МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДНІПРОПЕТРОВСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ

ГРИЦЕНКО ПЕТРО ОЛЕКСІЙОВИЧ

УДК 616.22-006.61-036.1-078-091.8

ДІАГНОСТИКА ТА ПРОГНОЗ ПЕРЕБІГУ ПЛОСКОКЛІТИННИХ РАКІВ ГОРТАНІ: ІМУНОМОРФОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Дніпропетровськ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Шпонька Ігор Станіславович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії і судової медицини.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гасюк Анатолій Петрович, ВДНЗУ „Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії з секційним курсом;

доктор медичних наук, професор Туманський Валерій Олексійович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії і судової медицини з основами права.

Захист відбудеться “13” грудня 2007 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 08.601.03 в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України (49005, м. Дніпропетровськ, вул. Севастопольська, 17).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Дніпропетровської державної медичної академії (49044, м. Дніпропетровськ, вул. Дзержинського, 9).

Автореферат розісланий „9” листопада 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, доцент Машталір М.А.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У теперішній час злоякісні пухлини гортані представляють значну медичну проблему внаслідок їх високої поширеності й частої інвалідізації пацієнтів. Вони становлять від 1 до 8% у загальній структурі онкопатології та від 38 до 65% новоутворень ЛОР-органів (Заболотний Д.І., 1997; Лукач Є.В., 2000). Серед усіх злоякісних пухлин гортані абсолютна більшість представлена плоскоклітинними раками. У групі пацієнтів переважає працездатне чоловіче населення в діапазоні від 40 до 55 років. Останнім часом відзначається тенденція до збільшення захворюваності раком гортані, при цьому до 70% раків вперше діагностується на пізніх стадіях захворювання. Розроблені й впроваджені різні підходи до терапії і варіантів хірургічного лікування пухлин даної локалізації, однак загальні результати їх ефективності не повною мірою задовольняють онкологів. Загальна 5-річна виживаність залишається на рівні 35-50% (Пачес А.И., 2000; Абизов Р.А., 2001; Gallo A. et al., 2005).

Ріст захворюваності й висока смертність хворих раком гортані диктують необхідність пошуку ефективних методів діагностики й лікування злоякісних новоутворень, а також вивчення факторів, які визначають хід захворювання і його прогноз. Різний перебіг пухлин однієї й тієї ж локалізації та гістологічної форми, у тому числі їх резистентність до терапії, обумовлює необхідність більш глибокого вивчення біологічних властивостей пухлин з метою призначення індивідуального й максимально раціонального комплексу терапії (Monnerat C. et al., 2002; Ушаков В.С., Иванов С.В., 2003; Гасюк А.П. та ін., 2003; Троян В.И., 2005). Як показує досвід, визначення морфологічних характеристик, таких як ступінь диференціювання й мітотична активність, не завжди є достатніми, тому необхідним є дослідження біологічних властивостей, у тому числі експресії імуногістохімічних маркерів, як більш достовірних показників властивостей пухлинних клітин (Петров С.В., 2004; Smilek P. et al., 2006; Шпонька І.С. та ін., 2007).

Визначення імунофенотипу пухлини дозволяє не тільки прогнозувати її подальший хід, ймовірність метастазування та розвиток рецидивів, а також передбачати вірогідну відповідь на терапію (Ogawa T. et al., 2003; Licitra L., Vermorken J.B., 2004). Таким чином, з'являється можливість призначення індивідуального раціонального комплексу терапії, що є невід'ємною запорукою ефективного лікування, збільшення кількості органозберігаючих операцій і зниження економічних витрат на лікування.

Не дивлячись на велику кількість робіт, присвячених раку гортані, досліджень по вивченню імуногістохімічного статусу пухлин цієї локалізації, а також зв'язку останнього з клінічним перебігом проведено недостатньо. Основна маса відомостей стосується окремих показників і здебільшого носить суперечливий характер.

Таким чином, зазначені обставини визначають актуальність і необхідність подальшого вивчення експресії маркерів біологічних властивостей плоскоклітинних раків гортані для прогнозування їх клінічного перебігу й розробки критеріїв для вибору раціональної терапії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена робота є фрагментом науково-дослідної роботи кафедр патологічної анатомії і судової медицини та онкології і медичної радіології Дніпропетровської державної медичної академії „Індивідуалізація лікування злоякісних пухлин з урахуванням біологічних показників активності пухлинного процесу та маркерів хіміогормонорезистентності” (№ держреєстрації 0101U001002).

Мета і завдання дослідження. Удосконалити діагностичні й прогностичні критерії перебігу плоскоклітинних раків гортані на підставі вивчення показників експресії маркерів біологічних властивостей клітин.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні завдання:

1. Виявити імуногістохімічні маркери диференціювання плоскоклітинних раків гортані, що дозволяють уточнити гістогенез та ступінь зрілості пухлин.

2. Визначити експресію молекулярних маркерів (проліферації та онкотрансформації) у раках гортані різного гістологічного ступеня диференціювання.

3. Виявити відмінність імуногістохімічного профілю раків гортані з різним клінічним перебігом, наявністю метастазів, раннім розвитком рецидивів.

4. Визначити зв'язок рівня експресії імуногістохімічних маркерів в плоскоклітинних раках гортані з ефективністю проведеної променевої або хіміотерапії.

Об'єкт дослідження: матеріал плоскоклітинних раків гортані, отриманих при біопсії або проведенні операційного втручання.

Предмет дослідження: морфологічні особливості, гістологічний ступінь диференціювання, експресія імуногістохімічних маркерів в плоскоклітинних раках гортані.

Методи дослідження - морфологічні: гістологічні, імуногістохімічні, морфометричні для встановлення структурних і молекулярних характеристик плоскоклітинних раків гортані; математико-статистичні для обробки й аналізу отриманих даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчений комплекс імуногістохімічних маркерів в плоскоклітинних раках гортані різного ступеня диференціювання, клінічного перебігу й чутливості до проведеної терапії. Виявлені відмінності в імуногістохімічному статусі пухлин з різним клінічним перебігом і відповіддю на проведену терапію. Встановлені маркери, що дозволяють уточнити гістологічний ступінь диференціювання пухлини (фракції цитокератинів), прогнозувати ймовірність метастазування та розвитку рецидивів протягом першого року (експресія онкобілків р53 і bcl-2, висока проліферативна активність). Визначено діагностичне, прогностичне й передбачувальне значення кожного маркера біологічних властивостей для плоскоклітинних раків гортані. Доведено зв'язок терапевтичної чутливості рака гортані з генетичними порушеннями, що виникли в ході канцерогенезу, насамперед у механізмах регуляції апоптозу, які можуть бути виявлені за допомогою молекулярних маркерів. Визначені імунофенотипи раків гортані, що відповідають кожному ступеню диференціювання, пухлин з високим ризиком метастазування та рецидивування, високою ймовірною чутливістю до хіміотерапії, а також до променевого лікування.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати доводять необхідність дослідження комплексу імуногістохімічних маркерів у діагностиці пухлин гортані. Отримані дані розширюють уявлення про морфологію й біологічні властивості плоскоклітинних раків гортані, дозволяють краще зрозуміти їхню гетерогенність у клінічному плані. Матеріали даного дослідження дозволяють на підставі імуногістохімічного профілю раку уточнити гістологічний ступінь диференціювання, прогнозувати його подальший перебіг, ймовірність розвитку метастазів або рецидивів. Це дає можливість виділити групи пацієнтів, які потребують більш ретельного клінічного обстеження й спостереження, більш тривалої та масивної терапії, а також тих хворих, до котрих можуть бути застосовані органозберігаючі методи лікування.

На підставі експресії маркерів біологічних властивостей можна передбачати чутливість пухлини до променевої або хіміотерапії, а отже вибирати найбільш адекватний метод лікування, його тривалість та етапність. Таким чином, комплексна оцінка статусу пухлини, особливо на передопераційному етапі, дозволяє прогнозувати клінічний перебіг, вибирати найбільш адекватну схему лікування вже на ранніх стадіях, що дає змогу підвищити ефективність лікування й знизити його вартість, зменшити ймовірність розвитку метастазів і рецидивів, і, саме головне, - збільшити загальну виживаність пацієнтів. Отримані дані доцільні для використання як у практичній діяльності лікаря-патологоанатома, так і онколога, а також як теоретичні основи для викладання на кафедрах патологічної анатомії, онкології, оториноларингології, медичної радіології.

Результати проведених досліджень впроваджені в роботу Дніпропетровського обласного патологоанатомічного бюро, Одеського обласного патологоанатомічного бюро, Кримського республіканського клінічного онкологічного диспансеру, Херсонського обласного онкологічного диспансеру.

Теоретичні й практичні положення дисертації використовуються в навчальному процесі кафедри патологічної анатомії й судової медицини Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри патологічної анатомії з біопсийно-секційним курсом Кримського державного медичного університету ім. С.І.Георгієвського, кафедри патологічної анатомії Харківського дер-жав-ного медичного університету, кафедри патологічної анатомії Харківської державної медичної академії післядипломної освіти, кафедри патологічної анатомії Донецького державного медичного університету ім. М.Горького, кафедри патологічної анатомії Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика, кафедри патологічної анатомії і судової медицини з основами права Запорізького державного медичного університету, кафедри патологічної анатомії із секційним курсом ВДНЗУ “Українська медична стоматологічна академія”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним дослідженням автора, що втілив оригінальні наукові ідеї й задуми. При допомозі наукового керівника складена програма дослідження та проведені основні етапи роботи. Дисертантом особисто виконані патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури по даній проблемі. Самостійно проведений збір і систематизація біопсійного й операційного матеріалу, виконані гістологічне й імуногістохімічне дослідження, проведено аналіз, інтерпретація, статистична обробка отриманих результатів, сформульовані висновки й рекомендації, написані всі розділи дисертації. Результати роботи відображені в публікаціях, представлені на наукових з'їздах і конференціях.

У роботах, виконаних у співавторстві, ідея й основні положення належать дисертантові. Автором не були використані результати та ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені й обговорені на щорічних традиційних конференціях Українського наукового медичного товариства оториноларингологів (Дніпропетровськ, 2003; Київ, 2004; Яремча, 2006; Місхор, 2007), III з'їзді онкологів і радіологів СНД (Мінськ, 2004), XVII з'їзді оториноларингологів Росії (Нижній Новгород, 2006), XI з'їзді онкологів України (Судак, 2006), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Патологоанатомічна діагностика хвороб людини: здобутки, проблеми, перспективи” (Чернівці, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, з них 4 статті в рекомендованих ВАК України наукових фахових журналах (у тому числі 2 самостійно), 1 стаття оглядова, 1 деклараційний патент, 9 тез наукових з'їздів і конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертацію викладено державною мовою на 148 сторінках, з яких 118 сторінок залікового принтерного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів дослідження, 2 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку літературних джерел. Роботу ілюстровано 68 рисунками та 26 таблицями. Список цитованої літератури налічує 185 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В нашому дослідженні проведено ретроспективний аналіз клініко-анатомічнного матеріалу 205 хворих, який отримано під час операцій (тотальна або часткова ларингектомія, лімфаденектомія, операція Крайля) і діагностичних біопсій з приводу раку гортані III - IV стадій з ЛОР-онкологічного відділення Дніпропетровської обласної клінічної лікарні ім. І.І.Мечникова в період з 2000 по 2007р.

За гістологічною будовою всі новоутворення були представлені плоскоклітинними раками: зроговілими - 126 випадків та без зроговіння - 79 випадків. Весь клініко-анатомічний матеріал був розподілений на 3 групи: пацієнти з високодиференційованими плоскоклітинними раками - 49 випадків, пацієнти з помірнодиференційованими раками - 124 випадки та пацієнти з низькодиференційованими плоскоклітинними раками - 32 спостереження. З усіх спостережень в 112 випадках виявлені метастази в регіональні лімфатичні вузли, в 64 випадках розвинулися рецидиви протягом першого року після лікування. В якості передопераційного лікування 131 пацієнт отримав курс хіміотерапії за стандартною схемою, інші 74 пацієнти - курс променевої терапії.

Комісією з біоетики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол №6 від 12.06.07) встановлено, що проведені наукові дослідження тканин людини відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2000 року.

Для проведення морфологічного дослідження використовували парафінові блоки операційного та біопсійного матеріалу у випадках раку гортані та його метастазів у лімфатичні вузли. Для отримання зрізів використовували мікротом зі станцією прийому зрізів (Microm HM-340), що дозволило готувати серійні зрізи та оцінювати тотожні ділянки пухлинної тканини при подальшому проведенні імуногістохімічних реакцій. Парафінові зрізи товщиною 4-6 мкм фарбувалися гематоксиліном та еозином за стандартною методикою та піддавалися ретельному мікроскопічному дослідженню.

Для проведення ІГХ дослідження зрізи товщиною 4-6 мкм наносили на спеціальні адгезивні предметні стекла SuperFrost Plus, потім депарафінізували відповідно до прийнятих стандартів. Для проведення теплової індукції епітопного (антигенного) звороту (HІER - heat іnductіon of epіtope retrіeval) використовували нагрівання в цитратному буфері з рН=6,0 в автоклаві (8 хвилин при температурі +1210С) із симетричним розташуванням стекол у кюветі.

В якості первинних використовувалися моноклональні антитіла до цитокератину 19 (клон ВА17, DakoCytomation), високомолекулярного цитокератину (клон 34вЕ12, DakoCytomation), онкопротеїну р53 (клон DO-7, DakoCytomation), Ki-67 (клон MIB-1, DakoCytomation), онкопротеїну bcl-2 (клон 124, DakoCytomatіon). Для кожного маркера виконувалися контрольні дослідження з метою виключення помилковопозитивних або помилковонегативних результатів.

Наступний етап імуногістохімічного дослідження проводили з використанням системи візуалізації останнього покоління EnVision (DakoCytoma-tion). Вторинні антитіла наносили на зрізи та інкубували у вологих камерах протягом 30 хвилин з промиванням у ТРИС-буферному розчині між кожним етапом протягом 10 хвилин. Ідентифікація реакції проводилась за допомогою хромогену (DAB (DakoCytomation)) під контролем мікроскопу протягом від 20 секунд до 3 хвилин, з проявом у вигляді темно-коричневого забарвлення специфічних структур в залежності від маркеру (ядерна, цитоплазматична, мембранна реакція).

Для диференціювання структур тканин зрізи додатково фарбувались гематоксиліном Майєра протягом 1-3 хвилин. Наступна дегідратація і включення у бальзам здійснювалися згідно загальноприйнятим методикам.

Кількісні та якісні показники експресії маркерів вивчали як мінімум на 8-10 випадково обраних полях зору мікроскопа гістологічних зрізів. Після підрахунку 300 гістологічно ідентифікованих об’єктів (ядер або клітин), обчислювали показники експресії за результатами всіх вивчених ділянок. Оцінювалась реакція безпосередньо в тканині плоскоклітинних раків та в нормальних структурах гортані (епітелії, стромі, запальному інфільтраті).

Оцінка експресії кожного маркера проводилась індивідуально у відповідності з рекомендаціями інших дослідників (Dabbs D.J., 2006). Для цитокератинів враховувалось тільки специфічне коричневе забарвлення цитоплазми клітин. В залежності від кількості та інтенсивності фарбування клітин експресія маркера оцінювалась як негативна, слабка, помірна та виражена.

При оцінці експресії з антитілами до Кі-67 позитивною реакцією вважалося коричневе забарвлення ядер клітин. Показник експресії - індекс проліферації (ІП) – розраховувався як відсоток клітин з інтрануклеарною реакцією до всієї популяції клітин, що вивчалися (Pich A. et al., 2004).

Для оцінки експресії p53 враховувалось тільки специфічне коричневе забарвлення ядер. Незалежно від інтенсивності забарвлення, обчислювався відсоток клітин з інтрануклеарною реакцією до загальної кількості клітин у середньому за результатами всіх вивчених ділянок. Оцінка експресії р53 здійснювалась за наступною шкалою: негативна реакція – 0-10% забарвлених клітин, позитивна реакція - більше 10% клітин з імуногістохімічною міткою (Kizas P.A. et al., 2005).

При оцінці імуногістохімічної реакції з антитілами до онкопротеїну bcl-2 враховували коричневе забарвлення цитоплазми клітин різного ступеню інтенсивності. Також, незалежно від інтенсивності реакції, визначався відсоток клітин із специфічною реакцією до загальної кількості клітин, що були оцінені. Негативною вважалася експресія при забарвленні 0-10% клітин, позитивною - при специфічному цитоплазматичному забарвленні більше 10% клітин (Dabbs D.J., 2006).

Мікроскопію проводили за допомогою світлового мікроскопу Leіca DMLS, мікрофотографування виконувалось за допомогою цифрової фотокамери Canon EOS D30.

Результати, отримані під час імуногістохімічного дослідження, піддавалися статистичній обробці з використанням варіаційних статистичних методів. Визначення достовірності відмінностей ознак проводили за допомогою параметричних методів (t-критерій Стьюдента). Зв’язок між ознаками визначали за допомогою коефіцієнта кореляції. У випадку, коли розподілення не відповідало нормальному закону, оцінку відмінностей між вибірками оцінювали за допомогою непараметричних критеріїв: Х-критерію Ван-дер-Вардена і U-критерію Уілкоксона (Манна-Уітні).

Результати дослідження та їх обговорення.

У нашому дослідженні експресія високомолекулярних цитокератинів (СК34вЕ12) виявлена у всіх випадках плоскоклітинних раків гортані (ПРГ), при цьому інтенсивність реакції коливалася від вираженої у всій пухлинній паренхімі, до слабкої в окремих клітинах. У більшості випадків (59%) відзначалося виражене фарбування практично всіх клітин раку. Інтенсивність реакції в деяких випадках варіювала в різних зонах пухлини. Як правило, виразність фарбування була меншою в периферичних відділах ракових осередків, збільшуючись до їй центральних зон. Особливо помітним цей феномен був у плоскоклітинних зроговілих раках, у яких реакція була сильнішою не тільки в центральних ділянках, але й, у значній мірі, в зроговілих клітинах ракових перлин. У частині ПРГ відзначалося зниження інтенсивності фарбування в зонах глибокого інвазивного росту в порівнянні з поверхневими ділянками. Кількість випадків з вираженою експресією СК34вЕ12 зменшувалася відповідно до зниження ступеня диференціювання з відповідним ростом частки пухлин з низькою й помірною реакцією. Визначено зворотну залежність ступеня диференціювання й експресії СК34вЕ12, що дозволило зробити висновок про можливість використовування даного маркеру для уточнення ступеня диференціювання ПРГ (рис. 1).

Характер реакцій з СК34вЕ12 в клітинах метастазів в лімфовузли, як правило, відповідав такому в первинній пухлині. У ряді випадків були виявлені невеликі відмінності, що проявлялось в меншій гетерогенності й інтенсивності фарбування в тканині метастазів. Імуногістохімічна реакція з СК34вЕ12 дозволяла чітко ідентифікувати пухлинні клітини серед лімфоїдної тканини, що в сумнівних випадках сприяло точній діагностиці мікрометастазів.

У дослідженні був проведений аналіз експресії високомолекулярного цитокератину СК34вЕ12 в ПРГ з наявністю метастазів у лімфатичні вузли та без них. В метастатичних раках в порівнянні з пухлинами з відсутнім метастатичним ураженням лімфатичних вузлів інтенсивна реакція спостерігалась на 3,7% частіше, помірна – на 4,8% рідше, а слабка – на 0,7% частіше. Співвідношення реакцій різної інтенсивності в раках з метастазами складало – 1:2,1:4,9, а в раках без метастазів – 1:2,6:4,8. Виявлені відмінності не мали статистичної значущості.

Експресія СК34вЕ12 з вираженою інтенсивністю фарбування в ПРГ з розвитком рецидивів протягом першого року спостерігалась на 8,6% рідше ніж в пухлинах без рецидивів, помірної інтенсивності – на 0,9%, слабкої - на 5,0% частіше. Співвідношення реакцій слабкої, помірної та вираженої інтенсивності в групі ПРГ з рецидивами склало – 1:1,7:3,4, а в групі без рецидивів – 1:2,6:5,8. При статистичній обробці зазначенні відмінності не були значущими, та не виявили кореляційного зв’язку з розвитком рецидивів в ПРГ.

Рис. 1. Розподіл експресії фракцій цитокератинів в ПРГ в залежності від ступеня диференціювання.

Позитивний статус ІГХ реакцій з цитокератином 19 (СК19) спостерігався в 41,5% всіх ПРГ, при цьому в більшості з них реакція була слабкої інтенсивності й тільки в чотирьох випадках - високої. На відміну від цитокератинів плоских епітеліїв експресія СК19 відрізнялася відносною однорідністю як в окремих ракових осередках, так і у всій пухлинній паренхімі взагалі. У більшості випадків з позитивною експресією відзначено рівномірне фарбування клітин раку. Тільки в 8 випадках відзначалося переважне фарбування центральних відділів ракових осередків, а в 3 - периферичних. При порівнянні експресії СК19 у первинних пухлинах і їх метастазах істотних відмінностей не виявлено. Рівень і інтенсивність експресії СК 19 збільшувалася відповідно до зниження ступеня диференціювання (р<0,05). Нами було проведено порівняння рівня експресії СК19 в ПРГ з рецидивами та без рецидивів. В першій групі реакція з СК19 зустрічалась на 5,6% частіше ніж в другій. Співвідношення реакцій різної інтенсивності в цих групах відповідно складало 1:0,40:0,37:0,06 та 1:0,40:0,24:0,02. Не визначено значущих відмінностей та зв’язку цих параметрів з розвитком рецидивів в ПРГ.

Проведено аналіз проліферативної активності ПРГ за допомогою моноклонального антитіла Кi-67 та визначення індексу проліферації (ІП). Проліферативна активність оцінювалася як низька при ІП у діапазоні 0-20%, помірна при 21-30% і висока більш ніж в 30%. У ПРГ інтрануклеарну реакцію давали в основному клітини периферійних відділів пухлинних осередків. У плоскоклітинних зроговілих раках у клітинах з ознаками зроговіння реакція, як правило, не виявлялася, кількість клітин з реакцією була меншою, ніж у групі незроговілих раків. При порівнянні ІП в більшості випадків відзначена неоднорідність показника в різних зонах пухлини. Так, спостерігалася тенденція до збільшення частки проліферуючих клітин в зонах інвазивного росту в порівнянні з поверхневими відділами пухлини, в окремих випадках ІП в різних зонах пухлини відрізнявся на 15-20%. При порівнянні проліферативної активності первинної пухлини і її метастазів у лімфатичні вузли відзначені відповідні відмінності. Більш високі значення ІП визначені в клітинах метастазів, їх показники відповідали у більшості випадків показникам первинної пухлини у ділянках з вираженим інвазивним ростом. ІП у ПРГ коливався від 6 до 74% і, в середньому, складав 32,72,57%. Частка пухлин з високою проліферативною активністю вірогідно збільшувалась відповідно до зниження ступеня гістологічного диференціювання. Так, відносна кількість активно проліферуючих раків у групі низькодиференційованих пухлин була в 1,3 рази більше, ніж у групі помірнодиференційованих, в 1,8 рази - високодиференційованих.

При аналізі ІП в пухлинах з різним клінічним перебігом було визначено істотні розходження. В групі ПРГ з наявністю метастазів проліферативна активність була значно вищою ніж у пухлинах без метастазів (середні показники склали 38,12,52% і 26,32,91%) (рис. 2).

Рис. 2. Розподіл експресії ІГХ маркерів в ПРГ з різним клінічним перебігом.

Кількість випадків активно проліферуючих пухлин серед ПРГ з метастазами була переважаючою, в порівнянні з пухлинами без метастазів їх було в 1,6 разів більше. Серед пухлин з помірною проліферативною активністю значних розходжень між групами не відзначено. Ймовірність розвитку метастазів в ПРГ з високою проліферативною активністю була в 1,5 рази вищою, ніж у пухлинах з ІП менше 30%, а у порівнянні з низькою та помірною проліферативною активністю ризик розвитку метастазів в цій групі збільшувався в 1,8 та 1,3 рази відповідно. При проведенні порівняльного аналізу рівня експресії Кi-67 в ПРГ, в яких протягом першого року розвинулись рецидиви, й пухлинах з безрецидивним перебігом середні значення ІП у цих групах склали 40,44,23% і 29,22,41% відповідно. Новоутворення з епізодом рецидивування характеризувалися більш високим ІП, більшою часткою пухлин з показниками експресії Кi-67 більше 30%, на 10,2% більше ніж серед усіх пухлин і на 14,8% більше ніж серед раків без рецидивів (рис. 2). Згідно з нашими даними ймовірність виникнення рецидивів серед ПРГ з високою проліферативною активністю була в 1,9 рази вище ніж серед раків з низькою проліферативною активністю, та в 1,2 рази – ніж з помірною.

В роботі проаналізована проліферативна активність ПРГ залежно від проведеного лікування у вигляді курсу передопераційної терапії й досягнутого їм ефекту (рис. 3). ІП пухлин, які відповіли на хіміотерапію склав 30,43,73%, серед резистентних до неї - 34,94,22%, ПРГ з високим ефектом від променевого впливу - 44,16,15%, радіорезистентних - 26,33,51%. Серед пухлин, з приводу яких була проведена хіміотерапія, частка з високою проліферативною активністю, як у групі з високим ефектом на терапію, так і в групі з неефективним лікуванням незначно відрізнялася від середніх показників.

Рис. 3. Розподіл експресії ІГХ маркерів в ПРГ з різним ефектом від проведеної терапії.

Кількість випадків ПРГ з високою експресією Кi-67 була вище серед пухлин, які не відповіли на хіміотерапію на 7,0%, що не показало достовірних відмінностей. У той же час, між групами з різним ефектом від проведеної променевої терапії визначені певні відмінності. Відносне число ПРГ з високим ІП було значно більшим (в 1,6 рази) серед пухлин чутливих до променевої терапії, ніж серед не чутливих, і на 13,6% більше, ніж серед всіх ПРГ. Згідно з отриманими даними вірогідність достатнього ефекту від променевої терапії в ПРГ з високою проліферативною активністю в 1,8 раз вище ніж серед решти пухлин, в 2,7 та 1,2 рази ніж в раках з низькою та помірною експресією Кi-67. Отримані дані свідчать про відсутність розходжень експресії Кi-67 у пухлинах з різним ефектом від проведеної хіміотерапії. У той же час значні розходження показників ІП між групами радіочутливих і радіорезистентних ПРГ дозволяють використовувати цей параметр, як передбачувальний.

У клітинах ПРГ експресія р53 виявлялася як специфічне інтрануклеарне фарбування різної інтенсивності, в основному високої і помірної. У нашому дослідженні більшість випадків ПРГ (57,6%) мали р53-позитивний статус. У плоскоклітинних зроговілих раках реакція виявлялася головним чином в клітинах периферичних відділів пухлинних осередків, у той час як зроговілі клітини практично завжди, за винятком декількох випадків, не фарбувалися. Переважно периферичний тип фарбування був характерним для високодиференційованих зроговілих ПРГ, у яких експресія р53 спостерігалася тільки в зовнішньому шарі пухлинних клітин. У ПРГ без ознак зроговіння розподіл клітин з позитивною реакцією був гетерогенним, без значних розходжень між центральними й периферичними ділянками.

У нашому дослідженні було проведено аналіз експресії онкобілку р53 у групах із наявними метастазами в лімфатичні вузли й без таких. Частота надекспресії р53 у метастатичних пухлинах була на 9,4% вище, ніж серед всіх ПРГ й на 20,8% ніж серед пухлин без метастазів (рис. 2). За нашими даними, ймовірність наявності метастазів у р53-позитивних ПРГ була в 1,5 рази вище, ніж у випадках з негативним статусом. Нами була вивчена експресія р53 у метастазах ПРГ в лімфовузли. Як і в тканині первинної пухлини, в метастазах відзначалася позитивна інтрануклеарна реакція переважно високої й помірної інтенсивності. При порівнянні рівня експресії р53 у первинній пухлині й у метастазах у ряді випадків відзначені незначні відмінності. Так, кількість клітин з реакцією у метастатичній популяції була на 5-15% вище, ніж у материнській пухлині. У той же час, нами не визначено випадків відмінного від первинного вогнища статусу метастазу за онкопротеїном р53, тобто надекспресії в метастазі й відсутність її у первинній пухлині. Отримані дані можна трактувати як підтвердження впливу мутації гена р53 на метастатичні властивості ПРГ.

У досліджені був проведений аналіз експресії р53 в групі ПРГ з рецидивами протягом першого року після проведеного лікування та спостереженнях з безрецидивним перебігом процесу. При аналізі експресії р53 у цих групах визначені достовірні розходження. Серед пухлин з рецидивами кількість р53-позитивних було на 11,7% більше, ніж серед пухлин без рецидивів (рис. 2). При цьому ймовірність розвитку рецидивів протягом першого року серед раків з надекспресією р53 була в 1,4 рази вище ніж в р53-негативних пухлинах. Отримані дані дозволяють зробити висновок про вплив надекспресії р53 на біологічні властивості ПРГ і його перебіг.

При дослідженні експресії bcl-2 позитивний статус спостерігався в 22,9% випадків ПРГ. При цьому в більшості спостережень відзначалося слабке або помірної інтенсивності фарбування з дифузним розподілом клітин з реакцією у пухлинній паренхімі. У плоскоклітинних незроговілих раках реакція визначалась рівномірно серед всіх клітин пухлини без явної переваги реакції в периферичних або центральних зонах. У раках з ознаками зроговіння відзначена така ж тенденція з тією відмінністю, що в зроговілих клітинах ракових перлин фарбування не спостерігалось. При порівнянні рівня експресії bcl-2 у різних зонах пухлини значимих відмінностей не знайдено. У більшості випадків інтенсивність експресії bcl-2 в пухлині й метастазах була однаковою, у той час як кількісні показники експресії в декількох випадках в клітинах метастазів були вищими на 5-10%, що, ймовірно, свідчить про вплив його експресії на метастатичний потенціал пухлини. В дослідженні не простежені зв'язки рівня експресії bcl-2 з гістологічним ступенем диференціювання, що не підтверджує його діагностичного значення в ПРГ.

Експресія bcl-2 у ПРГ з наявністю метастазів і без таких мала значні розходження. Так, серед метастатичних пухлин кількість bcl-2-позитивних була в 1,6 рази більше, ніж серед новоутворень без метастазів (рис. 2). Ймовірність наявності метастазів у пухлинах з експресією bcl-2 в 1,3 рази вище, ніж у раках з негативною реакцією. Таким чином, виявлені розходження в експресії bcl-2 свідчать про його вплив на раннє метастазування ПРГ. Серед раків з рецидивами кількість bcl-2-позитивних було в 1,9 рази більше, ніж серед безрецидивних новоутворень, і на 11,5% більше ніж у середньому у вибірці (рис. 2). За даними отриманими у ході дослідження ймовірність розвитку рецидивів серед ПРГ з високою експресією bcl-2 в 1,8 рази вища ніж серед пухлин без експресії. Таким чином, експресія bcl-2 відіграє важливу роль у несприятливому плині ПРГ з раннім розвитком рецидивів.

Серед пухлин з низьким ефектом від проведеної хіміотерапії кількість bcl-2 - позитивних було на 5,4% більше ніж серед раків з вираженою відповіддю на терапію, що, однак, не склало статистично достовірної різниці. У той же час серед ПРГ нечутливих до променевої терапії реакція з bcl-2 відзначена в 2,3 рази частіше ніж серед пухлин з високим ефектом від проведеної радіотерапії. При цьому, виходячи з отриманих даних, ймовірність відсутності ефекту від проведеної променевої терапії в пухлинах з надекспресією bcl-2 в 1,4 рази вища ніж в bcl-2 - негативних раках (рис. 3). Таким чином, експресія bcl-2 у ПРГ є одним із механізмів розвитку низької чутливості пухлини до променевого впливу, та є важливим передбачувальним маркером можливої чутливості до променевої терапії в ПРГ.

ВИСНОВКИ

В дисертації проведене теоретичне узагальнення і нове вирішення науково-практичного завдання з вивчення експресії імуногістохімічних маркерів в плоскоклітинних раках гортані, яке полягає в удосконаленні критеріїв визначення ступеня диференціювання раків, виявленні факторів прогнозування їх подальшого клінічного перебігу, а саме можливого розвитку метастазів та рецидивів, визначенні факторів передбачення можливого ефекту проведення променевої та хіміотерапії. Отримані дані є підґрунтям для подальших наукових досліджень в галузі патологічної анатомії, оториноларингології, онкології.

1. У плоскоклітинних раках гортані та тканині їх метастазів у лімфатичні вузли завжди відзначається експресія високомолекулярних цитокератинів СК34вЕ12. Найбільша інтенсивність реакцій спостерігається в центральних відділах ракових осередків, особливо в ракових перлинах плоскоклітинних зроговілих раків гортані. Існує прямий кореляційний зв'язок між рівнем експресії високомолекулярних цитокератинів в плоскоклітинних раках гортані та ступенем гістологічного диференціювання (r=+0,63). Співвідношення слабкої, помірної та вираженої експресії СК34вЕ12 в високодиференційованих раках складає 1:2,5:8,8, в помірнодиференційованих - 1:2,5:4,8, і в низькодиференційованих - 1:2,0:2,3.

2. У плоскоклітинних раках гортані експресія цитокератину 19 спостерігається в 41,5% випадків. Реакція має одноманітний вид в усій пухлинній паренхімі. Серед високодиференційованих пухлин реакція визначається в 24,5% спостережень, помірнодиференційованих - в 42,7%, низькодиференційованих - в 62,5%. Існує зворотний кореляційний зв'язок між експресією СК19 та ступенем гістологічного диференціювання (r=–0,78).

3. Експресія білка Кi-67 є показником проліферативної активності пухлин та в раках гортані має середній показник 32,72,57%. Аналіз показників індексу проліферації в клінічних групах дозволив визначити діапазони значень параметра: при індексі проліферації більше 30% проліферативна активність розцінюється як висока, у діапазоні від 21% до 30% - як помірна, 20% і менше - як низька. Раки з високою проліферативною активністю складають 50,7%. Підвищення проліферативної активності відзначається в клітинах периферії ракових осередків та в зонах вираженого інвазивного росту. Параметри проліферативної активності клітин метастазів раку гортані співвідносяться з показниками індексу проліферації первинної пухлини або перевищують їх на 5-10%. Існує зворотний кореляційний зв’язок між показниками індексу проліферації та ступенем гістологічного диференціювання (r=–0,47). Плоскоклітинні раки гортані з високою проліферативною активністю в групі високодиференційованих пухлин складають 36,7%, серед помірнодиференційованих - в 52,4%, низькодиференційованих - 65,6%.

4. Проліферативна активність раків гортані має прогностичне значення щодо подальшого перебігу захворювання. Висока проліферативна активність (ІП більше 30%) в раках гортані з наявністю метастазів у лімфовузли зустрічається в 61,6%, в раках без метастазів – в 37,6%. Існує прямий кореляційний зв'язок рівня експресії Кi-67 з наявністю метастазів (r=+0,59). Серед випадків раків гортані, в яких протягом першого року після лікування розвинулись рецидиви, високий рівень проліферативної активності зустрічається в 60,9%, серед раків з безрецидивним перебігом - в 46,1%. Існує прямий кореляційний зв'язок між проліферативною активністю та раннім розвитком рецидивів (r=+0,38).

5. Проліферативна активність в плоскоклітинних раках гортані має передбачувальне значення щодо можливої ефективності променевої терапії. В раках з високим ефектом від проведеної променевої терапії високий рівень ІП зустрічається в 64,3%, в той час як серед раків з низьким ефектом – в 41,3%. Існує прямий кореляційний зв'язок проліферативної активності з чутливістю раків гортані до променевої терапії (r=+0,56).

6. Експресія онкопротеїну р53 спостерігається в 57,6% випадків плоскоклітинних раків гортані. Переважає рівномірний характер розподілу клітин з позитивним статусом у пухлинній паренхімі. Статус тканини метастазів раку гортані за онкобілком р53 відповідає такому у первинній пухлині. Експресія онкопротеїну р53 має прогностичне значення щодо перебігу раків гортані. Серед раків гортані з метастазами в лімфатичні вузли р53-позитивними є 67,0%, серед неметастатичних пухлин - 46,2%. Існує прямий кореляційний зв'язок експресії р53 з наявністю метастазів в раках гортані (r=+0,52). Раки гортані в яких розвинулись рецидиви протягом першого року мають експресію р53 в 65,6% випадків, пухлини без розвитку рецидивів – в 53,9%. Існує прямий кореляційний зв'язок експресії р53 з раннім розвитком рецидивів (r=+0,31).

7. Статус пухлини за р53 має передбачувальне значення щодо можливої ефективності хіміотерапії. Раки гортані з високим ефектом від проведеного хіміотерапевтичного лікування виявляють експресію р53 в 44,9% спостережень, раки з низьким ефектом від лікування – в 71,0%. Існує зворотний зв'язок між експресією р53 та ефективністю проведеної хіміотерапії (r=–0,65).

8. Реакція з онкобілком bcl-2 в плоскоклітинних раках гортані виявляється в 22,9% випадків. Переважає дифузний тип розподілу позитивних клітин в пухлині. Рівень експресії bcl-2 в тканині метастазу та первинному раці гортані відповідають один одному. Експресія білку bcl-2 має прогностичне значення щодо подальшого перебігу процесу. Раки гортані з наявністю метастазів у регіональні лімфовузли показують експресію bcl-2 в 27,7% випадків, пухлини без метастазів – в 17,2%. Існує прямий кореляційний зв'язок експресії bcl-2 з наявністю метастазів (r=+0,34). Реакція з bcl-2 в раках з виникненням рецидивів протягом першого року виявляється в 34,4%, в раках з безрецидивним перебігом – в 17,7%. Існує прямий кореляційний зв'язок між експресією bcl-2 та раннім розвитком рецидивів (r=+0,46). Статус пухлини за bcl-2 має передбачувальне значення щодо можливої ефективності променевої терапії. Експресія bcl-2 визначається у випадках з високим ефектом від проведеного променевого лікування в 14,3%, серед раків з низьким ефектом лікування – в 32,6%. Існує зворотний кореляційний зв'язок експресії bcl-2 з ефектом проведеної променевої терапії (r=–0,51).

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. У плоскоклітинних раках гортані необхідно використовувати імуногістохімічне дослідження комплексу маркерів біологічних властивостей пухлини для поліпшення діагностики та прогнозування можливого подальшого перебігу захворювання з подальшим вибором діагностичних та лікувальних заходів.

2. Для поліпшення гістологічної діагностики та визначення ступеня диференціювання раків гортані доцільно використовувати комплекс імуногістохімічних маркерів, що включає цитокератини СК19, СК34вЕ12 та Кi-67. Для підтвердження походження метастазів при плоскоклітинних раках гортані використовувати цитокератин СК34вЕ12.

3. Для прогнозування можливого розвитку метастазів та раннього розвитку рецидивів при раках гортані рекомендується використовувати комплекс маркерів Кi-67, р53 та bcl-2 (висока проліферативна активність (індекс Кi-67 більше 30%), надекспресія онкопротеїнів р53 та bcl-2).

4. Для передбачення можливої ефективності хіміотерапії при лікуванні плоскоклітинних раків гортані доцільно визначати експресію маркера р53 (відсутність експресії онкопротеїну р53 в пухлині).

5. Для передбачення можливого ефекту від променевої терапії при лікуванні раків гортані рекомендовано використовувати маркери Кi-67 та bcl-2 (висока проліферативна активність та відсутність реакції з онкопротеїном bcl-2).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гриценко П.А., Шпонька И.С., Лымарь Л.И. Использование маркера Ki-67 для выявления пролиферативного потенциала клеток // Вісн. проблем біол. і мед.- 2003.- Вип. 4.- С. 94-96. (особисто здобувачем виконані морфологічні дослідження).

2. Гриценко П.А. Плоскоклеточный рак гортани: иммуногистохимический профиль цитокератинов и значение их в диагностике // Патологія.- 2006.- Т.3, 3.- С. 37-40.

3. Гриценко П.О., Шпонька І.С., Ковтуненко О.В. Імуногістохімічний профіль раків гортані з різним клінічним плином та ефектом на проведену терапію // Морфологія.- 2007.- Т.І, №2.- С.95-101. (особисто здобувачем виконані збір матеріалу та морфологічні дослідження).

4. Гриценко П.О. Прогноз перебігу плоскоклітинних раків гортані на підставі визначення імуногістохімічного профілю // Морфологія.- 2007.- Т.І, №4.- С.21-26.

5. Гриценко П.А., Шпонька И.С., Ковтуненко А.В., Березнюк В.В., Тымчук С.Н. Бондарева В.А. Тканевые маркеры в определении биологических свойств и прогнозировании течения рака гортани // Журн. вушних, носових і горлових хвороб.- 2005.- № 5.- С. 77-87. (здобувач особисто провів аналітичний огляд наукової літератури).

6. Пат. 18143 Україна, МПК А61В 10/02. Спосіб прогнозування клінічного перебігу раку гортані / О.В.Ковтуненко, І.С.Шпонька, С.М.Тимчук, В.В.Березнюк, П.О.Гриценко, В.О.Бондарєва, О.В.Дорохова (Україна) - № 200606965; Заявл. 22.06.2006; Опубл. 16.10.2006. Промислова власність. Офіційний бюлетень.- 2006.- № 10.- 6 с. (здобувачем проведено патентний пошук та виконані морфологічні дослідження).

7. Гриценко П.О., Шпонька І.С. Бондарєва В.О. Роль імуногістохімічного визначення маркерів проліферації (Ki-67) та р53-онкопротеїну в оцінці біологічних властивостей пухлин гортані // Галицький лікарський вісник.- 2003.- Т.10, №4.- С. 148. (особисто здобувачем виконані морфологічні дослідження).

8. Гриценко П.А., Шпонька И.С., Березнюк В.В., Ковтуненко А.В.,