НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

ГРИНЕНКО Тетяна Вікторівна

УДК 577.151.4

РЕГУЛЯЦІЯ ФІБРИНОЛІЗУ НЕКАТАЛІТИЧНИМИ

ДІЛЯНКАМИ МОЛЕКУЛ ПЛАЗМІНОГЕНУ/ПЛАЗМІНУ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий консультант – доктор біологічних наук, професор

КУДІНОВ Станіслав Олександрович,

завідувач відділу хімії та біохімії ферментів

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

КОЗЛОВ Едуард Андрійович,

старший науковий співробітник відділу

біохімічної генетики Інституту молекулярної біології

і генетики НАН України;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ЛІСНЯК Іван Олексійович,

провідний науковий співробітник відділу клітинної

фотобіології та фотомодуляції пухлинного росту

Інституту експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ЛУГОВСЬКОЙ Едуард Віталійович,

головний науковий співробітник відділу молекулярної

імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України.

Захист відбудеться 24 грудня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої

вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

(01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 22 листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дослідження складнопідпорядкованих багатокомпонентних ферментних систем організму, таких як зсідаюча та фібринолітична системи крові, є однією з важливих проблем сучасної біохімії.

Між системами зсідання крові та фібринолізу існує динамічна рівновага, порушення якої приводить до тромбоутворення або геморагій, наслідком чого є серцево-судинні захворювання різного ступеня складності. Вивчення багатьох механізмів, що забезпечують васкулярний кровоток, а в разі необхідності – зупинку кровотечі, є необхідною умовою розуміння закономірностей виникнення різних захворювань та розробки стратегії їх лікування.

Дослідження біохімічних механізмів функціонування цих систем має важливе теоретичне значення для вирішення проблем ензимології та білкової хімії, а саме: міжмолекулярного розпізнавання та комплексоутворення молекул, взаємозв’язку між структурою та функцією білка, селективності дії, багатофункціональності та регуляції активності ферментів.

Фібринолітична система забезпечує рідинний стан крові та розчинення фібринових згустків. До ії складу входять проферменти, ферменти, активатори, інгібітори та модуляторні білки. Ключовим ферментом є плазмін, який виконує фібринолітичну функцію. В плазмі крові він циркулює як неактивний попередник плазміноген.

Для плазмін(оген)у характерна мультидоменна структурна організація. В кринглових доменах, що розташовані в некаталітичній частині молекули, містяться специфічні центри міжбілкових взаємодій, які можуть відігравати важливу роль в функціонуванні та регуляції активності плазмін(оген)у.

Механізм селективності руйнування фібрину плазміном в плазмі крові, який обгрунтовано Wiman, Collen ще в 1978 р., і сьогодні є загальноприйнятим. Він базується на активації плазміногену на поверхні фібрину, дії плазміну в межах фібринового згустка та інгібуванні вільного плазміну б2-антиплазміном.

Процес фібринолізу складається з послідовних етапів: взаємодії плазміногену та тканинного активатора з фібрином, активації плазміногену до плазміну на поверхні фібрину, гідролізу фібрину до розчинних фрагментів, інгібування плазміну, що вивільняється у кровоток, б2-антиплазміном.

Фізіологічний фібриноліз контролюється численними взаємодіями між окремими компонентами фібринолітичної системи.

Вирішальне значення білок-білкових взаємодій для фібринолітичного процесу ставить важливу в теоретичному і практичному плані проблему визначення функціональної ролі окремих структур білкових молекул фібринолітичної системи, насамперед плазміногену/плазміну, в механізмах комплексоутворення і регуляції багатостадійного процесу фібринолізу.

Плазмін, крім своєї основної функції – гідролізу фібрину, приймає участь у багатьох фізіологічних та патологічних процесах в організмі: міграції клітин, диференціації та ремоделюванні тканин, інвазії та метастазуванні. Багатофункціональність плазміну потребує з’ясування молекулярних механізмів, що регулюють його активність при взаємодії з іншими білками.

Незважаючи на досягнуті успіхи у вивченні механізму фібринолізу, залишаються не з’ясованими важливі питання щодо експонування та ролі комплементарних центрів взаємодії плазміногену/плазміну з фібриногеном/ фібрином під час гідролізу, залежність таких взаємодій від конформації молекул, участі певних ділянок зв’язування молекул плазміногену/плазміну на окремих етапах фібринолітичного процесу, зміни активності плазміну та можливості контактної активації плазміногену в комплексі з іншими білками. Вирішення цих питань є необхідною умовою розуміння як механізмів регуляції фібринолізу, так і загальних принципів регуляції активності протеолітичних ферментів на рівні білок-білкових взаємодій. Визначення ділянок молекул, що є важливими для їх функціонування, відкриває можливості активно впливати на опосередковані ними процеси.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділах хімії та біохімії ферментів і структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України по ДНТП „Біохімія тварин і людини”(шифр 2.28.4) за бюджетними темами: „Дослідження білок-білкових взаємодій компонентів фібринолітичної системи” (1983-1987 рр.), ДР № 01830064150; „Дослідження молекулярного механізму дії та регуляції фібринолітичної системи” (1988-1992 рр.), ДР № 01880076299; „Вивчення механізму регуляції фібринолітичного процесу на етапі утворення фрагментів молекул та їх комплексів” (1993-1996 рр.), ДР № 01930012959; „Вивчення структурної організації та функції тромбоцитарного інтегрину GPIIbIIIa та інших білків системи гемостазу” (1995-1997 рр.), ДР № 0195U002946; „Вивчення механізму активації ключових проферментів системи фібринолізу та гемостазу активаторами непрямої дії” (1998-2000 рр.), ДР № 0198U00345; „Вивчення молекулярних механізмів регуляції активації проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в нормі та при патології” (2001-2003 рр.), ДР № 0101U000103; „Вивчення механізму активації плазміногену низькомолекулярною стрептокіназою та ролі фібрину у забезпеченні цього процесу” (2002-2004 рр.), ДР № 0102U000626 і „Вивчення механізмів регуляції та взаємодії компонентів системи зсідання крові та фібринолізу з судинно-тромбоцитарною ланкою системи гемостазу” (2004-2008 рр.), ДР № 0104U003276. У всіх зазначених темах здобувач приймав участь як відповідальний виконавець.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування механізмів регуляції фібринолітичного процесу на рівні білок-білкових взаємодій за участі некаталітичних ділянок молекули плазміногену/плазміну.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні задачі:–

дослідити взаємодію плазміногену з фібриногеном, фібрином та їх фрагментами, визначити доменну локалізацію плазміноген-зв’язувальних ділянкок на молекулі фібриногену/фібрину;–

визначити роль ліганд-зв’язувальних ділянок плазміногену/плазміну в регуляції швидкості гідролізу фібриногену/фібрину, активації плазміногену та інгібуванні плазміну;–

з’ясувати можливість контактної активації нативної форми плазміногену в комплексі з фрагментом Е фібриногену;–

визначити регуляторну дію б2-антиплазміну у фібринолізі; –

з’ясувати механізм зміни активності плазміну в комплексі з активаторами непрямої дії;

– розробити способи кількісного визначення основних компонентів фібринолітичної системи в плазмі крові.

Об’єкт дослідження. Фібринолітична система плазми крові та процес фібринолізу.

Предмет дослідження. Молекулярні механізми комплексоутворення білків фібринолітичної системи в регуляції процесу фібринолізу.

Наукова новизна отриманих результатів. В результаті проведених досліджень визначено функціональну роль некаталітичних ділянок певних доменів молекули плазміногену/плазміну на всіх етапах процесу фібринолізу. Установлено, що вони забезпечують взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/фібрином, визначають швидкість процесів руйнування фібринового згустка плазміном, активації плазміногену та інгібування плазміну.

Вперше визначено доменну локалізацію та відповідність центрів комплексоутворення молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/ фібрину.

Вперше обгрунтовано та доведено, що швидкість гідролізу фібрину плазміном визначається послідовністю взаємодій молекул ферменту та субстрату за участі комплементарних центрів. Ключовими етапами гідролізу є полімеризація фібрину, що забезпечує ініціацію процесу, та початкові стадії, на яких відбувається підвищення швидкості гідролізу.

Під час полімеризації в D доменах молекул фібрину експонуються центри взаємодії з кринглом 5 плазміногену. Глу-плазміноген, зв’язуючись з ними, переходить у частково відкриту конформацію, що обумовлює його активацію тканинним активатором і початок гідролізу.

На стадії розщеплення С-доменів фібрину на них утворюються нові центри взаємодії з кринглом 4. Глу-плазміноген, зв’язуючись з ними, переходить у повністю відкриту конформацію, що забезпечує його взаємодію кринглом 1-3 з відповідними центрами молекул фібрину тієї самої або суміжних протофібрил. При цьому новоутворені центри вивільняються для наступних молекул. В такий спосіб в місцях первинного зв’язування плазміногену на фібрині за утворення обмеженої кількості нових центрів відбувається підвищення локальної концентрації плазміногену, що приводить до збільшення швидкості його активації та швидкості гідролізу фібрину.

Сформульовано положення, що взаємодія ділянок зв’язування різної спорідненості молекул плазміну з відповідними центрами молекул субстрату забезпечує переміщення ферменту по DDE-тріадам протофібрил та орієнтацію активного центра на гідроліз неупорядкованих ділянок в суперспіралізованій міждоменній частині молекул фібрину, внаслідок чого розщеплення протофібрил є строго спрямованим процесом.

Вперше показано існування неферментативного шляху активації Глу-плазміногену Е-фрагментом фібриногену. Плазмін в комплексі з Е-фрагментом інгібується б2-антиплазміном, тому наслідком активації може бути зменшення локальної концентрації потенційно активного плазміногену в кров’яному згустку.

Установлено багатоцентрову взаємодію б2-антиплазміну з лізин-зв’язувальними ділянками кринглових доменів та протеїназним доменом плазміну, що забезпечує ефективність дії інгібітора. Вперше доведено, що б2-антиплазмін є регулятором фібринолітичного процесу, він контролює швидкість гідролізу полімерного фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.

Вперше показано, що лізин-зв’язувальні ділянки кринглових доменів плазміногену приймають участь у всіх етапах активації плазміногену стрептокіназою: утворенні еквімолярного комплексу, формуванні активного центра, взаємодії активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.

Обґрунтовано, що в основі регуляції функціональної активності плазміногену/плазміну за участі ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів лежать тонкі структурні відмінності між окремими центрами зв’язування, багатоцентровість взаємодій, злагоджена одночасна дія декількох центрів зв’язування, конформаційна мінливість молекули та можливість переключення внутрішньомолекулярних взаємодій на міжмолекулярні.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати щодо конкретизації ділянок молекул плазміногену та фібрину, які мають провідне значення для активації фібринолітичної системи та руйнування згустків фібрину, є передумовою пошуку нових підходів для регуляції процесу фібринолізу та інших процесів, пов’язаних з перетворенням плазміногену на плазмін.

Виявлені особливості низькомолекулярної стрептокінази, а саме: ефективність активації асоційованого з фібрином плазміногену, низька активаторна активність у розчині та відсутність протекторної дії за інгібування плазміну 2-антиплазіном, що поясняють фібрин-селективну дію низькомолекулярної стрептокінази, можуть бути теоретичним обґрунтуванням для розробки нового ефективного тромболітичного препарату направленої дії на основі стрептокінази.

Запропоновано способи кількісного визначення в плазмі крові основних компонентів фібринолітичної системи: плазміногену, тканинного активатора плазміногену, б2-антиплазміну, а також антистрептокіназних антитіл, що базуються на використанні фізіологічного субстрату плазміну – фібрину і можуть бути використані в медичній практиці для характеристики загального фібринолітичного потенціалу, контролю за ефективністю тромболітичної терапії, визначення функціонально активних білків та виявлення низькомолекулярних похідних плазміногену/плазміну.

Запропоновано афіннохроматографічний метод виділення б2-антиплазміну, який запатентовано.

Отримані автором результати досліджень використано в курсі лекцій з дисципліни „Функціональні властивості білків” навчальної програми кафедри біохімії, філіал – біотехнологія біологічного факультету Київського університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1983-2007 рр. Дисертантом особисто обгрунтовано основну проблему та завдання роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, проведено пошук та аналіз даних літератури. Самостійно синтезовано афінні сорбенти, одержано всі необхідні для дослідження білки та їх фрагменти. Більшість досліджень, результати яких представлено в експериментальній частині роботи, виконані автором особисто. Дослідження взаємодії плазміногену з фрагментами фібриногену проведено за співучасті з інж. В.Г. Третяченко. Вивчення швидкості гідролізу фібриногену плазміном та фібрину плазміногеном, активованим тканинним активатором, виконано разом з інж. Е.М. Золотарьовою та пров. інж. О.В. Скоморовською. Вивчення впливу б2-антиплазміну на активацію плазміногену тканинним активатором та взаємодію інгібітора з фрагментами фібриногену проведено за співпраці з м.н.с. М.Б. Задорожньою. Кінетику активації плазміногену та його похідних стрептокіназою досліджено за співучасті з м.н.с. Л.І. Соколовською. Дослідження протекторної дії стрептокінази та розробку способу визначення антистрептокіназних антитіл в плазмі крові проведено у співпраці з н.с. О.І. Юсовою. Основні теоретичні положення, що виносяться на захист, висунуто та обгрунтовано дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень дисертації були представлені на науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (2005 р.), V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987 р.), VІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992 р.), VІІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.), ІV Всесоюзному симпозіумі „Инженерная энзимология” (Київ, 1983 р.), ІІІ симпозіумі „Химия протеолитических ферментов” (Москва, 1993 р.), IV симпозіумі СРСР-Італія „Макромолекулы в функционирующей клетке” (Київ, 1984 р.), XVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Єрусалим, Ізраїль, 1995 р.), XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Хамамацу, Японія, 2000 р.), міжнародному симпозіумі „Гемостаз – проблеми та перспективи” (Київ, 2002 р.), second Product biotechnology meeting (Курасао, Антильські острови, Нідерланди, 2003 р.), першій Українській конференції „Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування” (Київ, 2004), науково-практичній конференції „Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005 р.), 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Сан-Дієго, США, 2006 р.), XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Женева, Швейцарія, 2007 р.).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 45 друкованих праць, в тому числі 31 стаття, з яких 26 у наукових фахових виданнях, 1 патент та 13 тез у збірках наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, основної частини, що включає огляд літератури, експериментальну частину (2 розділи), заключення, висновків, списку використаних літературних джерел (508 найменувань). Роботу викладено на 307 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 94 рисунками, 14 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасні дані про структурну організацію та функціональні властивості основних компонентів фібринолітичної системи, а саме: плазміногену, плазміну; ендогенних та екзогенних активаторів – тканинного активатора, урокінази та стрептокінази; інгібітора плазміну – б2-антиплазміну. Особливої уваги приділено структурі, специфічності та функціональній ролі ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів плазміногену, конформаційним перебудовам молекули проферменту. Узагальнено дані про роль фібрину у фібринолітичному процесі, білок-білкові взаємодії в механізмах ініціації та регуляції фібринолізу.

Матеріали та методи досліджень. Glu-плазміноген та Ліз-плазміноген виділяли відповідно з плазми крові донорів і фракції ІІІ2,3 по Кону шляхом афінної хроматографії на лізин-сефарозі 4В (Deutch, Mertz, 1970).

Фрагменти плазміногену – крингл 1-3, крингл 4 і міні-плазміноген одержували з еластазного (Sottrup-Jensen et al., 1978), тоді як мікро-плазміноген – з плазмінового (Shi, Wu, 1988) гідролізатів Ліз-плазміногену.

Плазмін, міні- та мікро-плазмін одержували за активації Глу-плазміногену, міні- та мікро-плазміногену урокіназою, що була іммобілізована на сефарозі 4В (Norman et al., 1985).

Фібриноген виділяли з оксалатної плазми крові бика шляхом фракційного висолювання сульфатом натрію (Варецька та ін., 1961).

ДезААВВ фібрин одержували, обробляючи фібриноген тромбіном (Pozdnjakova et al., 1979) та розчиняючи утворені фібринові згустки в 0,02 М оцтовій кислоті. Для інактивації фактора XIIIа та видалення плазміногену процедуру проводили за присутності пара-хлормеркурійбензоату натрію (п-ХМБ) та 6-аміногексанової кислоти (6-АГК).

Фрагменти фібриногену, DH- та Е-фрагменти отримували з плазмінового гідролізату фібриногену на КМ-сефадексі G-50 (Белицер, 1972). DL-фрагмент – пепсиновим гідролізом DH-фрагмента (Medved, 1988 ). DLа-фрагмент – плазміновим гідролізом фібриногену в присутності фізіологічної концентрації іонів кальцію (Medved, 1986). D-D – з плазмінового гідролізату стабілізованого фактором ХІІІа фібрину шляхом гель-фільтрації на сефакрилі S-300 з послідуючою доочисткою на КМ-сефадексі G-50 (Белицер и др. 1986).

б2-Антиплазмін одержували з виснаженої на плазміноген та гістидин-збагачений білок плазми крові донорів на кринглі 1-3 (форма ІІ)-сефарозі.

Стрептокіназу (Kabikinase, Швеція) очищали від альбуміну на цибакрон-сефарозі CL-6B (Castellino et al., 1976).

Фрагмент стрептокінази з молекулярною масою 36 кДа виділяли препаративним електрофорезом з б-хімотрипсинового гідролізату стрептокінази (Корольчук, 2000).

Моноклональне антитіло IV-1c до Глу-плазміногену людини виділяли з супернатантів гібридомних клітин, одержаних у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, на плазміноген-сефарозі.

Антистрептокіназні антитіла одержували із сироватки крові людей, які пройшли курс лікування стрептокіназою, на протеїн-А сефарозі з подальшою доочисткою на стрептокіназ-сефарозі.

Протеолітичну активність плазміну і потенційну – плазміногену визначали казеїнолітичним методом (Robbins, Summaria, 1979) та за кількістю аміногруп, що вивільняються протягом гідролізу казеїну (Кастрикіна та ін., 1981).

Амідазну активність плазміну визначали з використанням хромогенного субстрату S2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-нітроаніліну гідрохлорид) за методом виробника (Kabi Diagnostica).

Фібриногенолітичну активність плазміну визначали за кількістю продуктів гідролізу фібриногену, що втрачали здатність утворювати фібриновий згусток.

Гідроліз фібрину визначали турбідиметричним методом (Bouvier, 1975) та методом фібринових пластин (Haverkate, 1975).

Швидкість гідролізу 125І-фібриногену визначали за кількістю утворених фрагментів, вимірюючи радіактивінсть відповідних їм електрофоретичних зон.

Інгібіторну активність б-2-антиплазміну визначали за здатністю гальмувати амідолітичну активність плазміну.

Кінетику інгібування плазміну та його похідних б2-антиплазміном, активацію Glu-плазміногену тканинним активатором та стрептокіназою вивчали з використанням специфічного хромогенного субстрату плазміну S2251.

Взаємодію білків досліджували декількома способами: зв’язування Глу- та Ліз-плазміногену з фібриногеном та його фрагментами, іммобілізованими на сефарозі 4В, – методом рівноважної афінної сорбції; плазміногену з фібрином, – визначаючи кількість білка, що специфічно зв’язується з фібриновим згустком під час його утворення; мічених біотином б2-антиплазміну з плазміном, тканинним активатором плазміногену, фрагментами плазміногену та фібриногену/фібрину, а також стрептокінази з плазміном і фрагментами плазміногену та плазміногену з фібриновими плівками, утвореними з desAABB мономерного фібрину, – з використанням принципу імуноферментного аналізу та авідин-біотинової реакції.

Вестерн-блот аналіз плазмін-стрептокіназного комплексу здійснювали згідно із стандартним протоколом (Burnett, 1981).

Фермент-зв’язаний імуносорбційний аналіз (ELISA) використовували для визначення титру антистрептокіназних антитіл в сироватці крові людини та спорідненості одержаних антитіл до стрептокінази.

Мічення білків 125І та біотином відповідно здійснювали із застосуванням хлораміну-Т (McConahey, 1980) та сукцинімідобіотину (Gilting et al., 1987).

Іммобілізацію білків проводили на сефарозі 4В після її активації бромціаном (March, 1974).

Хімічну модифікацію гуанідинових та аміногруп груп залишків аргініну та лізину в білках проводили за допомогою циклогександіону (Trexler, 1982) та малеїнового ангідриду (Butler, 1969) відповідно.

Електрофорез у поліакриламідному гелі проводили за присутності ДС-Na для перевірки гомогенності отриманих білків (Laemli, 1970) та в системі сечовина/оцтова кислота за низьких значень рН – для визначення форми одержаного плазміногену (Panyim, Chalkley, 1969).

Математичну обробку результатів досліджень виконували за допомогою пакету ORIGIN 6.1. До роботи включено результати експериментів, допустима похибка яких не перевищувала 6 відсотків (р < 0,06). Криві, що представлені на рисунках, є типовими для серії повторних дослідів (щонайменше три в кожній серії).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Комплексоутворення Глу- і Ліз-форм плазміногену з фібриногеном/

фібрином. Нативною формою плазміногену, який циркулює у крові, є Глу-плазміноген, що містить глутамінову кислоту на N-кінці. Молекула складається з N-кінцевого пептиду, п’яти кринглових доменів та серин-протеїназного домену, в якому в процесі активації до плазміну формується активний центр. В кринглових доменах розташовані ліганд-зв’язувальні ділянки. Тонкі структурні відмінності, що існують між ними, обумовлюють різну спорідненість і специфічність окремих ділянок до низькомолекулярних лігандів – лізину та аргініну і їх аналогів, а також високоспецифічне розпізнавання різних макромолекул. Внутрішньомолекулярні взаємодії N-кінцевого пептиду з п’ятим кринглом та третього крингла з четвертим забезпечують закриту конформацію Глу-плазміногену у розчині.

Під час досліджень використано: нативний Глу- або частково гідролізований Ліз-плазміноген, у якого відсутній N-кінцевий пептид, як форми проферменту, що різняться за конформацією та здатністю до міжбілкових взаємодій; окремі фрагменти плазміногену з різним набором кринглових доменів – крингли 1-3, крингл 4, міні-плазміноген, що складається з серин-протеїназного домену та крингла 5, і мікро плазміноген, у якого відсутні всі кринглові домени; низькомолекулярні ліганди – аналог лізину 6-аміногексанову кислоту (6-АГК) та аргінін для блокування певних ділянок зв’язування. З використанням одержаних високоочищених білків: різних форм плазміногену, плазміну, фібриногену, фібрин-мономеру, тромбіну, тканинного активатора плазміногену, стрептокінази, 2-антиплазміну, ізольованих фрагментів цих білків розроблено системи, що моделюють певні стадії процесу фібринолізу за фізіологічних умов.

Взаємодія плазміногену з фібрином, по перше, є необхідною умовою активації проферменту і послідуючого лізису фібринового згустка, по-друге, визначає вибірковість руйнування фібрину плазміном in vivo. Зважаючи на суперечливість даних щодо взаємодії різних форм плазміногену з фібрин(оген)ом і кількості сорбованого білка та обмежені відомості про участь в цьому процесі окремих ліганд-зв’язувальних ділянок проферменту та локалізацію комплементарних центрів взаємодії з плазміногеном в молекулах фібриногену/фібрину, проведено детальне дослідження комплексоутворення Глу- і Ліз-форм плазміногену з фібриногеном, фібрин-мономером, полімерним фібрином, фрагментами фібриногену, що утворюються в процесі гідролізу, а також вплив обмеженого протеолізу фібрин(оген)у плазміном на зміну конформації та властивості обох форм проферменту.

Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з фібриноген-сефарозою, фібрин-мономер-сефарозою та полімерним фібрином. Показано, що за еквімолярного співвідношення взаємодіючих білків Ліз-плазміноген специфічно сорбується на фібриноген-сефарозі, фібрин-мономер-сефарозі та полімерному фібрині в однаковій кількості – 0,5 молей на 1 моль білка. В усіх випадках специфічно сорбований білок елююється 0,1 М 6-АГК. Кd комплексу Ліз-плазміногену з фібриноген-сефарозою дорівнює 5,6 мкМ, один центр зв’язування плазміногену припадає на одну молекулу фібриногену. З усіх фрагментів плазміногену ізольований крингл 1-3 зв’язується з фібриноген-сефарозою, а розчинний фібриноген – з іммобілізованим кринглом 1-3. Отримані дані свідчать, що молекула фібриногену містить центр взаємодії з плазміногеном, комплементарний ділянкам зв’язування кринглів 1-3. Очевидно, цей центр зберігається при відщепленні фібринопептидів А і В та експонований в фібрин-мономерних одиницях полімерного фібрину.

На відміну від Ліз-плазміногену, Глу-плазміноген не зв’язується з фібриноген- або фібрин-мономер-сефарозою за використаних співвідношень 0,5-3,0 моля проферменту на 1 моль іммобілізованого білка. Це пояснюється закритою конформацією нативної форми проферменту та недоступністю ділянок зв’язування кринглів 1-3 для взаємодії з фібриногеном. Тому в кров’яному руслі Глу-плазміноген та фібриноген, незважаючи на їх високу концентрацію, циркулюють незалежно один від одного і утворення комплексу між ними не відбувається.

Разом з тим, Глу-плазміноген зв’язується з полімерним фібрином в кількості 0,05-0,065 молей на 1 моль фібрину, що майже на порядок нижче значень, отриманих для Ліз-плазміногену. Взаємодія Глу- і Ліз-плазміногену з фібрином характеризується різною чутливістю до 6-АГК. Кількість сорбованого Ліз-плазміногену зменшується на 50 % за концентрації 6-АГК 8 10-5 М, що насичує високоафінні ділянки зв’язування кринглів 1-3, тоді як Глу-плазміногену – в області мілімолярних концентрацій за насичення низькоафінних ділянок, розташованих в кринглах 4 або 5 проферменту (рис. 1). З’ясування участі окремих доменів Глу-плазміногену у взаємодії з фібрином показало, що за 10-50-разового молярного надлишку до проферменту ізольовані крингли 1-3 та 4 не впливають, тоді як міні-плазміноген більш ніж на 50 % знижує величину сорбції міченого біотином Глу-плазміногену на фібринових плівках (рис. 2).

Отже, в процесі полімеризації на фібрині експонуються центри взаємодії з плазміногеном, наймовірніше, комплементарні ділянці крингла 5. Вони забезпечують сорбцію нативної форми проферменту на фібрині. Оскільки крингл 5 контролює конформаційний стан Глу-плазміногену, профермент, зв’язуючись з фібрином, набуває конформації, яка забезпечує його активацію тканинним активатором і початок гідролізу.

На важливе значення крингла 5 у взаємодії нативної форми проферменту з фібрином та його активації вказують дані про те, що моноклональні антитіла до міні-плазміногену (Church, 1991) та тромбоспондин (Markus, 1996), який проявляє специфічну спорідненість до крингла 5, інгібують активацію Глу-плазміногену тканинним активатором на фібрині.

Виходячи з отриманих даних про кількість Глу-плазміногену, яка сорбується на фібрині, легко підрахувати, що на 20-30 фібрин-мономерних одиниць припадає один центр зв’язування Глу-плазміногену і тому за фізіологічної концентрації проферменту та фібриногену з фібриновим

згустком, який утворюється, зв’язується не більш ніж 1/10 кількості нативної форми плазміногену, що міститься в плазмі.

Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з фрагментами фібриногену, які послідовно утворюються в процесі гідролізу плазміном. Складність процесу фібрин(оген)олізу передбачає експонування на різних його етапах нових центрів взаємодії з плазміногеном. На таку можливість вказують отримані нами дані про те, що внаслідок обмеженого протеолізу іммобілізованого на сефарозі фібриногену плазміном, за умов утворення Х-фрагмента, фібриноген набуває здатності взаємодіяти з Глу-плазміногеном, за більш глибокого гідролізу – до появи в розчині D-фрагмента, підвищується сорбційна емкість фібриноген-сефарози до Ліз-плазміногену.

Для визначення доменної локалізації плазміноген-зв’язувальних центрів молекул фібриногену/фібрину і виявлення етапів гідролізу, що приводять до експонування нових центрів, досліджували взаємодію Глу- і Ліз-плазміногену з фрагментами, що послідовно утворюються під час протеолізу фібриногену або непрошитого фібрину: Х, У, DH та Е.

Ліз-плазміноген специфічно зв’язується з переліченими фрагментами, іммобілізованими на BrCN-сефарозі, але в різній кількості і з різних афінних сорбентів елююється розчином 6-АГК або аргініну (рис. 3 А). Кількість Ліз-плазміногену, що сорбується на Х та Е-фрагментах, є однаковою і співпадає з величиною зв’язування на фібриногені. З цих сорбентів профермент повністю елююється 0,1 М 6-АГК. В найбільшій кількості профермент зв’язується з У-фрагмент-сефарозою і частково елююється 0,1 М 6-АГК, повна десорбція білка спостерігається за послідуючого використання 0,1 М аргініну. У-фрагмент складається з центрального Е- та одного з периферичних D-доменів. Ліз-плазміноген, сорбований на DH-фрагмент-сефарозі, стійкий до дії високих концентрацій 6-АГК і елююється 0,1 М аргініном. Взаємодія проферменту з DH-фрагментом має місце в присутності 0,1 М 6-АГК за умов насичення всіх ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів. В плазміногені тільки одна ділянка, що міститься в серин-протеїназному домені, проявляє вузьку специфічність до бічних радикалів аргініну в білках та лігандів з позитивно зарядженою гуанідиновою групою. Очевидно, саме вона відповідає за взаємодію Ліз-плазміногену з DH-фрагментом.

За подальшого протеолізу DH-фрагмента за певних умов плазміном або іншими гідролітичними ферментами відщеплюються С-кінцеві ділянки -ланцюга або -ланцюга і утворюються DL- та DLa-фрагменти відповідно, що супроводжується конформаційними змінами у просторовій орієнтації доменів, з яких складено D-фрагмент (Медведь, 1989).

Наші дослідження взаємодії Ліз-плазміногену з DL- та DLa-фрагментами виявили, що профермент зв’язується з кожним з цих сорбентів і, на відміну від DH-фрагменту, повністю елююється 6-АГК. Очевидно, в результаті структурних перебудов, які мають місце при переході DH-фрагмента до низькомолекулярних фрагментів, експонуються або з’являються центри взаємодії з плазміногеном відповідні одній з лізин-зв’язувальних ділянок. На можливість локалізації центра в суперспіралізованій області DH-фрагмента вказують існуючі дані про те, що Ліз-плазміноген та крингл 1-3 зв’язуються з високою спорідненістю з ізольованим фрагментом, що відповідає цій області (Lezhen, 1986).

Отримані результати про взаємодію Ліз-плазміногену з фібриногеном та його фрагментами свідчать, що в фібриногені центри зв’язування плазміногену локалізовано в центральному Е та периферічних D доменах. Розташовані в D доменах центри є скритими, вони експонуються під час гідролізу фібриногену – при утворенні У-фрагмента та низькомолекулярних D-фрагментів.

Дані дослідженнь комплексоутворення Глу-плазміногену з іммобілізованими фрагментами фібриногену представлені на рис. 3 Б. Як зазначалось вище, внаслідок закритої конформації нативна форма плазміногену не взаємодіє з фібриногеном. Разом з тим, Глу-плазміноген специфічно зв’язується з ранніми та пізніми продуктами гідролізу фібриногену – Х- та Е-фрагментами в однаковій кількості, величина якої близька до кількості сорбованого на цих фрагментах Ліз-плазміногену. Дані концентраційної залежності сорбованого Глу-плазміногену від нанесеного на колонку з Е-фрагмент-сефарозою, представлені в координатах Скетчарда, показали, що подібно до Ліз-плазміногену, взаємодія відбувається за участі двох типів центрів Глу-плазміногену – з високою та низькою спорідненістю до Е-фрагменту, з Кd відповідно 1,8•10-6 та 7,5•10-5 М. Близькі значеннями Кd свідчать, що комплексоутворення обох форм проферменту з Е-фрагментом відбувається за участі однакових ділянок зв’язування. Отримані дані показали, що при взаємодії Глу-плазміногену з фрагментами, які утворюються в процесі гідролізу фібриногену, його конформація може змінюватись на Ліз-плазміноген подібну.

Глу-плазміноген, на відміну від Ліз-плазміногену, не взаємодіє з DH-фрагментом і зв’язується з DL-фрагментом в невеликій кількості – 0,04-0,05 молей на моль фрагмента з низькою спорідненістю, Кd дорівнює 20 мкМ. Відсутність взаємодії Глу-плазміногену з DH-фрагментом можна пояснити тим, що в молекулі Глу-плазміногену, структура якого має форму кільця спіралі, N-кінцева ділянка поліпептидного ланцюга, що містить перші три кринглові домени, перекриває частину поверхні серин-протеїназного домену, в якій, очевидно, розташована ліганд-зв’язувальна ділянка, що забезпечує взаємодію Ліз-плазміногену.

Кількісні параметри взаємодії Глу-плазміногену з DL-фрагментом відрізняються від таких Ліз-плазміногену і подібні до значень, що характеризують взаємодію Глу-плазміногену з фібрином. Для того щоб з’ясувати, яка з низькоафінних ділянок плазміногену здатна взаємодіяти з DL-фрагментом, досліджували зв’язування з ним крингла 4 та міні-плазміногену. Крингл 4 не взаємодіє, тоді як міні-плазміноген специфічно зв’язується з DL-фрагментом, сорбований білок не чутливий до дії низьких концентрацій 6-АГК, але може бути елюйований з колонки розчином 0,1 М 6-АГК або 0,1 М аргініну. Отримані дані показують, що взаємодія Глу-плазміногену з DL-фрагментом, як і з фібрином, може відбуватись за участі ліганд-зв’язувальної ділянки п’ятого крингла.

Дослідження процесу активації плазміногену тканинним активатором на фібрині та фрагментах бромціанового розщеплення фібриногену дозволили установити, що послідовність 148-160 А-ланцюга, яка входить до суперспіральної частини D-фрагмента, відповідає за взаємодію з плазміногеном (Nieuwenhuizen, 2001). З використанням моноклональних антитіл доведено, що ця послідовність є закритою в молекулі фібриногену та DH-фрагменті, але експонована на фібрині (Schielen, 1991). Її експонування відбувається під час полімеризації фібрину на стадії латеральної асоціації протофібрил (Yang, 2000) або за фрагментації DH-фрагмента (Yakovlev, 2000).

Послідовність Аб 148-160 має незвичайне розміщення заряджених амінокислотних залишків:

148 160

Ліз-Арг-Лей-Глу- Вал-Асп-Лей-Асп-Лей-Ліз-Лей-Арг-Сер

+ + 0 – 0 – 0 – 0 + 0 + 0 ,

де від’ємні та нейтральні амінокислоти чередуються між собою і розміщені між двома наборами позитивно заряджених амінокислот. Наявність в ній ділянки, до складу якої входять Асп 155, Ліз 157 та Арг 159, дозволяє пояснити взаємодію Глу- та Ліз-плазміногену з DL-фрагментом за участі різних ліганд-зв’язувальних ділянок. Бічні радикали лізину або аргініну можуть відповідати за взаємодію з АН- (або аргініл-) зв’язувальною ділянкою крингла 5, тоді як карбоксильна група аспарагінової кислоти та аміно- або гуанідинова група лізину або аргініну можуть утворювати електростатичну пару, яка відповідає за взаємодію з лізин-зв’язувальною ділянкою кринглів 1-3.

На підставі наведених літературних даних та отриманих нами результатів про відсутність взаємодії між Глу-плазміногеном і фібриногеном, здатність нативної форми проферменту зв’язуватись з полімерним фібрином, малу і майже однакову кількість Глу-плазміногену, що сорбується на один моль фібрину та DL-фрагмента, інгібування комплексоутворення Глу-плазміногену з фібрином міні-плазміногеном та можливість останнього взаємодіяти з DL-фрагментом зроблено висновок, що первинний центр зв’язування Глу-плазміногену, який формується при переході розчинного фібриногену до полімерного фібрину, локалізовано в області D-домену.

Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з частково гідролізованим фібрином. Механізм збільшення кількості Гду-плазміногену, що сорбується на фібрині, на початкових стадіях його гідролізу. За незначної кількості Глу-плазміногену, яка за фізіологічних концентрацій зв’язується з полімерним фібрином, для ефективного руйнування фібринового згустка необхідним є надходження та сорбція на фібрині додаткових молекул плазміногену. Обмежений протеоліз фібрину плазміном приводить до збільшення сорбції на ньому плазміногену. Вважається, що під час гідролізу в молекулах фібрину з’являються С-кінцеві залишки лізину, взаємодія з якими плазміногену збільшує його локальну концентрацію на фібрині. В такому разі повинна існувати кореляція між ступенем гідролізу фібрину та величиною сорбованого на ньому плазміногену. Представлені вище дані про взаємодію Глу- і Ліз-плазміногену з фрагментами фібриногену, показали, що перетворення фібриногену на Х-фрагмент не позначаеться на кількості Ліз-плазміногену, що зв’язується з цими білками, і дозволяє Глу-плазміногену, який не взаємодіє з фібриногеном, в максимальнй кількості зв’язуватись з Х- фрагментом.

Для з’ясування механізму, що спричинює на початкових стадіях гідролізу фібрину до значного збільшення кількості зв’язуваного з ним Глу-плазміногену, було проведено порівняльне дослідження взаємодії обох форм проферменту з частково гідролізованим фібрином, що утворювали з фібриногену, який попередньо обробляли плазміном. Умови обробки добирали таким чином, щоб під час гідролізу в молекулах фібриногену мало місце розщеплення лише бС доменів. Ступінь гідролізу визначали за кількістю продуктів деградації фібриногену, що залишались у розчині після утворення фібрину. Дані електрофорезу показали, що в отриманих препаратах desAABB фібрину з’являються Х-фрагменти, кількість яких збільшується з підвищенням концентрації плазміну. В усіх випадках зберігається твердо-фазна структура фібринових згустків.

Показано, що кількість сорбованого на частково гідролізованому фібрині Ліз-плазміногену є такою ж, як і на вихідному (рис. 4), і не залежить від ступеня гідролізу (рис. 5). Отже, поява С-кінцевих лізинів на початкових стадіях гідролізу фібрину не приводить до збільшення сорбції Ліз-плазміногену.

Тоді як зв’язування Глу-плазміногену з фібрином залежить від структурної цілістності складових молекул. За еквімолярного співвідношення взаємодіючих білків кількість сорбованого Глу-плазміногену на моль фібрину збільшується з 0,05 на вихідному до 0,5 молей на частково гідролізованому фібрині і досягає величини, характерної для Ліз-плазміногену (рис. 4). Для розуміння досліджуваного механізму важливе значення має виявлена експоненційна залежність кількості Глу-плазміногену, сорбованого на фібрині, від ступеня його гідролізу. Збільшення в декілька разів сорбції білка спостерігається за 0,35 % ступеня гідролізу. Максимальна кількість Глу-плазміногену зв’язується з фібрином за відщеплення 1-2 % молекулярної маси вихідного фібриногену і за умов експерименту далі не змінюється (рис. 5). Зважаючи на те, що бС-домени складають 25 % молекулярної маси фібриногену, можна стверджувати, що відсутність невеликих С-кінцевих пептидів в б-ланцюгах окремих фібрин-мономерних одиниць полімерного фібрину є достатньою умовою збільшення до максимального рівня кількості сорбованого на ньому Глу-плазміногену.

Зв’язування Глу-плазміногену з частково гідролізованим фібрином супроводжується зміною властивостей проферменту. Сорбція білка на такому фібрині, на відміну від нативного, пригнічується 6-АГК за концентрацій, що насичують високоафінні ліганд-зв’язувальні ділянки. Фрагмент плазміногену крингл 1-3 за 50-разового надлишку до Глу-плазміногену на 60 % інгібує сорбцію проферменту на частково гідролізованому фібрині, тоді як в разі нативного фібрину його вплив був відсутнім. Отже, за часткового гідролізу до взаємодії з фібрином залучаються високоафінні ділянки перших трьох кринглових доменів Глу-плазміногену, що свідчить про зміну його конформації.

Таким чином, можна зробити висновок, що на початкових етапах гідролізу фібриногену/фібрину при розщепленні А-ланцюга в молекулі з’являється новий центр взаємодії з плазміногеном, який контролює конформаційний стан проферменту. Зважаючи на появу С-кінцевих залишків лізину за гідролізу пептидних зв’язків плазміном, які найбільше відповідають лігандній специфічності ділянці крингла 4, і те, що цей крингл регулює конформаційні переходи молекули плазміногену, можна припустити, що новий центр, електростатичною складовою якого є заряджені групи С-кінцевого лізину, комплементарний ділянці, розташованій в четвертому крингловому домені плазміногену.

Висловлене припущення підтвердується наступними дослідженнями функціональних властивостей ізольованого крингла 4, які показали, що він не зв’язується з іммобілізованими Е- та D-фрагментами фібриногену, незважаючи не те, що лізин є С-кінцевим амінокислотним залишком -ланцюга в складі D-фрагмента та кожного з трьох ланцюгів обох субодиниць в складі Е-фрагмента. Крингл 4, як і Глу-плазміноген, не проявляє спорідненості до фібриноген-сефарози. Після пропускання через колонку з фібриноген-сефарозою розчину Ліз-плазміногену з слідовою спонтанною активністю або тканинного активатора крингл 4 і Глу-плазміноген набувають здатності специфічно зв’язуватись з афінним сорбентом. Поясненням цього є часткове ферментативне розщеплення іммобілізованого фібриногену плазміном, який міститься в слідовій кількості у розчині Ліз-плазміногену або утворюється за активації домішок плазміногену в препаратах фібриногену. Отже, нові центри взаємодії з плазміногеном, що з’являються на початкових стадіях гідролізу фібрин(оген)у, містяться в С-доменах і комплементарні ліганд-зв’язувальній ділянці крингла 4. Основна роль їх полягає в зміні конформації плазміногену.

В результаті проведених порівняльних досліджень взаємодії Глу- та Ліз-плазміногену з фібриногеном, його фрагментами та нативним і частково гідролізованим фібрином обґрунтовано положення про послідовність взаємодій, доменну локалізацію та етапи експонування комплементарних центрів розпізнавання молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/фібрину в процесі полімеризації та на початкових стадіях гідролізу:

- молекула фібриногену в центральній частині – Е-домені містить експонований центр взаємодії з плазміногеном, комплементарний ліганд-зв’язувальним ділянкам перших трьох кринглових доменів молекули проферменту. Внаслідок закритої конформації Глу-плазміногену і недоступності ділянок перших трьох кринглових доменів для міжбілкових взаємодій нативна форма плазміногену та фібриноген у кров’яному руслі циркулюють незалежно один від одного;

- під час формування фібрилярної структури фібринового згустка в молекулах фібрину в області D-доменів експонуються центри взаємодії з Глу-плазміногеном, які комплементарні ліганд-зв’язувальній ділянці п’ятого крингла;

- взаємодія Глу-плазміногену з цими центрами за участі п’ятого кринглового домену обумовлює дисоціацію внутрішньомолекулярного зв’язку між п’ятим кринглом та N-кінцевим пептидом Глу-плазміногену, внаслідок чого профермент переходить у частково відкриту конформаційну форму, що забезпечує його активацію тканинним активатором до плазміну і початок гідролізу;

- на ранніх стадіях гідролізу фібрин(оген)у, за розщеплення С-доменів, на них утворюються або експонуються нові центри взаємодії з плазміногеном, які комплементарні ліганд-зв’язувальній ділянці четвертого крингла;

- взаємодія Глу-плазміногену з новоутвореними в молекулах фібрину центрами за участі ділянки четвертого кринглового домену обумовлює