ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ГРУШКА Наталія Георгіївна

УДК 612.35:612.014.3:615.015.44

УЧАСТЬ ТРОМБОКСАНУ В ЗАГИБЕЛІ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ В КУЛЬТУРІ

03.00.13. - Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі імунології та цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Алексєєва Ірина Миколаївна,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу імунології та цитотоксичних сироваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний

університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

кандидат біологічних наук

Розова Катерина Всеволодівна,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

старший науковий співробітник

відділу з вивчення гіпоксичних станів

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

Захист відбудеться "_15_" _травня_" 2007р. о _14_годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Бого-

мольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Бого-

мольця, 4.

Автореферат розісланий "_14_" _квітня_ 2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ейкозаноїди, похідні арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами її метаболізму, є молекулами-посередниками міжклітинної взаємодії. Вони активно синтезуються та метаболізуються в печінці і відіграють суттєву роль в регуляції її функцій за фізіологічних умов. При патології змінюється кількість і спектр ейкозаноїдів. В експериментах in vivo показана гепатопротективна дія одних ейкозаноїдів (простагландинів – ПГЕ2, Е1, простацикліну) і ушкоджуюча інших (лейкотриєнів, тромбоксанів - Тх) [Quiniou C. et al., 2006, Yokoyama Y. et al., 2003, Beauchamp M.H. et al., 2001, Nanji A.A. et al., 1997]. Ця дія може бути обумовлена як змінами кровотоку, так і безпосереднім впливом на клітини печінки, тим більше, що на гепатоцитах знайдені рецептори до ряду похідних арахідонової кислоти. Тому важливим є вивчення впливу ейкозаноїдів на життєдіяльність і загибель гепатоцитів в культурі. Особливий інтерес представляє вивчення впливу тромбоксанів (ТхА2 та ТхВ2, який швидко утворюється при гідроксилюванні ТхА2) на шляхи загибелі клітин печінки (апоптоз або некроз). Відомо, що тромбоксан А2 відіграє суттєву роль у регуляції гомеостазу крові. Відомо також, що тромбоксани синтезуються у клітинах печінки - гепатоцитах і клітинах Купфера і можуть бути аутокринними та паракринними регулятороми їх функцій [Xu H. et al., 2005, Yokoyama Y. et al., 2005, Pestel S. et al., 2003, Victorov A.V. et al., 1995]. Встановлено, що за деяких патологічних умов, при безпосередньому ураженні гепатоцитів в культурі чотирихлористим вуглецем (CCl4) утворення ТхВ2 в гепатоцитах значно посилюється [Marinovich M. et al., 1989, Nagai H., et al., 1989]. Є дані про те, що тромбоксани мають ушкоджуючу дію на печінку, а блокатори їх синтезу чинять протективний ефект при ураженні цього органу, однак безпосередній вплив ТхВ2 на життєздатність гепатоцитів і їх загибелі практично не вивчений.

На сьогоднішній день виділяють три основні типи клітинної смерті – апоптоз, аутофагічна загибель клітин і некроз, які розрізняють за морфологічною картиною, механізмами і наслідками для організму. Механізми апоптозу, які складаються з цілого каскаду процесів в клітині, завершуються активацією каспаз і ендонуклеаз, що призводить до конденсації і фрагментації хроматину і ядра, ущільнення цитоплазми, утворення апоптотичних тілець з їх наступним фагоцитозом. Аутофагічна загибель – самоперетравлювання клітини за допомогою утворення аутофагосом – вакуолей з клітинними органелами і/або білковим матеріалом, які зливаються з лізосомами. Для некротичної загибелі характерні перш за все втрата цілості плазматичної мембрани, яка призводить до виходу клітинного вмісту в навколишні тканини та розвитку запального і імунного процесів. Таким чином, апоптоз являє собою більш фізіологічну форму загибелі клітин і є механізмом підтримання клітинного гомеостазу. Однак, при порушенні регуляції апоптозу, при його неконтрольованому збільшенні апоптоз є патологічним чинником. Порушення регуляції апоптозу в печінці призводить до виникнення різних захворювань, пов”язаних з посиленням чи, навпаки, пригніченням апоптозу. Так, індукція апоптозу була показана при аутоімунному гепатиті, вірусному гепатиті С та В, ішемії-реперфузії, ендотоксичному ураженні, холестазі та інших захворюваннях печінки; пригнічення апоптозу сприяє онкологічним захворюванням [Yan X.B. et al., 2005, Дмитреева и др. 2003, Higuchi H. et al., 2003, Neuman M.G., 2001, Бабак О.Я., 1999]. Механізми загибелі клітин знаходяться в центрі уваги сучасної біології, як і розробка нових терапевтичних засобів, що здатні коригувати ці процеси. В дослідженні ураження органів і клітин, зокрема гепатоцитів, доцільно розрізняти морфологічні ознаки, що характеризують стадію апоптотичної загибелі, а також прояви некрозу, що важливо для встановлення механізмів деструкції печінки при різних типах її ушкодження. Відомо, що морфологічні та біохімічні риси окремих типів клітинної смерті перекриваються. Два загальновизнані типи загибелі клітин - апоптоз та некроз - довгий час розглядалися як фундаментально різні процеси, але останнім часом встановлено, що риси апоптотичної, аутофагічної та некротичної загибелі часто співіснують.

Все це призводить до необхідності детального вивчення участі простаноїдів, зокрема ТхВ2, в регуляції життєздатності клітин та балансу процесів некрозу і апоптозу гепатоцитів за нормальних та патологічних умов. Важливо також встановити механізми його впливу на загибель клітин, з метою корекції цього процесу. Адекватною експериментальною моделлю для вивчення безпосередньої дії простаноїдів та блокаторів їх синтезу на процеси апоптозу, аутофагії та некрозу є первинна культура гепатоцитів. Такі клітини є нетрансформованими, ця модель дозволяє вивчати зміни в гепатоцитах, не опосередковані процесами, що відбуваються на органному та організменному рівнях.

Метою дослідження було оцінити вплив ТхВ2 на шляхи загибелі культивованих гепатоцитів щурів (апоптоз, некроз, аутофагія) в нормі та при їх ушкодженні чотирихлористим вуглецем та хенодезоксихолевою кислотою. Для дослідження цієї мети були поставленні наступні завдання.

1. Одержати і охарактеризувати первинну культуру гепатоцитів щурів, оцінити спонтанну клітинну загибель в ній за даними подвійного флуоресцентного забарвлення ядер гепатоцитів та електронної мікроскопії.

2. Вивчити кількість гепатоцитів, що мають прояви апоптотичної, некротичної і аутофагічної загибелі за умов дії різних доз екзогенного ТхВ2 в динаміці.

3. Оцінити активність каспаз 3 та 8 при дії екзогенного ТхВ2, та вплив циклоспорину А на розвиток апоптозу гепатоцитів.

4. Оцінити вміст апоптотичних та некротичних гепатоцитів у культурі, на двох моделях ушкодження клітин: 1) токсичного - при дії CCl4 та 2) індукованого хенодезоксихолевою кислотою (ХДХК).

5. На двох моделях ураження гепатоцитів дослідити вплив екзогенного ТхВ2 на загибель клітин в порівнянні з дією ПГЕ2 і ПГF2a.

6. Вивчити дію блокатора циклооксигенази ацетилсаліцилової кислоти та блокатора тромбоксансинтази бензилімідазолу на апоптотичну і некротичну загибель гепатоцитів, ушкоджених CCl4 та ХДХК.

Об'єкт дослідження: культура гепатоцитів щурів.

Предмет дослідження: загибель інтактних та ушкодженних CCl4 і ХДХК гепатоцитів за апоптотичним, некротичним та аутофагічним шляхами під впливом ТхВ2.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації пов’язана з дослідженнями, які виконуються відділом імунології і цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України “Вивчення ролі оксиду азоту і ейкозаноїдів в механізмах розвитку гуморальних імунних реакцій та змін функціональної активності клітин під впливом антитіл“ (2001-2004рр.), та “Вивчення механізмів розвитку імунної патології печінки і жіночої репродуктивної системи та шляхів її корекції“ (2005-2007рр.).

Наукова новизна одержаних результатів: Вперше показано, що під дією ТхВ2 у культурі гепатоцитів підвищується кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу та відбувається активація каспази 3. Вперше встановлено, що внесення інгібітора утворення мітохондріальних пор циклоспорину А в культури гепатоцитів призводило до зменшення кількості апоптотичних клітин в порівнянні з дією ТхВ2, що свідчить про участь мітохондріального шляху в проапоптотичній дії ТхВ2. Вперше показано, що ТхВ2 посилює апоптоз гепатоцитів за умов їх токсичного ушкодження (ССl4) або ушкодження жовчними кислотами (ХДХК). Вперше охарактеризовано морфологічні форми апоптозу гепатоцитів за умов дії ТхВ2 в нормі та при ушкодженні ССl4 або ХДХК.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження мають фундаментальне значення для з’ясування механізмів регуляції апоптотичної та некротичної загибелі клітин, зокрема гепатоцитів, в нормі та при патології. Їх практичне значення полягає в обгрунтуванні необхідності диференційованного вивчення апоптотичної і некротичної загибелі клітин при захворюванні печінки різної етіології, а також в обгрунтуванні можливості корекції цих процесів за допомогою впливу на синтез тромбоксану.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведено науковий пошук і обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконані експерименти по вивченню впливу екзогенних ТхВ2, ПГЕ2, ПГF2a та блокаторів їх синтезу на загибель інтактних і ушкодженних гепатоцитів. Досліджено вплив циклоспорину А на загибель клітин; вивчено зміни активності каспаз у культуральному середовищі гепатоцитів. Проведено статистичну обробку і аналіз одержаних результатів, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень. Експериментальна робота по одержанню і культивуванню гепатоцитів проведена спільно з співробітниками відділу іммунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на Пленумі наукового товариства патофізіологів України (Одеса, 19-21 вересня 2002р.); на конференції молодих учених Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАНУ (Київ, листопад 2003р); на конференції студентів та молодих вчених по молекулярній біології та генетиці з міжнародною участю, (Інститут молекулярної біології та генетики, Київ, 25-27 вересня, 2003р); на 17 з’їзді фізіологів України (Чернівці, 18-20 травня 2006р).

Публікації. Результати дисертації викладені в 16 публікаціях: статті - 6, тези конференцій, симпозіумів, з’їздів, пленумів - 10.

Структура та обсяг дисертації: Дисертація викладена на 135 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 15 рисунками і 14 таблицями. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису матеріалів і методів дослідження, 5 розділів результатів власних досліджень, розділу аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, що нараховує 164 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження.

Одержання культури гепатоцитів щурів. Для отримання клітин печінки були використані статевозрілі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г, що утримувалися на стандартному раціоні віварію. При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.

Виділення гепатоцитів проводили в стерильних умовах за методом Сеглена з деякими модифікаціями [Ruan Z. et al, 2004]. Тварин наркотизували нембуталом (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно) та вводили гепарин (100 од.) в хвостову вену. Далі здійснювали двохетапну перфузію печінки через нижню полу вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса (7-10 хв.), що містив 9 ммоль/л HEPES і 0,5 ммоль/л EГTA, після чого продовжували перфузію 0,05 % розчином колагенази (Sigma, тип 1А) в розчині Хенкса з 9 ммоль/л HEPES і 5 ммоль/л CaCl2 (рН 7,4; 37оС) протягом 25-30 хвилин. Капсулу печінки розривали, отриману суспензію клітин фільтрували та паренхіматозні клітини осаджували двічі протягом 30 сек при 280 g. Додатково гепатоцити очищали центрифугуванням в дискретному градієнті густини Перколу (Sigma, USA) протягом 30 хвилин при 750 g (20оС). Очищені гепатоцити збирали на межі розділу між 73 % і 57 % розчином Перколу.

Культивування гепатоцитів проводили в середовищі культивування (RPMI 1640 (Sigma) з 15 ммоль/л HEPES та 10% ембріональної телячої сироватки та антибіотиків) в 24-лункових планшетах для культур клітин (“Sigma”, США) на покритому колагеном склі, або в 6-лункових планшетах, дно яких покривали полі-L-лізіном, в залежності від схеми експерименту. Гепатоцити вносили в кількості 1,5·105 клітин на лунку 24-лункового планшета в 0,6 мл середовища культивування, або в кількості 2·106 клітин на лунку 6-лункового планшета в 2 мл культурального середовища. Через 3 години після посадки культури відмивали від неприкріплених клітин. Після 18-годинного культивування моношар гепатоцитів відмивали, вносили середовище інкубації та здійснювали відповідні для різних серій експериментів впливи.

1 серія –екзогенний ТхВ2 (“Sigma”, США), вносили в культури двічі з інтервалом 1 годину в кінцевих концентраціях – 0,001, 0,01, 0,1 і 1 мкмоль/л.

2 серія - СС14 (попередньо розчинений в диметилсульфоксиді –ДМСО), вносили в культури в кінцевій концентрації 10 ммоль/л. Екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу СС14 і через 30 хвилин після нього.

3 серія - ХДХК вносили в культури в кінцевій концентрації 100мкмоль/л; екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу ХДХК і через 30 хвилин після нього.

4 серія – в культуральне середовище вносили блокатори: загальний блокатор циклооксигенази - ацетилсаліцилову кислоту (АСК) в кінцевій концентрації 200 мкмоль/л і блокатор тромбоксансинтетази - бензилімідазол (БІА) в кінцевій концентрації 20 мкмоль/л. Через 15 хвилин додавали СС14 (10 ммоль/л) або ХДХК (100мкмоль/л).

5 серія - в культуральне середовище вносили блокатор утворення мітохондріальних пор циклоспорин А в кінцевій концентрації 1 мкмоль/л, через 15 хвилин після впливу - Тх В2 в кінцевій концентрації 0,1 мкмоль/л.

Контролем для кожної концентрації ТхВ2 слугували культури, оброблені етанолом в концентрації, що дорівнювала такій в відповідному розчині ТхВ2.

Оцінка апоптозу та некрозу гепатоцитів за методом прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками. Культури клітин прижиттєво забарвлювали розчином барвників Хехст 33342 (“Sigma”, США) та пропідіума йодид (“Sigma”, США) [Shimizu S. et al., 1996]. Йодид пропідіума проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин і клітин, що гинуть за апоптотичним шляхом, у зелено-синій колір. Зв’язані з хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні риси ядерного матеріалу, притаманні апоптозу: периферичне розташування хроматину, його конденсацію, фрагментацію ядер, а також розпад гепатоцитів на апоптотичні тільця.

Підрахунок живих, некротичних та апоптотичних клітин здійснювали за допомогою люмінесцентного мікроскопа (МЛ-2) з водно-імерсійним об’єктивом х70 та окуляром х 5. В кожному експерименті оцінювали стан не менш ніж 600 клітин. У випадку неоднорідної популяції, як при ушкодженні СС14, підраховували в кожній культурі 800-1200 клітин на межі зони ушкодження.

Електронно-мікроскопічні дослідження апоптотичної та некротичної загибелі гепатоцитів.

Гепатоцити культивували за вищеописаною схемою в обробленних колагеном 8-ми лункових планшетах для електронної мікроскопії з відривним дном (“Lab-Tek”) в 0,6 мл культурального середовища. Препарати готували за загальноприйнятою методикою.

Визначення активності каспаз.

Активність каспаз в клітинному лізаті вивчали колориметричним методом (Сaspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit, FLICE/Сaspase-8 Colorimetric Protease Assay Kits) за інструкцією фірми-виробника набору (BioVision Research Products, USA). Метод базується на спектрофотометричному визначенні кількості хромофора р-нітроаніліда (pNA), після його відщеплення від міченого субстрата (для каспази-3 - DEVD-pNA і для каспази 8 - IETD- pNA).

Забарвлення аутофагічних структур.

Оцінку активності процесів аутофагії в умовах дії ТхВ2 в концентрації 0,1 мкмоль/л проводили за допомогою флуоресцентного барвника монодансилкадаверіна (МДК) фірми “Sigma” у кінцевій концентрації 50 мкмоль/л на протязі 10 хв у темряві за інструкцією виробника. ТхВ2 вносили в культури двічі з інтервалом в 1 год. Через 3 год інкубації з ТхВ2 здійснювали забарвлення МДК. Після відмивання холодним ЗФР (чотири рази), здійснювали прижиттєву оцінку процесів аутофагії, підраховуючи кількість клітин з вираженою гранулярною флуоресценцією, оцінювали забарвлення не менш ніж 200 клітин в кожній культурі. Підраховували кількість клітин з сильним, слабим забарвленням, а також без забарвлення і вираховували їх відсоток.

Представлені дані є результатом трьох-шести незалежних експериментів. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур [Munafo D.B., 2001].

Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика культури гепатоцитів.

За оцінкою методом включення барвника (трипанового синього) кількість виділених живих гепатоцитів перед їх культивуванням складала 84,6±5,6%. Домішок непаренхіматозних клітин (НПК) в суспензії гепатоцитів, оцінений за морфологічними ознаками, складав при посадці 4,23%1,68% від загальної кількості клітин, тоді як кількість цих клітин у печінці складає -30-40%. Через 18 год після посадки культури гепатоцитів мали вигляд моношару полігональних клітин. Їх можна охарактеризувати, як культури високої щільності, що приблизно відповідає щільності злиття клітин. Гепатоцити розпластувалися та утворювали контакти з сусідніми клітинами. Виявлялися одно-, дво- та багатоядерні гепатоцити. Домішок НПК в культурах гепатоцитів після 18-42 годин культивування складав 0,92±0,07% від загальної кількості клітин, тобто в процесі прикріплення клітин до колагенового субстрату, їх культивування та відмивання відбувалося подальше очищення культур гепатоцитів від НПК.

Загибель культивованих гепатоцитів щурів та морфологічні ознаки клітинної загибелі під впливом екзогенного ТхВ2 за даними люмінесцентної та електронної мікроскопії.

Встановлено, що екзогенний ТхВ2 в кінцевих концентраціях 0,001, 0,01, 0,1 і 1 мкмоль/л за даними люмінесцентної мікроскопії зменшував кількість живих гепатоцитів та підвищував кількість гепатоцитів з морфологічними ознаками апоптозу відповідно в 2,8 (P<0,001), в 2,8 (P<0,01), в 1,6 (P<0,01), в 1,4 (P<0,05) рази по відношенню до контролю через 4 год після внесення ТхВ2. Подібні результати були отримані через 8 та 24 год (дані відносно 0,1 мкмоль/л ТхВ2 представлені в Таблиці 1). Важливо те, що виражені ефекти спостерігалися навіть при наномолярних концентраціях ТхВ2 (0,01 та 0,001 мкмоль/л), які можуть відповідати його концентрації в печінці при фізіологічних умовах або при незначній стимуляції його вивільнення тромбоцитами, гепатоцитами або синусоїдними клітинами печінки. Встановлено, що ТхВ2 суттєво не впливав на інші вивчені шляхи загибелі гепатоцитів, такі як некроз та аутофагію: відсоток клітин, забарвлених флуоресцентним барвником аутофагосом монодансилкадаверином становив в контролі 2,66±0,7%, за умов дії ТхВ2 2,74±0,8%.

Ці дані відносно проапоптотичної дії Тх на культивовані гепатоцити щурів отримані вперше. Однак в літературі є непрямі підтвердження таких ефектів Тх: при дії на ізольовані гепатоцити ТхВ2 спричиняв через активацію нелізосомальних протеїназ утворення вип’ячувань плазматичної мембрани (blebs), які вважають характерними для апоптозу [, 1991, , 1990]. Подібні до наших даних отримані результати [Yusuf K., et al., 2001, Ushikubi F., et al., 1993] про безпосередній вплив Тх на загибель інших типів клітин (тимоцитів, трофобластів). Однак є дані і про збільшення некротичної загибелі [Beauchamp M.H. et al., 2001]. В цій роботі аналог ТхА2 викликав дозо- і часозалежну смерть нейроретіноваскулярних ендотеліальних клітин щурів, в більшій мірі некротичну, ніж апоптотичну (щоправда автори не оцінювали первинний і вторинний некроз).

В аналізі морфологічних форм загибелі важливо оцінювати цілісність плазматичної мембрани, тобто первинний і вторинний постапоптотичний некроз, що супроводжується виходом клітинного вмісту і розвитком запалення і імунних реакцій in vivo. За морфологічними та біохімічними ознаками розрізняють декілька стадій развитку апоптозу. На основі літературних даних та морфологічної картини апоптозу гепатоцитів при люмінесцентному дослідженні, ми виділили 5 типів апоптозу, враховуючи стадії його розвитку (ранні чи пізні), а також ушкодження плазматичної мембрани, тобто вторинний некроз.

Проведено аналіз кількості окремих типів клітин, що знаходяться на різних стадіях апоптозу. Було виділено такі типи апоптотичних клітин: 1) – гепатоцити з конденсованим ядерним хроматином і незначним зменшенням розмірів, що відповідає раннім морфологічним ознакам апоптозу; 2) суттєво зменшені в розмірах клітини з сильно конденсованими ядрами і, переважно, з

ушкодженою мембраною (клітини, в яких процес апоптозу був перерваний на стадії конденсації ядер); 3) гепатоцити, дещо зменшені в розмірах, з сильноконденсованим і фрагментованим хроматином, зменшене у розмірах ядро зберігає цілісність, мембрана неушкоджена; 4) – гепатоцити з вираженими ознаками апоптозу, як і тип 3, однак з ушкодженою плазматичною мембраною. Ці клітини мають, таким чином, ознаки вторинного некрозу, що відбувся на фоні розвинутого апоптотичного процесу; 5) – гепатоцити, що розпались на апоптотичні тільця, які містять залишки ядерного матеріалу.

Встановлено, що при додаванні в культуру інтактних гепатоцитів ТхВ2 в кінцевих концентраціях 1, 0,1, 0,01 і 0,001мкмоль/л через 4, 8 і 24 год збільшується кількость гепатоцитів з конденсованим хроматином (тип 1), не виявлено значних змін кількості клітин з морфологічними ознаками, що характеризують пізні стадії апоптозу (тип 3, 4 і 5), або постапоптотичного некрозу (тип 2, 4) (Таблиця 2). Ці дані підтверджуються електронно-мікроскопічними дослідженнями: морфологічні зміни, спричинені ТхВ2, виявлялися переважно у ядрі, частково у цитоплазмі, але не у органелах і свідчили про підсилення ранніх стадій апоптозу. Слід відмітити, що в широкому спектрі морфологічних змін за умов захворювань печінки є такі, що співпадають з відміченими нами: каріопікноз, фрагментація ядер, конденсація хроматину, його крайове розташування. Морфологічна форма ядер – “пісочні ядра гепатоцитів” є характерною для деяких видів патології печінки, особливо хронічного вірусного гепатиту [Бабак О.Я., 1999]. Це ядра з периферичним розташуванням конденсованого ядерного хроматину, що співпадає з основною морфологічною формою апоптозу гепатоцитів за умов дії ТхВ2. Як і в наших дослідах, при захворюваннях печінки апоптоз часто супроводжуються процесами вторинного некрозу.

Електронномікроскопічні дослідження показали, що в культурах гепатоцитів, в які вносили ТхВ2 в кінцевих концентраціях 0,1 і 0,01 мкмоль/л протягом 4 год, підвищувалася кількість гепатоцитів із зміненими ядрами. Спостерігалася конденсація хроматину з крайовим його розташуванням (Рис 1б). Конденсований хроматин мав гомогенний вигляд; в його масі інколи відмічалося утворення везикул. Ядра ущільнені, з інвагінаціями. Ядерна мембрана втрачала свою чітку двошарову структуру, однак конденсований хроматин лишався в межах зони ядра, як компактне утворення (Рис 1в). Описані зміни ядер можна віднести до апоптотичних, оскільки при некрозі ніколи не спостерігається пікноз ядер. Ядерця ущільнювалися та зливалися з конденсованим хроматином. Цитоплазма таких клітин ущільнена, осмиофільна, що свідчить про втрату води (Рис 1в). Цитоплазматичні органели таких клітин (мітохондрії, плазматичний ретикулум і комплекс Гольджі) переважно не піддавалися змінам і мали неушкоджений вигляд. Спостерігалося також утворення вип’ячувань цитоплазми (blebs) і відшнурування частин цитоплазми й утворення апоптотичних тілець (Рис 1г).

Рис. 1. Ультраструктура інтактних гепатоцитів (а) та при дії екзогенного ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) (б – початкова стадія конденсації хроматину, в – виражена стадія конденсації хроматину, г - утворення вип’ячувань цитоплазми та апоптотичних тілець) через 4 год культивування.

(М – мітохондрії, X- хроматин, В - везикули в мaci хроматину, К.Х. - конденсований хроматин, ЯМ - ядерна мембрана, У.Ц. – ущільнена цитоплазма, А - апоптотичні тільця, b - blebs, Е.Р.- щільно упакований ендоплазматичний ретикулум, В – вакуолі).

Дія циклоспорину А на викликану ТхВ2 загибель гепатоцитів.

З метою встановлення механізмів проапоптотичної дії ТхВ2 ми використали циклоспорин А –антибіотик, що інгібує утворення мітохондріальних пор, які призводять до переходу мембрани мітохондрій в стан високої проникливості (MPT-mitochondrial permeability transition pores). Це попереджує вихід цитохрому c з мітохондрій і пов’язану з цим активацію каспази 3 і апоптотичні морфологічні зміни ядер. Внесення інгібітора МРТ в оброблені ТхВ2 культури (Таблиця 1) призводило до значного зменшення кількості клітин що гинули за апоптотичним шляхом в порівнянні з дією ТхВ2. Вірогідних змін кількості некротичних клітин при дії циклоспорину А виявлено не було. Дані про вплив циклоспорину А на склад гепатоцитів з різними морфологічними ознаками апоптозу при дії ТхВ2 (Таблиця 2) показали, що не відбулося змін у співвідношенні різних морфологічних стадій апоптозу, однак спостерігалось зменшення кількості гепатоцитів на стадії конденсації хроматину (тип 3). Дані про зниження індукованого ТхВ2 апоптозу в умовах застосування інгібітора МРТ циклоспорина А свідчать, що дія ТхВ2 опосередковується, принаймні частково, через утворення мітохондріальних пор.

Відомо, що при відкриванні мітохондріальних пор з мітохондрії в цитозоль вивільнюється цитохром c, який викликає активацію каспази 9 й, в подальшому, ефекторної каспази 3. Нами показано, що внесення ТхВ2 в культуральне середовище вже через 4 год призводило до активації каспази 3 в 1,12 рази (P<0,05 по відношенню до контролю) у гепатоцитах.

Таблиця 1

Вплив циклоспорину А на кількість живих, апоптотичних та некротичних гепатоцитів (у % до загальної кількості клітин) в культурах, обробленних ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) протягом 4, 8 та 24 год (M±m, n=9).

Вплив | Кількість гепатоцитів (%) | живих | апопто-тичних | некро-тичних | живих | апопто-тичних | некро-тичних | живих | апопто-тичних | некро-тичних | 4 год | 8 год | 24 год | Контроль

до ТхВ2 | 93,0

±0,6 | 4,95

±0,49 | 2,07

±0,28 | 93,8

±0,8 | 4,65

±0,58 | 1,55

±0,34 | 94,4

±1,0 | 3,50

±0,24 | 2,25

±0,91 | ТхВ289,3

±1,1** | 8,00

±0,66** | 2,75

±0,88 | 88,9

±0,9*** | 8,86

±0,75*** | 2,20

±0,54 | 92,4

±0,8 | 6,37

±0,71* | 1,26

±0,26 | ЦспА+ТхВ2 | 90,6

±1,06 | 5,70

±0,67# | 3,73

±1,02 | 92,1

±1,07# | 4,22

±0,70### | 3,68

±0,92 | 94,2

±0,50 | 3,99

±0,64# | 1,78

±0,48 | *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 - вірогідність відмінностей кількості гепатоцитів при дії ТхВ2 по відношенню до відповідного контролю.

#P<0,05, ###P<0,001 - вірогідність відмінностей кількості гепатоцитів при дії циклоспорину А на оброблені ТхВ2 гепатоцити по відношенню до дії ТхВ2

Таблиця 2

Вплив циклоспорину А на кількість гепатоцитів з різними морфологічними ознаками апоптозу (у % до загальної кількості клітин) в культурах, обробленних ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) протягом 4, 8 та 24 год (M±m, n=9).

Вплив | Кількість гепатоцитів (%) | (тип 1) | (тип 2) | (тип 3) | (тип 4) | (тип 5) | 4 год | Контр. до ТхВ24,35±0,53 | 0,22±0,07 | 0,29±0,13 | 0 | 0,09±0,04 | ТхВ2 | 6,88±0,67* | 0,45±0,16 | 0,29±0,10 | 0,04±0,03 | 0,32±0,11 | Цсп А+ТхВ2 5,05±0,68 | 0,20±0,08 | 0,21±0,08 | 0,04±0,03 | 0,20±0,09 | 8 год | Контр. до ТхВ24,08±0,50 | 0,35±0,13 | 0,16±0,08 | 0 | 0,06±0,04 | ТхВ2 7,95±0,82** | 0,38±0,13 | 0,21±0,09 | 0,04±0,03 | 0,27±0,09 | Цсп А+ТхВ2 | 3,66±0,40## | 0,29±0,14 | 0,11±0,05 | 0,08±0,08 | 0,07±0,03 | 24 год | Контр. до ТхВ23,13±0,20 | 0,11±0,08 | 0,24±0,13 | 0 | 0,02±0,02 | ТхВ2 | 5,87±0,67* | 0,08±0,04 | 0,30±0,09 | 0,04±0,04 | 0,08±0,04 | Цсп А+ТхВ2 | 3,41±0,64# | 0,27±0,13 | 0,27±0,07 | 0,02±0,02 | 0,03±0,03 | *P<0,05, **P<0,01 - вірогідність відмінностей кількості гепатоцитів при дії ТхВ2 по відношенню до відповідного контролю.

#P<0,05, ##P<0,01 - вірогідність відмінностей кількості гепатоцитів при дії циклоспорину А на оброблені ТхВ2 гепатоцити по відношенню до дії ТхВ2 .

Вплив екзогенних простаноїдів (ТхВ2, ПГЕ2 і ПГF2a) на загибель оброблених ССl4 або ХДХК гепатоцитів та морфологічні ознаки клітинної загибелі за цих умов.

Одержавши дані про те що, що екзогенний ТхВ2 впливав на загибель гепатоцитів щурів в інтактній культурі, підвищуючи кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу, ми продовжили дослідження впливу цього ейкозаноїда і інших похідних арахідонової кислоти за циклооксигеназним шляхом на загибель клітин за умов ушкодження ССl4 або ХДХК.

В наших експериментах виявлено значне зменшення кількості інтактних гепатоцитів за умов дії обох ушкоджуючих речовин. Однак при дії СС14 це зменшення відбувалося за рахунок стимуляції як некрозу, так і апоптозу, тоді як при внесенні ХДХК посилювалась тільки апоптотична загибель клітин. Раніше СС14 вважався класичним чинником некрозу. Наші дані про індукцію апоптозу цим гепатотоксином підтверджуються дослідженнями інших авторів [Cai Y. et al., 2005], які показали, що CCl4 викликає важкий оксидантній стрес, що супроводжується активацією каспази 3 у печінці щурів, і, як наслідок, може спричиняти апоптоз.

За даними експериментів по вивченню дії ТхВ2 на ушкоджені СС14 гепатоцити нами встановлено посилення апоптозу в порівнянні з дією самого СС14 (Рис.2).

За умов ушкодження гепатоцитів ХДХК при дії ТхВ2 спостерігалося вірогідне зменшення кількості живих клітин в порівнянні з дією самої ХДХК та підвищення кількості апоптотичних клітин. При цьому за дії обох чинників (CCl4 або ХДХК) ТхВ2 вірогідно не впливав на некроз.

На відміну від вираженої проапоптотичної дії ТхВ2, ПГЕ2 та ПГF2a (3 мкмоль/л), внесені до культури клітин, уражених CCl4 або ХДХК, не викликали вірогідних змін кількості живих та некротичних гепатоцитів, хоча показано, що ПГЕ2 за умов ушкодження CCl4 підвищував кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу в 1,4 рази (P<0,05).

Рис. 2. Вплив ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) на кількість живих, апоптотичних та некротичних гептоцитів (у % до загальної кількості клітин) через 4 год після обробки CCl4 або ХДХК.

**P<0,01, ***P<0,001 - вірогідність відмінностей кількості живих, апоптотичних та некротичних гепатоцитів при дії CCl4 та ХДХК по відношенню до контролю.

#P<0,05 - вірогідність відмінностей кількості живих, апоптотичних гепатоцитів при дії CCl4+ТхВ2 та ХДХК+ТхВ2 по відношенню до CCl4 або ХДХК.

Проведений нами аналіз морфологічних ознак апоптозу, викликаних ТхВ2 в культурі інтактних гепатоцитів, дав підставу для висновку, що ТхВ2 стимулює переважно початкові стадії апоптозу неушкоджених гепатоцитів. Важливо було дослідити вплив ТхВ2 та інших ейкозаноїдів (ПГЕ2 і ПГF2б) на різні стадії апоптозу гепатоцитів, ушкоджених ССl4 або ХДХК.

Показано (Рис.3.І) що при дії ССl4 спостерігається збільшення апоптозу гепатоцитів на всіх стадіях; він супроводжується збільшенням вторинного/постапоптотичного некрозу (тип 2, тип 4). На відміну від ССl4, ХДХК (Рис.3.ІІ) індукує апоптоз, який доходить до кінцевих стадій – фрагментації ядер без втрати цілості плазматичної мембрани (тип 3), тобто без приєднання некротичних процесів. За умов дії CCl4 спостерігався значно менший (в порівнянні з дією ХДХК) відсоток гепатоцитів з неушкодженою мембраною, в яких апоптоз дійшов до стадії фраґментації ядер (тип 3), в той же час кількість таких клітин з порушенням плазматичної мембрани збільшувалась (тип 4). CCl4, також значно збільшував кількість гепатоцитів з конденсованим ядерним хроматином (початкова стадія апоптозу). Таким чином, CCl4, призводив до запуску апоптозу, оскільки спостерігалося збільшення кількості клітин з ознаками апоптозу на всіх стадіях, але цей процес супроводжувався вторинним/постапоптотичним некрозом, тоді як за умов дії ХДХК клітини досягали кінцевої стадії апоптозу – фраґментації ядер та утворення апоптотичних тілець.

Рис. 3. Вплив екзогенного ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) на кількість культивованих гепатоцитів щурів з різними морфологічними рисами апоптозу (у % до загальної кількості клітин) через 4 год після обробки ССl4 (І) або ХДХК (ІІ).

*P<0,05 - вірогідність відмінностей кількості апоптотичних гепатоцитів з різними морфологічними ознаками при дії ХДХК або ССl4 по відношенню до контролю.

#P<0,05 - вірогідність відмінностей кількості апоптотичних гепатоцитів з різними морфологічними ознаками при дії ТхВ2 за умов ушкодження ССl4 або ХДХК по відношенню до самого ССl4 або ХДХК

Встановлено, що за умов ушкодження гепатоцитів CCl4, ТхВ2 впливав на апоптоз в основному на ранній стадії (конденсація хроматину – тип 1), достовірно підвищуючи кількість клітин на цій стадії. На відміну від уражених CCl4, гепатоцитів, клітини, оброблені ХДХК, інакше реагували на цей простаноїд. ТхВ2 підсилював апоптоз клітин на більш пізній стадії – фрагментації ядер без втрати цілості плазматичної мембрани (тип 3) (Рис.3.ІІ).

Таким чином, морфологічна картина апоптотичної загибелі ушкоджених гепатоцитів залежала від виду ушкоджуючого агента. При токсичному ушкодженні гепатоцитів екзогенні простаноїди збільшували конденсацію хроматину (тип 1, рання стадія апоптозу), як і в експериментах на неушкоджених гепатоцитах. ТхВ2 мав найбільш виражений вплив. За умов ушкодження гідрофобною жовчною кислотою – ХДХК, екзогенний ТхВ2 збільшував кількість клітин з фрагментованими ядрами, кінцевою стадією апоптозу (тип 3), тоді як в експериментах на неушкоджених гепатоцитах збільшувалась кількість клітин з конденсацію хроматину - початковою стадією апоптозу. Ймовірно, сигнал від ТхВ2 стимулює деякі процеси в ядрі, що призводять до конденсації хроматину, але цей сигнал є недостатнім для повного завершення апоптозу. Коли дія ТхВ2 сумується з дією ХДХК, суттєво зростає кількість клітин, що перебувають не на ранніх, а на завершальних стадіях апоптозу. ТхВ2 відіграє виражену модулюючу роль в апоптозі гепатоцитів, яка повною мірою проявляється за наявності інших сигналів до апоптозу.

Вплив блокаторів метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним шляхом (ацетилсаліцилової кислоти та бензилімідазолу) на загибель оброблених СС14 і ХДХК гепатоцитів.

З метою дослідження ролі ендогенного, продукованого гепатоцитами Тх, ми вивчали дію блокаторів циклооксигенази та тромбоксансинтази в умовах токсичного ураження гепатоцитів ССl4 та ХДХК. Внесення у середовище інкубації ацетилсаліцилової кислоти (АСК) за умов дії ССl4 не призводило до суттєвих змін кількості живих та некротичних клітин протягом 4 годин. В той же час блокада циклооксигенази за допомогою АСК призводила до зменшення апоптозу, індукованого CCl4 (на 20%, Р0,05). Під дією бензилімідазолу (БІА) спостерігалось зменшення кількісті апоптотичних клітин на 30 % (Р<0,05). На відміну від впливу на оброблені CCl4 культури, використані інгібітори (АСК та БІА) не впливали на апоптоз, індукований ХДХК. Не виявлено також змін кількості живих та некротичних клітин.

Таким чином, застосування інгібіторів циклооксигеназного шляху метоболізму арахідонової кислоти за умов ушкодження гепатоцитів СС14 свідчить, що цей шлях і його кінцевий продукт – ТхВ2 сприяє апоптозу. Отримані нами результати свідчать на користь того, що блокатор тромбоксансинтази має протективний вплив на гепатоцити в умовах токсичного їх ушкодження. В той же час в умовах ушодження гідрофобною жовчною кислотою (ХДХК) використані інгібітори суттєво не впливали на апоптоз.

Різницю в ефектах інгібіторів на апоптоз гепатоцитів, викликаний CC14 або ХДХК, можна пояснити різними механізмами дії цих двох пошкоджуючих агентів. Є дані, що СС14 призводить до сильної активації перикисного окислення ліпідів (ПОЛ) і підвищення синтезу ейкозаноїдів, особливо Тх, саме в гепатоцитах. Активація ПОЛ веде до активації фосфоліпази А2, циклооксигенази та тромбоксансинтази і посилення синтезу ейкозаноїдів. Ці ендогенні ейкозаноїди можуть аутокринним шляхом додатково підвищувати апоптоз в гепатоцитах, ушкоджених СС14; однак за умов застосування блокаторів циклооксигенази та тромбоксансинтази такої стимуляції апоптозу ендогенними ейкозаноїдами не відбувається. Вочевидь, за умов ураження ХДХК немає підвищення синтезу ендогенних ейкозаноїдів, тому блокатори циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти не мають суттєвого впливу на апоптоз цих клітин.

Таким чином, сукупність отриманих даних свідчить, що ТхВ2 бере участь в регуляції загибелі гепатоцитів, сприяючи апоптозу цих клітин як в інтактних кільтурах, так і за умов ушкодження СС14 і

ХДХК. Важливо підкреслити, що ТхВ2 проявляє свій проапоптотичний ефект на гепатоцити при наномолярних концентраціях, тобто таких, які можуть створюватись у печінці за фізіологічних умов. Проапоптотична дія Тх, який виділяється як тромбоцитами при утворенні тромбів, так і гепатоцитами та

іншими клітинами печінки, може сприяти усуненню ушкоджених і старих клітин без розвитку запалення, тобто грати фізіологічну роль в регуляції клітинного гомеостазу. Однак за умов сильних ушкоджуючих впливів, як при дії ХДХК, ТхВ2 може бути патологічним агентом, оскільки він буде сприяти загибелі надмірної кількості клітин печінки.

ВИСНОВКИ

Метаболіти арахідонової кислоти за циклооксигеназним шляхом – тромбоксани, які виділяються тромбоцитами при утворенні тромбів, клітинами Купфера та гепатоцитами (ТхА2 і швидкоутворюваний з нього ТхВ2), являються модуляторами функціонального стану печінки в нормі та при патології, однак їх безпосередній вплив на гепатоцити майже не з'ясований. Адекватною моделлю для вивчення впливу ейкозаноїдів, зокрема ТхВ2, на гепатоцити і шляхи їх загибелі, є первинна культура.

1.

2.

3.

4.

5.

6.