поголів’я, підсилює імунну відповідь при щепленні курчат проти ньюкаслської хвороби і позитивно впливає на неспецифічні фактори захисту курчат та на їхню продуктивність.

2. При ентеральному застосуванні ЕЛПР курчатам при оптимальній дозі 0,5 см3 на голову за результатами біохімічних та імуноморфологічних досліджень імунний статус підвищувався за показниками IgG до 8,03±0,036 мг/см3, IgМ – до 1,64±0,04 мг/см3, IgА – до 0,52±0,01 мг/см3. У контрольних курчат ці показники були нижчими і дорівнювали відповідно 6,44±0,042 мг/см3; 1,39±0,04 мг/см3 та 0,35±0,013 мг/см3.

Імуноморфологічні показники за даними індексу тимусу дорівнювали 5,62±0,016, індексу бурси Фабриціуса – 5,71±0,019, а в контрольній групі ці індекси були меншими і відповідно дорівнювали 4,40±0,012 і 4,35±0,013.

3. При щепленні курчат проти ньюкаслської хвороби за результатами серологічних досліджень застосування ЕЛПР при ентеральному введенні підвищує імунну відповідь. Титри антигемаглютинінів при дозі 0,5 cм3 значно зростають порівняно з контролем 5,6±0,01 log2 і сягають 7,67±0,07 log2, а при подальшому збільшенні дози, цей показник лише незначно збільшується, що свідчить про недоцільність застосування більших доз.

4. Біохімічними та імуноморфологічними дослідженнями у щеплених курчат при ентеральному застосуванні ЕЛПР у дозі 0,5 см3 було встановлено чітко виражене зростання рівня IgG, IgМ, IgА, індексу тимуса та індексу бурси Фабриціуса у порівнянні з контролем відповідно 9,62±0,016 мг/см3; 1,62±0,014 мг/см3; 0,67±0,016 мг/см3; 5,64±0,02 та 5,74±0,012. А при збільшенні дози (0,7 см3 та 0,9 см3) імуностимулятору, ці показники незначно зростали, що свідчить про оптимальність дози 0,5 см3.

5. Порівняльним дослідженням ентерального, внутрішньом’язового та інтраперитонеального методів застосування ЕЛПР разом із щепленням проти ньюкаслської хвороби всі три методи показали кращі результати порівняно з контрольною групою, яка не одержала імуностимулятора.

При деяких кращих показниках інтраперітонеального та внутрішньом’язового методів введення імуностимулятора перевагу отримує ентеральний метод за простотою його застосування і з урахуванням досить високої його ефективності.

6. При ентеральному застосуванні ЕЛПР разом із щепленням курчат проти ньюкаслської хвороби ефективними були всі три схеми застосування, тобто одночасно з щепленням, за 5 діб до і через 5 діб після вакцинації було одержано подібні результати при статистично недостовірних розбіжностях.

7. Імуностимуляція разом із щепленням проти ньюкаслської хвороби курчат 25-денного віку порівняно з курчатами 15-денного віку є незначно ефективнішою за показниками титрів антитіл і рівнів імуноглобулінів, що необхідно враховувати при визначенні термінів профілактичного щеплення і в залежності від епізоотичної ситуації.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Розроблено „Методичні рекомендації щодо застосування екстракту лімфоїдного птахів-реконволесцентів (ЕЛПР) для підвищення рівня імунного статусу курчат і для посилення імунної відповіді при вакцинації”, які затверджені науково-методичною радою Міністерства аграрної політики України, протокол № 3 від 23.12.2005 року та затверджені першим заступником голови Держдепартаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

2. Матеріали дисертації використовуються в навчальному процессі на кафедрі „Мікробіології та біотехнології” факультету ветеринарної медицини Харківської державної зооветеринарної академії.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Грінченко Д.М., Апатенко В.М. Імуностимулюючі властивості лімфоїдного препарату // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. – Х., 2005. – Т.1, Вип.85. - С.360-363. Дисертант самостійно виготовив та застосував препарат на курчатах та провів статистичну обробку отриманих результатів.

2. Грінченко Д.М., Апатенко В.М. Застосування різних методів введення лімфоїдного препарату для підвищення імунного статусу птахів // Ветеринарні науки: Зб. наук. праць Луганського національного аграрного ун-ту. – Луганськ, 2005. - №50/73. – С.31-35. Дисертант самостійно провів досліди, виготовив імуностимулятор та всі тести з визначення імунологічного статусу і самостійно провів статистичну обробку отриманих результатів.

3. Грінченко Д.М. Імуностимуляція курчат лімфоїдним препаратом // Підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин: Зб. наук. праць. – Харків, 2005. - Т. 15. – С.343-345. Дисертант провів дослід і самостійно провів серологічні, біохімічні дослідження.

4. D.N.Grinchenko, V.M.Apatenko. Immunostimulation of Birds by Lymphoid Preparation // 14-th world veterinary poultry Congress, 22-26 august 2005, Istambul, Turkey. – Istambul, 2005. - P.534. Дисертант самостійно виготовив та застосував препарат на курчатах і провів статистичну обробку отриманих результатів.

5. Грінченко Д.М., Апатенко В.М. Імуностимуляція курчат лімфоїдним препаратом // Птахівництво: Міжвід.темат.наук.зб.: Матеріали VI Української конференції з птахівництва з міжнародною участю, 19-23 вересня 2004 р., м. Алушта. – Харків, 2005. – Вип. 57. - С.390-392. Дисертант самостійно провів ряд серологічних, біохімічних та морфометричних досліджень та провів статистичну обробку отриманих результатів

6. Грінченко Д.М. Імуностимуляція при вакцинації проти ньюкаслської хвороби // Науковий вісник Національного аграрного університету. - К., 2005. – Вип.89. – С.164-168. Дисертант самостійно провів наукове дослідження

7. Грінченко Д.М., Апатенко В.М. Новий імуностимулювальний препарат при щепленні птиці проти ньюкаслської хвороби // Ветеринарна медицина України. - 2006. - №10. – С.39-40. Дисертант провів досліди, узагальнив і проаналізував дані.

8. Грінченко Д.М., Апатенко В.М. Імуностимулятор з лімфоїдної тканини для курчат // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: Зб.наук. праць /ХДЗВА. - Х., 2006. – Вип. 13(38). – С.282-289. Дисертант узагальнив експериментальні матеріали та проаналізував дані літератури.

9. Удосконалений ад’ювант / В. Апатенко, Д. Грінченко, В. Заболотна, О. Сосницкий // Ветеринарна медицина України. - 2006. - №1. – С.44-45. Дисертант проводив гістологічні, серологічні та біохімічні дослідження та узагальнив отримані дані.

10. Грінченко Д.М. Новий імуностимулятор для курчат // Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине: Материалы международной научной конференции, посвящен. 160-летию со дня рождения лауреата Нобелевской премии И.И.Мечникова. - Х., 2006. – Вип. 13, Ч.2. – С. 32-35. Дисертант узагальнив експериментальні матеріали і проаналізував дані літератури.

Грінченко Д.М.