НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ГАЛЬЧЕНКО СЕРГІЙ ЄВГЕНОВИЧ

УДК 615.361.014.41.451.16:57.043

Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних з них водно-сольових екстрактів

03.00.19- кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Харків 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор, Заcлужений діяч науки і техніки України Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу експериментальної кріомедицини.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування, м. Харків;

Доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії біологічного факультету, м. Харків.

Доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Турчин Іван Семенович, Український науково-практичний центр ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України, завідувач відділу експериментальної і клінічної трансплантології, м. Київ.

Провідна установа:

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, Науково-дослідний лабораторний центр, м. Київ.

Захист відбудеться 22 травня 2007 року о 1330 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий 19 квітня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор А.М. Гольцев

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Останнім часом в Україні та за її межами проводяться широкі дослідження ефективності та механізмів дії препаратів клітинної та тканинної терапії, в тому числі створених із ксеногенних органів (И.П. Ашмарин и др., 2002; Т.П. Бондаренко, 2003; И.П. Кайдашев и др., 2003; Б.П. Сандомирський и др., 2003; K. Edamura, 2003; А.М. Гольцев та інш., 2004; И.С. Ролик, 2004; В.І. Грищенко, 2005; C.N. Berger, 2005). Головним чином це пов'язано з тим, що при використанні ксеногенного матеріалу не виникають морально-етичні проблеми, а також відсутня небезпека інфікування на характерні для людини віруси (ВІЛ, гепатит, тощо), яка має місце при використанні алогенного матеріалу (О.И. Смыкодуб, 2002). Але залишається небезпека передачі загальних для людини та тварин інфекцій. Тому в одержаному від тварин матеріалі повинна бути відсутня бактеріологічна, вірусологічна та мікологічна контамінація (Наказ МОЗ України № 96 від 4 травня 2000 р). Для проведення аналізів на відсутність контамінації такого матеріалу потрібен відповідний час, протягом якого його раціонально зберігати в кріоконсервованому стані. Тканинні препарати використовують в клініці та наукових дослідженнях у вигляді клітин, фрагментів органа, екстрактів тканини відповідного органа та інш. Тому в своїй роботі ми вивчили вплив умов кріоконсервування на збереження фрагментів органів свиней та поросят, а також склад та біологічну активність водно-сольових екстрактів, одержаних з деконсервованого матеріалу.

На теперішній час накопичено достатньо наукової інформації про вплив швидкостей охолодження, різних кріопротекторів і їх концентрацій на збереження біологічного матеріалу після кріоконсервування. Слід зазначити, що вплив вищевказаних чинників на клітинні суспензії при їх кріоконсервуванні вивчений досить повно, а вплив на збереження фрагментів досліджено значно менше.

Практично не вивченим залишається питання щодо стану деконсервованих фрагментів органів після відігріву та повернення в умови нормотермії. У зв'язку з цим доцільно дослідити вплив різних швидкостей охолодження на фрагменти тканин, в яких існують клітинне мікрооточення, міжклітинні зв'язки та інш. Слід мати на увазі, що при кріоконсервуванні процеси позаклітинної кристалізації, зневоднення клітин, їх взаємодія з позаклітинними кристалами в суспензії клітин і тканині протікають по-різному. Недостатньо вивченим залишається питання ефективності кріопротекторів залежно від їх природи (спирт, оксид, полімер) при кріоконсервуванні фрагментів тканин різних органів. Крім того, кріостійкість тканини може також залежати від віку тварини. Одержані дані можуть бути основою для теоретичного обґрунтування застосування тих або інших швидкостей охолодження і кріопротекторів для кріоконсервування тканинних препаратів. Вплив умов кріоконсервування на збереження біоматеріалу доцільно вивчати на фрагментах органів з різною структурою тканини (підшлункова залоза, печінка, селезінки) і одержаних від тварин різного віку. Такий вибір об'єктів пов'язаний з тим, що препарати з цих органів проявляють високу біологічну активність і знаходять досить широке використання в наукових дослідженнях та клінічній практиці (В.И. Зубков, 2000; т Н.А. Онищенко и др., 2000; T. Kin et. al., 2002; H. Krook, 2002; О.П. Потіха, 2003).

У всьому світі, зокрема і в Україні, зростає кількість хворих на цукровий діабет (Ю.І. Караченцев, 2002), який призводить до багатьох порушень в організмі та ускладнень. Наприклад, складним є хірургічне лікування даної категорії хворих у зв'язку з уповільненням репараційних процесів і небезпекою розвитку гнійних ускладнень. Будь-яке оперативне втручання призводить до дестабілізації вуглеводного обміну і вимагає значного підвищення дози екзогенного інсуліну. При трансплантація острівців підшлункової залози спостерігається часткова компенсація діабету, стабілізація перебігу хвороби, перехід до більш легкої форми, а найголовніше - стабілізація, а у ряді випадків - і зворотній розвиток судинних і неврологічних ускладнень, перш за все мікроангіопатій, чого практично неможливо досягти іншими шляхами (І.С. Турчин, 2003). Проте широке впровадження даного методу лікування в клінічну практику ускладнено труднощами при отриманні і збереженні запасів гормонально активної тканини в кількості, здатній задовольнити запити клініки. Рішенням цієї проблеми може бути отримання біоматеріалу в спеціалізованій лабораторії і створення низькотемпературного банку для його довготермінового зберігання.

Для компенсації септичних і токсичних станів використовують методи, засновані на екстракорпоральному очищенні і модуляції складу крові контурами для гемоперфузії, що включають функціонально активні клітини або тканинні фрагменти ксеногенних органів (Н.А. Онищенко, 1999; В.Е. Рябинин, 2002). Ксеногенні органи знаходять також використання при одержанні різноманітних тканинних препаратів, в тому числі і екстратів, які містять регуляторні пептиди (В.Х. Хавинсон, 2005).

Отже, кріобіологічні підходи при довготерміновому зберіганні біологічного матеріалу є перспективними, а вивчення впливу режимів кріоконсервування фрагментів органів на їх збереження, склад одержуваних з них екстрактів і їх біологічної дії має науковий та практичний інтерес.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідних тем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України: “Розробка технології кріоконсервування фрагментів деяких ксеноорганів для клінічного застосування” (шифр-2.2.6.75, № держреєстрації 0100U004240) і “Дослідження впливу та механізму дії кріоконсервованих тканинних препаратів з ксеногенних органів на перебіг ряду патологічних процесів в організмі” (шифр-2.2.6.05, № держреєстрації 0102U002027).

Мета і задачі дослідження. Визначити вплив умов кріоконсервування на збереження фрагментів печінки і підшлункової залози свиней та новонароджених поросят і селезінки свиней, а також на склад одержуваних з них водно-сольових екстрактів і їх біологічну дію при експериментальних патологічних станах.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити такі задачі:

1. Вивчити збереження в часі фрагментів печінки і селезінки свиней, а також печінки і підшлункової залози новонароджених поросят залежно від природи кріопротектора, його концентрації і швидкості охолодження.

2. Визначити кількісний склад водно-сольових екстрактів фрагментів печінки та підшлункової залози новонароджених поросят і підшлункової залози, печінки та селезінки свиней залежно від умов одержання.

3. Визначити молекулярно-масовий розподіл речовин пептидної природи в екстрактах кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів.

4. Провести дослідження взаємодії компонентів екстрактів з альбуміном.

5. Визначити біологічну дію екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів при експериментальному цукровому діабеті, токсичному гепатиті, цирозі печінки, опіковій травмі.

6. Дослідити вплив екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів на тварин різного віку.

7. Провести експериментальне вивчення впливу суміші екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней на ріст пухлини Герена.

Об’єкт дослідження - процес низькотемпературного кріоконсервування фрагментів органів та одержання з них екстрактів, а також їх біологічна дія при експериментальних патологіях.

Предмет дослідження - фрагменти печінки, селезінки, підшлункової залози свиней, а також печінки і підшлункової залози новонароджених поросят; екстракти кріоконсервованих фрагментів органів.

Методи дослідження: полярографічний, спектрофотометричний, спектрофлуориметричний, гель-проникаючої хроматографії, диференціальної скануючої калориметрії, радіоімунологічний, хемілюмінесцентний, гістологічний, світлової мікроскопії, прижиттєвої мікроскопії мікрогемоциркуляторного русла печінки, а також математичні методи статистичної обробки.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було проведено комплексне вивчення впливу кріопротекторів різної хімічної природи та швидкостей охолодження на збереження протягом деякого часу після відігріву фрагментів різних органів свиней та поросят.

При вивченні впливу режимів заморожування на збереження фрагментів підшлункової залози поросят встановлено, що кращий захист матеріалу забезпечують ДМСО та ПЕО-1500, в порівнянні з гліцерином та ПЕО-400, за показниками інтенсивності ендогенного дихання та перекисного окислення ліпідів. Інсулінпродукуюча здатність матеріалу не відрізняється від контролю при використанні ДМСО та ПЕО-1500 в якості кріопротекторів. Вперше показана висока ефективність поліетиленоксидів як кріопротекторів при кріоконсервуванні фрагментів печінки та селезінки. Доведена також можливість кріоконсервування такого матеріалу з використанням високих швидкостей охолодження. Отже, отримані фундаментальні результати дозволили теоретично обгрунтувати можливість оптимізації процесу кріоконсервування фрагментів органів.

Вперше встановлено, що використання кріобіологічних підходів дозволяє збільшити вихід в екстракт речовин пептидної природи, а також той факт, що молекулярно-масовий спектр цих речовин залежить від органа та віку тварин.

Важливе теоретичне значення мають вперше одержані дані, що речовини, які входять до складу екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів, зв’язуються з альбуміном сироватки крові. При уведенні в організм пептидів таке зв’язування повинно захищати їх від дії пептидаз.

Показано, що вищезгадані екстракти проявляють високу біологічну активність. При алоксановому цукровому діабеті екстракт підшлункової залози свиней більш ефективно знижує рівень глюкози в крові та рівень перекисного окислення ліпідів в організмі ніж фрагменти. Екстракти печінки стимулюють процеси репарації та регенерації в ураженому органі при токсичному гепатиті та цирозі печінки.

Встановлено також, що екстракти печінки та підшлункової залози свиней, які проявляють високу біологічну активність при патологіях відповідних органів, практично не впливають на перебіг патології в іншому органі. Таким чином, регуляторний вплив екстрактів спрямовано на клітини органа, з якого вони були отримані, тому характер їх дії є органоспецифічним. Екстракт селезінки свиней сприяє нормалізації досліджених показників при цукровому діабеті, токсичному гепатиті, прискорює процес загоєння опікових ран.

Хронічне уведення щурам починаючи з 6-місячного віку екстрактів ксеноорганів не впливає на зміну маси тварин, обумовлену фізіологічними причинами. Концентрація ТБКАП в плазмі крові дослідних тварин достовірно не відрізнялась від цього показника у контрольних протягом усього строку спостереження (12 місяців). При уведенні суміші екстрактів 24-місячним щурам спостерігаються зниження активності пероксидації ліпідів в організмі та збільшення тривалості життя тварин.

За результатами проведених досліджень доведено, що використання суміші екстрактів печінки, селезінки та підшлункової залози свиней протягом 10 діб сприяє гальмуванню росту карциноми Герена в початковий період на 24,7%, якщо уведення починали відразу після трансплантації пухлини. При цьому збільшується тривалість життя щурів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи кріоконсервування фрагментів органів дозволяють створити банк кріоконсервованого матеріалу для клінічного застосування та наукових досліджень. Використання поліетиленоксидів як кріопротекторів дозволяє спростити процес кріоконсервування, тому що зникає необхідність у відмиванні матеріалу від кріопротектора розчинами цукрози.

Розроблений спосіб одержання екстрактів ксеногенних органів з використанням кріобіологічних технологій дозволяє не тільки збільшити кількість речовин пептидної природи, які виходять в розчин, але значно спростити та скоротити процес одержання екстрактів у порівнянні з відомими способами (Патент України № 64381 А).

Встановлений ефект зв’язування компонентів екстрактів з сироватковим альбуміном може розглядатися як один із специфічних механізмів транспортування біологічно активних речовин до відповідних тканин і органів. Результати досліджень можуть застосуватися при розробці методів терапії, заснованих на використанні сироваткового альбуміну як переносника біологічно активних компонентів екстрактів (Патент України № 11183). На основі даних дослідження впливу екстрактів підшлункової залози свиней на перебіг експериментального діабету було розроблено засіб для лікування цукрового діабету (Патент України № 6704). Отримані результати відносно біологічної дії екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки при дифузних захворюваннях печінки можуть бути використані при розробці препаратів для профілактики та лікування токсичного гепатиту і цирозу печінки. На основі екстракту селезінки свиней розроблено засіб для лікування ран (Патент України № 54055).

У зв’язку з тим, що екстракти зменшують рівень перекисного окислення ліпідів у організмі старих тварин і збільшують тривалість їх життя, вони можуть знайти використання в геріатричній практиці.

Встановлено, що досліджені екстракти сприяють гальмуванню росту карциноми Герена, збільшують тривалість життя експериментальних щурів. Одержані результати можуть бути основою для більш детальних досліджень термінів, методів застосування екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней і механізмів їх дії на ріст пухлин.

Особистий внесок здобувача. Основні результати досліджень, які наведені в дисертації, одержані здобувачем особисто. Автором дисертаційної роботи визначені тема, мета, задачі роботи та методи досліджень. Автор приймав безпосередню участь у проведенні експериментів. Статистична обробка, аналіз, інтерпретація та узагальнення одержаних результатів, а також формулювання основних положень і висновків проведені автором самостійно. При виконанні окремих розділів було отримано методичну та консультативну допомогу від зав. відділу, канд. мед. наук І.П. Висеканцева, ст. наук. співр., канд. біол. наук О.Ю. Семенченка, ст. наук. співр., канд. біол. наук Т.С. Дюбко (Інститут проблем кріобіології і кріомедицини), доцента, канд. мед. наук Т.В. Гануліч (Харківський державний медичний університет), ст. наук. співр., канд. біол. наук Н.Є. Узлєнкової (Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України).

В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1 -6, 11, 12] у виборі режимів і проведенні кріоконсервування; визначенні інтенсивності перекисного окислення ліпідів і показників біоенергетики в фрагментах органів;

- у роботах [7 - 10] в одержанні екстрактів, оцінці їх біологічної дії в експерименті;

- у роботах [13 - 17, 20, 23 - 26, 30, 31] в одержанні екстрактів; виборі методичних підходів; участі в моделюванні патологічних станів; експериментальному визначенні біологічної дії екстрактів;

- у роботах [21, 22, 32, 34] в одержанні екстрактів; виборі методичних підходів; проведенні експериментальних досліджень взаємодії компонентів екстрактів з альбуміном.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались та обговорювались на Науково-практичній конференції ”Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии" (Харьков, 1991); Conference Theoretical basis of cryopreservation (Hradek Kralove, 1992); Burn symposium on occasion of the 40-th anniversary of the Prague Burn Centre (with international participation) (Prague, 1993); Международном хирургическом конгрессе ”Раны, ожоги, повязки” (Тель-Авив, 1994); Proc. 3-rd Intern. Congress on Wound, Burn and Dressing (Tel-Aviv, 1994); Proc. I-st Intern. Congress on Biological Med (Tel-Aviv, 1994); I З’їзді українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харьків, 1995); IWA. International Wound association the 4-th International Congress (Tel-Aviv, 1996); CRYO’96 “The 33-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology” (Indianapolis, 1996); CRYO’97 “The 34-th Annual Meeting of the Society for Cryobiology” (Barcelone, 1997); "Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины" (Харьков, 1998); “Allograft against disability” 2-nd World Congress on Tissue Banking and 8-th International Conference of EATB" (Warsawa, 1999); Всеукраинской научной конференции “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины” (Харьков, 2001); Научно-практической конференции “Лекарства-человеку” (Харьков, 2001); Международной научно-практической конференции “Новые технологии применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002); Науково-практичній коференції "Сучасні напрямки розвитку ендокринології“ (Другі Данилевські читання) (Харків, 2003); Науково-практичній конференції ”Проблеми клітинної та тканинної трансплантології“ (Івано-Франківськ, 2003); "Cryobiomol, Low temperature biology" (Coimbra, 2003); Х Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Чернівці, 2004); III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004); Міжнародній науковій конференції “Каразинські природознавчі студії” (Харків, 2004); Международной научно-практической конференции “Применение лазеров в медицине и биологии” (Одесса, 2004); I Міжнародній науково-практичній конференції "Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок" (Тернопіль, 2004); III з'їзді трансплантологів України (Донецьк, 2004); Четвертих Данилевських читаннях "Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології" (Харків, 2005).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 61 науковій праці: 32 статтях, опублікованих в фахових наукових виданнях, 4 патентах, 2 методичних рекомендаціях і 23 тезах доповідей.

Структура дисертації. Робота викладена на 272 сторінках. Вона має вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи дослідження, отримані результати та їх обговорення), аналіз і узагальнення результатів, висновки. Список використаної літератури складає 487 джерел і викладений на 55 сторінках. Дисертація містить 31 рисунок та 52 таблиці.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експерименти проведені відповідно до "Загальних принципів експериментів на тваринах", схвалених II Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна) і узгоджених з положеннями "Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових цілей" (Страсбург, 1985).

В дослідженнях були використані фрагменти органів статевозрілих свиней та новонароджених поросят, а також водно-сольові екстракти, які одержували з кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів. Фрагменти печінки одержували шляхом продавлювання її шматочків через решітку з отворами діаметром 0,8 мм, а фрагменти підшлункової залози та селезінки - подрібнюючи шматочки органів ножицями. Маса фрагментів становила в середньому 2 – 5 мг.

Перед кріоконсервуванням до фрагментів органів по краплях додавали в співвідношенні 1:1 розчин кріопротектора подвійної концентрації, завись ретельно і обережно перемішували та розфасовували в поліетиленові ампули об'ємом 1,5 або 20 мл при заморожуванні зі швидкостями охолодження 1, 10 та 100єС/хв. При заморожуванні зі швидкостями охолодження 1000, 8000 та 80000єС/хв матеріал поміщали в контейнери з алюмінієвої фольги товщиною 30 мкм. Товщина заморожуваного шару становила 0,3 мм. Розмір контейнера 40х45 мм.

Заморожування фрагментів проводили за допомогою програмного заморожувача УОП-6 виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України (швидкості охолодження 1 та 10 єС/хв) до температури -70єС з наступним перенесенням в рідкий азот; зануренням поліетиленового контейнера або контейнера з алюмінієвої фольги в рідкий азот (швидкості охолодження 100 та 1000єС/хв відповідно) та за допомогою пристрою для заморожування біологічних об'єктів (8000 та 80000єС/хв), який дозволяє отримувати високі швидкості охолодження (Патент РФ № 1655426). Заморожений матеріал зберігали в рідкому азоті.

Матеріал відігрівали на водяній бані з температурою 37 – 40єС. Фрагменти відмивали від ПЕО-400 та ПЕО-1500 фізіологічним розчином, а від гліцерину та ДМСО - розчином сахарози тієї ж молярної концентрації що і кріопротектор.

Інтенсивність дихання вимірювали полярографічним методом (Е.Н. Мохова, 1978) на полярографі фірми Radelkis (Угорщина) в нмоль О2/хв/ мг тканини, швидкість відновлення фериціаніду калію - спектрофотометрично при довжині хвилі 420 нм (Л.Д. Лукьянова и др., 1982).

Екстракти одержували з нативних або кріоконсервованих фрагментів органів шляхом їх інкубації в фізіологічному розчині. Екстракти для дослідження молекулярно-масового розподілу пептидів отримували з фрагментів органів, кріоконсервованих в присутності 10%-го ПЕО-1500 зі швидкістю охолодження 1°С/хв. Ці ж екстракти використовували і в інших експериментальних дослідженнях.

Загальну концентрацію білків в екстрактах визначали модифікованим методом Лоурі (І.П. Кайдашев, 2003), концентрацію пептидів і нуклеотидів – спектрофотометричним методом при довжині хвилі 280 і 260 нм відповідно (Д. Уильямс, 1978). Молекулярно-масовий розподіл низькомолекулярних фракцій пептидної природи досліджували методом високоефективної гельпроникаючої хроматографії (Б.В. Столяров и др., 1998).

Для моделювання експериментального цукрового діабету статевозрілим щурам-самцям масою 180-210 г одноразово під шкіру вводили алоксан-моногідрат (ICN Biomedical Inc.) в дозі 130 мг/кг маси тіла тварини після попереднього 24-годинного голодування при вільному доступі до води. Критерієм цукрового діабету була концентрація глюкози в крові не менше 9 ммоль/л (А.С. Ефимов и др., 1981).

Токсичний гепатит викликали одноразовим уведення в черевну порожнину 40%-го розчину тетрахлорметану на вазеліновій олії в дозі 0,4 мл/100 г маси тіла тварини (І.П. Кайдашев, 2003). Цироз печінки моделювали введенням під шкіру 40%-го розчину тетрахлорметану в олії з персикових кісточок у дозі 0,2 мл на 100 г маси тіла тварин два рази на тиждень (Н.Х. Абдулаев и др., 1989). Всього було зроблено 16 ін’єкцій.

Термічний опік шкіри моделювали на щурах лінії Вістар масою 180 - 210 г (Б.А. Парамонов и др., 2002). Під поверхневим ефірним наркозом видаляли шерсть на спині. Опік викликали мідним аплікатором з діаметром 10 мм і температурою 100°С, експозиція - 40 сек.

Експериментальною моделлю росту пухлини була аденокарцинома Герена, штам якої був наданий Інститутом експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Трансплантацію пухлини проводили шляхом підшкірного уведення 0,5 мл 20%-ї суспензії клітин пухлини (Н.Е. Узленкова, 2002).

Дослідження впливу препарату при хронічному уведенні (1 раз на місяць) протягом року проводили на щурах лінії Вістар починаючи з 6-місячного віку. Старим щурам, тобто тим, які досягли 24-місячного віку, уводили суміш екстрактів протягом десяти діб.

Процеси вільнорадикального окислення оцінювали хемілюмінесцентним методом. Рівень перекисного окислення ліпідів визначали за рівнем ТБКАП в сироватці крові та тканинах органів спектрофотометричним методом (при довжині хвилі 532 нм), використовуючи стандартні методики (А.В. Арутюнян и др., 2000; С.Е. Овсянников и др., 1996).

Фрагменти підшлункової залози культивували в середовищі такого складу: 80% середовища 199, 10% ЕТС, 5% гідролізату лактальбуміна, 5% середовища Ігла, пеніцилін і стрептоміцин із розрахунку по 100 од/мл (Б.К. Гаврилюк, 1983). Вміст інсуліну в середовищі культивування визначали радіоімунологічним методом за допомогою наборів РИО-ИНС-ПГ-125J (м. Мінськ, Білорусь). Рівень глюкози в сироватці крові встановлювали натще хромооксигеназним методом з використанням набору фірми “Lachema” (Чехія). Активність АлАТ та АсАТ досліджували з використанням стандартних наборів АО „Реагент” (м. Дніпропетровськ).

Для гістологічного аналізу шматочки тканини фіксували в 10%-му нейтральному формаліні з подальшою заливкою в парафін. Одержані з парафінових блоків зрізи завтовшки 6-8 мкм фарбували гематоксиліном і еозином (О.В. Волкова и др., 1982). Мікрогемоциркуляцію в печінці вивчали методом вітальної мікроскопії за допомогою контактного мікроскопа Люмам К-1 (И.В. Слета, 2002).

Площу ран встановлювали планіметричним методом (І.П. Кайдашев, 2003). Для визначення ступеня обсіменіння рани і видової приналежності мікроорганізмів з поверхні рани відбирали біоптати та робили мазки. Виділення та ідентифікацію аеробної і анаеробної мікрофлори проводили за стандартними методиками (М.И. Кузин и др., 1990; Н.К. Коваленко и др., 2000).

Взаємодію екстрактів з альбуміном визначали спектрофлуориметричним методом на спектрофлуориметрі Varian Cary Eclipse (А.П. Демченко, 1988). Калориметричні вимірювання виконували на диференційному адіабатичному скануючому мікрокалориметрі ДАСМ-4 (А.В.Зинченко и др., 1977).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою пакета програм Statistica for Windows 5.1 (В.П. Боровиков и др., 1997).

Результати власних досліджень

Збереження фрагментів підшлункової залози поросят в залежності від умов кріоконсервування. До клітинного складу фрагментів підшлункової залози поросят входять переважно ацинарні та острівцеві клітини. Після отримання фрагментів звертає на себе увагу різний стан цих клітин: ацинарні клітини на гістологічних зрізах мають ознаки набряку, тоді як острівці складаються з характерних компактних сферичних клітин без ознак дистрофії. Оскільки підшлункова залоза цікавить дослідників з точки зору гормональної продукції, видалося доцільним вивчити стан її біоенергетики та здатності до інсулінпродукції. Було встановлено, що під час гіпотермічного зберігання фрагментів підшлункової залози протягом 15 год досліджені показники біоенергетики та перекисне окислення ліпідів залишаються на рівні контролю, а через 24 год спостерігається незначне пошкодження біологічного матеріалу. Інсулінпродукуюча функція фрагментів в момент вилучення залози і після 24 год зберігання при 4°С достовірно не відрізняється.

При культивуванні фрагментів протягом 5 - 7-и діб в умовах нормотермії спостерігається масова загибель ацинарних клітин при збільшенні кількості ендокринних. В цей строк фрагменти адекватно реагували на глюкозне навантаження та його відміну.

Фрагменти кріоконсервували на 5-7 му добу культивування при 37 оС. Матеріал після еквілібрації з кріопротектором протягом 15 хв при кімнатній температурі витримували 5 хв на водяній бані з температурою 0оС і заморожували під захистом кріопротекторів ДМСО, гліцерину, ПЕО-400 або ПЕО-1500 у 10%-й концентрації. Інтенсивність ендогенного дихання, а також сполученість дихання та окислювального фосфорилювання - важливі показники стану фрагментів органів, адже значна частина біологічних процесів є енергозалежною. Виявилося, що краще збереження інтенсивності ендогенного дихання деконсервованих фрагментів забезпечують ДМСО та ПЕО-1500, причому ПЕО-1500 є ефективним в більш широкому діапазоні швидкостей охолодження, в той час як ДМСО проявляє кріопротекторну активність при низьких швидкостях охолодження (1оС/хв). Кількість ТБКАП в деконсервованому матеріалі збільшується незначно, що може свідчити про здатність антиоксидантних систем запобігати неконтрольованому розвитку перекисного окислення ліпідів.

Дані, представлені в табл. 1, показують, що при культивуванні розмороженого матеріалу спостерігаються як адекватна відповідь на глюкозне навантаження так і зменшення інсулінпродукції після видалення глюкози з середовища. Таким чином, деконсервованим фрагментам підшлункової залози поросят притаманна висока життєздатність і функціональна активність.

Таблиця 1

Інсулінпродукуюча здатність (мкОд/г/год) культур фрагментів підшлункової залози поросят після кріоконсервування

Умови експерименту | Продукція інсуліну

базальна | Індукована

глюкозою | базальна після індукованої

Контроль | 174,1±12,8 | 612,7±42,5 | 202,4±14,1

ДМСО | 204,1±18,3 | 641,5±51,8 | 224,3±21,6

ПЕО-1500 | 207,9±20,5 | 678,5±56,2 | 207,7±19,5

Примітка. Відмінності від контролю при всіх умовах експерименту статистично недостовірні, р<0,05.

Вплив умов кріоконсервування на збереження фрагментів печінки поросят та свиней. В момент отримання фрагментів печінки поросят інтенсивність їх ендогенного дихання і дихання в присутності дінітрофенолу (ДНФ) досить висока (табл. 2).

Кріоконсервування фрагментів призводить до достовірного порівняно з контролем зменшення цих показників відразу після відігріву при всіх досліджених режимах заморожування. Ендогенне дихання фрагментів в контролі через 60 хв зменшується до 0,51±0,05 нмоль О2/хв/мг тканини. Одночасно зменшується і сполученість дихання з окислювальним фосфорилюванням. Після отримання фрагментів відношення VДНФ/VО становило 2,81, а через 60 хв - 2,39. Таке значення досить високе для тканинних препаратів (Л.Д. Лукьянова, 1982). В цей термін інтенсивність ендогенного дихання кріоконсервованих фрагментів статистично достовірно не відрізняється від ендогенного дихання в контролі незалежно від швидкості охолодження і використаного кріопротектора. Відношення дихання, стимульованого ДНФ, до ендогенного, в кріоконсервованих фрагментах знаходиться в межах 2,31–2,41, а в контролі становить 2,39. Отже, в цей термін спостереження досліджені показники біоенергетики не відрізняються від контрольних значень. В контролі на 120-ту хвилину у порівнянні з 60-ю

Таблиця 2

Інтенсивність ендогенного дихання (VО), та дихання в присутності ДНФ (VДНФ) (нмоль О2/хв/мг тканини) фрагментів печінки поросят в залежності від умов кріоконсервування та часу інкубації

Час інкубації,

хв |

Показник |

Конт-роль | Кріопротектор та швидкість охолодження

ПЕО-400 | ПЕО-1500

1ОС/хв | 8000ОС/хв | 1ОС/хв | 8000ОС/хв

5 | VО | 0,72±

0,61 | 0,34±

0,03 | 0,48±

0,04 | 0,33±

0,02 | 0,46±

0,04

VДНФ | 2,21±

0,20 | 0,41±

0,03 | 0,67±

0,05 | 0,30±

0,03 | 0,58±

0,05

VДНФ/VО | 2,81 | 1,21 | 1,40 | 0,91 | 1,21

60 | VО | 0,51±

0,05 | 0,45±

0,04* | 0,49±

0,05* | 0,42±

0,04* | 0,48±

0,04*

VДНФ | 1,22±

0,10 | 1,04±

0,09* | 1,13±

0,10* | 0,97±

0,091 | 1,18±

0,11*

VДНФ/VО | 2,39 | 2,36 | 2,31 | 2,40 | 2,41

120 | VО | 0,48±

0,04 | 0,36±

0,03* | 0,38±

0,03* | 0,32±

0,03 | 0,30±

0,03

VДНФ | 0,67±

0,05 | 0,46±

0,05 | 0,48±

0,04 | 0,39±

0,03 | 0,37±

0,02

VДНФ/VО | 1,39 | 1,29 | 1,27 | 1,21 | 1,23

Примітка. * - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з

контролем, р > 0,05.

спостерігається незначне зменшення ендогенного дихання. Але стимуляція дихання ДНФ значно зменшується. В фрагментах, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500, інтенсивність ендогенного дихання достовірно менша, ніж в контролі. Якщо ж використовувався кріопротектор ПЕО-400, то цей показник достовірно не відрізняється від контролю. Але стимуляція дихання в усіх випадках незначна.

Інтенсивність ендогенного дихання фрагментів печінки свиней в момент отримання була менша, ніж фрагментів печінки поросят, і становила 0,54±0,03 нмоль О2/хв/мг тканини, але відношення VДНФ/VО досить високе, і становить 2,41. Кріоконсервування цього матеріалу також призводить до значного зменшення ендогенного дихання і сполучення дихання та окислювального фосфорилювання. При незмінному ендогенному диханні нативного матеріалу через 60 хв спостерігається його відновлення в кріоконсервованих фрагментах. В кріоконсервованих фрагментах також збільшується відношення VДНФ/VО. В цей термін досліджені показники дихання в кріоконсервованих фрагментах статистично достовірно не відрізняються від таких показників в контролі. На 120-ту хв в кріоконсервованому матеріалі показники дихання зменшуються більш швидкими темпами, ніж в контролі. І тільки інтенсивність ендогенного дихання фрагментів печінки свиней, кріоконсервованих у присутності ПЕО-400 зі швидкістю охолодження 8000ОС/хв, залишається на рівні контролю.

Дослідження дії аміталу на НАД-залежну ділянку окислення дає інформацію про направленість метаболічного потоку в клітині. Встановлено, що ця частина дихання в кріоконсервованих фрагментах залишається практично незмінною протягом 120 хв спостереження.

У модельних ситуаціях для дослідження обміну відновними еквівалентами тканинних препаратів із зовнішнім середовищем використовується непроникаючий в клітини акцептор електронів – фериціанід калію, за допомогою якого можна оцінити активність НАДФН-регенеруючих систем. Одразу після відігріву матеріалу і протягом 60 хв швидкість його відновлення фрагментами печінки не відрізняється від такої у контролі при усіх режимах кріоконсервування. Цей показник на 120-ту хвилину спостереження не відрізняється від контролю тільки в фрагментах печінки при їх кріоконсервуванні в присутності ПЕО-400.

Одержані нами дані свідчать про те, що кріоконсервування активує процеси перекисного окислення ліпідів у фрагментах печінки свиней: накопичення ТБКАП проходе більш швидкими темпами, хоча на 60-ту хвилину після відігріву в фрагментах, кріоконсервованих під захистом ПЕО-400, в окремих випадках цей показник не перевищує контрольних величин.

Збереження фрагментів селезінки свиней після їх кріоконсервування в присутності поліетиленоксидів. Як видно з наведених даних (табл. 3), ендогенне дихання фрагментів селезінки, заморожених зі швидкістю охолодження 1°С/хв, статистично достовірно не відрізняється від контролю. При додаванні ДНФ спостерігаються незначна стимуляція дихання, а, отже, і незначне сполучення дихання та окислювального фосфорилювання як в контролі, так і в деконсервованих фрагментах. На 60-ту хвилину спостереження при незмінній інтенсивності ендогенного дихання в контролі спостерігається збільшення відношення VДНФ/VО до 1,9, в кріоконсервованих фрагментах селезінки – до 1,8-1,9, що свідчить про збільшення сполученості дихання та окислювального фосфорилювання. На 120-ту хвилину спостереження відмічається значне падіння досліджених показників біоенергетики як в контролі, так і в кріоконсервованих фрагментах селезінки. Отже, біоенергетика кріоконсервованих фрагментів селезінки змінюється в процесі інкубації матеріалу таким же чином, як і контрольних. Одночасно кількість ТБКАП в кріоконсервованих фрагментах зберігається на рівні контролю до 60-ї хвилини інкубації, але на 120-ту хвилину цей показник різко збільшується і статистично достовірно перевищує значення норми. В цей же час відмічалося значне зменшення досліджуваних показників біоенергетики.

Таблиця 3

Інтенсивність ендогенного дихання (VО) та дихання в присутності ДНФ (VДНФ)

нмоль О2/хв/мг тканини) фрагментів селезінки свиней в залежності від умов

кріоконсервування та часу інкубації

Час інкубації,

хв |

Показник |

Контроль | Кріопротектор та швидкість охолодження

ПЕО-400 | ПЕО-1500

1ОС/хв | 1000ОС/хв | 1ОС/хв | 1000ОС/хв

5 | VО | 0,39±0,03 | 0,35±

0,041 | 0,27±0,02 | 0,32±

0,031 | 0,23±0,02

VДНФ | 0,62±0,05 | 0,49±

0,03 | 0,32±0,03 | 0,48±

0,04 | 0,32±0,02

VДНФ/VО | 1,6 | 1,4 | 1,2 | 1,5 | 1,4

60 | VО | 0,32±0,02 | 0,30±

0,031 | 0,28±0,021 | 0,29±

0,031 | 0,23±0,02

VДНФ | 0,61±0,05 | 0,57±

0,051 | 0,50±0,041 | 0,52±

0,051 | 0,46±0,041

VДНФ/VО | 1,9 | 1,9 | 1,8 | 1,8 | 1,9

120 | VО | 0,21±0,02 | 0,15±

0,01 | 0,09±0,01 | 0,10±

0,01 | 0,11±0,01

VДНФ | 0,29±0,02 | 0,20±

0,02 | 0,10±0,01 | 0,12±

0,01 | 0,13±0,01

VДНФ/VО | 1,4 | 1,3 | 1,1 | 1,2 | 1,2

Примітка. 1 - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з

контролем, р > 0,05.

Дослідження залежності складу екстрактів від умов кріоконсервування фрагментів органів. Вікова та органна специфічність екстрактів. Однією з задач, що виникають при одержанні екстрактів із ксеноорганів, є задача одержання препарату з максимально можливим вмістом біологічно активних речовин, особливо пептидної природи. Ми вивчали концентрацію білка, пептидів і нуклеотидів в екстракті, який одержували з кріоконсервованих фрагментів селезінки, печінки та підшлункової залози свиней, а також печінки та підшлункової залози новонароджених поросят у залежності від кріопротектора та його концентрації.

Мінімальний вихід білка в розчин спостерігається при інкубації фрагментів, що не піддавалися заморожуванню, або заморожених у присутності 10-и або 20-и процентів ПЕО–1500, а максимальний – при заморожуванні в присутності 10%-го ДМСО. З даних, наведених в табл. 4, видно, що мінімальний вихід пептидів у розчин спостерігається в випадках, коли екстракт отримували з некріоконсервованих фрагментів (контроль).

Таблиця 4

Концентрація пептидів (мкг/мл) у супернатанті в залежності від джерела фрагментів, кріопротектора та його концентрації. Швидкість охолодження 1°С/хв

Джерело фрагментів | Кріопро-тектор | Концен-трація, % | Час інкубації, хв

30 | 60 | 90

Селезінка

свиней | Контроль | 20,41,3 | 42,73,5 | 51,24,11

ДМСО | 10 | 43,83,2 | 68,75,1 | 71,95,91

20 | 54,64,0 | 74,65,9 | 74,66,11

ПЕО-1500 | 10 | 56,73,93 | 85,46,73 | 88,26,51

20 | 61,04,7 | 92,87,43 | 106,47,21,3

Печінка

свиней | Контроль | 16,00,9 | 17,01,1 | 20,02,31

ДМСО | 10 | 16,81,2 | 29,34,4 | 37,92,71

20 | 27,01,72 | 41,73,22 | 53,34,91,2

ПЕО-1500 | 10 | 36,72,6 | 62,24,03 | 67,33,41,3

20 | 29,72,3 | 72,23,83 | 71,74,71,3

Підшлункова залоза

свиней | Контроль | 26,22,0 | 38,32,9 | 47,52,8

ДМСО | 10 | 31,32,7 | 51,52,4 | 62,33,9

20 | 36,82,9 | 61,53,5 | 66,23,31

ПЕО-1500 | 10 | 54,33,9 | 87,33,63 | 97,04,01,3

20 | 64,73,4 | 97,38,73 | 102,37,61,3

Примітки: 1 – відмінності статистично недостовірні в порівнянні з попереднім строком спостереження, р > 0,05; 2 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з концентрацією кріопротектора 10%, р < 0,05; 3 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з тією ж концентрацією ДМСО, р < 0,05.

Максимальна концентрація пептидів у супернатанті спостерігалася в тому випадку, коли фрагменти кріоконсервували в присутності ПЕО-1500. Вихід цих речовин в розчин не залежав від використаних концентрацій кріопротектора. Але їх концентрація достовірно зростала при збільшенні строку інкубації з 30 до 60 хв. Збільшення цього строку до 90 хв не призводило до статистично достовірного збільшення концентрації пептидів.

Динаміка виходу нуклеотидів із кріоконсервованих фрагментів органів свиней нагадує динаміку виходу пептидів в залежності від використаного кріопротектора та його концентрації.

Вихід білків і нуклеотидів з кріоконсервованих фрагментів печінки та підшлункової залози новонароджених поросят в залежності від використаного кріопротектора, його концентрації та часу інкубації принципово не відрізняється від наведених вище результатів для фрагментів органів статевозрілих свиней. Вихід пептидів в розчин із контрольних та кріоконсервованих в присутності ПЕО-1500 фрагментів органів новонароджених поросят дещо вищий, ніж з фрагментів органів свиней. При цьому вихід пептидів з кріоконсервованих фрагментів значно вищий, ніж з нативних. Збільшення часу інкубації до 90 хв не призводить до збільшення концентрації пептидів у порівнянні з інкубацією 60 хв.

Отже, максимальний вихід речовин пептидної природи спостерігається у випадку, коли екстракт одержується із фрагментів, кріоконсервованих в присутності ПЕО–1500. В подальших дослідженнях використовувались саме такі екстракти.

Аналізуючи хроматограми екстракту печінки свиней і екстракту печінки поросят, можна відмітити, що поліпептидний склад цих екстрактів відрізняється як якісно, так і кількісно (рис. 1).

Встановлено, по-перше - екстракт кріоконсервованих фрагментів печінки поросят має меншу кількість фракцій, по-друге – в ньому значно менша кількість пептидів з м.м., яка перевищує 10000 (пік 1). На хроматограмі екстракту печінки свиней ця фракція становить 42,6%, а на хроматограмі екстракту печінки поросят – 3,7%. Другою за величиною в екстракті печінки свиней є фракція з м.м. 1270, питома площа якої становить 21,6% (пік 8), а на хроматограмі екстракту печінки поросят вона відсутня. В цьому екстракті найбільшу фракцію становлять поліпептиди з м. м. 1100 (пік 6). Інші фракції значно менші. В екстракті печінки поросят також відсутні поліпептиди з м.м. меншою 800, які в екстракті печінки свиней виявляються (піки 11 та 12).

Екстракт підшлункової залози свиней відрізняється від екстракту підшлункової залози поросят незначною кількістю пептидів з м.м. більшою за 10000 (питома площа фракції – 3,4%) і доволі значною кількістю пептидів з м.м. 500 (13,4%).

Також виявляється досить значна кількість пептидів з м.м. 1080 та 800. Звертаючи увагу на фракції, які містять велику кількість пептидів, слід враховувати незначну кількість пептидів інших фракцій. Відомо, що біологічна дія регуляторних пептидів і деяких інших речовин in vitro та in vivo виявляється при незначних концентраціях їх концентраціях (Е.И. Григорьев и др., 2003).

Хроматограма екстракту селезінки свиней