УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ

ХОМЕНКО ГЕННАДІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 579.262:631.811.98:633.31

ДІАЗОТРОФИ КОРЕНЕВОЇ ЗОНИ VALERIANA OFFICINALIS L. І CALENDULA OFFICINALIS L. ТА ЇХ ВПЛИВ НА УРОЖАЙНІСТЬ

І ЯКІСТЬ ЛІКАРСЬКОЇ СИРОВИНИ

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук

Чернігів - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії біологічного азоту Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

Провідна установа: |

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

НАДКЕРНИЧНА Олена Володимирівна,

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, заступник директора з наукової роботи

доктор сільськогосподарських наук, професор

БЕРДНІКОВ Олександр Михайлович,

Чернігівський Інститут АПВ УААН

завідувач лабораторії агрохімії

доктор біологічних наук, професор, академік УААН

ПАТИКА Володимир Пилипович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Національний науковий центр

“Інститут землеробства” УААН

с.м.т. Чабани, Києво-Св’ятошинський р-н, Київська обл.

Захист відбудеться “19” квітня 2007 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 79.377.01 при Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН за адресою: 14027, м. Чернігів, вул. Шевченка, 97.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН за адресою: 14027, м. Чернігів, вул. Шевченка, 97.

Автореферат розісланий “15” березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Т.М. Ковалевська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтерес до асоціативної азотфіксації зумовлений її важливою роллю в азотному балансі природних екосистем. Мікробіологічна фіксація азоту – екологічно безпечний та економічно вигідний шлях забезпечення рослин зв’язаним азотом, підвищення урожайності сільськогосподарських культур, поліпшення якості одержаної продукції, при якому неможливе забруднення ґрунтів, водоймищ та повітря. Вважається, що за рахунок активізації цього процесу можна суттєво покращити азотне живлення небобових рослин біологічним азотом і зменшити дози мінеральних азотних добрив, що використовуються в рослинництві (Умаров М.М., 1986; Dobereiner J., Day J. M., 1975; Okon Y., 1982; Gough C. et al., 1997).

В останні роки створено низку екологічно безпечних препаратів, застосування яких дозволяє регулювати чисельність та активність корисних мікроорганізмів у ризосфері рослин, підвищувати коефіцієнт засвоєння поживних речовин ґрунту та забезпечувати сільськогосподарські культури доступним азотом і за рахунок цього збільшувати продуктивність агроценозів та якість сільськогосподарської продукції (Іутинська Г.О., Патика В.П., 2000; Шерстобоєва Е.В. та співавт., 1996). При цьому зменшується застосування азотних добрив, що сприяє оздоровленню, збереженню і частковому відновленню родючості ґрунтів (Коць С.Я., 2001; Курдиш И.К., 2001; Gilbert G.S., Parke J.L., 1993).

Дослідження доцільності інтродукції асоціативних азотфіксаторів у кореневу зону рослин проводяться з багатьма сільськогосподарськими культурами (Антипчук А.Ф. та ін., 1997; Rai S.N., Gaur A.S., 1988; Патика В.П. та співавт., 2003), проте роль діазотрофів в азотному живленні лікарських рослин ще недостатньо вивчена. Створення препаратів на основі активних азотфіксуючих мікроорганізмів і їх застосування у сучасних технологіях вирощування лікарських культур буде сприяти підвищенню урожайності і одержанню високоякісної сировини для фармацевтичної промисловості.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з НТП УААН “Наукові основи стійких агроекосистем”, підпрограмою “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем”, завданням “Вивчити взаємодію мікро- і макросимбіонтів при ефективному функціонуванні системи азотфіксуючі мікроорганізми – рослина” (№ДР 0101U003749).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було вивчити активність процесу асоціативної азотфіксації у кореневій зоні валеріани лікарської та нагідок лікарських, виявити основні групи діазотрофів, відповідальних за цей процес, виділити активні азотфіксуючі бактерії і дослідити їх вплив на урожайність та якість лікарської сировини, а також визначити економічну доцільність

використання нового штаму діазотрофів як агента біопрепарату.

Для досягнення поставленої мети передбачалося:

·

·

·

·

·

·

·

Об’єкт досліджень: асоціативні азотфіксуючі мікроорганізми кореневої зони нагідок лікарських та валеріани лікарської, новий штам Pseudomonas fluorescens 211, біоагенти мікробних препаратів - Azospirillum brasilense 18-2 (діазобактерин), Agrobacterium radiobacter 204 (діазофіт) та консорціум штамів Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22 (азотобактерин), збудники кореневих гнилей нагідок лікарських – Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae Bilai, Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Rhizoctonia DC, рослини валеріани лікарської (Valeriana officinalis L.) та нагідок лікарських (Calendula officinalis L.).

Предметом досліджень були особливості функціонування асоціативної системи діазотрофи-лікарські рослини та вплив активних штамів азотфіксуючих бактерій на урожайність і якість лікарської сировини.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше вивчено якісний склад і нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій кореневої зони Valeriana officinalis L. і Calendula officinalis L.

Показано, що в кореневій зоні згаданих культур створюються сприятливі умови для розвитку основних груп асоціативних азотфіксуючих мікроорганізмів. Асоціативну азотфіксуючу систему діазотрофи – Valeriana officinalis L. віднесено до ендоризосферного типу, а систему діазотрофи – Calendula officinalis L. – до екзоризосферного типу.

З кореневої зони нагідок лікарських та валеріани лікарської виділено активні азотфіксуючі бактерії, які були віднесені до родів Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas та Flavobacterium.

Одержано новий штам Pseudomonas fluorescens 211, що характеризується поліфункціональним впливом на рослини валеріани та нагідок. Показано, що інтродукція нового штаму в кореневу зону нагідок дозволяє суттєво підвищити

нітрогеназну активність в кореневій зоні, збільшити вміст загального азоту в листках і обмежити поширення та розвиток кореневих гнилей рослин.

Практичне значення одержаних результатів. Сільськогосподарському виробництву запропоновано новий, захищений патентом України, штам Pseudomonas fluorescens 211 як біоагент препарату для підвищення урожайності суцвіть та покращання якості сировини нагідок лікарських. Одержано дослідні партії біопрепарату на основі Pseudomonas fluorescens 211, що підвищує урожайність суцвіть на 7,9 – 35,1 %, вміст ефірної олії у лікарській сировині нагідок на 16,7 – 20,0 %, екстрактивних речовин – на 5,9 – 15,5 %. Його використання дозволяє заощадити кошти і енергію на застосування азотних мінеральних добрив та зберегти довкілля в благополучному стані.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проаналізована відповідна література, виконано весь обсяг експериментальної роботи: вивчено склад та нітрогеназну активність азотфіксуючих мікроорганізмів кореневої зони лікарських рослин, виділено активні штами азотфіксуючих мікроорганізмів, закладено і проведено лабораторні, вегетаційні та польові досліди, виділено збудників кореневих гнилей нагідок лікарських, статистично оброблено одержані результати, проведено економічні та біоенергетичні розрахунки. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретація та формулювання основних положень, а також друковані роботи підготовлено за безпосередньої участі наукового керівника.

Штами біоагентів мікробних препаратів отримано з колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.

Ідентифікація збудників кореневих гнилей нагідок проведена к.б.н. Надкерничним С.П., за що автор висловлює йому глибоку подяку.

У проведенні дослідів брали участь співробітники лабораторії біологічного азоту, котрі є співавторами опублікованих робіт і яким автор щиро вдячний.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було представлено на: Всеукраїнській конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, 28 – 30 жовтня 2002 р.); Міжнародній науковій конференції “Біологічні науки і проблеми рослинництва” (Умань, 23-26 червня 2003 р.); ІІ конференції молодих вчених “Сільськогосподарська мікробіологія: проблеми та здобутки” (Чернігів, 7 жовтня 2003 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Шляхи підвищення ефективності землеробства та родючості ґрунтів” (Одеса, 15 – 17 вересня 2004 р.); Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 15 – 17 вересня 2004 р.); ІХ конференції молодих дослідників “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів” (Київ, 24-25 лютого 2005 р.); науково-практичній конференції “Агроекологічні проблеми сьогодення та шляхи їх вирішення” (Полтава, 31 травня – 1 червня 2005 р.); ІІІ конференції молодих вчених “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми” (Чернігів, 7 червня 2005 р.); науковій конференції молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 1 – 3 грудня 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, із них 4 статті у фахових виданнях, 1 патент, 5 тез доповідей на наукових конференціях.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 156 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, 7 розділів експериментальної частини, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури, що містить 261 літературних джерел, з яких 73 латиницею. Робота ілюстрована 34 таблицями, 23 рисунками, 11 додатками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В розділі наведено сучасні погляди вітчизняних та зарубіжних дослідників на процес фіксації молекулярного азоту діазотрофами в кореневій зоні сільськогосподарських культур, а також вплив азотфіксуючих мікроорганізмів на рослину. Розглядається перспективність використання бактеріальних препаратів для підвищення урожайності і покращення якості сировини лікарських рослин.

На основі аналізу літературних джерел обґрунтована необхідність проведення досліджень за темою дисертації.

ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень були: асоціативні азотфіксуючі мікроорганізми кореневої зони нагідок лікарських та валеріани лікарської, новий штам Pseudomonas fluorescens 211, біоагенти мікробних препаратів - Azospirillum brasilense 18-2 (діазобактерин), Agrobacterium radiobacter 204 (діазофіт) та консорціум штамів Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22 (азотобактерин), збудники кореневих гнилей нагідок лікарських – Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae Bilai, Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Rhizoctonia DC., рослини валеріани лікарської (Valeriana officinalis L.) та нагідок лікарських (Calendula officinalis L.).

Визначення чисельності та виділення азотфіксуючих мікроорганізмів з ризосфери та ризоплани лікарських рослин проводили за загально прийнятими в ґрунтовій мікробіології методами та з використанням прийомів, що описані в оригінальних роботах авторів (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1980; Калининская и др., 1981; Большой практикум по микробиологии, 1962; Векірчик, 2001; Виноградский С.Н., 1952; Теппер З.Е. и др, 1979; Caseras S.A.R., 1982; Iuzuka H. Komagata K., 1963).

Здатність до азотфіксації накопичувальних культур, мікроорганізмів у чистій культурі та в асоціації з лікарськими рослинами визначали ацетиленовим методом на газовому хроматографі “Chrom-4” з полум’яно-іонізаційним детектором. Колонка довжиною 370 см була заповнена хромосорбом з в-вґоксидіпропіонітрилом. Температура термостату 500С, газ-носій – азот, витрата газів (в мл / хвилину): водню – 30, азоту – 100, повітря – 500 (Калининская и др., 1986; Волкогон В.В., 1997).

Визначення схожості та енергії проростання насіння лікарських рослин під впливом інокуляції діазотрофами проводили в лабораторних дослідах (ГОСТ 12038 – 84).

Ідентифікацію найбільш активних штамів діазотрофів, виділених з кореневої зони лікарських рослин, проводили за визначником Берджі (Берджи, 1997).

Вивчення здатності діазотрофів колонізувати ризосферу та поверхню коренів нагідок лікарських здійснювали за допомогою резистентного методу з одержанням генетично маркованих штамів за ознакою стійкості до високих доз стрептоміцину (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1980).

При виділенні збудників кореневих гнилей з коріння уражених рослин нагідок лікарських використовували метод, описаний Зражевською Т.І. (Зражевская Т.И., 1980). Для встановлення поширення та розвитку хвороби викопані з коренями рослини промивали водою і оцінювали за інтенсивністю ураження в балах за шкалою ВІЗР у модифікації В.Ф. Пересипкіна та В.М. Підоплічко (1975). До уваги приймалася також шкала, рекомендована В.П. Кривуненко зі співавт. (2001).

Культурально-морфологічні ознаки мікроміцетів вивчали на середовищах Чапека, сусло-агарі та картопляному агарі з глюкозою.

Антибіотичну активність мікроорганізмів вивчали за допомогою методів дифузії в агар і зустрічних культур (Методы экспериментальной микологии, 1982). Як тест-об'єкти були використані фітопатогенні мікроміцети, виділені з уражених рослин нагідок лікарських.

Урожай квіткових кошиків нагідок лікарських збирали 11 разів з інтервалом 3-5 днів – у фазі розкриття не менше половини язичкових квітів у кошиках. При цьому враховували кількість рослин, кількість суцвіть та масу кошиків з облікової ділянки.

Вміст ефірної олії визначали перегонкою з водяним паром (метод Кінзберга) (Васильева З.В., Кириллова Г.А., 1968; Государственная фармакопея СССР, 1987).

Визначення екстрактивних речовин проводили згідно з вимогами Державної фармакопеї (Государственная фармакопея СССР, 1987).

Масову частку загального азоту в рослинах визначали фотометричним методом з реактивом Неслера (Грицаєнко З.М. та ін, 2003).

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за допомогою дисперсійного аналізу (Доспехов Б. А., 1979) та з використанням комп’ютерного пакету Statistika 6.0 (Царенко О. М. та ін, 2000). Для оцінки достовірності різниці

між варіантами дослідів визначали найменшу істотну різницю (НІР05), критерій Фішера (F) та рівень значущості (p).

Вивчення впливу діазотрофів на рослини проводили за умов лабораторних і польових дослідів з валеріаною лікарською сорту Кардіола та поліпшеною сортопопуляцією нагідок лікарських, наданих відділом селекції і насінництва Дослідної станції лікарських рослин УААН.

Польові досліди проводили на базі Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН на дерново-підзолистому ґрунті. Вміст гумусу (за Тюріним) складав 1,0 – 1,2 %, загального азоту – 0,08 – 0,12 %, рухомого фосфору (за Кірсановим) – 16,0 – 18,0 мг, обмінного калію (за Кірсановим) – 10,0 – 14,0 мг на 100 г ґрунту, рН сол – 5,6.

Норма висіву валеріани становила 2,5 млн. схожого насіння на 1 га, нагідок лікарських – 1,3 млн. Площа облікової ділянки 5 м2, повторність досліду чотириразова. Спосіб посіву широкорядний, ширина міжрядь – 45 см. В технології вирощування кожної культури виключали внесення добрив та пестицидів.

Визначали необхідне бактеріальне навантаження в залежності від культури, яке становило 50 – 100 тис. бактеріальних клітин на 1 насінину для валеріани і 0,6 – 1,0 млн. – для нагідок. Інокуляцію насіння лікарських рослин здійснювали в день посіву.

Виробничу перевірку експериментальних партій біопрепарату на основі Pseudomonas fluorescens 211 при вирощуванні нагідок лікарських проводили в ПАФ “Тарасівка” Коропського району Чернігівської області у 2004 р (на площі 2,3 га) та 2005 р (2,5 га). Ґрунт дерново-підзолистий з вмістом гумусу в орному шарі 0,9 – 1,0 % (за Тюріним), загального азоту – 0,10 – 0,14 %, рухомих форм Р2О5 – 18,2 - 20,6 мг (за Кірсановим), обмінного калію – 10,0 – 12,0 мг (за Кірсановим) на 100 г ґрунту, рНсол – 5,3.

Норма висіву складала 1,3 млн. схожого насіння нагідок. Спосіб посіву широкорядний, ширина міжрядь – 45 см. Мінеральні добрива при вирощуванні культурине застосовувались. Під основний обробіток ґрунту вносився гній в дозі 40 т/га.

АКТИВНІСТЬ АЗОТФІКСАЦІЇ І АЗОТФІКСУЮЧІ МІКРООРГАНІЗМИ КОРЕНЕВОЇ ЗОНИ ВАЛЕРІАНИ ЛІКАРСЬКОЇ ТА НАГІДОК ЛІКАРСЬКИХ

Визначення активності азотфіксації в кореневій зоні Valeriana officinalis L. та Calendula officinalis L. дозволило встановити стимулюючий вплив рослини на даний процес.

Для з'ясування питання про те, в якій саме частині кореневої зони найбільш інтенсивно проходить процес фіксації молекулярного азоту, вивчали потенційну активність нітрогенази в ризосфері та у ризоплані лікарських рослин.

Як свідчать одержані дані, в кореневій зоні валеріани лікарської у фазу активного розвитку (розвинутої розетки) найбільш інтенсивно процес потенційної фіксації молекулярного азоту відбувається на поверхні коренів і залежить від використаного джерела вуглецю. Так, при використанні глюкози активність азотфіксації на поверхні відмитих коренів складала 9,1 нмоль С2Н4 / г коренів за годину, тоді як у ризосфері та в ґрунті без рослин відповідно – 3,9 і 2,2 нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину. Застосування цукрози приводило до аналогічного результату: азотфіксуюча здатність у ризоплані складала 9,3, у ризосферному ґрунті – 3,3, а в ґрунті без рослин – 2,2 (табл. 1). При використанні бурштинової кислоти спостерігався дуже низький рівень редукції ацетилену в ґрунті та ризосфері рослин, тоді як активність нітрогенази у ризоплані досягала значення 6 нмоль С2Н4 / г коренів за годину.

Аналіз результатів вивчення потенційної нітрогеназної активності показав, що в кореневій зоні нагідок лікарських картина дещо інша: активність азотфіксації при використанні глюкози у ризосфері рослин досягає 15,8 нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину, тоді як на поверхні коренів вона складає 6,3 нмоль С2Н4 / г коренів за годину (табл. 2). Цукроза сприяє підвищенню ацетиленредукції в ризосфері до 17,4 нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину, а на поверхні коренів – до 7,4 нмоль С2Н4 / г коренів за годину. У разі використання мікроорганізмами бурштинової кислоти в ґрунті без рослин, так само як і у випадку з валеріаною, спостерігається низька нітрогеназна активність. Це можна пояснити незначною чисельністю в ґрунті діазотрофів, які використовують бурштинову кислоту як джерело вуглецю. Але в ризосфері нагідок лікарських при використанні бурштинової кислоти спостерігається підвищення активності фіксації молекулярного азоту, що перевищує варіант без рослин в 22,6 рази.

За визначенням Дж. Доберейнер асоціації азотфіксуючих мікроорганізмів з рослинами є доволі специфічними, але різною мірою тісними (Dobereiner J., 1978). Згідно з поглядами автора, асоціації діазотрофів з рослинами називаються екзоризосферними, якщо нітрогеназна активність переважає у ризосферному ґрунті. У разі локалізації бактерій-азотфіксаторів на поверхні коренів чи безпосередньо в кореневих тканинах – ендоризосферними.

Таким чином, проведені дослідження дозволяють зробити висновок, що асоціативну азотфіксуючу систему діазотрофи – Valeriana officinalis L. можна віднести до ендоризосферного типу, а систему діазотрофи – Calendula officinalis L. – до екзоризосферного типу.

Вивчення складу азотфіксуючого мікробного комплексу кореневої зони валеріани та нагідок показало, що як в ризосфері, так і в ризоплані досліджуваних культур створюються сприятливі умови для розвитку різних систематичних і еколого-трофічних груп мікроорганізмів.

Вивчення складу азотфіксуючого мікробного комплексу кореневої зони рослин показало, що існує зв’язок азотфіксації з чисельністю мікроорганізмів у ризоплані валеріани на середовищах Федорова-Калінінської, Доберейнер та Ііцука-Комагата (табл. 3) і у ризосфері нагідок на середовищі Ешбі, Федорова-Калінінської, Доберейнер, Виноградського, а також Ііцука-Комагата (табл. 4).

Таблиця 1

Потенційна нітрогеназна активність в кореневій зоні валеріани лікарської у фазу розетки (польовий дослід 2003 р.)

Джерело вуглецю | Ґрунт без рослин,

нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину | Ризосферний ґрунт,

нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину | Відмиті корені,

нмоль С2Н4 / г коренів за годину

Глюкоза | 2,2 ± 0,16 | 3,9 ± 0,48 | 9,1 ± 0,50

Цукроза | 2,2 ± 0,25 | 3,3 ± 0,29 | 9,3 ± 0,59

Бурштинова кислота | 0,1 ± 0,01 | 0,3 ± 0,02 | 6,0 ± 1,50

8

Таблиця 2

Потенційна нітрогеназна активність в кореневій зоні нагілок лікарських у фазу бутонізації-початку цвітіння

(польовий дослід 2003 р.)

Джерело вуглецю | Ґрунт без рослин,

нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину | Ризосферний ґрунт,

нмоль С2Н4 / г ґрунту за годину | Відмиті корені,

нмоль С2Н4 / г коренів за годину

Глюкоза | 8,1 ± 2,34 | 15,8 ± 3,86 | 6,3 ± 0,93

Цукроза | 11,0 ± 2,40 | 17,4 ± 2,31 | 7,4 ± 0,43

Бурштинова кислота | 1,0 ± 0,25 | 22,8 ± 4,61 | 4,7 ± 0,64

Таблиця 3

Азотфіксуючі мікроорганізми кореневої зони Valeriana officinalis L.

(фаза розвинутої розетки, діапазон зміни чисельності за вегетаційні періоди 2002 – 2003 рр.)

Варіант | Кількість бактерій на середовищах (в 1г абсолютно сухого ґрунту або коренів)

Ешбі з цукрозою,

тис. | Федорова-Калінінської,

тис. | Доберейнер,

тис. | Виноград-ського

(Clostridium),

тис. | Ііцука-Комагата

(Pseudomonas), млн. | Ешбі

(Azotobacter),

% обросших грудочок ґрунту

Ґрунт без рослин | 41,8 – 56,9 | 18,4 – 120,3 | 27,2 – 56,9 | 3,2 – 16,1 | 3,2 – 75,9 | 82,0 – 100,0

Ризосфера рослин | 98,3 – 397,8 | 397,1 – 839,9 | 98,3 – 248,4 | 9,8 – 22,5 | 3,4 – 265,2 | 82,0 – 100,0

Ризоплана (відмиті корені) | 1,9 – 144,9 | 38,8 – 2173,9 | 7,2 – 475,0 | 0,1 – 0,2 | 150,0 – 617,5 | 55,0 – 86,7

9

Таблиця 4

Азотфіксуючі мікроорганізми кореневої зони Calendula officinalis L.

(фаза бутонізації – початку цвітіння, діапазон зміни чисельності за 2002 – 2004 рр.)

Варіант | Кількість бактерій на середовищах (в1г абсолютно сухого ґрунту або коренів)

Ешбі з цукрозою,

тис. | Федорова-Калінінської,

тис. | Доберейнер,

тис. | Виноград-ського (Clostridium),

тис. | Ііцука-Комагата

(Pseudomonas), млн. | Ешбі

(Azotobacter)

% обросших грудочок ґрунту

Ґрунт без рослин | 51,1 – 52,9 | 51,1 – 52,9 | 51,1 – 52,9 | 2,8 – 2,9 | 0,96 – 27,1 | 82,0 – 100,0

Ризосфера рослин | 86,4 – 429,4 | 227,3 – 1130,0 | 86,4 – 677,9 | 3,4 – 4,1 | 4,0 – 227,3 | 96,0 – 100,0

Ризоплана (відмиті корені) | 0,7 – 1,5 | 9,3 – 471,2 | 9,3 – 223,2 | 0,1 – 0,3 | 0,4 – 12,2 | 95,0 – 100,0

ВІДБІР АКТИВНИХ ШТАМІВ ДІАЗОТРОФІВ

Протягом 2002 - 2003 років методом аналітичної селекції з ризосфери і ризоплани Valeriana officinalis L. та Calendula officinalis L. було виділено 164 культури азотфіксуючих мікроорганізмів. До активних азотфіксаторів ми відносили мікроорганізми, нітрогеназна активність яких перевищувала 10 нмоль С2Н4 / 5 мл середовища за годину. Всього з кореневої зони лікарських рослин було виділено 11 діазотрофів, які мали високу нітрогеназну активність. Це представники родів Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas та Flavobacterium (табл. 5).

Таблиця 5

Нітрогеназна активність чистих культур діазотрофів,

виділених з кореневої зони лікарських рослин

на середовищі Ешбі

Культура | Джерело виділення | нмоль С2Н4 / 5 мл середовища за годину

Azotobacter sp. 6 | ризоплана валеріани | 94,01±11,43

Azotobacter sp. Ш1 | ризосфера нагідок | 212,09±13,22

Azotobacter sp. 45 | ризосфера нагідок | 202,56±34,26

Bacillus sp. 16 | ризосфера нагідок | 18,673,72

Bacillus sp. 18 | ризосфера нагідок | 10,843,12

Bacillus sp. 28 | ризосфера нагідок | 12,083,25

Pseudomonas sp. К1 | ризосфера нагідок | 64,49±6,31

Pseudomonas sp. 211 | ризосфера валеріани | 376,96±16,37

Pseudomonas sp.37 | ризосфера нагідок | 182,57±34,51

Flavobacterium sp.228 | ризосфера нагідок | 257,51±15,32

Flavobacterium sp.112 | ризосфера валеріани | 84,93±17,70

Встановлено, що насіння валеріани та нагідок по різному реагує на інокуляцію мікроорганізмами. Так, бактеріальне навантаження менше 50 тисяч клітин на 1 насінину не впливало на проростання насіння валеріани лікарської. При обробці штамами Agrobacterium radiobacter 204, Flavobacterium sp. 228 та Pseudomonas fluorescens 211 спостерігалося збільшення маси проростків на 15,5 – 24,4 % при навантаженні 50 – 100 тисяч бактеріальних клітин на одну насінину. Збільшення навантаження бактерій на 1 насінину до 150 – 400 тис. клітин в більшості випадків призводило до зменшення маси проростків до 28,9 % у порівнянні з неінокульованим насінням.

Інокуляція насіння нагідок лікарських діазотрофами позитивно впливала на проростання насіння культури. При навантаженні 1 – 2 млн. бактерій на 1 насінину відмічалося підвищення енергії проростання на 1,3 – 21,1 %, схожості насіння – на 4,1 – 8,3 %, а маса проростків на 8 добу зростала на 6,1 – 16,8 %. Проте, збільшення навантаження до 3 – 4 млн. або зменшення до 500 – 600 тис., не позначалося на стимуляції проростання насіння.

З усіх штамів, що перевірялися, Flavobacterium sp. 228 та Pseudomonas fluorescens 211 виявилися найбільш активними продуцентами біологічно активних речовин і відібрані для подальших досліджень.

ВПЛИВ ДІАЗОТРОФІВ НА АЗОТФІКСУЮЧЕ МІКРОБНЕ УГРУПОВАННЯ КОРЕНЕВОЇ ЗОНИ ВАЛЕРІАНИ ТА НАГІДОК

Упродовж 2003 – 2004 рр. вивчалось мікробне азотфіксуюче угруповання кореневої зони лікарських рослин при застосуванні активних штамів діазотрофів.

У фазу формування розетки валеріани визначали чисельність основних груп азотфіксаторів. Отримані дані свідчать про підвищення кількості мікроорганізмів у ризосфері рослин при використанні діазотрофів. Так, інокуляція насіння валеріани діазотрофами Agrobacterium radiobacter 204, Flavobacterium sp. 228 та Pseudomonas fluorescens 211 сприяла зростанню чисельності мікроорганізмів на середовищах Ешбі з цукрозою, Федорова-Калінінської та Доберейнер. Також спостерігається активне заселення ризосфери представниками родів Pseudomonas, Azotobacter та анаеробами роду Clostridium.

Інокуляція насіння нагідок Azospirillum brasilense 18-2 сприяла збільшенню чисельності псевдомонад, при цьому кількість бактерій у ризосфері на середовищах Ешбі з цукрозою зменшилась в 4 – 11 разів, а Федорова-Калінінської – у 2,8 рази в порівнянні з варіантом без інокуляції.

При використанні штаму Agrobacterium radiobacter 204 спостерігається кращий розвиток усіх груп азотфіксаторів, які активно заселяють ризосферу та ризоплану. Особливо це стосується азотобактера, а також анаеробів роду Clostridium, які є досить вибагливими до умов існування.

Використовуючи консорціум штамів Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22 як інокулянт при передпосівній обробці насіння нагідок, спостерігається активне заселення азотобактером як ризосфери, так і ризоплани.

Штами Flavobacterium sp. 228 і Pseudomonas fluorescens 211 стимулювали розвиток псевдомонад і мікроорганізмів на середовищах Федорова-Калінінської та Доберейнер.

При інокуляції насіння валеріани лікарської асоціативними азотфіксуючими мікроорганізмами спостерігалися незначні зміни рівня асоціативної азотфіксації в кореневій зоні рослин протягом усього періоду вегетації. Також встановлено, що під впливом бактеризації не відбулося істотного збільшення вмісту загального азоту в листках рослин.

На відміну від валеріани, застосування азотфіксуючих бактерій при передпосівній обробці насіння нагідок лікарських дозволило значно активізувати азотфіксацію в кореневій зоні рослин.

У найбільш активний період розвитку рослин (фазу бутонізації-початку цвітіння) завдяки використанню діазотрофів A. radiobacter 204 та P. fluorescens211 активність нітрогенази в зоні коренів нагідок підвищувалася відповідно на 79,1 і 47,8 %. У фазу повного цвітіння фіксація молекулярного азоту знижувалася і перевага варіантів з інокуляцією становила всього 8,9 – 27,3 % (рис. 1).

Підвищення рівня асоціативної азотфіксації під впливом інокуляції діазотрофами позначилось на вмісті загального азоту в рослинах. На азотне живлення рослин нагідок позитивно впливали всі застосовані штами діазотрофів. У варіантах з інокуляцією Agrobacterium radiobacter 204, консорціумом Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22 та Pseudomonas fluorescens211, вміст загального азоту відповідно на 22,3; 16,5 та 15,6 % перевищує цей показник у контрольних рослин (табл. 6).

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Фаза 5-6 справжніх листків Фаза бутонізації-початку цвітіння Фаза повного цвітіння

Рис. 1. Активність актуальної азотфіксації у кореневій зоні нагідок лікарських при інокуляції активними штамами діазотрофів (в середньому за 2003 – 2004 рр.):

1 – ґрунт без рослин; 2 – рослини без інокуляції; 3 – інокуляція Azospirillum brasilense 18-2; 4 – -“- Agrobacterium radiobacter 204; 5 – -“- Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22; 6 – -“- Flavobacterium sp. 228; 7 – -“- Pseudomonas fluorescens 211.

Таблиця 6

Вміст загального азоту в листках нагідок лікарських у фазу цвітіння рослин

Варіант | %

Неінокульовані рослини (контроль) | 2,24

Інокуляція Azospirillum brasilense 18-2 | 2,55

-“- Agrobacterium radiobacter 204 | 2,74

-“- консорціум Azotobacter chroococcum 21

i Azotobacter vinelandii 22 | 2,61

-“- Flavobacterium sp. 228 | 2,53

-“- Pseudomonas fluorescens 211 | 2,59

НІР01 | 0,26

Примітка. Істотні значення виділені жирним шрифтом

Таким чином, інокуляція насіння нагідок активними діазотрофами Azospirillum brasilense 18-2, Agrobacterium radiobacter 204, консорціумом Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22, Flavobacterium sp. 228 та Pseudomonas fluorescens 211, дозволила створити активну асоціативну систему діазотрофи - Calendula officinalis L.. При цьому істотно підвищилась активність асоціативної азотфіксації і вміст загального азоту в листках цієї культури.

ІНОКУЛЯЦІЯ ДІАЗОТРОФАМИ ЯК ФАКТОР ПІДВИЩЕННЯ

СТІЙКОСТІ НАГІДОК ЛІКАРСЬКИХ ДО КОРЕНЕВИХ ГНИЛЕЙ

За умов польових дослідів, проведених нами протягом 2003 – 2005 років, виявлено ураження кореневої системи нагідок лікарських збудниками кореневих гнилей.

В процесі вивчення хвороби коренів нагідок лікарських виділено ізоляти збудників кореневих гнилей: Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae (P. k) Wr. emend Bilai, Alternaria alternata (Fr.) Keissler та Rhizoctonia DC.

З метою достовірного встановлення грибної етіології хвороби, витримували постулати Коха. Для цього рослину інфікували виділеним фітопатогенним мікроорганізмом, викликали характерні симптоми та знову з хворих рослин, які вирощувалися в умовах in vitro, виділяли збудника хвороби. Це дозволило підтвердити ідентичність та шкодочинність виділених ізолятів. Через 7 – 10 діб після проростання насіння, інокульованого фітопатогенами, проростки нагідок уражалися збудником хвороби та в’янули.

Результати обліку кореневих гнилей свідчать, що інокуляція насіння діазотрофами сприяє обмеженню поширення та розвитку хвороби.

Аналізуючи дані 2004 року, приходимо до висновку, що у фазу початку цвітіння спостерігається значне поширення кореневих гнилей (в контрольному варіанті кількість уражених рослин досягала 80,3 %. Розвиток хвороби становив 20 %). Використовуючи інокуляцію насіння діазотрофами можна обмежити поширення та розвиток хвороби. При застосуванні штамів Agrobacterium radiobacter 204 та Pseudomonas fluorescens 211 біологічна ефективність складала відповідно 20,5 та 18,8 %. В період достигання насіння біологічний ефект від інокуляції цими культурами становив 32,2 і 29,8 % (рис. 2).

В умовах польового досліду 2005 року результати досліджень були аналогічними.

Як свідчать дані з вивчення антагоністичних властивостей мікроорганізмів, штам Pseudomonas fluorescens 211 не виявляє антагоністичної дії щодо Fusarium sporotrichiella, Alternaria alternata і Rhizoctonia DC. Тому, зменшення захворювання нагідок лікарських кореневими гнилями при інокуляції насіння Pseudomonas fluorescens 211 можна пояснити більш раннім заселенням згаданим штамом кореневої зони, а також підвищенням стійкості рослин до дії

фітопатогенів, що узгоджується з даними літератури (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. 1990; Чумаков М.И., Емцев В.Т. 1988; Надкерничний С.П., Надкернична О.В., 1999; Bothe H., 1988).

Рис. 2. Біологічна ефективність застосування діазотрофів проти кореневих гнилей нагідок лікарських, % (польовий дослід 2004 р.).

1 – Контроль (рослини без інокуляції);

2 – Інокуляція Azospirillum brasilense 18-2;

3 – -“- Agrobacterium radiobacter 204;

4 – -“- консорціумом Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22;

5 – -“- Flavobacterium sp. 228;

6 – -“- Pseudomonas fluorescens 211;

НІР05 у фазу початку цвітіння – 5,3;

НІР05 у фазу достигання насіння – 5,2.

ЕФЕКТИВНІСТЬ БАКТЕРИЗАЦІЇ НАГІДОК ЛІКАРСЬКИХ АКТИВНИМИ ДІАЗОТРОФАМИ

Ефективність інокуляції насіння нагідок лікарських виділеним штамом Pseudomonas fluorescens 211 у порівнянні з біоагентами існуючих бактеріальних препаратів вивчалася упродовж 2003 – 2005 років в умовах польового досліду. Одержані результати наведені в таблиці 7. Дані таблиці засвідчують, що прибавка урожаю суцвіть нагідок від інокуляції насіння P. fluorescens 211 змінювалася по роках в межах 7,9 – 35,1 %. Істотна прибавка урожаю при використанні даного штаму була одержана протягом всього періоду спостереження, тоді як застосування існуючих біопрепаратів сприяло підвищенню урожайності суцвіть тільки в окремі роки.

Результати польових дослідів підтверджуються виробничими випробуваннями експериментальних партій біопрепарату на основі Pseudomonas

Таблиця 7

Вплив діазотрофів на урожайність суцвіть нагідок лікарських при вологості 14 %

Варіант | 2003 рік | 2004 рік | 2005 рік | В середньому

за 3 роки

ц/га | % до контро-лю | ц/га | % до контро-лю | ц/га | % до контро-лю | ц/га | % до контро-лю

Неінокульовані рослини (контроль) | 10,1 | - | 11,4 | - | 5,7 | - | 9,1 | -

Інокуляція Azospirillum brasilense 18-2 | 10,5 | 4,0 | 12,2 | 7,0 | 6,1 | 7,0 | 9,6 | 5,5

-“- Agrobacterium radiobacter 204 | 10,2 | 1,0 | 12,2 | 7,0 | 6,6 | 15,8 | 9,7 | 6,6 | 15

-“- консорціум

Azotobacter chroococcum 21

i Azotobacter vinelandii 22 | 10,4 | 3,0 | 12,2 | 7,0 | 7,0 | 22,8 | 9,9 | 8,8

-“- Flavobacterium sp. 228 | 10,6 | 5,0 | 12,0 | 5,3 | 6,5 | 14,0 | 9,7 | 6,6

-“- Pseudomonas fluorescens 211 | 10,9 | 7,9 | 12,7 | 11,4 | 7,7 | 35,1 | 10,4 | 14,3

НІР05 | 0,62 | 0,64 | 0,80 | -

fluorescens 211 упродовж 2004 - 2005 років, при цьому прибавка урожаю суцвіть у виробничих дослідах складала 9,0 – 9,8 % відповідно (табл. 8).

Таблиця 8

Вплив біопрепарату на основі Pseudomonas fluorescens 211 на урожайність суцвіть нагідок лікарських у виробничих випробуваннях

Варіант | 2004 рік | 2005 рік

Маса сирих суцвіть, ц/га | % до контролю | Маса сирих суцвіть, ц/га | % до контролю

Неінокульовані рослини (контроль) | 8,15 | - | 30,60 | -

Інокуляція біопрепаратом на основі Pseudomonas fluorescens 211 | 8,95 | 9,8 | 33,34 | 9,0

Аналіз сировини нагідок лікарських показав, що застосування Pseudomonas fluorescens 211 дозволило підвищити вміст ефірної олії на 16,7 – 20,0 % у порівнянні з контрольним варіантом. Крім цього спостерігається підвищення вмісту екстрактивних речовин в суцвіттях на 5,9 – 15,5 %.

Таким чином, в умовах польових і виробничих дослідів показано ефективність інокуляції нагідок лікарських новим штамом Pseudomonas fluorescens 211 і біопрепаратом на його основі, прибавка урожаю складала 7,9 – 35,1%, вміст ефірної олії підвищився на 16,7 – 20,0 %, екстрактивних речовин – на 5,9 – 15,5 %.

ЕКОНОМІЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ТА БІОЕНЕРГЕТИЧНА ОЦІНКА ЗАСТОСУВАННЯ PSEUDOMONAS FLUORESCENS 211 ЯК БІОАГЕНТА ПРЕПАРАТУ ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ УРОЖАЙНОСТІ ТА ЯКОСТІ ЛІКАРСЬКОЇ СИРОВИНИ CALENDULA OFFICINALIS L.

Аналіз економічної ефективності використання передпосівної інокуляції насіння нагідок лікарських біопрепаратом у порівнянні з контрольним варіантом (без інокуляції) дозволив встановити, що собівартість виробництва продукції знижується на 10,83 грн./ц, зростає прибуток від реалізації сировини на 958,04 грн./га і підвищується рентабельність виробництва на 9,1 %. Крім того, відмічений досить високий розрахунковий рівень рентабельності застосування препарату, що складає 280,2 %, а кожна вкладена гривня в результаті застосування біопрепарата окупається в 3,80 грн.

Розрахунки біоенергетичної ефективності вирощування нагідок лікарських показали, що при використанні передпосівної інокуляції експериментальними партіями біопрепарату зростають затрати енергії для отримання суцвіть на 12,2 %,

але вміст енергії в господарсько-цінній частині урожаю також підвищився і переважав контрольний варіант на 14,1 %. Коефіцієнт енергетичної ефективності складає 1,28, що перевищує варіант без інокуляції на 1,6 %.

ВИСНОВКИ

На основі теоретичних узагальнень і проведених експериментальних досліджень визначено склад азотфіксуючого мікробного угруповання кореневої зони Valeriana officinalis L. та Calendula officinalis L., показана можливість активізації асоціативної системи діазотрофи – лікарські рослини за рахунок інтродукції активних штамів бактерій-азотфіксаторів для забезпечення підвищення продуктивності і поліпшення якості лікарської сировини за одночасного збереження навколишнього середовища у благополучному стані.

1. Вивчено активність фіксації молекулярного азоту в кореневій зоні Valeriana officinalis L. та Calendula officinalis L. Асоціативна азотфіксуюча система діазотрофи – Valeriana officinalis L. належить до ендоризосферного типу, а система діазотрофи – Calendula officinalis L. – до екзоризосферного типу.

2. Вперше вивчено склад азотфіксуючого мікробного угруповання кореневої зони валеріани та нагідок. З ризосфери і ризоплани зони лікарських рослин виділено 11 активних штамів діазотрофів, представників родів Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas та Flavobacterium. Їх нітрогеназна активність коливалася в межах від 53 до 377 нмоль С2Н4 / 5 мл середовища за годину.

3. Комплекс збудників кореневих гнилей нагідок лікарських представлений мікроміцетами: Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae (P. k) Wr. emend Bilai, Alternaria alternata (Fr.) Keissler та Rhizoctonia DС.

4. Одержано новий штам Pseudomonas fluorescens 211, інтродукція якого в кореневу зону лікарських рослин стимулює розвиток основних груп азотфіксуючого мікробного угруповання, підвищує активність асоціативної азотфіксації, сприяє збільшенню вмісту загального азоту в листках нагідок лікарських і обмежує розвиток кореневих гнилей культури.

5. Інокуляція нагідок лікарських новим штамом Pseudomonas fluorescens211 забезпечила приріст урожаю суцвіть в середньому на 14,3, ефірної олії в суцвіттях нагідок – на 16,7 – 20,0, вміст екстрактивних речовин – на 5,9 – 15,5 % у порівнянні з неінокульованими рослинами.

6. Застосування Pseudomonas fluorescens 211 як біоагента препарату є ефективним технологічним прийомом, що дозволяє знизити собівартість продукції на 10,83 грн./ц, підвищити прибуток від реалізації сировини на 958,04 грн./га та рентабельність виробництва на 9,1 %. Щодо енергетичної оцінки, то бактеризація насіння є також ефективною, оскільки дозволяє підвищити вміст енергії в господарсько-цінній частині урожаю на 14,1 %, а коефіцієнт енергетичної ефективності – на 1,6 %.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Сільськогосподарському виробництву запропоновано штам Pseudomonas fluorescens 211 як біоагент препарату для підвищення урожайності і якості сировини нагідок лікарських. Результати виробничих випробувань показали підвищення урожайності суцвіть нагідок лікарських на 9,0 – 9,8 %. Крім того покращується якість лікарської сировини – вміст ефірної олії зростає на 16,7 – 20,0 %, а екстрактивних речовин – на 5,9 – 15,5 % порівняно з неінокульованими рослинами.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хоменко Г.В., Надкернична О.В. Ефективність інокуляції нагідок лікарських (Calendula officinalis L.) асоціативними азотфіксуючими мікроорганізмами // Агроекологічний журнал. – 2005. - № 4. – С. 57-60. (Проведення