МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ

ОСВІТИ ім. П.Л.ШУПИКА

ІГРУНОВА КСЕНІЯ МИКОЛАЇВНА

УДК: 616.127-0058.001.6:616-097+615+009+557.8+616.155.1

МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ ПОШКОДЖЕНЬ СЕРЦЯ

ПРИ БАГАТОРАЗОВОМУ СТРЕСІ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика Міністерства охорони здоров'я України

Наукові консультанти:

- член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Губський Ю.І.,

завідувач кафедри органічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України.

- доктор медичних наук, професор Зозуля І.С.,

завідувач кафедри медицини невідкладних станів, проректор з наукової роботи, Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України.

Офіційні опоненти:

- Гуляр С.О., доктор медичних наук, професор, провідний науковий співробітник відділу експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України;

- Міхньов В.А., член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор кафедри патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця, головний вчений секретар АМН України.

- Великий М.М., професор, доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу коферментів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна

НАН України.

Провідна установа:

Національний науковий центр "Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України

Захист дисертації відбудеться “ 27 ” березня 2007 року о 14 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4)

Автореферат розіслано “ 26 ” лютого 2007 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

АВТОРЕФЕРАТ

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Не зважаючи на значні досягнення в кардіології, серцево-судинні захворювання залишаються ведучими серед загальної кількості захворювань і серед основних причин летальності населення. Рішення цієї багатофакторної проблеми потребує розробки нових концепцій та підходів. Все частіше сучасні дослідження приводять до висновку про важливість врахування вихідного метаболічного стану, енергообміну міокарда без врахування яких значно знижується ефективність сучасних лікувальних засобів та технологій (Литвицкий П.Ф., 2002; Мойбенко А.А. и соавт., 2003).

Oсновним етіопатогенетичним фактором росту захворюваності і смертності населення розвинутих країн від серцево-судинних захворювань є постійно діючий стрес. Переважають у формуванні несприятливої статистики випадки помірного але систематично діючого стресу на протязі життя, які характерні для людини сучасної цивілізації. Емоційні реакції при стресі супроводжуються змінами активності вегетативної та нейроендокринної систем, які в першу чергу впливають на діяльність серцево-судинної системи (Судаков К.В., 2003).

Активація гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи (ГГНС) та ренін-ангіотензін-альдостеронової системи (РААС), що призводить до гіперпродукції вільнорадикальних продуктів при стресі знайшла своє відображення в нейро-ендокринній теорії розвитку серцевої патології: гіпертонічної хвороби (ГХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС). Але в останні роки з’являється все більше фактів, які неможливо пояснити тільки підвищеною активністю нейрогормонів. Блокада адренорецепторів та активності РААС не дає 100% клінічного ефекту, не є фізіологічною, так як порушує не тільки негативний, а і адаптаційний ефект гормонів (Визир А.Д. и соавт., 2000). Новітні досягнення патофізіології як фундаментальної медичної науки дозволяють прийти до висновку, що при всьому розмаїтті етіологічних факторів, розвиток патології міокарда, в остаточному підсумку визначається виснаженням захисних можливостей єдиної генералізованої регуляторної інтегративної системи організму, що включає в себе нервову, нейрогуморальну й імунну системи (Абрамов В.В., 1999; Земсков А.М. и соавт., 2003; Цейликман О.Б. и соавт., 2004). Одним з важливих досягнень медицини є визнання ролі імунної системи не лише як фактора в розвитку інфекційної, запальної та аутоімунної патології серцево-судинної системи, але і як регуляторної системи підтримання своїми медіаторами – цитокінами гомеостазу разом з нейроендокринними медіаторами (Крыжановский Г.Н., 1997; Korneva E., 1998). Дія ж стресорного чинника на імунну систему через активацію цитокінів традиційно розглядається з погляду порушення саме імунітету, а не гомеостазу. А розвиток патологічних процесів при стресі пов’язують переважно з нейроендокринною активністю. За сучасними уявленнями поєднання нейрогормональної активації та імунної запальної реакції лежить в основі розвитку атеросклерозу та серцевої недостатності (СН), інфаркту міокарда (ІМ), ініціації некрозу та апоптозу клітин серцево-судинної системи (Wood D., Backer G., 1998; Шляхто Е.В., 2002).

Класична діагностика ІМ та виявлення групи ризику базується на виявленні зон та маркерів некрозу. Але за сучасними уявленнями розвиток патології предує некротичним змінам. У випадках, коли некротичні вогнища ще не сформовані, а порушення функції вже є, ці методи не можуть бути інформативними. Крім того, вважається, що не стільки вогнища некрозу можуть бути причиною скоротливої дисфункції серця, як процес ремоделювання, формування якого зумовлюють зони гіпокінезії та апоптоз клітин міокарда (Симоненко В.Б. и соавт., 2000; Фролов В.А. и соавт., 2004).

За сучасними уявленнями апоптоз клітин серцево-судинної системи є одним з основних фундаментальних механізмів розвитку патологічних процесів при помірній, але тривалій дії патогенних чинників, або супутнім некрозу при ІМ. Тому, прогноз перебігу до і післяінфарктного періоду захворювання напряму залежить від формування гіпоксичного типу метаболізму, інтенсивності апоптозу кардіоміоцитів та зниження функціонального резерву міокарда. Розробка нових концептуальних підходів, доступних методів діагностики та виявлення груп ризику, в основу яких покладено визначення апоптозу клітин серцево-судинної системи та його чинників дозволить не тільки виявити ранні етапи розвитку патології, у тому числі ІМ, а і попередити її виникнення, так як перші стадії апоптозу на відміну від некрозу є зворотніми і піддаються корекції. Цитокіни мають специфічні рецептори та сигнальні шляхи апоптозу, безпосередній вплив на апоптозні гени-регулятори, розташовані в мітохондріях, де зосереджені основні ферменти енергообміну, ініціюють апоптоз кардіоміоцитів. Визнано, що падіння мембранного потенціалу мітохондрій та дефіцит АТФ викликають запуск апоптозу (Skulachov V.P., 1994; Лук’янова Л.Д., 2004). Відомо, що саме клітинний енергодефіцит провокує компенсаторну активацію нейроендокринних та імунних медіаторів, що з часом і призводить до формування патологічних станів (Watchinger B. еt al., 1995; Литвицкий П.Ф., 2002). Клінічний прояв захворювань, у тому числі і критичних станів є результатом довгострокового накопичення побічних ефектів попередніх процесів адаптації на різних системних рівнях. Апоптоз лежить в основі ранніх етапів розвитку або загострення патологічних процесів, які до часу клінічно та лабораторно не виявляються. При тому, всі ці процеси носять індивідуальний характер у кожного хворого, мають сезонні та інші біоритмічні коливання. Це передбачає необхідність оперувати не тільки абсолютними значеннями різних показників, які прив’язані до сталої абстрактної середньостатистичної норми, а орієнтуватися на відносні, індивідуалізовані значення, такі як функціональний резерв, метаболічний стан. Поглиблене знання розвитку механізмів пошкодження міокарда дозволить не тільки виділити адекватні критерії діагностики серцево-судинних захворювань, а і завчасно попередити їх подальше прогресування, підібрати адекватні засоби корекції. Пошкодження мітохондрій, порушення енергообміну, ініціація апоптозу та зниження внаслідок цього функціонального резерву клітин є єдиним патобіохімічним механізмом у розвитку патології міокарда, зниження його скоротливості.

Між тим, не встановлено зв’язку між психо-емоційним стресом та активацією продукції цитокінів, як складових загальної нейроендокринноімунної регуляторної системи, станом мембран і енергообміну мітохондрій, ініціацією апоптозу та функціональним резервом в клітинах серцево-судинної системи. Не вивчено ефективність впливу на функціональний резерв та апоптоз клітин корекції стану та енергообміну мітохондрій.

Виходячи із зазначеного, актуальним є комплексний підхід - дослідження механізмів впливу стресу на метаболічний стан та життєздатність клітин імунної системи, ролі цитокінів в пошкодженні енергообміну мітохондрій, ініціації апоптозу кардіоміоцитів, визначення мембранопротекторної та антиапоптозної ефективності корекції порушеного при стресі енергообміну клітин міокарда.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота є самостійною науково-дослідною роботою, яка виконана згідно з планом наукових досліджень НМАПО ім. П.Л.Шупика МОЗ України, є фрагментом комплексних науково-дослідницьких робіт “Розробка патогенетичнозумовлених методів діагностики, профілактики, лікування гострої серцево-судинної недостатності” (державний реєстраційний № 0197И01И694) та “Раптова смерть. Вивчення нейроімунних механізмів розвитку гострої серцево-судинної та цереброваскулярної патології. Розробка комплексних діагностичних тест-систем для виявлення груп ризику, засобів профілактики та лікування” (державний реєстраційний № 0199И000213).

Мета і завдання дослідження. Вивчення механізмів, які лежать в основі розвитку пошкоджуючої дії стресу на енергообмін та морфо-функціональний стан міокарда в експерименті та клініці, створення теоретичної бази для розробки нових діагностичних підходів та засобів корекції при серцево-судинній патології.

Для досягнення цієї мети були поставлені завдання.

1. Вивчити вплив стресу на стан специфічної (імунної) та неспецифічної резистентності, продукцію прозапальних цитокінів, ініціацію спонтанного та індукованого апоптозу мононуклеарних клітин крові в експерименті.

2. Дослідити енергообмін мітохондрій, апоптоз кардіоміоцитів, морфологічний стан міокарда при експериментальному стресі.

3. Розробити на підставі одержаних експериментальних даних концептуальну модель пошкодження міокарда при стресі. Обґрунтувати роль цитокінів у зміні стану мітохондріальних мембран, розвитку енергодефіциту та ініціації апоптозу як ключового механізму пошкодження міокарда при дії стресу.

4. Вивчити ефективність використання антиоксиданта - мембранопротектора та імуномодулятора за умов експериментального імобілізаційного стресу: дослідити в експерименті дію редокс-системи поліфеноли-аскорбінова кислота та імуномодулятора тімаліна на корекцію енергообміну, морфологічного стану, ініціацію апоптозу кардіоміоцитів (КМЦ) при моделюванні стресу.

5. Розробити комплекс діагностичних методик для вивчення функціонального стану клітин крові за визначенням спонтанного та індукованого апоптозу, індукторів апоптозу.

6. Провести апробацію запропонованих методик в кардіологічній клініці.

Наукова новизна отриманих результатів.

У результаті проведених досліджень вперше експериментально встановлено, що через 14 днів імобілізаційного стресу мононуклеари дослідних тварин починають виробляти прозапальні цитокіни: у відповідь на кардіальний антиген – інтерлейкін-1, у відповідь на ендотоксин (ЛПС) – фактор некрозу пухлин при незначній активації оксидантних процесів в крові.

Вперше визначено, що в нормі оптимальне співвідношення функціональної активності – спонтанного апоптозу мононуклеарів (МНК)до функціонального резерву – індукованого апоптозу мононуклеарів дорівнює фундаментальному значенню золотого перетину. Відхилення від цього значення в сторону збільшення означає незабезпеченість роботи клітини її функціональним резервом і подальше виснаження. Відхилення в сторону зменшення свідчать про порушення стимуляції функціональної активності і перевагу синтетичних процесів - анаболізму над катаболізмом.

Показано, що імобілізаційний стрес призводить до активації апоптозу мононуклеарних клітин крові через 14 днів і пригнічення через 28 днів, відповідно до рівня фактору некрозу пухлин (ФНП).

Вперше встановлено, що імобілізаційний стрес призводить до прозапальних змін мікроциркуляторного русла та сполучної тканини міокарда, набряку, порушення інтактності мембран, зниження активності ферментів окисного фосфорилювання мітохондрій кардіоміоцитів (КМЦ), компенсаторної активації гліколізу, зниження вмісту АТФ та ініціації апоптозу клітин міокарда. Застосовано в експерименті редокс-систему поліфеноли – аскорбінова кислота для нормалізації показників імунної та неспецифічної резистентності, покращення енергообміну міокарда та зниження рівня апоптозу у міокарді.

Вперше клінічно показано збільшення рівнів прозапальних цитокінів та експресії проапоптозного гену bax у крові хворих на ішемічну хворобу серця (ІХС) та гіпертонічну хворобу (ГХ), у яких спостерігали зниження загальної фракції викиду (ЗФВ) за рахунок виникнення зон гіпокінезії, підвищення чутливості до дефіциту кисню – зниження скоротливості міокарда на фоні гіпоксичного типу метаболізму.

Вперше застосовано новий комплекс діагностичних методик, які грунтуються на за визначенні інтенсивності спонтанного та індукованого апоптозу клітин крові, рівня їх індукторів. Було проведено визначення функціональної активності і функціонального резерву в культурі мононуклеарів крові пацієнтів за індукцією їх апоптозу та знайдено характерні особливості цього процесу в залежності від форми хвороби. Вперше знайдено зворотний зв’язок між апоптозом МНК та гіпертрофією міокарда.

Вперше сформульована концепція розвитку стресогенної патології міокарда за участю імунних механізмів. Мобілізаційні реакції при дії тривалого невираженого стресу супроводжуються активацією клітин адаптаційної імунної системи та продукції ними прозапальних медіаторів, що згодом зменшує їх енергетичне забезпечення та рівень функціонального резерву. Вже на етапі адаптації до дії стресорного чинника за рахунок прозапальних цитокінів відбуваються зміни на мікроморфологічному рівні, які при подальшому розвитку призводять до формування гіпоксичного типу метаболізму, зниження інтактності та активності ферментів енергообміну мембран мітохондрій. Компенсаторно активується енергозабезпечення через гліколіз, виникає потреба структурної підтримки функції, активації геному, що провокує зниження кількості функціонуючих кардіоміоцитів шляхом апоптозу клітин з дефектними мітохондріями. За рахунок перерозподілу внутрішньо-серцевих об'ємів здійснюється гемодинамічна компенсація і зберігається загальна фракція викиду, тому перебіг цих змін є безсимптомним. Вперше зроблено припущення, що зниження функціонального резерву міокарда через дифузне зменшення кількості КМЦ шляхом апоптозу може привести до виникнення критичних станів без попередньої клінічної маніфестації.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів

Робота відноситься до фундаментальних досліджень, оскільки на основі вивчення рівнів цитокінів та апоптозу в патогенезі пошкоджуючої дії стресу на стан клітин серця, розроблено нові концептуальні підходи до діагностики та корекції патології клітин серцево-судинної системи. Результати дисертаційної роботи мають значення для патологічної фізіології, медичної біохімії, імунології, кардіології, неврології, онкології; поглиблюють і розширюють існуючі уявлення про механізми ушкодження енергообміну та ініціацію апоптозу, дають змогу запропонувати препарат поліфенолів з аскорбіновою кислотою з метою корекції енергообміну в мітохондріях міокарда та протекції апоптозу КМЦ. Завдяки комплексному клініко-експериментальному дослідженню були виявлені аналогічні зміни у розвитку апоптозу кардіоміоцитів та мононуклеарів крові, що дозволило запропонувати новий комплекс діагностичних методик для виявлення осіб групи ризику з загостреннями перебігу захворювання, концептуально відмінний від традиційних лабораторних методів діагностики, спрямованих на визначення маркерів некрозу міокарда.

Особистий внесок здобувача

Автором даної роботи зроблено основний внесок у всі розділи роботи, включаючи постановку завдань, розробку нових методів діагностики патології серцево-судинної системи за визначенням спонтанного, індукованого апоптозу мононуклеарних клітин та їх чинників; проведено всі експерименти, сплановано та організовано проведення клінічних досліджень Проведено аналіз отриманих результатів, написання статей, патентів, тез доповідей.

Апробація результатів дослідження

Основні положення дисертаційного дослідження доповідались та обговорювалися на міжнародній конференції „Нейроиммунология (Санкт-Петербург, 2000)”; Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); Українському біохімічному з’їзді (Київ, 2000); науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю КМАПО ім. П. Л. Шупика (Київ, 1998); першій науково-практичній конференції „Сучасні проблеми невідкладних станів” (Київ, 2000); на засіданні товариства патофізіологів України (Київ, 2004); IV Національному Конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); науково-практичній конференції „Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці” (Київ, 2001); конференції, присвяченій 160 річчю кафедри фізіології КНУ ім. Тараса Шевченко (Київ, 2003); науково-практичній конференції з міжнародною участю „Генетика мультифакторіальної патології” (Київ, 2004); міжнародній науковій конференції “Еколого-фізіологічні проблеми адаптації” (Партеніт, 2003, 2006); Всеукраїнський науково-практичній конференції “Втілення досягнень теоретичної медицини в практику охорони здоров’я” (Київ, 2004); розшириних засіданнях ЦНДЛ та кафедр КМАПО ім. Шупика (Київ, 2003, 2005); сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (Київ, 2006), засіданні Комітету Верховної Ради України з питань охорони здоров’я (Київ, 2006).

Публікації

За темою дисертації опубліковано 46 наукових робіт, в тому числі 20 статей у фахових наукових виданнях, 26 тез в матеріалах з’їздів та конференцій, 3 статті написані автором одноосібно. Отримано 7 деклараційних патентів України на винахід, з них 2 одноосібно. Надруковано 1 методрекомендації.

Обсяг і структура дисертації

Дисертація викладена українською мовою на 330 сторінках машино-писного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу присвяченого опису об’єктів та методів дослідження, 8 розділів, в яких викладено результати власних досліджень, розділу присвяченого аналізу і узагальненню отриманих результатів, переліку використаних літературних джерел, що включає 308 найменувань, з них 201 українською та російською мовами, 107 іншими мовами та додатків.

Робота ілюстрована 74 таблицями, 69 малюнком та 2 схемами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об’єкт дослідження 157 білих щурів та 40 кролів породи Шиншила, підданих дії імобілізаційного стресу; кров 45 хворих на ІХС, 94 хворих на ГХ, 37-и донорів.

Предмет дослідження. Механізми резистентності, цитокіновий статус; апоптоз в клітинах крові дослідних тварин та в крові хворих на ІХС і ГХ; енергообмін, стан мітохондрій та апоптоз кардіоміоцитів у дослідних тварин; морфо-функціональний стан міокарда хворих на ІХС та ГХ.

Методи дослідження. біохімічні, біофізичні, гематологічні, цитологічні, імунологічні, радіологічні, генетичні, клінічні, варіаційно-статистичні.

Матеріали та методи дослідження.

Експериментальні дослідження.

Для відтворення найбільш значущих етіопатогенетичних факторів розвитку серцево-судинної патології - повсякденного невираженого стресу та гіпокінезії, було обрано модель імобілізаційного стресу за Ф.З.Меєрсоном (1984), яка признана класичною моделлю емоційного стресу і на якій можна прослідкувати розвиток морфологічних змін, зокрема апоптозу. 14-денна модель погодинного стресу характеризується перехідним зниженням скоротливості міокарда, ригідністю серцевого м’яза, схильністю до виникнення аритмій, підвищеною адренергічною активністю. Для дослідження подовженої дії стресу основні показники імунного статусу, енергообміну міокарда, морфологічні зміни внутрішніх органів, ефективність корекції енергообміну та апоптозу кардіоміоцитів вивчали через 28 днів погодинного імобілізаційного стресу.

Для корекції стресорних ушкоджень клітинного енергообміну використовували редокс-систему поліфеноли-аскорбінова кислота (препарат корекції - ПК) (5мг/кг) і для порівняння - імунокоректор препарат тімусу – тімалін (стандартне дозування). Критерії та стадії стресу визначали за Сель’є: абсолютні та відносні маси, клітинність селезінки та тимусу, стан слизової оболонки шлунку з метою виявлення виразок та ерозій, лейкограму крові, морфологію наднирників.

Вивчали вплив стресу на фактори імунної системи та неспецифічної резистентності. Проводили: вивчення імунної відповіді на еритроцити барана (ЕБ) за титрами гемолізінів та аглютинінів, розеткоутворюючих клітин – В-РУК та І-РУК методом C. Bianco et al. (1970), факторів клітинного і гуморального імунітету за визначенням сенсибілізованих Т-лімфоцитів та титрів антитіл до серцевого антигену (Е. Кэбот, М. Мейер, 1968), загальних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) (V. Haskova et. al., 1977), неспецифічної резистентності: активності природних клітин кілерів (ПКК) (О.Ф. Мельников, Т.А. Заяц, 1999), фагоцитів (А.А. Славинский, 1989), модуляторів апоптозу – активності оксидантної та антиоксидантної систем за хемілюмінесценцією (ХЛ) плазми крові (М.Е. Кучеренко, А.Н. Васильєв, 1985) вміст прозапальних цитокінів: LIF/LAF інтерлейкіну 1 (ІЛ-1) (Д.К. Новиков, В.И. Новикова, 1979) інтерферону IFN (ІФН), фактору некрозу пухлин TNF (ФНП) (Н.Я. Спивак и др., 1994). Вивчали енергообмін клітин крові– активність лактатдегідрогенази (ЛДГ), сукцинатдегідрогенази (СДГ), К-Na-АТФ-ази, в лімфоцитах та нейтрофілах гістохімічним методом (V. Wachtain, E. Vasel, 1957).

Вивчення апоптозу мононуклеарів. Визначали функціональну активність та функціональний резерв мононуклеарних клітин крові (МНК), як клітин, чутливих до змін гомеостазу, дії нейроендокринних та імунних медіаторів. Доведено, що характер фізіологічної відповіді клітин та систем відображає їх потенційні – резервні можливості. Нами була розроблена методика вивчення функціонального стану– життєздатності МНК за визначенням в культурі їх спонтанного та індукованого з дексаметазоном (ДМТ) in vitro апоптозу методом флуоресцентної мікроскопії з ДНК-барвником Hoechst 33342 (Патенти України № 65147 А (2004 р.), № 65985 А (2004 р.), № 66076 А (2004 р.). Вивчали функціональний стан, адренореактивність мембран: еритроцитів - за осморезистентністю, тромбоцитів - за агрегацією і активністю аденілатциклази та фосфодіестерази гістохімічним за Г. Гайер (1974) та електрономікроскопічним методами.

Вивчення енергообміну міокарда. Проводили спектрофотометричне дослідження показників енергообміну міокарда: K-Na-АТФ-ази (О.М. Романова, 1966), ферментів мітохондрій: сукцинатдегідрогенази СДГ (J. Nordman et al., 1951) цитохромоксидази ЦХО (W. Kerpolla, E. Pitkanen, 1960) АТФ+-синтетази (П.А. Калиман, 1974), пірідінових нуклеотидів (H.U. Bergmeyer, 1963) за умов імобілізаційного стресу, введення адреналіну і обзидану; вивчення стану мітохондріальних мембран міокарда, в яких вбудовані ферменти енергообміну за їх активним набряком (B.K. Tam, P.B. McCay, 1970). Хроматографічним методом вивчали вміст аденозинтрифосфату, аденозиндифосфату, аденозинмонофосфату (АТФ, АДФ, АМФ) (В.Г. Воскобойников, 1966).

Морфологічні дослідження. Морфологічну оцінку стану внутрішніх органів проводили за результатами світлової та електронної мікроскопії, гістохімії. Вивчали апоптоз кардіоміоцитів мікроскопічним та електроно-мікроскопічним методом.

Клінічні дослідження.

Одним з найбільш серйозних ускладнень ішемічної хвороби серця (ІХС) є розвиток порушень ритму і провідності, який збільшує розлад коронарного кровообігу і серцеву недостатність, найчастіше стає ведучим, іноді єдиним проявом захворювання, визначає його прогноз. Групу обстеження склали 45 хворих, що лікувалися у відділенні аритмій серця НДІ кардіології ім. М.Д.Стражеска АМНУ. Морфологічним субстратом для виникнення порушення ритму в 40 хворих був ІХС, у 5-х – міокардитичний кардіосклероз. Обстежено 94 хворих з гіпертонічною хворобою (ГХ), які знаходились на лікуванні в відділі гіпертонічної хвороби інституту кардіології. Відомо, що гіпертензія є найчастішим наслідком стресу (К.В. Судаков, 2003). Контрольну групу склали 37 практично здорових осіб, аналогічних за віком і статтю.

Клініко-інструментальні дослідження. У всіх обстежених за допомогою ЕКГ вивчали аритмогенез, методом ехокардіографії встановлювали рівень гіпертрофії міокарда. Радіонуклідна вентрикулографія (РНВГ) за методикою D. Maddox et. al., (1978) проводилась усім хворим до початку медикаментозного лікування в стаціонарі. Комплекс параметрів РНВГ включав наступні показники скоротливості та гемодинаміки міокарда: загальна фракція вигнання правого і лівого шлуночків серця, фракції вигнання трьох зон шлуночків (переднє-перегородкова, верхівкова, задньобокова), серцеві об’єми (КСО, КДО, УО), характеристики вигнання (СНШСВ, ШВм, Т- ШВм, Vcf ) і наповнення (ШНм, Т-ШНм).

Вивчення стану адренореактиності. Вміст цАМФ і цГМФ у крові досліджуваних хворих визначався радіоімунологічним методом реактивами фірми Immunotech (Чехія). Агрегацію та активність аденілатциклази (АЦ) тромбоцитів досліджували люмінісцентномікроскопічним, електронномікроскопічним та цитохімічним методами.

Дослідження імунного статусу. Вивчали формулу крові, субпопуляції лімфоцитів з моноклональними міченими антитілами до CD, імуноглобуліни, ЦІК, фагоцитоз, активність природних клітин кілерів (ПКК).

Дослідження фізіологічних модуляторів апоптозу. Визначали рівень перекисних сполук за хемілюмінесценцією плазми крові та рівень прозапальних цитокінів: ФНП, ІФН. Методом ПЛР в клітинах крові вивчали експресію проапоптозного гену bax сімейства bcl-2 – генів регуляторів апоптозу (Sigma).

Вивчення апоптозу МНК. Досліджували інформативність розробленої нами методики визначення функціонального резерву та метаболічного стану МНК крові хворих за вивченням їх спонтанного та індукованого дексаметазоном in vitro апоптозу, співпоставляли з імунним статусом, станом скоротливості та гіпертрофії міокарда (патенти України № 63745 А (2004), № 63744 А (2004).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили з використанням непараметричних критеріїв U Вілкоксона-Манна-Уїтні а також параметричного критерію t Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення.

Вплив імобілізаційного стресу на резистентність організму.

Критерії стресу. У тварин, що зазнали впливу 14- денного імобілізаційного стресу виявлена тенденція до зниження відносних та абсолютних показників маси та клітинності лімфоїдних органів. Під дією стресу колір слизової оболонки шлунка змінювався з рожевого до червоного, складки ставали чіткими, з набряком, що притаманно запальній реакції, з подовженням терміну дії стресу виявляли поодинокі зони ерозії та язви на слизовій оболонці. В тканині наднирників за стресорної дії виявляли витончення коркового шару з деліпоїдизацією клітин, в тканині селезінки - ознаки гіпоплазії білої пульпи і повнокрів’я синусоїдів. Подовження строків стресування поглиблювало вираженність змін показників, що вивчалися. За визначеннями лейкоцитарної формули спостерігали еозинопенію, лімфопенію та нейтрофільний лейкоцитоз, що свідчить про стрес-реакцію у дослідних тварин.

Зміни показників формули залежали від їх вихідного стану і мали біоритмічну залежність. Ці зміни ставали чіткішими за умови підсилення стресорного впливу за рахунок або додаткової імунізації еритроцитами барана (ЕБ), або подовження терміну стресування.

Імунний статус. При даних моделях стресу не виявлялося достовірного підвищення титрів антитіл та сенсибілізованих Т-лімфоцитів до алогенної серцевої тканини. Імунна відповідь на ЕБ стресованих щурів була зниженою за титрами гемолізінів та гемаглютинінів, кількістю В-РУК і І-РУК. Підвищувався вміст загальних ЦІК: у щурів на 58% і на 30% у крові кролів.

Енергетичний обмін у клітинах крові – лімфоцитах та нейтрофілах при стресуванні змінювався. Активністі ЛДГ у лімфоцитах і нейтрофілах крові підвищувалася майже вдвічі. Підвищення активності ЛДГ при стресі може бути пов’язаним з переходом від аеробного до анаеробного окислення – гліколізу і може відображати зниження енергозабезпечення клітин. Вивчали активність К-Nа-АТФ-ази цитоплазматичної мембрани лімфоцитів та нейтрофілів. Відомо, що цей фермент бере участь у формуванні трансмембранного потенціалу клітинної мембрани, його активність залежить від рівня АТФ та стану фосфоліпідного шару цитоплазматичної мембран і тому зразу змінюється при різних метаболічних та структурних зрушеннях. Активність ферменту в лімфоцитах стресованих тварин була зниженою у порівнянні з контрольними значеннями на 35,7%, а в нейтрофілах – підвищеною на 30%.

Рис. 1 Активність ЛДГ та СДГ в лімфоцитах щурів, які зазнали 14-денного імобілізаційного стресу (у. о.), n= 20

Разом з даними про активність ферментів енергоутворення (ЛДГ та СДГ) можна констатувати, що дана модель стресу стимулює енергообмін в клітинах неспецифічного захисту та пригнічує його в лімфоцитах.

Механізми неспецифічної резистентності. Стрес, в даній моделі, збільшував природну цитотоксичну активність ПКК, яка підвищувалася при подовженні термінів стресування: у щурів через 14 днів на 7% (неімунізовані), на 32% (імунізовані), у кролів через 14 днів на 31%, через 28 днів – на 100%. При вивченні показників фагоцитозу було знайдено невиражені зміни з тенденцією до активації через 14 днів стресування та пригнічення через 28 днів стресу. Було відмічено залежність змін показників фагоцитозу від вихідного рівня.

З метою визначення стадії стресу окрім гематологічних, можуть використовуватись показники стану системи перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Так первинний спалах ПОЛ можна розглядати як прояв стадії тривоги, реактивне підвищення антиокислювального потенціалу живої системи з пригніченням інтенсивності спонтанного ПОЛ варто розцінювати як стадію резистентності, а вичерпання антиокислювальних ресурсів з виникненням вторинного спалаху ПОЛ – як стадію виснаження (В.А.. Барабой, Д.А. Сутковой, 1997). Стресування імунізованих щурів не веде до суттєвих зрушень процесів ПОЛ відносно контролю. Однак, сама по собі імунізація призводить до зростання середніх значень св. за 5 хв у контрольних тварин, тобто до підсилення інтенсивності у них процесів ПОЛ та збільшення антиперекисного потенціалу крові порівняно з неімунізованими тваринами. Імобілізаційний стрес у імунізованих щурів недостовірно зменшує інтенсивність ПОЛ при одночасному зниженні антиперекисного потенціалу плазми крові. А такі зрушення є характерними для стресу у стадії тривоги у фазі протишоку. Дослідження протягом трьох років процесів ПОЛ у плазмі крові неімунізованих щурів, що зазнавали імобілізаційного стресу показали, що стресування достовірно не змінює у них інтенсивності ПОЛ відносно контролю. Про це свідчать середні значення у них св. за 5 хв. У кролів двотижневий імобілізаційний стрес майже не впливає на показники ПОЛ у плазмі крові. Разом із цим, подовження стресування до одного місяця веде до достовірного зростання інтенсивності ПОЛ та недостовірного збільшення антиперекисного потенціалу крові.

Рис. 2 Перекисна хемілюминесценція плазми крові кролів, що зазнали імобілізаційного стресу протягом 14 та 28 днів у весняно-літній період (травень 2000р.) | Рис. 3 Перекисна хемілюминесценція плазми крові кролів, що зазнали імобілізаційного стресу протягом 14 днів у весняно-літній період (травень 2000 р.)

1 - св. за 5 хв, мВ, 2 – I max/I min

Таким чином, інтенсивність ПОЛ є вираженою не через 14, а через 28 днів стресу.

Вивчення системи цитокінів при імобілізаційному стресі. Відомо, що прозапальні цитокіни, такі як інтерлейкін (IL-1) та фактор некрозу пухлин (ФНП), відіграють важливу роль у патогенезі серцево-судинних захворювань, в реалізації процесів гіперкоагуляції крові, порушенні регулювання судинного тонусу, розвитку гострих коронарних синдромів і ХСН (J. Oppenheim et. al., 1993; Е.Л. Насонов и др., 1999). Аналіз результатів дослідження продукції IL-1 або лімфоцит-активуючого фактора (ЛАФ) показав, що 14-ти денний імобілізаційний стрес призводив до активації прозапальної цитокінової відповіді на кардіальний антиген, спричинював зростання на 50% серед дослідних тварин таких, мононуклеари яких стають чутливими до кардіального антигену і продукують ЛАФ замість ЛІФ. Таким чином, стрес у щурів та кролів призводив до зміни продукції цитокінів на кардіальний антиген, сприяючи підсиленій продукції ЛАФ (ІЛ-1).

Табл. 1 Продукція цитокінів (ЛІФ/ЛАФ) клітиніми крові щурів, що зазнали вплив експериментального стресу

Показник | 1-а група
Інтактні | 2-а група
Стрес

% співвідношення ЛІФ/ЛАФ у дослідних тварин | 50/50 | 22/78

Також спостерігається тенденція визначати ФНП- ? як первинний аферентний імпульс, що генерується організмом у відповідь на численні пошкоджуючі фактори зовнішнього середовища. Встановлена провідна роль ФНП в індукції апоптозу – запрограмованої загибелі клітин при серцево-судинній патології.

Рис. 4 Динаміка змін концентрації фактору некроза пухлин при багаторазовому стресі (пкг/мл).

Після щоденного імобілізаційного стресу впродовж 14 днів виявлено достовірне підвищення (P<0,5 та P<0,05) в 2,08-3,91 рази вмісту ФНП індукованого, та в 1,42-2,86 разів ФНП спонтанного, збільшення кількості ФНП в плазмі кролів в 1,42-3,91 рази. Чутливість клітин крові до індуктора ФНП – ліпополісахариду підвищувалась майже в 4 рази. А після продовження стресу іще впродовж 14 діб – клітини ставали практично не чутливими до дії ЛПС in vitro. Таким чином, імобілізаційний стрес призводив до підвищення рівня ФНП в крові дослідних тварин максимально через два тижні стресування через підвищення чутливості імуноцитів до дії ендотоксину. Через місяць дії стресу чутливість імунокомпетентних клітин до ЛПС падала і рівень ФНП в крові знижувався, що свідчить про виснаження мононуклеарів при тривалому стресі.

Таким чином, можна стверджувати, що у тварин різних видів імобілізаційний стрес, відтворений за обраною нами схемою, переважно не спричинював появи гуморальної та клітинної відповіді на серцевий антиген, однак підвищував чутливість до нього мононуклеарів і продукцію ними прозапальних цитокінів. Також спостерігалася помірна активація системи неспецифічної резистентності.

Вплив імобілізаційного стресу на стан мембран клітин крові. Моделювання стресу призводило до тенденції зниження осморезистентності еритроцитів та істотних змін показників морфофункціонального стану кров'яних платівок експериментальних тварин. Кількість неактивованих тромбоцитів знижувалася до 52,2%, зростало число зворотньо- та незворотньоактивованих, відповідно на 33,3 і 8,6 %, дегранульованих на 5,9 %, зворотньо- та незворотньоагрегованих кров'яних платівок на 13 та 8%. Ці зрушення свідчать про гіперреактивність кров'яних платівок в умовах експерименту. Перебудова глікокаліксу та плазмолеми тромбоцитів обумовлює зміну активності локалізованих в них ферментних систем, що знайшло своє підтвердження у вкрай низькій активності АЦ в плазматичній мембрані. Таким чином, дія імобілізаційного стресу за даною моделлю призводила до хронічного подразнення тромбоцитів та підвищення їх агрегаційної здатності, що може бути зумовленим зниженням активності аденілатциклази тромбоцитів внаслідок тривалого стресу і свідчити про порушення адренергічної регуляції.

Вивчення функціонального стану клітин крові за індукцією їх апоптозу. Вивчення і розшифровка механізмів апоптозу є одним з найбільш актуальних напрямків сучасної медичної науки. Вивчення механізмів розвитку даного процесу дозволить певним чином впливати на його окремі етапи з метою їхньої регуляції і корекції. Вплив ендо-, та екзогенних факторів при стресі може прискорювати або затримувати апоптоз, регулюючи, таким чином, чисельність клітин серцево-судинної системи (G.Takemura et al., 1998; В.Б. Симоненко и др., 2000). Це обгрунтовує вивчення апоптичних індексів при хронічному стресі, серцево-судинних та інших захворюваннях. Нами проводились дослідження впливу імобілізаційного стресу на апоптоз мононуклеарних клітин крові (МНК) щурів та кролів. Глюкокортикоїдна модель індукції апоптоза через активацію НАДФ-Н-оксидази та факторів транскрипції є класичною (A.M. Katz et. al., 1985). В експериментальних умовах найбільш часто використовується дексаметазонова (ДМТ) модель індукції апоптозу тимоцитів, яка дозволяє виявити функціональний стан клітини по значенням спонтанного та індукованого апоптозу. Для визначення функціонального або метаболічного стану МНК як параметра гомеостазу нами була розроблена оригінальна методика визначення рівнів спонтанного та індукованого апоптозу, а також їх співвідношення. Виходячи з одержаних даних, ми можемо зробити висновок, що співвідношення спонтанного апоптозу, який відображає функціональну активність мононуклеарів, до індукованого, який відображає функціональний резерв, в нормі дорівнює значенню золотого перетину. Це значить, що оптимальне співвідношення функції і резерва становить 0,6. ДМТ на фоні 14-денного стресу зменшував кількість живих клітин за рахунок некрозу на 28,7% порівняно з контролем і на 300% збільшував рівень апоптозу. Це непрямо може свідчити про потенціювання дії ДМТ та невиражені зміни вмісту глюкокортикоїдів in vivo при 14-денному стресі. При цьому індекс індукції апоптозу, який у контролі дорівнював значенню золотого перетину, при стресі зменшувався з 0,607±0,06 до 0,497±0,06, що свідчить про активацію МНК у щурів при даній моделі стресу.

Рис. 5. АІ у щурів після 14-денного стресу

(в % відношенні до контролю) | Рис. 6. Процеси апоптозу у кролів

після 14- та 28 днів стресу

(в % відношенню до контролю) |

В культурі МНК кролів 2-тижневий стрес викликав зростання АІ на 37,8% і зменшення кількості живих клітин за рахунок некрозу на 5%, і менше ніж у щурів впливав на відповідь МНК на індукцію апоптозу дексаметазоном – 173,7% порівняно з вихідними показниками, що свідчить про видову специфіку апоптозного процесу. Апоптозний індекс в культурі МНК тварин, що зазнали дії 4-тижневого стресу, становив 51,3%, рівень живих клітин – 87,6% від вихідних показників відповідно, кількість живих клітин при дії ДМТ на фоні стресу становила 77,8%, апоптозний індекс становив 56,4%, тобто дексаметазон практично не викликав індукції апоптозу. Таким чином, через 4 тижні стресу дія ДМТ in vitro не була вираженою, що опосередковано вказує на підвищення рівня глюкокортикоїдів in vivo та зниження чутливості до них МНК. Рівень метаболічного стану або життєздатності, який виявлявся в культурі МНК як співвідношення спонтанного до індукованого апоптозу можемо спостерігати в наступній таблиці.

Табл. 2 Рівень метаболічного стану у культурі МНК (співвідношення спонтанного та індукованого апоптозу) у кролів |

Контроль | Стрес 2 тижні | Стрес 4 тижні

Індекс індукції апоптозу | 0,614±0,06 | 0,739±0,07 | 0,909±0,07 |

Таким чином, двотижневий стрес призводив в середньому до підвищення рівня апоптозу в МНК крові дослідних тварин, що співпадало з підвищенням у них в цей період стресу рівня ФНП. Через місяць стресування рівень апоптозу МНК і продукція ФНП мононуклеарами у крові знижувалися, що дає можливість пов’язати активність апоптозного процесу з продукцією прозапального цитокіну – ФНП.

Адаптаційна модель стресу характеризувалася активацією неспецифічної резистентності організму переважно за рахунок підвищення рівня прозапальних цитокінів – ІЛ-1 та ФНП, ініціацією апоптозу імунокомпетентних клітин - МНК, що супроводжувалося зміною їх метаболічного стану та функціонального резерву.

Вивчення енергообміну міокарда при імобілізаційному стресі. Відомо, що цитокіни безпосередньо впливають на функцію міокарда, рецепторний, трансдукторний та генетичний апарат кардіоміоцитів (КМЦ) (R. Bucala, 1996; В.Н. Федорич, А.В. Федорич, 2001). З іншого боку всі ці процеси є енергозалежними. Основними продуцентами енергії в КМЦ є мітохондрії (МХ). Тому вплив цитокінів на стан мітохондріальних мембран та ферментів, які в них вбудовані є тією патогенетичною ланкою розвитку стресорної патології, яка ще не вивчена і представляє науковий інтерес.

Імобілізаційний стрес через 14 днів призводив до зниження активності ферментів мітохондріальної внутрішньої мембрани: – СДГ на 43%, ЦХО на 24,7%, а також АТФ-синтетази на 41,9%. Знижувався і рівень аденілових нуклеотидів, у тому числі АТФ на 11,4%. Через 28 днів стресування рівень АТФ в міокарді знижувався на 38,1%. При вивченні впливу на ці ферменти -блокатора та адреноміметика було знайдено, що як обзидан так і адреналін призводили до зниження функціональної активності ферментів внутрішньої мембрани мітохондрій, як наведено на діаграмі.

Рис. 7 Вміст аденілових нуклеотидів у міокарді щурів після 14-денного імобілізаційного стресу, після введення адреналіну та обзідану

(мкМ/г сирої тканини)

Рис. 8 Активність та концентрація цитохромів в мітохондріях міокарда щурів після імобілізаційного стресу та дії обзидану і адреналіну (мМ/г білка)

Після 14-денного стресу та після 14-денного введення адреналіну активність АТФ-синтази зменшувалася аналогічно - на 41,9% та 40% відповідно. І стрес і агоністи адренорецепторів призводили до значного підвищення концентрації цитохромів а та С у мітохондріях міокарда, що може свідчити про компенсаторне підвищення синтезу цитохромів при стресі, пов’язане з порушенням адренергічної регуляції. Проведені дослідження показали, що в серцевому м’язі дослідних тварин підвищувався рівень лактату, що призводить до зниження співвідношення NAD(P)/NAD(P)H пар, характерного для підвищення відновних процесів в клітині. |

Рис. 9. Рівень лактату в міокарді дослідних тварин

Співвідношення NAD/NADH в серці щурів при стресі знижувалися, в той час як співвідношення NADP/NADPH за цих умов, навпаки, зростали, що є свідченням переключення потоку вуглецю з гліколізу на глюконеогенез. Дослідження функціонування мітохондрій включає ряд параметрів, серед яких - вивчення стану мітохондріальних мембран, вимірюване спектрофотометрично як набрякання мітохондрій. При вивченні процесу активного енергозалежного набряку мітохондрій тварин після дії імобілізаційного стресу було знайдено, що стрес призводив до зниження властивості мітохондрій активно набрякати у порівнянні з інтактною групою на 45,7% через 30 хвилин інкубації, на 42%, 63,5%, 18,1% відповідно через 60, 90, 120 хвилин.

Примітка: 1 - 30 хв // 2 - 60 хв // 3 - 90 хв // 4 - 120 хв

Рис. 10 Процес активного енергозалежного набряку мітохондрій тварин після дії імобілізаційного стресу

Додавання до середовища інкубації