ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

ім. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО

Герасун Олександр Борисович

УДК 616.36-002.16.17-085.376-037

Клініко-епідеміологічні та імунопатогенетичні особливості HВeAg-негативного HBV DNA-позитивного

хронічного гепатиту В

14.01.13 - інфекційні хвороби

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському Національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Вовк Алла Дмитрівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач відділу вірусних гепатитів і СНІДу.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Малий Василь Пантелійович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб;

доктор медичних наук, професор Нікітін Євген Васильович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри інфекційних хвороб.

Провідна установа:

Івано-Франківський державний медичний університет МОЗ України

Захист відбудеться “ 29 ” березня 2007 р. о 11 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України за адресою: 01015, м. Київ, вул. Січневого повстання, .

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України за адресою: 03038, м. Київ, вул. М. Амосова, .

Автореферат розіслано “ 24 ” лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук О.Л. Панасюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Повсюдне поширення, високий рівень захворюваності, тяжкість перебігу та особливості наслідків роблять проблему гепатиту В однією з найактуальніших у медицині (М.А. Андрейчин, 2003; Ж.І. Возіанова, 2004).

Попри розробку високоефективних вакцин, хронічна НВ-вірусна інфекція створює один з найпотужніших постійно діючих епідемічних процесів; за кількістю джерел інфекції її можна порівняти хіба що з гепатитом С (А.Л. Гураль, В.Ф. Марієвський, 2001; А..Д. Вовк, 2003; Й.В. Шахгильдян, 2003; В.П. Малий, 2005).

Удосконалення методів імуноферментного аналізу позитивно вплинуло на якість діагностики, впровадження у клініку ампліфікаційних технологій для виявлення НВV DNA дало змогу підняти специфічну діагностику на новий якісно вищий щабель. Разом з тим, визначні відкриття та досягнення не тільки не спростили проблему боротьби з гепатитом В, але натомість поставили перед інфектологією нові завдання. Так, завдяки успіхам генетики стало відомим існування мутантних штамів збудника. В аспекті клініки найактуальнішою є проблема, зумовлена мутацією pre-core та core гена НВV, оскільки цей квазівид втрачає здатність до синтезу НВеAg – потужного антигена вірусу. Внаслідок цього виникає толерантність до НВV та посилюється резистентність до лікування (D.R. et al. 1998; M.L. Funk et al., 2002; M. Rizzetto, 2005). У гепатології з’являється нова проблема: зумовлений мутацією вірусу НВeAg-негативний НВV DNA-позитивний гепатит, який є якісно іншою, недостатньо вивченою формою ХГВ.

Незважаючи на значну кількість публікацій, присвячених питанням реплікації НВV DNA та ролі НВеAg, клінічні та імунологічні аспекти проблеми залишаються недостатньо розробленими, навіть поширеність НВeAg-негативного ХГВ в Україні потребує дослідження. Хоча у клінічній практиці визначення мутантних штамів залишається недоступним, все ж такий наслідок мутації, як відсутність НBеAg за наявності НВV DNA дає змогу зробити крок до вирішення цілої низки актуальних аспектів проблеми. Сьогодні до них можна віднести вивчення поширеності НBеAg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ та механізмів формування НBеAg-негативності, зокрема під впливом противірусної терапії. Особливу увагу приділяють дослідженню аспектів клініки та імунопатогенезу ХГВ, пов’язаних з інверсією НBеAg, насамперед – вивченню механізмів, що викликають толерантність організму до антигенів НВV у хворих зі збереженням реплікації НВV DNA та наявністю HBcAg, який розглядається як потужніший антиген аніж НВeAg. Питання це є принциповим для розуміння імунопатогенезу НВeAg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ.

Для ХГВ типові позапечінкові прояви, насамперед ураження судин. Найчастіше їх розвиток пов’язують з ушкоджувальною дією специфічних імунних комплексів. Як саме відбуваються ці процеси за відсутності НВеAg, невідомо, хоч цей аспект проблеми також є надзвичайно важливим. Потребує вдосконалення і методика попередження розвитку pre-core/core мутацій генома НВV під час противірусної терапії ХГВ. У вітчизняній літературі практично немає робіт за цією проблемою.

Навіть цей неповний перелік нез’ясованих аспектів з проблеми НВeAg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ вказує на широке коло проблемних питань, що потребують свого вирішення, і відповідно – на актуальність теми дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження виконано відповідно до плану науково-дослідної роботи кафедри інфекційних хвороб Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького на тему “Клініко-патогенетичні особливості запальних, метаболічних, судинних енцефалопатій при Лайм-бореліозі, лептоспірозі та вірусних гепатитах”, державний реєстраційний номер – 0103U002362.

Мета роботи. Визначити реальну поширеність НBеAg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ та особливості клінічного перебігу й імунопатогенезу, зумовлені інверсією НBеAg у хворих зі збереженням реплікації HBV DNA.

Завдання дослідження

1. Вивчити поширеність НВеАg-негативного HBV DNA-позитивного варіанта інфекційного процесу серед нелікованих хворих на ХГВ та HBsAg-позитивний цироз печінки і окремо серед пацієнтів, які отримували різні види противірусної терапії.

2. Вивчити особливості клінічного перебігу реплікативної форми ХГВ з відсутністю НВeАg порівняно з НВeАg-позитивною формою хвороби. Проаналізувати і зіставити особливості позапечінкових проявів при НВeАg-негативному та НВeАg-позитивному ХГВ.

3. Дослідити особливості імунопатогенезу НВеАg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ шляхом вивчення сенсибілізації імуноцитів до антигенів HBV.

4. Розробити метод дослідження специфічної реактивності лімфоцитів, трансформованих під впливом НВeАg та НВcАg, за інтенсивністю синтезу цитокінів.

Об’єкт дослідження. Хворі на ХГВ.

Предмет дослідження. Дослідження поширеності НВеАg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ, особливостей його клінічного перебігу та імунопатогенезу.

Методи дослідження. Клінічні, епідеміологічні, біохімічні, імунологічні, інструментальні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні вивчено поширеність НBeАg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ та цирозу печінки серед нелікованих хворих на HB-вірусну інфекцію; одержано нові дані про вплив різних видів противірусної терапії на формування НBeАg-негативності у хворих на ХГВ.

Одержано нові дані про особливості перебігу НBeАg-негативного ХГВ зі збереженням реплікації HBV DNA; запропоновано патогенетичне обґрунтування клініко-лабораторних та патоморфологічних особливостей хвороби, зокрема розвитку системних васкулітів у хворих із різними варіантами репродукції HBV.

Вперше у культурі лейкоцитів периферійної крові вивчено особливості сенсибілізації лімфоцитів до НВеАg та НВcАg у хворих на ХГВ в динаміці інфекційного процесу. Встановлено, що інверсія НВеАg впливає на рівень сенсибілізації до НВcАg, тобто з’ясовано механізм розвитку толерантності до антигенів HBV у хворих із інверсією НBeАg попри наявність потужного НВcАg.

Встановлено, що в культурі лейкоцитів периферійної крові хворих на ХГВ НВеАg та НВcАg виступають індуктором синтезу г-ІНФ та ФНП-б. Вміст цих цитокінів у супернатанті трансформованих клітин характеризує рівень специфічної реактивності імуноцитів і тому може використовуватись як новий показник сенсибілізації до антигенів HBV. Подано заявку на патентування методу.

Вперше показано, що здатність трансформованих лейкоцитів до синтезу г-ІНФ та ФНП-б у дослідах in vitro характеризує стан противірусної активності і може використовуватись як прогностичний показник у моніторингу інфекційного процесу.

Практичне значення та впровадження результатів роботи. Дані про поширеність НBeАg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ та особливості формування НBeАg-негативності зі збереженням реплікації HBV DNA необхідно враховувати під час вибору алгоритму лікування та оцінювання його ефективності. Показано, що комбінована противірусна терапія ХГВ препаратом з групи аналогів нуклеозидів (ламівудин) разом з альфа-інтерфероном попереджає розвиток pre-core/core мутації HBV.

Метод, розроблений для визначення сенсибілізації до антигенів HBV з використанням культури лейкоцитів периферійної крові за вмістом г-ІНФ та ФНП-б у супернатанті трансформованих лейкоцитів, рекомендується до впровадження у практику наукових досліджень з вивчення імунопатогенезу ХГВ, а також для використання під час моніторингу інфекційного процесу.

Новий метод визначення реактивності імуноцитів за вмістом г-ІНФ та ФНП-б у супернатанті стимульованих лейкоцитів впроваджено у наукову роботу кафедри інфекційних хвороб та кафедри імунології ЛНМУ імені Данила Галицького, у практику інфекційної клінічної лікарні м. Львова; результати дисертаційного дослідження впроваджено в навчальний процес кафедр інфекційних хвороб Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та Тернопільського медичного університету (включені в тематику лекцій для студентів 5 та 6-го курсів, лікарів-інтернів, слухачів факультету післядипломної освіти).

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто вивчено та проаналізовано сучасну літературу з досліджуваної проблеми, виконано всі основні клінічні, епідеміологічні, імунологічні дослідження, ідентифікацію HBV DNA та розроблено метод визначення специфічної реактивності імуноцитів у культурі лейкоцитів. Самостійно проаналізовано результати клінічних, лабораторних та інструментальних досліджень, статистично оброблено, інтерпретовано, узагальнено та викладено отримані результати, оформлено висновки та практичні рекомендації, винесені на захист.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційних досліджень доповідалися на пленарних засіданнях Львівського обласного науково-практичного товариства лікарів-інфекціоністів (2004, 2005, 2006), на науково-практичній конференції, присвяченій сорокаріччю відкриття австралійського антигена (Львів, 2004), представлені на VI та VII з’їздах інфекціоністів України (2002, 2006), на науково-практичних конференціях і пленумах інфекціоністів України (Дніпропетровськ, 2002; Івано-Франківськ, 2003; Тернопіль, 2004). Апробація дисертації відбулась на спільному засіданні кафедри інфекційних хвороб Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та Львівського обласного науково-практичного товариства лікарів-інфекціоністів.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 праць, які відображають основні її положення, зокрема 5 робіт, що відповідають вимогам Вищої атестаційної комісії до публікацій основних результатів дисертацій.

Структура та об’єм дисертації. Робота викладена на 149 сторінках, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів та методів, власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки, практичні рекомендації та список літератури зі 107 кирилицею і 148 латиницею позицій. Дисертацію ілюстровано 26-ма таблицями та 5-ма рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом для біохімічних та імунологічних досліджень були сироватка крові та лейкоцити периферійної крові.

НВeAg-негативний НВV DNA-позитивний ХГВ діагностували на підставі загальноприйнятих діагностичних критеріїв (G.V. Papatheodoridis, S.J. Hadziyannis, 2003).

Для вивчення поширеності хронічної HBeAg-негативної DNA НВV-позитивної інфекції обстежено 130 хворих (з них 72 з ХГВ та 58 з HBsAg-позитивним цирозом печінки), які раніше не отримували противірусної терапії.

Для дослідження впливу противірусної терапії на формування НВeAg-негативного DNA НВV-позитивного ХГВ обстежували хворих на ХГВ, які отримували противірусні препарати (112); вплив набутої імунної недостатності на формування НВеАg-негативності вивчали у групі хворих з термінальною стадією ниркової недостатності, що знаходились на програмному гемодіалізі (61). Можливу роль первинного зараження мутантним по pre-core/core штамом НВV досліджували шляхом обстеження хворих з гострим гепатитом В на НВeAg та антитіла до нього (100).

До групи хворих, відібраних для вивчення особливостей клінічного перебігу НВеАg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ, включали лише тих пацієнтів, в яких не було тяжких супутніх захворювань, що могли вплинути на перебіг гепатиту (туберкульоз, цукровий діабет, онкологічні захворювання, хвороби щитоподібної залози, тяжка виразкова хвороба шлунку та дванадцятипалої кишки тощо), з групи вилучали ВІЛ-інфікованих та хворих з ЦМВ та іншими герпетичними інфекціями, пацієнтів з HCVAb та HDVAb.

Для вивчення імунопатогенезу НВеАg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ розроблено метод діагностики сенсибілізації лімфоцитів до HBcAg та НВеАg шляхом визначення специфічної бласттрансформації лімфоцитів та вмісту г-ІНФ та ФНП-б у культурі лейкоцитів периферійної крові хворих на ХГВ (40).

Лейкоцити периферійної крові хворих на ХГВ культивували на середовищі №199. Як специфічний стимулятор трансформації використовували рекомбінантні HBсAg та НВеАg, надані науково-виробничим об’єднанням "Диагностические системы" (Н.Новгород, Росія). Препарат вносили у дозі від 0,01 до 0,1 мг білка на мл середовища.

Для неспецифічної трансформації лімфоцитів використовували ФГА.

Культивування проводили при 370 С протягом 7 днів.

Кількість бласттрансформованих форм підраховували на 5–7-ий день культивування; на 3-й день визначали вміст г-ІНФ та ФНП-б у супернатанті трансформованих клітин.

HBV DNA та HCV RNA визначали методом ПЛР із застосуванням діагностичних систем виробництва АТЗТ “Биотех” (Москва); маркери вірусних гепатитів визначали методом ІФА з використанням тест-систем III–IV покоління, переважно НВО “Диагностические системы” (м. Н.Новгород, Росія) та “Вектор-Бест”(м. Новосибірськ, Росія) в комплектації з ОФД та ТМБ.

За відсутності HBeAg сироватки крові додатково перевіряли за допомогою тест-системи “Сalbiotech inc” (США, Каліфорнія), а за відсутності HBsAg – паралельно з використанням тест-систем виробництва НВО “Диагностические системы”, “Вектор-Бест” та ImmunоComb (Orgenics, Ізраїль).

Щоб запобігти неспецифічним результатам, HBsAg-позитивні взірці перевіряли за допомогою реакції нейтралізації. Внутрішньолабораторний контроль якості ідентифікації маркерів вірусних гепатитів здійснювали за допомогою контрольної панелі сироваток виробництва НВО “Диагностические системы”.

Статистичний аналіз. Усі клінічні та лабораторні дані, отримані у процесі роботи, було внесено до бази даних “Електронний архів” (О.М. Зінчук, Л.Ю. Шевченко, 2000). Результати дослідження обробляли з використанням критерію Стьюдента–Фішера за допомогою статистичного модуля “Електронного архіву”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В обстеженій групі ХГВ переважна більшість хворих виявилася HBeAg-негативною (52 із 72 обстежених; 72,2%). Із 52 хворих, що не мали HBeAg, у 50 ідентифіковані HBeAb (96,2%), тобто встановлено, що відсутність е-антигена зазвичай є наслідком інверсії антигена в антитіла. У значної частини хворих на HBeAg-негативний ХГВ виявлено реплікацію HBV DNA (у 24 з 52; 46,2%). У загальній кількості обстежених хворих (72) цей показник становить 33,3%, тобто у третини хворих на ХГВ відбувається реплікація HBV DNA за відсутності її серологічного маркера – HBeAg (рис. 1).

Ще частіше така форма інфекційного процесу зустрічається у хворих на HBsAg-позитивний цироз печінки: у понад половини з них реплікація продовжується після інверсії HBeAg (55,2%; при ХГВ аналогічний показник – 33,3%; р<0,02). Те, що частота HBeAg-негативної форми зі збереженням реплікації HBV DNA у хворих на цироз печінки є вищою, ніж у пацієнтів з ХГВ, на нашу думку, вказує на зв’язок між типом реплікації і наслідками ХГВ (табл. 1).

Таблиця 1

Частота HBeAg-негативної HBV DNA-позитивної форми інфекційного процесу у хворих на ХГВ та HBsAg-позитивний цироз печінки |

Разом

хворих | Зокрема (%)

HBeAg “-“

HBV DNA “+” | HBeAg “+“

HBV DNA “+”

ХГВ | 72 | 33,3 | 27,8

ЦП | 58 | 55,2 | 20,7

р | <0,02 | >0,05

Середня ж частота хронічної HBeAg-негативної HBV DNA-позитивної форми HB-вірусної інфекції становить 46,2%.

Висока частота HBeAg-негативного ХГВ (у 52 з 72 обстежених), що сягає у нелікованих хворих 72,2%, вказує на те, що припинення синтезу HBeAg можна розглядати як закономірний етап розвитку інфекційного процесу. У 38,9% хворих це зумовлено переходом до інтегративної форми ХГВ (HBeAg “-”, HBV DNA “-” або “±”), а у 33,3% хворих інверсія HBeAg не супроводжується припиненням реплікації HBV.

Враховуючи, що у обстежених хворих моноінфекція, можна припустити, що відсутність HBeAg на тлі реплікації HBV зумовлена мутацією гена С HBV. Це свідчить про значну поширеність квазівиду в регіоні обстеження.

За нашими даними, перехід до інтегративної форми ХГВ відбувається швидше, ніж припинення синтезу HBeAg зі збереженням реплікації. Встановлено, що в 60% хворих з інтегративною формою ХГВ припинення реплікації відбулось у перші 5 років хвороби. Натомість HBeAg-негативність, зумовлена мутацією С-гена, формується повільніше і починається після п’яти років від початку хвороби (39,4%), значно зростаючи у хворих з тривалістю процесу понад 10 років (45,8%; табл. 2).

Таблиця 2

Інтегративна та реплікативна форми інфекційного процесу

у хворих з різною тривалістю ХГВ

Група хворих | Тривалість хвороби (в роках) | Разом хворих

до 5-ти | 5-10 | понад 10-ть

n | % | n | % | n | % | n | %

ХГВ | 15 | 20,8 | 33 | 45,8 | 24 | 33,3 | 72 | 100

Зокрема:

HBeAg “-“

HBV DNA “+” | 0 | 0 | 13 | 39,4 | 11 | 45,8 | 24 | 33,3

HBeAg “-“

HBV DNA “-” | 9 | 60 | 15 | 45,5 | 4 | 16,7 | 28 | 38,9

HBeAg “+“

HBV DNA “+” | 6 | 40 | 5 | 15,1 | 9 | 37,5 | 20 | 27,8

Останнім часом у літературі обговорюється питання про вплив противірусної терапії на розвиток мутації pre-core/core ділянки HBV. У наших дослідженнях у частини хворих противірусна терапія не призвела до бажаного ефекту, натомість супроводжувалась pre-core/core мутацією HBV. Так, під впливом противірусної терапії інверсія HBeAg зі збереженням реплікації HBV DNA становила залежно від виду препарату, від 9,1 до 21,4% (рис. 2).

У цих дослідженнях встановлено зв’язок між противірусною та мутагенною активністю препаратів, що призначались для лікування ХГВ. На користь цього свідчить зіставлення показників терапевтичної ефективності з частотою мутацій С-гена HBV. Так, найефективнішим з використовуваних препаратів був Інтрон-А (його застосування призводило до ранньої вірусологічної відповіді у 35,7%), найвищий відсоток мутацій спостерігався у хворих, які отримували лікування саме цим препаратом (21,4%). Ефективність лаферону була значно меншою (13,6%), і відповідно рідше

Рис. 2. Вплив лікування на розвиток HBe-негативності

у хворих з реплікативною формою ХГВ

відбувалась мутація (9,1%). Вірусологічний ефект від застосування циклоферону був взагалі відсутній (припинення реплікації HBV DNA не встановлено); у цій групі хворих також не зареєстровано зникнення HBeAg за наявності HBV DNA.

Отже, чітко прослідковується зв’язок між противірусною потужністю препарату та його мутагенною активністю. Це збігається з даними інших дослідників, за якими мутацію розглядають як еволюційне пристосування для уникнення антивірусного пресингу. У хворих, що отримували комбіновану терапію (зеффікс+лаферон), випадків HBe-антигенемії зі збереженням реплікації HBV DNA ми не спостерігали.

Хоч комбінована терапія не сприяла підвищенню ефективності лікування, перевага її, за нашими даними, полягає в тому, що вона запобігає мутації С-гена HBV. У цьому відношенні комбінована терапія є перспективнішою, тим більше, що, за даними західної літератури, вона зменшує ймовірність й інших мутацій, зокрема типової для ламівудину мутації гена полімерази (YMDD-мутації).

У частини хворих з ранньою вірусологічною відповіддю на лікування в різні терміни після закінчення противірусної терапії виникали рецидиви хвороби. Поява в цей час у крові хворого HBV DNA та HBeAg свідчила, що удаване уявлення про інверсію HBeAg було зумовлене низькореплікативним типом репродукції HBV. Інакше це виглядало, коли поява у крові HBV DNA на кілька тижнів або місяців випереджала поновлення персистенції HBeAg. Можна припустити, що така своєрідна динаміка маркерограми пов’язана із співіснуванням мутантного по pre-core/core та дикого штамів HBV. Випереджувальний розвиток pre-core/core штаму з подальшим посиленням реплікації дикого штаму (поява HBeAg) ймовірно зумовлений тим, що мутантні штами менш контролюються імунною системою. Клінічні аспекти такої можливості описані Brunеtto (1993, 2002).

Більшість клінічних проявів реплікативної форми HBeAg-негативного та HBeAg-позитивного ХГВ виявилися подібними, тим не менше, є і певні відмінності. До них належать більша частота випадків свербежу (у 17,5% хворих основної групи і лише у 5,5% з групи зіставлення; р<0,05) та іктеричності шкіри та слизових оболонок (відповідно 64,9 та 41,6%; р<0,01). УЗД показало, що у хворих основної групи значно частіше, ніж у пацієнтів з групи зіставлення, є розширеною v. Portae (46,1 та 23,6% відповідно; р<0,01; табл. 3).

За даними біохімічного обстеження, у хворих основної групи істотно вища активність лужної фосфатази у сироватці крові (активність понад 1,3 ммоль/год.л зареєстрована у 19,3% пацієнтів проти 9,7% у групі зіставлення; р<0,05).

Отже, прояви холестазу (свербіж, іктеричність, підвищена активність лужної фосфатази) та портальної гіпертензії типовіші для хворих основної групи, ніж групи зіставлення.

Істотні відмінності між HBeAg-негативним та HBeAg-позитивним ХГВ встановлені за даними морфологічних досліджень печінкової тканини. Стосуються вони інтенсивності фіброзу та гістологічної активності запалення. Так, ступінь фіброзу печінки, вищий за 4 бали, характерний для HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ і реєструється майже у половини хворих основної групи (48,1 проти 8,7% у групі зіставлення; р<0,001). Відповідно мінімальні прояви фіброзу (0-1 бал) типовіші для хворих групи зіставлення (65,2 проти 11,1%; р<0,001).

Таблиця 3

Основні клінічні прояви

HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ

Показник | Основна група

n=57 | Група зіставлення n=72 | р

абс. число | % | абс. число | %

Загальна слабкість | 40 | 70,2 | 50 | 69,4 | >0,05

Погіршення апетиту | 38 | 66,7 | 45 | 62,5 | >0,05

Артралгії | 20 | 35,1 | 26 | 36,1 | >0,05

Свербіж шкіри | 10 | 17,5 | 4 | 5,5 | <0,05

Носові кровотечі | 15 | 26,3 | 18 | 25 | >0,05

Іктеричність склер, шкіри | 37 | 64,9 | 30 | 41,6 | <0,01

Телеангіектазії | 15 | 26,3 | 21 | 29,2 | >0,05

Множинні розширення капілярної сітки шкіри | 26 | 45,6 | 31 | 43,1 | >0,05

Крововиливи (синці) | 4 | 7,0 | 2 | 2,8 | >0,05

Ксантоми, ксантелазми | 28 | 49,1 | 31 | 43,1 | >0,05

Гепатомегалія | 51 | 89,5 | 65 | 90,2 | >0,05

Спленомегалія | 27 | 47,4 | 36 | 50,0 | >0,05

Розширення v. Portae | 25 | 48,1 | 17 | 23,6 | <0,01

Асцит | 4 | 7,0 | 7 | 9,7 | >0,05

Відсутність відхилень | 5 | 8,8 | 8 | 11,1 | >0,05

Щодо гістологічної активності запально-некротичних процесів, то вона виявилася інтенсивнішою у хворих на HBeAg-позитивний ХГВ (активність понад 3 бали встановлено у 34,8 % хворих проти 7,4 % в основній групі; р<0,05). Кількість хворих, в яких активність процесу була мінімальною (0–1 бали), в основній групі становила 51,9 %, а в групі зіставлення – 21,7 % (р<0,05). За результатами цього дослідження у хворих основної групи переважають процеси фіброзу печінки, тоді як у групі зіставлення – запально-некротичні зміни.

Для оцінки активності гепатиту важливе значення надається вмісту аланінамінотрансферази у сироватці крові, що розглядається у гепатології як “золотий стандарт” діагностики (Л.Л. Громашевська, 1977). За нашими даними, підвищена активність АлАТ у сироватці крові є типовішою для HBeAg-позитивного ХГВ. Так, під час першого обстеження її виявлено у 61,4% хворих основної групи і у 81,9% групи зіставлення (р<0,02). До того ж у 12 з 22 хворих на HBeAg-негативний ХГВ із гіперферментемією, які з різних причин протягом року не отримували противірусної терапії, відбулась стійка нормалізація активності АлАТ (54,5%). За цей час таке спостерігалося лише у 4 з 20 хворих на HBeAg-позитивний ХГВ (20%; р<0,02). З наведеного можна дійти висновку; що для HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ характерною є схильність до спонтанної нормалізації рівня ферментемії.

Ймовірно саме інверсія HBeAg на HBeAb є причиною зменшення запально-некротичних процесів та тенденції до нормалізації показників АлАТ у хворих основної групи.

Вивчення частоти і спектра позапечінкових проявів ХГВ показало (табл. 4), що найчастішими з них є суглобовий синдром, шкірний васкуліт та гломерулонефрит, які майже однаково часто спостерігаються у хворих на HBeAg-негативний та HBeAg-позитивний ХГВ. Однак причини їх виникнення та клінічні прояви значно відрізняються. Звертає на себе увагу те, що у більшості хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ системний васкуліт виникав на тлі кріоглобулінемії (у 7 із 8 хворих з проявами васкуліту), тоді як у групі зіставлення таке спостерігалося лише в одного із 10 хворих з васкулітом. Загальна ж частота кріоглобулінемічного васкуліту становить в основній групі 12,3% (у 7 з 57 обстежених) і лише 1,4% у групі зіставлення (у 1 з 72 хворих; р<0,02). У частини хворих основної групи (3 з 8, 37,5%) васкуліт супроводжувався акроціанозом кріоглобулінемічного ґенезу. Клінічно він проявлявся ціанозом кінцівок, переважно рук, підвищеною чутливістю до холоду, болючістю суглобів пальців рук, скутістю рухів. У двох хворих була синюшність кінчика носа. За даними термографії уражених ділянок зареєстровано зниження температури кінцівок на 4–5єС.

Встановлено також клініко-патогенетичну різницю між особливостями ураження нирок у хворих на HBeAg-негативний та HBeAg-позитивний ХГВ. Так, у хворих основної групи гломерулонефрит зумовлено, на нашу думку, кріоглобулінемією. На це вказувало виявлення у сироватці крові всіх цих хворих холодових преципітуючих білків. Натомість у групі зіставлення лише в одного з 8 хворих (12,5%) із ХНН виявлено кріоглобулінемію.

Таблиця 4

Наявність позапечінкових проявів у хворих

на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ

Показник | Основна група

n=57 | Група зіставлення

n=72 | р

абс.число | % | абс.число | %

Суглобовий синдром | 12 | 21,1 | 15 | 20,8 | >0,05, | Кріоглобулінемія | 16 | 28,1 | 9 | 12,5 | <0,05 | Системний васкуліт, | 8 | 14,0 | 10 | 13,9 | >0,05 | зокрема з кріоглобулінемією | 7 | 87,5 | 1 | 10 | Синдром Рейно | 1 | 1,7 | 2 | 2,8 | >0,05 | ХГН | 6 | 10,5 | 8 | 11,1 | >0,05 | зокрема з кріоглобулінемією | 6 | 100 | 1 | 1,25 | Синдром Шегрена | 0 | 1 | 1,4 | >0,05 | Поліневропатія | 1 | 1,7 | 1 | 1,4 | >0,05 |

Традиційно ураження судин у хворих на ХГВ пояснюють ушкоджувальною дією імунних комплексів. Згідно з результатами наших спостережень, таке пояснення прийнятне лише відносно HBeAg-позитивного ХГВ: ми не можемо проігнорувати високу частоту підвищеного рівня кріоглобулінів у крові хворих з васкулітами та ХГН на тлі HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ.

За сучасними уявленнями антигенна стимуляція В-лімфоцитів супроводжується посиленням синтезу в печінці поліклональних та моноклональних IgM (антитіла до Fc-фрагмента IgG – ревматоїдний фактор), що реагують з IgG утворенням змішаних кріоглобулінів. У хворих на гепатит С роль таких IgG виконують анти-HCV. Не виключається, що пов’язана з процесами мутації модифікація HBV може призводити до таких змін у будові антитіл, які сприяють кріоглобулінемії. Отже, можна дійти висновку про істотні відмінності у патогенезі позапечінкових проявів, що виникають у хворих на HBeAg-негативний та HBeAg-позитивний ХГВ.

Для розуміння впливу HBeAg-негативності на перебіг ХГВ особливого значення набуває вивчення аспектів імунопатогенезу, пов’язаних зі специфічною реактивністю імуноцитів до антигенів HBV.

Для цього вивчали сенсибілізацію імуноцитів до антигенів HBV у культурі лейкоцитів периферійної крові хворих на ХГВ.

Головним результатом цих досліджень вважаємо встановлення того, що у хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ ПЧСТ до HBeAg поступово зменшується та одночасно з тим змінюється і сенсибілізація до HBсAg (табл. 5). Цим пояснюється чому у хворих на HBeAg-негативний ХГВ попри наявність HBсAg формується толерантність до HBV.

Таблиця 5

Динаміка інтенсивності сенсибілізації до HBсAg

у хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ (n=15)

Час від інверсії HBeAg | Показники РБТЛ під впливом антигена (%) | HBсAg | HBeAg | 6–12 місяців | 28,4±2,3 | 32,2±4,8 | 1–3 роки | 20,5±2,6 | 18,0±2,4 | 4–5 років | 11,3±2,6 | 10,1±1,8 | > 5 років | 8,0±1,9 | 5,1±2,2 | Спонтанна БТЛ | 3,4±0,81 |

Послаблення специфічної реактивності імуноцитів істотно впливає на клінічний перебіг ХГВ, що розглядається як хвороба імунної відповіді. Цим ми пояснюємо типові для HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ особливості клінічного перебігу. Зокрема це стосується встановленої тенденції до зменшення рівня активності АлАТ та меншої інтенсивності, порівняно з групою зіставлення, гістологічних ознак запального процесу в печінці.

Аналогічні особливості сенсибілізації до антигенів HBV було встановлено шляхом вивчення синтезу г-ІНФ та ФНП-б у культурі лейкоцитів периферійної крові. З’ясовано, що під впливом HBeAg та HBсAg у КЛ відбувається синтез г-ІНФ та ФНП-б. Вміст цих цитокінів у супернатанті короткочасної КЛ характеризує трансформуючий вплив антигенів і відповідно рівень сенсибілізації імуноцитів до антигенів HBV.

Наявність г-ІНФ та ФНП-б у супернатантах культур лейкоцитів, стимульованих HBсAg та HBeAg, дає змогу припустити, що в природних умовах відбувається спільний вплив цитокінів на інфіковану клітину із кооперативною взаємодію у забезпеченні імунологічного гомеостазу.

У результаті досліджень встановлено відсутність зв’язку між вмістом цитокінів у сироватці крові та рівнем їхнього синтезу у культурі лейкоцитів. Тому видається ймовірним, що результати досліджень in vitro характеризують потенційну здатність клітин до синтезу цитокінів. Таке припущення має певні реальні підстави. Так, у досліді з лейкоцитами хворої на ХГВ, яка повністю одужала і звільнилась від HBsAg, інтенсивна продукція ФНП-б у КЛ, простимульованих HBeAg та HBсAg, була зареєстрована ще до завершення інфекційного процесу, раніше ніж відбулось підвищення вмісту ФНП-б у сироватці крові. Після видужання вміст ФНП-б у сироватці крові вже через 5 місяців знизився до 50 пг/мл, але в культурі лейкоцитів клітини продовжували інтенсивно реагувати на HBeAg та HBсAg, ймовірно через збереження імунологічної пам’яті. Тест може мати прогностичне значення, а також використовуватись в наукових дослідженнях з вивчення особливостей специфічного реагування на антигени HBV.

Отже, вивчення особливостей клінічного перебігу та імунопатогенезу підтвердило тезу про те, що HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ є принципово новою клінічною формою HB-вірусної інфекції.

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично узагальнено та по-новому вирішено наукову задачу з вивчення поширеності, особливостей клініки та імунопатогенезу НВeAg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ; досліджено вплив противірусної терапії на формування НВеАg-негативності зі збереженням реплікації НВV DNA та розглянуто особливості формування позапечінкових проявів у хворих з відсутністю НВеАg. Розроблено новий метод вивчення сенсибілізації до антигенів HBV за синтезом г-ІНФ та ФНП-б у культурі лейкоцитів периферійної крові; показано, що ХГВ з інверсією НВеАg є принципово новою формою інфекційного процесу.

1. Інверсія HBeAg на HBeAb є закономірним етапом розвитку ХГВ і виявляється в 72,2% хворих; у 38,9% спостережень це зумовлено переходом до інтегративної форми ХГВ (HBeAg “-”, НВV DNA “-”), в 33,3% – формуванням НВеАg-негативної НВV DNA-позитивної форми ХГВ.

2. НВеАg-негативний НВV DNA-позитивний варіант інфекційного процесу виявляється у третини нелікованих хворих на ХГВ (33,3%) та у понад половини нелікованих хворих на HBsAg-позитивний ЦП (55,2%), що свідчить про значну поширеність у регіоні дослідження мутантного по pre-core/core штаму НВV.

3. Противірусна терапія ХГВ сприяє інверсії HBeAg зі збереженням реплікації НВV DNA; існує прямий зв’язок між противірусною та мутагенною активністю препаратів альфа-інтерферону. З непегільованих препаратів альфа-інтерферону розвиткові НВеАg-негативності зі збереженням реплікації НВV DNA найчастіше сприяє Інтрон-А (21,4%), лаферон викликає інверсію НВеАg у 9,1% хворих; лікування індуктором ендогенного інтерферону – циклофероном не призводить до pre-core/core мутації. Комбінована терапія (інтерфероном та аналогом нуклеозидів – зеффіксом) запобігає розвиткові мутації НВV.

4. Клінічний перебіг НВеАg-негативного НВV DNA-позитивного ХГВ, порівняно з НВеАg-позитивним ХГВ, характеризується монотоннішим перебігом із тенденцією до нормалізації активності АлАТ, частішим розвитком кріоглобулінемії з хронічною нирковою недостатністю та системним васкулітом, зокрема з акроціанозом; у хворих на НВеАg-негативний НВV DNA-позитивний ХГВ у тканині печінки менше виражені запально-некротичні зміни, але частіше наявні ознаки портальної гіпертензії та інтенсивніший фіброз печінки.

5. Інверсія НВеАg у хворих на ХГВ супроводжується поступовим зменшенням сенсибілізації не тільки до НВеАg, але й до НВсАg. Вміст г-ІНФ та ФНП-б у супернатанті культури лейкоцитів, що стимульована HBeAg або НВсАg, характеризує рівень сенсибілізації лімфоцитів до антигенів НВV.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Хворі на реплікативну форму ХГВ, які підлягають противірусній терапії, повинні обстежуватись на HBeAg, а у разі його відсутності – на HBeAb. Відсутність HBeAg та антитіл до нього ймовірно пов’язана із фазою імунологічного вікна і потребує продовження терміну обстеження до 6 місяців. Встановлення інверсії HBeAg у хворих з реплікативною формою хронічного моногепатиту В дає змогу діагностувати HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ, що необхідно враховувати, вибираючи алгоритм лікування.

2. Хворих на HBeAg-позитивний ХГВ, в яких під впливом противірусної терапії відбулась інверсія HBeAg, необхідно обстежувати на наявність у крові HBV DNA. Враховуючи часте формування HBeAg-негативності зі збереженням реплікації HBV DNA, інверсію HBeAg не можна сприймати як достовірну ознаку припинення реплікації.

3. Для зменшення частоти можливої мутації С-гена HBV рекомендується комбінована терапія HBeAg-позитивного ХГВ препаратами альфа-інтерферону та ламівудином.

4. Метод дослідження сенсибілізації імуноцитів шляхом визначення синтезу г-ІНФ та ФНП-б у стимульованій антигеном культурі лейкоцитів рекомендовано для використання в науковій роботі з вивчення імунопатогенезу ХГВ.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Герасун О.Б. HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний хронічний гепатит В: особливості діагностики та ефективність лікування // Сучасні інфекції. – 2003. – № 3. – С. 22–24.

2. Герасун О.Б. Актуальні аспекти специфічної діагностики хронічного гепатиту В // Практична медицина. – 2004. – №1.– С. 63–66.

3. Герасун Б.А., Ворожбит О.Б, Герасун О.Б., Бірка Ю.І., Тичка І.Б., Русин О.І. Гепатити В та С у хворих, які лікуються програмним гемодіалізом // Інфекційні хвороби. – 2006. – №2. – С. 24–27 (повністю виконано частину роботи, яка стосується гепатиту В).

4. Герасун О.Б. HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний хронічний гепатит В: клініко-патогенетичні аспекти // Практична медицина. – 2006. – №5.– С. 65–70.

5. Чоп`як В.В., Герасун О.Б. Патогенез хронічного гепатиту В: механізми тривалої персистенції HBV // Імунологія та алергологія. – 2006. – №3. – С. 39–43 (збирання матеріалу, узагальнення та аналіз даних).

6. Герасун А.Б. Репликативная форма HBeAg-отрицательного хронического гепатита B (по данным исследования в западном регионе Украины) // Мир вирусных гепатитов. – 2006. – № 1. – С. 18–20.

7. Ворожбит О.Б., Герасун Б.А., Телегін Д.Є., Герасун О.Б. Підходи до лікування тяжких геморагічних васкулітів у хворих на хронічні вірусні гепатити // Тяжкі форми інфекційних хвороб і невідкладні стани. Матеріали науково-практичної конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів України (16–17 травня 2002 року, м. Дніпропетровськ). – Тернопіль. – “Укрмедкнига”. – 2002. – С. 37–38 (збирання клінічного матеріалу, клінічне обстеження хворих, статистичне оброблення результатів).

8. Ворожбит О.Б., Герасун О.Б., Грицко Р.Ю. Серологічний профіль маркерів гепатиту В у зв'язку з можливістю мутантного впливу HBV (Деякі клінічні приклади та міркування) // Матеріали науково-практичної конференції та пленуму Асоціації інфекціоністів України (14–15 травня 2003 року, м. Івано-Франківськ). – Тернопіль. – “Укрмедкнига”. – 2003. – С. 36–38 (збирання клінічного матеріалу, виконання основних лабораторних досліджень, інтерпретація результатів).

9. Герасун О.Б., Ворожбит О.Б., Річняк Т.Г., Герасун Б.А., Тичка І.Б., Кондрат П.С., Бірка Ю.І. Гепатити В та С у хворих з термінальною стадією хронічної ниркової недостатності // Матеріали нaуково-практичної конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів України (5–6 травня 2004 року, м. Тернопіль). – Тернопіль. – “Укрмедкнига”. –2004. – С. 39–40 (повністю виконано частину роботи, що стосується гепатиту В).

10. Герасун О.Б.Поширення і структура HBeAg-негативного хронічного гепатиту В // Матеріали VII з’їзду інфекціоністів України (27–29 вересня 2006 року, м. Миргород). – Тернопіль. – “Укрмедкнига”. – 2006. – С. 26-27.

АНОТАЦІЯ

Герасун О.Б. Клініко-епідеміологічні та імунопатогенетичні особливості HВeAg-негативного HBV DNA-позитивного хронічного гепатиту В. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.13 – інфекційні хвороби. – Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського АМН України, Київ, 2007.

На підставі обстеження хворих на ХГВ та HBsAg-позитивний цироз печінки (130), встановлено, що на частку HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного варіанта інфекційного процесу припадає 33,3% ХГВ та 55,2% ЦП (р<0,02).

За нашими даними, зараження первинно мутантним по core-гена штамом HBV може відбуватися не більше ніж у 2% хворих на ГГВ.

Вплив вторинної імуносупресії на розвиток мутацій HBV досліджували у групі хворих на ХГВ з тХНН, корегованою програмним гемодіалізом. Вираженого впливу набутої імуносупресії на розвиток HBeAg-негативності не встановлено.

Під час вивчення впливу противірусної терапії на формування HBeAg-негативності встановлено прямий зв’язок між активністю препарату та його мутагенним ефектом.

Клінічний перебіг ХГВ у HВeAg-негативних HBV DNA-позитивних хворих вирізнявся схильністю до спонтанної нормалізації рівня АлАТ, меншою активністю запально-некротичних процесів у печінці зі збереженням темпів розвитку фіброзу та частішим виникненням кріоглобулінемії.

Дослідження особливостей імунопатогенезу HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ показало, що інверсія HBeAg супроводжується зменшенням сенсибілізації імуноцитів до HBeAg та HBсAg.

Розроблено новий метод визначення сенсибілізації до HBeAg та HBсAg за інтенсивністю синтезу г-ІНФ та ФНП-б у культурі лейкоцитів периферійної крові.

Ключові слова: хронічний гепатит В, HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ, цитокіни, сенсибілізація.

ANNOTATION

Herasun O. Clinical, Epidemiological, Immunological and Pathogenetic Features of HВeAg-negative HBV DNA-positive Chronic Hepatitis В. – Manuscript.

Dissertation for obtaining scientific degree Candidate of Medical Science on specialty 14.01.13. – infectious diseases. – Institute of Epidemiology and Infectious Diseases by Gromashevskyj L.V., AMS of Ukraine, Kiev, 2007.

Based on patients’ examination with chronic hepatitis B (CHB) and HBsAg-positive liver cyrosis (LC) (130), it was stated that on HBeAg-negative HBV DNA-positive variant of infectious process lot falls 33,3% of CHB and 55,2% of LC (p<0,02).

According to our data, infection with primary mutant core-gene culture of HBV can take place in less than 2% of patients with AHB.

Influence of secondary immunosuppression on development of HBV mutations were studied in group of CHB patients with terminal chronic renal failure (CRF),