АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ
ЖУРАВСЬКИЙ Андрій Володимирович
УДК 615.214.2/.3:577.1]-028.77
ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНІ ВЛАСТИВОСТІ
АДАМАНТИЛВМІСНИХ ДІАМІНІВ
14.03.05 – фармакологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ-2007
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано на кафедрі фармакології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України
Науковий керівник - член-кореспондент НАН і АМН України,
доктор медичних наук, професор Комісcаров
Ігор Васильович, Донецький державний
медичний університет ім. М. Горького,
професор кафедри фармакології
Офіційні опоненти - доктор медичних наук, професор, заслужений
діяч науки та техніки України, Громов Леонід
Олександрович, Інститут фармакології та
токсикології АМН України, завідувач відділу
нейрофармакології
- доктор медичних наук, професор Звягінцева
Тетяна Володимирівна, Харківський
державний медичний університет МОЗ
України, завідувач кафедри фармакології з
медичною рецептурою
Провідна установа Одеський державний медичний університет,
кафедра загальної та клінічної фармакології
МОЗ України, м. Одеса
Захист дисертації відбудеться “_16__”_травня_____2007 р. о 13-00_годині на засіданні Спеціалізованої Вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.
Автореферат розісланий “05__”_квітня_____2007 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої Вченої ради
Д 26.550.01
кандидат біологічних наук І. В. Данова
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Зараз в клінічній практиці широко використовують-ся антиамнестичні та церебропротекторні засоби, особливо для лікування психоорганічного синдрому, обумовленого гіпоксією або травмою мозку, нейроінфекцією або нейроінтоксикацією (Б.С. Биленский, 2002; Т.А. Воронина, 2003; І.В. Коміссаров та ін., 2004).
За останнє десятиріччя з’явилися нові дані, які свідчать про провідну роль глутаматергічних синапсів мозку в процесах нейродегенерації, навчання й пам’яті (J. Castillo et al., 1997; А.Ю. Беспалов и соавт., 2000; І.В. Коміссаров, 2004). Так, фенциклідин і дизоцилпін (МК-801) – високоафінні неконкурентні блокатори NMDA подтипу глутаматних рецепторів (NMDA-Rs) – протидіють ішемічним пошкодженням мозку, однак мають високий наркогенний потенціал і викликають нейродегенеративні зміни в ЦНС. Більш перспективними є декстрометорфан і мемантин (E.R. Peskind et al., 2006), оскільки в дозах, що протидіють ексайтотоксичним пошкодженням мозку, ці речовини, які мають властивості „швидких” блокаторів іонних каналів NMDA-Rs, наркогенної активності не виявляють (J.L. Molinuevo et al., 2005). Однак при системному введенні у ефективних дозах (5-20 мг/кг) мемантин та інші блокатори NMDA-Rs можуть викликати гіперкінез, гіперлокомоцію, атаксію й інші ускладнення, які є наслідком невеликої різниці між терапевтичними й токсичними дозами (В.Е. Гмиро и соавт., 2000), що свідчить про необхідність подальшого пошуку церебропротекторних засобів серед неконкурентних блокаторів глутаматних рецепторів. В цьому плані значний інтерес можуть мати адамантилвмісні біс-амонієви сполуки, синтезовані у відділі нейрофармакології Інституту експе-риментальної медицини РАМН, які мають властивості “дуже швидких” неконкурентних блокаторів NMDA і АМРА подтипу глутаматних рецепторів (NMDA/АМРА-Rs). Деякі з цих сполук (ІЕМ-1754, ІЕМ-1755, ІЕМ-1752) виявляють протиішемічну, протигіпоксичну дію, знижують викликану N-метил-D-аспартатом (NMDA) летальність гризунів, відзначаються більш високою активністю (С.Е. Сердюк, 2000). Встановлено, що “дуже швидкі” блокатори серії ІЕМ (ІЕМ-1460, ІЕМ-1490, ІЕМ-1592, ІЕМ-1754 тощо) дисоціюють від субстрату каналів NMDA/АМРА-Rs швидше, ніж канал встигає закритися. У результаті повторюваних переходів активованого NMDA каналу в блоковану форму й назад середня тривалість пачок імпульсів (burst), а отже, й кількість перенесених каналом зарядів, зростає (S.M. Antonov et al., 1995). Це дозволяє розглядати названі ліганди канального домену NMDA/АМРА-Rs швидше як потенціатори, ніж блокатори NMDA/АМРА-рецепторно-канальних ансамблів (І.В. Коміссаров та ін., 2003). Речовини серії ІЕМ в умовах патологічної активації глутаматних рецепторів можуть мати церебро-протекторні ефекти, що робить перспективним їх використання для профілактики й лікування ішемічних уражень головного мозку. Експе-риментальна перевірка цих припущень досі не проводилась, що і обумовлює актуальність роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках планової тематики НДР кафедри фармакології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького ”Механізми корекції функцій та захист ноотропами головного мозку при його гіпоксичних пошкодженнях”. Номер держреєстрації 0100U000003, шифр програми УН 00.01.06.
Мета роботи: експериментально обґрунтувати доцільність пошуку антиамнестичних і церебропротекторних засобів серед структурних аналогів сперміну та гліцину – ендогенних модуляторів глутаматних рецепторів нервових клітин.
Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішували наступні задачі:
1. Вивчити вплив гліцину, сперміну та його структурних аналогів на формування навику пасивного уникання та їх антиамнестичну активність на моделях електрошокової та скополамінової амнезії.
2. Дослідити вплив гліцину, сперміну та його похідних (сполуки серії ІЕМ) на викликані фокальною ішемією мозку порушення умовнорефлекторних навиків у білих щурів.
3. Оцінити нейрон-протективну дію біс-онієвих адамантилвмісних поліамінів серії ІЕМ, їх вплив на перекисне окислення ліпідів і систему анти-оксидантного захисту головного мозку щурів.
4. Дослідити механізми антиамнестичної і протигіпоксичної дії сполук серії ІЕМ.
5. Встановити залежність церебропротекторних властивостей сполук серії ІЕМ від їх хімічної будови.
Об’єкт дослідження – поведінка та процеси пам’яті в нормі, в експе-риментальних моделях скополамінової, електрошокової амнезії та фокальної ішемії головного мозку, церебропротекція при циркуляторній ішемії головного мозку щурів.
Предмет дослідження – неконкурентні блокатори іонних каналів із швидкою кінетикою взаємодії з глутаматними рецепторами (мемантин, ІЕМ-1460, ІЕМ-1490, ІЕМ-1592, ІЕМ-1755), активатор (спермін) поліамін-зв’язувальних сайтів і коагоніст (гліцин) NMDA-Rs, ноотропи (пірацетам, карбацетам).
Методи дослідження – фармакологічні, фізіологічні, біохімічні, морфологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що спермін і деякі його адамантилвмісні аналоги (ІЕМ-1460), що мають „дуже швидку” кінетику блокади/деблокади NMDA/АМРА-Rs, не порушують навчання тварин умовним рефлексам пасивного (УРПУ) і активного (УРАУ) уникання, а, навпаки, сприяють формуванню та збереженню набутих навиків в експе-риментальних моделях амнезії, викликаних у білих щурів скополаміном, електрошоком та компресійною осередковою ішемією мозку. Антиамнестична
активність сперміну та ІЕМ-1460 на 1-2 порядки вища від активності пірацетаму.
Одержано in vivo експериментальне підтвердження гіпотези T.D. Johnson (1996), згідно з якою речовини серії ІЕМ виявляють властивості не тільки блокаторів глутаматних рецепторів у разі їх надлишкової активації, але можуть виступати також у ролі потенціаторів глутаматергічної передачі при її послабленні. ІЕМ-1460, ІЕМ-1490, ІЕМ-1755 сприяють формуванню та відновленню пам’яті у тварин після амнезії, викликаної електрошоком, скополаміном і фокальною ішемією кори мозку, а речовини ІЕМ-1460, ІЕМ-1592 і ІЕМ-1755 зберігають пірамідні нейрони СА1 ділянки дорсального гіпокампа (справа) при циркуляторній гіпоксії мозку щурів.
На моделі циркуляторної гіпоксії мозку щурів встановлена наявність антиоксидантних (мемантин, ІЕМ-1592) і цитопротекторних (мемантин, ІЕМ-1460, ІЕМ-1755, ІЕМ-1592) властивостей речовин, що вивчалися.
Практичне значення одержаних результатів. На основі результатів досліджень експериментально обґрунтовани доцільність застосування гліцину, сперміну та структурно подібних поліамінів (адамантильних похідних діамінів серії ІЕМ), особливо в якості церебропротекторів і коректорів мнестичних функцій.
Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах фармакології Івано-Франківського, Харківського, Луганського, Запорізького, Одеського державних медичних університетів, на кафедрах клінічної фармакології, нормальної та патологічної фізіології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу автор виконав самостійно. Збирання матеріалу, опанування методів, проведення досліджень і статистичну обробку результатів здобувач виконав особисто. Дисертант узагальнив одержані результати, зробив аналіз отриманих даних, сформулював висновки та практичні рекомендації.
Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень оприлюднені на II конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю (Донецьк, 2001), на III національному з’їзді фармакологів України (Одеса, 2006), на засіданнях Донецького наукового товариства фармакологів (2001, 2002, 2003, 2004), опубліковані в тезах II конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю (Донецьк, 2001), республіканській конференції „Актуальні проблеми клінічної, експе-риментальної та профілактичної медицини” (Донецьк, 2001), III Всеросійської конференції з міжнародною участю „Гіпоксія: механізми, адаптація, корекція” (Москва, 2002), II науково-практичній конференції молодих вчених і фахівців „Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових робіт, з них 4 – у наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 4 – у матеріалах з’їздів і конференцій.
Об'єм та структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали та методи дослідження”, 3 розділів власних експериментальних досліджень, обговорення одержаних результатів і висновків. Роботу викладено на 143 сторінках друкованого тексту, ілюстровано 18 рисунками та 11 таблицями, 3 формулами. Список літератури містить 250 найменувань, з них 75 вітчизняних і 175 іноземних джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Досліди виконано на 658 білих щурах лінії „Вістар” обох статей масою 170-230 г, розводки віварію ДонДМУ ім. М. Горького. Усі тварини утримувались на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. Тварини отримували стандартне харчування у вигляді збалансованого гранульованого корму за встановленими нормами.
Біохімічні дослідження проводили в центральній науково-дослідницькій лабораторії ДонДМУ ім. М. Горького, акредитованій МОЗ України (атестат акредитації №0017113 від 30.02.04). Експерименти проводили з урахуванням методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України “Доклінічні дослідження лікарських засобів” (О.В. Стефанов, 2001). Вивчали антиамнестичну та антиоксидантну активність гліцину (“Реахим”, Росія), пірацетаму (ноотропіл, “Polfa”, Польща), карбацетаму (Інститут фізико-органічної хімії та вуглехімії НАН України, Донецьк), аркаіну та сперміну (“RBI”, США), мемантину (“Merc”, Німеччина), серії адамантилвмісних поліамінів (ІЕМ-1460, ІЕМ-1490, ІЕМ-1592, ІЕМ-1755), синтезованих д. х. н. В.Є. Гміро в Інституті експе-риментальної медицини РАМН, Санкт-Петербург (рис. 1).
Будову й чистоту сполук підтверджено даними елементарного аналізу, спектральними та хроматографічними методами. Експериментальні дози речовин серії ІЕМ складали 1/10 від LD50 (умовно-терапевтичні дози). ІЕМ-1490, ІЕМ-1592 використовували в дозі 3 мг/кг; ІЕМ-1755 – в інтервалі – 3-20 мг/кг; ІЕМ-1460 – 1-10 мг/кг. Дози пірацетаму, карбацетаму, сперміну і гліцину використовувалися з урахуванням Методичних рекомендацій по експе-риментальному вивченню препаратів з ноотропним типом дії (М.: Медицина, 1989).
Антиамнестичну активність речовин, що вивчалися, оцінювали за здатністю щурів зберігати умовнорефлекторні поведінкові навики – умовний рефлекс активного (УРАУ) та пасивного (УРПУ) уникання після їх пригнічення амнезуючими факторами, якими були максимальний електрошок (50 Гц, 50 мА, 0,5 с), скополаміну гідробромід (2 мг/кг, внутрішньом’язово) та фокальна ішемія головного мозку, виконана за методикою І.В. Барскова та І.І. Вікторова (1994). Фокальну ішемію виконували шляхом дозованого за ступенем (40 мм рт ст) і часом (15 хв) стискання обмеженої ділянки (9,6 мм2) тім’яної зони кори головного мозку щурів за такими координатами: 3 мм каудальніше Брегми й 3 мм латеральніше сагітального шва справа. Морфологічні дослідження прово-
дили через 5, 10 і 20 днів після фокальної компресійної ішемії головного мозку тварин.
Рис. 1. Загальна формула адамантилвмісних діамінів
Для оцінки цитопротекторної та антиоксидантної дії досліджуваних речовин використовували методики перев’язування правої загальної сонної артерії з подальшим морфологічним і біохімічним дослідженням мозку щурів. На 6 добу після перев’язування артерії в головному мозку визначали активність супероксиддисмутази (СОД), каталази, вміст малонового діальдегіду (МДА) та проводили підрахунок кількості пірамідних нейронів СА1 зони дорсального гіпокампа справа. Метод визначення активності СОД ґрунтується на здатності ферменту гальмувати реакцію автоокислення адреналіну при рН 10,2 (О.П. Макаревич и соавт., 1983). Вміст МДА визначали за реакцією з тіо-барбітуровою кислотою з подальшим кількісним визначенням забарвленого продукту спектрофотометрично (И.Д. Стальная и соавт., 1977). Принцип застосованого в роботі методу спектрофотометричного вимірювання активності каталази в гомогенатах мозку ґрунтується на здатності перекису водню
утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс (М.А. Королюк и соавт., 1988).
Паралельно з біохімічним проводили морфологічне дослідження мозку тварин. Згідно з атласом стереотаксичних координат (J. F. R. Kowig et al., 1963), з мозку щурів виділяли блоки товщиною 0,3-0,4 см, які містять дорсальний гіпокамп, фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну (1-2 дні), промивали в проточній воді (до 24 годин), зневоднювали в спиртах висхідної міцності й заливали в парафін. Потім на рівні nucleus mamillaris medialis, pars medialis (3 мм каудальніше Брегми) на мікротомі готували зрізи товщиною 5 мкм, які забарвлювали тіоніном за методом Ніссля (Г.А. Меркулов, 1969). Вивчення мікропрепаратів проводили при збільшенні об’єктива Х40, окуляра Х10 під мікроскопом Olympus СX-41 за допомогою інтегрованої цифрової фотокамери Olympus C-5060 4Х 5Mpx (http://www.olympus-global.com.). Використовували класифікацію М.С. Абдуллаходжаєвої (1981) та О.С. Виноградової (1975). Кількість непошкоджених пірамідних нейронів в одиниці площі СА1 зони дорсального гіпокампа справа розраховували в програмі Adobe Photoshop 5.5 (М. Стразницках, 2000) з поправкою на товщину зрізів за методикою Г.Г. Автанділова (1990). Для цього на мікрофотографії накладали сітку з величиною кожної зі сторін її квадратів, що дорівнювала ступеню збільшення мікроскопа та проводили підрахунок кількості квадратів сітки, розміщених всередині контура січення пірамідного шару СА1 зони гіпокампа. За кількістю квадратів розраховували загальну площу січення та кількість нейронів в одиниці площі. Критеріями загибелі нейронів вважали зміни форми (полігональні клітини), гіперхромію та набряк (зона просвітлення навколо нейрона).
Одержані результати обробляли загальноприйнятими методами варіацій-ної статистики. Для кожної серії дослідів визначали середню (М), стандартну похибку середньої (m), довірчий інтервал (m * t) при Р0,05. Вірогідність відмінностей оцінювали за допомогою критерію (t) Стьюдента. Статистичну обробку проводили в програмному пакеті “STATISTICA 5.1”.
Результати досліджень та їх обговорення. Антиамнестична активність гліцину, сперміну та адамантилвмісних аналогів останнього (сполук серії ІЕМ). Під час вивчення впливу досліджуваних речовин на УРПУ було встановлено, що жодна з речовин серії ІЕМ (ІЕМ-1460, ІЕМ-1490, ІЕМ-1755) у дозі 3 мг/кг не порушує набуття щурами УРПУ. Більше того, спермін (3 мг/кг), ІЕМ–1460 і ІЕМ–1490 сприяли збереженню УРПУ після скополамінової амнезії через 1 годину і навіть через 24 години після навчання УРПУ (рис.2). Німецькими вченими (L.J. Bertoglio et al., 2004) вже був установлений анксіо-літичний ефект мемантину (8 мг/кг) на білих щурах у моделі скополамінової (1,5 мг/кг) амнезії. Наші результати підтверджують антиамнестичні властивос-ті адамантилвмісних діамінів і свідчать про те, що ІЕМ-1460 і ІЕМ-1490, володіючи меншою кількістю побічних ефектів, також сприяють відновленню пам'ятного сліду, порушеного скополаміном. ІЕМ-1755 не усував скопо-ламінової амнезії, що може буди обумовлено наявністю холінолітичної актив-
ності у ІЕМ-1755. Ця речовина попереджала розвиток клоніко-тонічних судом, викликаних нікотином (В.Е. Гмиро и соавт., 2000).
Рис. 2. Вплив сперміну та сполук серії ІЕМ на скополамінову амнезію. Латентний час першого заходу (А) і кількість заходів (Б) до темного відсіку в контролі (розчинник) і в дослідах: спермін (СП), ІЕМ-1755, ІЕМ-1460, ІЕМ-1490 дозами 3 мг/кг. Три стовпчики в контролі – середні значення реєстрованих параметрів до, через 1 і 24 год після навчання; пари стовпчиків відбивають ті ж параметри через 1 і 24 год після навчання. Вертикальні лінії – довірчий інтервал середніх при Р=0,05 і n=8-10 тварин.
В умовах “жорсткої” моделі електросудомної амнезії антиамнестичний ефект чітко проявляється при введенні відразу після електрошоку ІЕМ-1460 (1-10 мг/кг) і сперміну (1-3 мг/кг). У вказаних дозах ці речовини збільшують кількість щурів, які відтворюють УРАУ через 1 і 24 год після електрошоку. Антиамнестичний ефект ІЕМ-1490 і ІЕМ-1755 виявляється тільки під час реєстрації УРАУ через 1 годину після електрошоку. Аналогічний ефект аркаіну спостерігається лише в разі застосування помірних доз (1-3 мг/кг). При вищих дозах (10-20 мг/кг) і в більш віддалені строки (24 год) антиамнестичний ефект аркаіну відсутній (табл. 1). Оскільки у високих дозах аркаін не виявляє антиамнестичного ефекту, який спостерігається при помірних дозах, його швидко минущий ефект обумовлений не високою швидкістю елімінації, а іншою причиною. Як парціальний конкурентний блокатор поліамін-зв’язувальних сайтів NMDA-Rs, аркаін при низьких концентраціях може виявляти сперміноподібні властивості позитивного модулятора NMDA-Rs. Ці його властивості, ймовірно, є основою описаного антиамнестичного ефекту аркаіну, який при високих дозах і в більш віддалені строки виступає в ролі блокатора спермінзв’язувальних сайтів NMDA-Rs. Належність ІЕМ-1490, і особливо ІЕМ-1755, до парціальних агоністів поліамінзв’язувальних місць NMDA-Rs може пояснити короткочасність антиамнестичного ефекту цих сполук. Про можливість співпадіння місць зв’язування сполук серії ІЕМ з місцями зв’язування поліамінів у NMDA-рецепторах свідчить здатність аркаіну (20 мг/кг) усувати антиамнестичний ефект ІЕМ-1460 (табл. 1). Сам
8
аркаін, активатор і парціальний блокатор сайтів, що зв’язують поліаміни, виявляє антиамнестичний ефект тільки у вузькому діапазоні доз і короткочасно: через одну добу після шоку він відсутній.
Таблиця 1
Вплив сперміну, аркаіну та сполук серії ІЕМ на амнезію, викликану максимальним електроконвульсивним шоком (МЕШ)
Речовина | Доза мг/кг | Кількість щурів у групі | Кількість щурів, що відтворюють УРАУ після електрошоку через
1 годину | 24 години
n | P* | n | P*
Контроль
(розчинник) | __ | 31 | 7 | 11
Спермін | 0,3 | 8 | 2 | 0,35 | 4 | 0,24
1 | 8 | 5 | 0,038 | 6 | 0,046
3 | 8 | 5 | 0,038 | 7 | 0,01
Аркаін | 0,3 | 8 | 3 | 0,23 | 4 | 0,23
1 | 8 | 5 | 0,038 | 5 | 0,12
3 | 8 | 5 | 0,038 | 5 | 0,12
10 | 8 | 3 | 0,23 | 4 | 0.24
20 | 8 | 2 | 0,35 | 4 | 0,24
ІЕМ-1755 | 3 | 8 | 5 | 0,038 | 2 | 0,29
ІЕМ-1460 | 1 | 8 | 6 | 0,009 | 6 | 0,046
3 | 8 | 7 | 0,001 | 6 | 0,046
10 | 8 | 8 | 0,0001 | 6 | 0,046
ІЕМ-1490 | 3 | 8 | 6 | 0,009 | 4 | 0,24
Аркаін +
+ ІЕМ-1460 | 20 | 9 | 3 | 0,007** | 7 | 0,4**
10
Примітки: 1.* – ймовірність нульової гіпотези порівняно з контролем, розрахована за Фішером; 2.** – те саме при порівнянні ефектів ІЕМ-1460 (10 мг/кг), введеного без аркаіну та сукупно з ним.
У дослідах встановлено, що фокальна компресійна ішемія головного мозку, виконана за І.В. Брасковим та І.І. Вікторовим (1994), шляхом дозованого за ступенем (40 мм рт ст) і часом (15 хв) стискання обмеженої ділянки (9,6 мм2) тім’яної зони кори головного мозку щурів за такими координатами: 3 мм каудальніше Брегми й 3 мм латеральніше сагітального шва справа, порушує вироблення УРПУ. Амнезуючий ефект компресійної ішемії мозку проявляється відсутністю змін латенції першого заходу порівняно з латенцією до навчання та
незначним зменшенням кількості заходів тільки в один часовий період.
9
Патогенез амнезії у цій моделі пов’язаний із формуванням необоротного морфологічного дефекту – структурної деструкції та втратою нейрональної функції (табл. 2).
Таблиця 2
Вплив компресії мозку на формування умовної реакції пасивного уникання у щурів (M±m, n=8-10 в кожній групі)
Умови дослідів | Латенція першого заходу до темного відсіку, с
До навчання | після навчання, годин
1 | 24 | 48 | 96
Контроль (інтактні щури) | 26,5±3,5
(18,834,9) | 117,5±18,1#
(54,2175,7) | 72,3±18,1#
(32,5112) | 40,2±14,1
(9,271,2)
Трепанація | 27,8±10,6
(2,653,1) | 99,3±20,5#
(54,2144,4) | 66,1±8,6#
(46,186,1) | 47,1±21,0
(1,997,4) | 12,7±3,9
(3,322,1)
Трепанація + компресія | 17,5±3,6
(8,826,2)
Р=0,3 | 13,1±5,0
(1,025,2)
Р=0,001 | 28,0±11,8
(0,0255,9)
Р=0,04 | 10,6±1,7
(6,614,5)
Р=0,1 | 12.0±1,84
(7,616,3)
Р=0,9
Кількість заходів до темного відсіку (M±m)
Контроль (інтактні щури) | 1,8±0,29
(1,12,5) | 0,5±0,18#
(0,060.94) | 0,75±0,11#
(0,51,0) | 0,9±0,15#
(0,561,24)
Трепанація | 1,6±0,26
(1,02,2) | 0,5±0,18#
(0,060,94) | 0,75±0,16#
(0,381,13) | 0,87±0,12#
(0,591,15) | 1,12±0,12
(0,81,4)
Трепанація + компресія | 2,0±0,26
(1,32,7)
Р=0,3 | 1,2±0,12#
(0,921,48)
Р=0,03 | 1,0±0
(1,01,0)
Р=0,14 | 1,3±0,2
(0,841,76)
Р=0,09 | 1,2±0,2
(0,71,6)
Р=0,3
Примітки: 1. Трепанацію або трепанацію та компресію проведено за одну добу до навчання щурів; 2. # – статистично значущі відмінності (Р0,05) латенції першого заходу та кількості заходів до темної камери до й після навчання; у дужках – довірчий інтервал для середньої при Р=0,05; 3. Р– ймовірність нульової гіпотези під час порівняння даних, одержаних на щурах, яким було зроблено трепанацію без компресії мозку й трепанацію з компресією.
Спермін (10 мг/кг), ІЕМ-1460 (3-20 мг/кг), пірацетам (200-400 мг/кг) і карбацетам (20 мг/кг) введені внутрішньом’язово двічі – після закінчення компресії та ушивання рани та через одну добу за 30 хв до навчання – сприяють формуванню УРПУ та збереженню навику протягом 24 годин після навчання, гліцин (50 мг/кг) і ІЕМ-1755 (6 мг/кг) – тільки виробленню УРПУ (рис. 3). ІЕМ-1490 (3-10 мг/кг), ІЕМ-1592 (1-2 мг/кг) і мемантин (3-20 мг/кг) не мають у цих
10
умовах антиамнестичної дії. Таким чином, серед досліджених речовин можна виділити ті, які в обраних моделях амнезії не відновлюють порушену скопо-ламіном, електрошоком і фокальною ішемією здатність до навчання (мемантин, ІЕМ-1592). Друга група речовин, до якої належать гліцин, ІЕМ-1490 і, значною мірою, карбацетам, відновлює здатність до навчання, але не діє або слабко впливає на збереження набутого поведінкового навику. Спермін, ІЕМ-1460 і пірацетам не тільки відновлюють порушену ішемією здатність до навчання, а й забезпечують збереження набутого навику протягом 48 годин після компресії мозку.
Рис. 3. Вплив ІЕМ-1460 і ІЕМ-1755 на навчання і збереження УРПУ у щурів з фокальною ішемією кори мозку.
* – Р<0,05 у порівнянні з контролем. Кількість щурів у групах (n=8).
ІЕМ-1592 не виявляє антиамнезуючої активності в жодній з використаних моделей амнезії. Антиамнестичний ефект ІЕМ-1460, ІЕМ-1755, ІЕМ-1490 ми пов’язуємо з кінетикою блокади/деблокади NMDA/АМРА-Rs. За даними S. M. Antonov і співавторів (1995), сполуки серії ІЕМ виявляють властивості блокатора відкритих каналів NMDA/АМРА-Rs з „дуже швидкою” кінетикою. Вони швидше дисоціють від субстрату каналу, ніж канал встигає закритися, і тому тривалість пачок імпульсів зростає: у контрольних умовах, тобто за наявності 10 мкМ NMDA і 10 мкМ Gly, burst складала 8,6±2,4 мс, а при додатковому впливі 30 мкМ ІЕМ-1460 зростала до 43,6 мс. При цьому, з одного боку, збільшується період десенситизації каналу, що сприяє захисту клітини в разі надлишкового вивільнення глутамату, а з іншого, зростає кількість зарядів, перенесених всередину клітини, що може бути основою позитивного впливу на навчання та пам’ять в фізіологічних умовах (І.В. Коміссаров, 2001). У антиамнезуючому ефекті ІЕМів важливе значення мають їх сперміноподібні властивості.
Церебропротекторні та антиоксидантні властивісті адамантил-вмісних діамінів. Для вивчення захисної дії сполук серії ІЕМ було використано
11
модель перев’язування правої загальної сонної артерії з подальшим (на 6 добу) морфологічним і біохімічним дослідженням мозку тварин. На 6 добу після перев’язування артерії в головному мозку визначали активність СОД, каталази, вміст МДА та проводили підрахунок кількості пірамідних нейронів СА1 зони дорсального гіпокампа справа. Мемантин, пірацетам, ІЕМ-1460, ІЕМ-1592, ІЕМ-1755 в лікувальному режимі вірогідно попереджують пошкодження та загибель пірамідних нейронів СА1 зони дорсального гіпокампа справа через 5 діб після перев’язування правої загальної сонної артерії (рис. 4).
Рис. 4. Кількість пірамідних нейронів в 1 мм2 пірамідного шару СА1 зони дорсального гіпокампа справа у щурів через 5 діб після перев’язування правої загальної сонної артерії без введення та після введення досліджуваних речовин;
# – Р<0,05 при співставленні з контролем; * – Р<0,05 відносно групи порівняння. Кількість щурів у групах (n=7-8).
Представлені в таблиці 3 результати свідчать про те, що перев’язування правої загальної сонної артерії істотно впливає на перекисне окислення ліпідів (ПОЛ) у мозку щурів. Це проявляється збільшенням вмісту кінцевого продукту ПОЛ, а саме МДА, вдвічі. Спостережуване при цьому, ймовірно, компенсатор-не підвищення активності каталази, виявлене й іншими авторами (V. Danieliso-va et al., 2005), теж розцінюється як реакція у відповідь на ішемію. Активність СОД істотно не змінювалась. Відсутність змін активності СОД спостерігалося й іншими дослідниками в різних моделях ішемії (Ю.Т. Салига та ін., 1999) і також узгоджується зі збільшенням активності каталази (В.Й. Кресюн та інш., 1990). П’ятиразове внутрішньом’язове введення пірацетаму (200 мг/кг), мемантину (10 мг/кг) та ІЕМ-1592 (3 мг/кг) 1 раз на добу призводило на 6 добу після оклюзії артерії до вірогідного зниження вмісту МДА в тканині мозку. Це дає підставу говорити про мембранопротекторний ефект ІЕМ-1592 і мемантину. Одержані дані узгоджуються з даними H. Ozsuer і співавторів (2005), які на моделі закритої травми головного мозку мишей лінії Sprague-Dawley встановили, що мемантин, введений інтраперитонеально дозою 10 мг/кг через 15 хв після закритої травми голови, призводить до вірогідного зниження рівня
12
МДА в головному мозку.
Таблиця 3
Вміст МДА, активність СОД і каталази в головному мозку щурів після перев’язування правої загальної сонної артерії без введення та після 5-денного введення досліджуваних речовин (M±m, n=8)
Групи тварин | Речови-
на | Доза,
мг/кг | МДА,
нмоль/г
тканини | СОД,
Е/мг белка | Каталаза,
Мккат/г тканини
Контрольна
(несправжньо-оперовані) | 0,9%
р-р
NaCl | __ | 12,4±1,34
(9,20ч15,6) |
1,20±0,27
(0,55ч1,85) |
40,0±8,07
(21,0ч59,1)
Порівняння
(перев’язування a. carotis com. dextr.) | 0,9%
р-р
NaCl | __ | 22,9±0,72*
(21,2ч24,6)
Р<0,001 | 1,63±0,33
(0,85ч2,41)
Р=0,34 | 131,0±7,2*
(114,0ч148)
Р<0,001
Дослідна
(перев’язування a. carotis com. dextr.) | Піраце-
там | 200 | 9,7±0,45
(8,6ч10,7)
Р<0,001 | 2,5±0,67
(0,9ч4,1)
Р=0,27 | 46,8±5,0
(34,9ч58,7)
Р<0,001
Меман-тин | 10 | 10,3±1,23
(7,4ч13,24)
Р<0,001 | 0,42±0,08
(0,23ч0,61)
Р=0,003 | 102,3±9,96
(78,7ч125,9)
Р=0,036
ІЕМ-1460 | 10 | 20,2±1,89
(15,6ч24,8)
Р=0,179 | 0,27±0,06
(0,12ч0,42)
Р=0,0023 | 85,7±15,9
(46,8ч124,7)
Р=0,018
ІЕМ-1592 | 3 | 11,3±0,7
(9,7 ч12,8)
Р<0,001 | 0,9±0,2
(0,5ч1,3)
Р=0,08 | 104,6±15,3
(68,4ч140,8)
Р=0,141
ІЕМ-1755 | 6 | 24,7±1,3
(21,6ч27,8)
Р=0,25 | 1,37±0,18
(0,9ч1,8)
Р=0,51 | 63,0±7,0
(46,4ч79,6)
Р<0,001
Примітки: 1. * – Р0,05 у співставленні з показниками контрольної групи; 2. – Р 0,05 у співставленні з показниками групи порівняння; 3. Р –
ймовірність нульової гіпотези; 4. У дужках – довірчий інтервал для середньої при Р=0,05;
ІЕМ-1592 в дозі 3 мг/кг перешкоджає вільнорадикальному окисленню ліпідів (зниження МДА) і в той же час сприяє збереженню пірамідних нейронів гіпокампа. Жодна з досліджуваних сполук серії ІЕМ не виявляла поєднання цих
13
двох властивостей. Ймовірно, збільшення об’єму онієвої групи шляхом заміни однієї метильної групи на ізопропільну (рис. 1) позбавляє сполуку ІЕМ-1592 антиамнезуючих властивостей і надає їй церебропротекторну активність. Навпаки, наявність трьох метильних радикалів біля аміногрупи надає речовині найбільш виражену антиамнестичну активність (ІЕМ-1460).
Дослідження останніх років засвідчують, що основним механізмом антиоксидантного захисту є не безпосередне пригнічення вільнорадикальних реакцій, а передусім регуляція інтенсивності вільнорадикальних процесів, які використовуються в організмі для формування кисневого гомеостазу. Якщо пірацетам є еталонним антиоксидантом, який або порушує утворення, або нейтралізує вільні радикали, що утворилися (Р.У. Островская, 2003), то анти-оксидантні властивості мемантину, ІЕМ-1460 і ІЕМ-1755, ймовірно, обумовлені блокадою глутаматних рецепторів і зниженням глутаматергічної трансмісії в умовах ішемії головного мозку. На користь цього припущення говорить той факт, що продукція активних форм кисню опосредкована не тільки енерго-дефіцитом, а й залежною від активації NMDA-Rs позаклітинною сигнал-регульованою кіназою (K.T. Kishida et al., 2005).
Таким чином, у роботі показано, що ІЕМ-1460 (1, 3, 10 мг/кг) ефективний на всіх експериментальних моделях амнезії. Не впливаючи на навчання УРПУ, ІЕМ-1460 сприяє формуванню УРПУ при скополамінової і електрошокової амнезії, а також формуванню й збереженню УРПУ після фокальної ішемії тім'яної кори головного мозку щурів. По спектру антиамнестичної активності й ефективності ІЕМ-1460 подібний сперміну – ендогенному лиганду полі-амінових сайтів, і карбацетаму – клінічно апробованому ноотропу. Анти-амнестичний ефект ІЕМ-1460 може бути пов'язаний з сперміноподібними властивостями, а також з „дуже швидкою” кінетикою блокади/деблокади відкритої форми каналу глутаматних рецепторів у фізіологічних умовах.
Інша група досліджених сполук представлена аркаіном, ІЕМ-1490, ІЕМ-1755. Ці речовини можуть сприяти формуванню умовного рефлексу уникання, але не забезпечують його збереження. Так, аркаін не сприяє збереженню УРАУ в широкому діапазоні доз: від 0,3 мг/кг до 20 мг/кг, але сприяє формуванню УРАУ в дозах 1 і 3 мг/кг. Дозу 0,3 мг/кг у цьому тесті можна розглядати як допорогову; дози 1 і 3 мг/кг – як ефективні, що викликають сперміноподібний ефект аркаіна в моделі електрошокової амнезії.
Третя група сполук, представлена мемантином і ІЕМ-1592, не виявляє антиамнезуючий активності в жодній з використаних моделей амнезії. Можна вважати, що ці речовини, як блокатори відкритих іонних каналів глутаматних рецепторів, перешкоджають їхній активації й знижують функцію глутамат-ергічних синапсів.
ІЕМ-1592, ІЕМ-1460 та ІЕМ-1755 вірогідно перешкоджають пошкоджен-ню та загибелі пірамідних нейронів СА1 зони дорсального гіпокампа справа, а ІЕМ-1592 перешкоджає також вільнорадикальному окисленню ліпідів нервових клітин при ішемії головного мозку, що робить перспективним використання ІЕМ-1592 у якості церебропротекторного засобу.
14
ВИСНОВКИ
В роботі експериментально обґрунтовується доцільність використання адамантилвмісних діамінів серії ІЕМ, особливо ІЕМ-1460 в якості церебро-протектора з антиамнестичною дією.
1. Спермін та його похідні (сполуки серії ІЕМ), так саме як і аркаін у дозах 1/10 LD50 (одноразове внутрішньом'язове введення) не змінюють показники УРПУ та УРАУ у інтактних білих щурів, тобто не порушують здатність набувати та зберігати умовнорефлекторні поведінкові навички.
2. На фоні електрошокової або скополамінової амнезії одноразове
внутрішньом'язове введення білим щурам ІЕМ-1460 (1-10 мг/кг), ІЕМ-1490 (3 мг/кг), так само, як і спермін (1-3 мг/кг), усувають прояви амнезії (нездатність білих щурів відтворювати вироблені умовнорефлекторні поведінкові навички УРПУ та УРАУ), сполука ІЕМ-1755 (3 мг/кг) виявляє такі властивості лише на електрошоковій моделі.
3. ІЕМ-1460 (3-20 мг/кг), спермін (10 мг/кг) при лікувальному введенні
(двічі, один раз на добу) сприяють формуванню та збереженню умовного рефлексу пасивного уникання, порушеного внаслідок минущої компресійної ішемії тім'яної кори мозку щурів, і в цьому відношенні не поступаються пірацетаму і карбацетаму. ІЕМ-1755 (5 мг/кг), гліцин (50 мг/кг) сприяють тільки навчанню УРПУ. ІЕМ-1490, ІЕМ-1592, мемантин не усувають пост-ішемічних порушень когнітивних функцій.
4. Перев'язка загальної правої сонної артерії у білих щурів приводить до
зменшення кількості пірамідних нейронів у гіпокампі. Всі речовини серії ІЕМ в лікувальному режимі (1 раз на добу, 5 діб) на 5 добу після операції сприяють збереженню кількості пірамідних нейронів у зоні СА1 правого гіпокампа, тобто виявляють церебропротекторні властивості.
5. Механізм церебропротекторної дії сполук серії ІЕМ може бути
повязаний з пригніченням процесів ПОЛ (зменьшення на 50% рівня МДА в корі головного мозку), та наявністю антиоксидантної дії - нормалізація активності каталази.
6. Антиамнестичні та церебропротекторні властивості лігандів NMDA-Rs
залежать від їх будови: заміна метилу в онієвій групі сполуки ІЕМ-1460 на об’ємний ізопропільний радикал (ІЕМ-1592) супроводжується втратою анти-амнезуючої активності.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Гмиро В.Е., Журавский А.В., Комиссаров И.В., Тихонов В.Н.
Сравнительная оценка “быстрых” блокаторов NMDA-рецепторов и полиаминов // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2002. – Т.65, № 1. – С. 11–14. (Здобувачем виконано експериментальну частину, проведено статистичну обробку, сформульовані висновки і практичні рекомендації, підготовлено матеріал до публікації).
15
2. Журавский А.В., Комиссаров И.В., Стрюченко К.В., Тихонов В.Н.
Влияние спермина и глицина на вызванные локальной ишемией мозга нарушения условнорефлекторных навыков у крыс // Архив клинической и экспериментальной медицины. – 2002. – Т.11, № 3. – С. 303–306. (Дисертантом особисто проаналізовано літературу та написано окремі розділи статті, проведено основні експерименти).
3. Комиссаров И.В., Журавский А.В., Гмиро В.Е. Коррекция лигандами
глутаматных рецепторов нарушений мнестических функций при экспе-риментальной фокальной ишемии коры мозга // Журнал АМН України. – 2003. – Т.9, № 2. – С. 238–249. (Дисертантом особисто проведено експеримент, інтерпритацію даних, підготовлено матеріал до друку).
4. Журавский А.В. Оценка эффективности адамантилсодержащих поли-
аминов при общей ишемии головного мозга у крыс // Архив клинической и экспериментальной медицины. – 2005. – Т.14, № 1. – С. 13–16. (Дисертантом особисто проаналізовано літературу, проведено основні експерименти та написано статтю).
5. Журавский А.В., Тихонов В.Н., Стрюченко К.В. Парадоксальное
влияние блокаторов NMDA-рецепторов на обучение и память // Архив клинической и экспериментальной медицины – 2001. – Т.10, № 2. – С. 156.
6. Журавский А.В., Стрюченко К.В. Изучение антиамнестических
свойств “быстрых” блокаторов NMDA-рецепторов и полиаминов // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених. – Донецьк, 2001. – С. 148.
7. Комиссаров И.В., Журавский А.В. Эффективность глицина, спермина
и их структурных аналогов при фокальной ишемии мозга в эксперименте // Материалы 3-ей Всероссийской конференции с международным участием “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция”. – Москва, 2002. – С. 53–54.
8. Журавский А.В. Церебропротекторные свойства бис-ониевых
адамантилсодержащих диаминов // Тези III Національного з'їзду фармакологів України. – Одеса, 2006. – С. 57–58.
АНОТАЦІЯ
Журавський А. В. Церебропротекторні властивості адамантилвмісних діамінів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Інститут фармакології та токсикології Академії медичних наук України, Київ, 2007
Дисертація присвячена вивченню церебропротекторних і антиамнестич-них властивостей біс-онієвих, адамантилвмісних речовин серії ІЕМ, які належать до класу блокаторів каналу NMDA/AMPA глутаматних рецепторів з “дуже швидкою” кінетикою блокади/деблокади.
Експериментальним шляхом встановлено, що речовини серії ІЕМ не порушують набуття тваринами умовнорефлекторних поведінкових навиків.
16
Навпаки, ІЕМ-1755 (3 мг/кг) усуває електрошокову амнезію, ІЕМ-1460 (1-10 мг/кг) і ІЕМ-1490 (3 мг/кг) є ефективними як при скополаміновій, так і при електрошоковій амнезії.
Короткочасна фокальна ішемія тім’яної зони кори головного мозку щурів справа призводить до порушення здатності тварин навчатись і зберігати вироблені поведінкові навики. Спермін (10 мг/кг), ІЕМ-1460 (3-20 мг/кг) і пірацетам (200-400 мг/кг) сприяють формуванню та збереженню УРПУ, порушеного внаслідок минущої компресійної фокальної ішемії тім’яної кори мозку щурів. Гліцин (50 мг/кг), ІЕМ-1755 (6 мг/кг) і карбацетам (3-10 мг/кг) сприяють виключно або переважно навчанню УРПУ. Мемантин (3-20 мг/кг), ІЕМ-1490 (3-10 мг/кг), ІЕМ-1592 (1-2 мг/кг) не усувають постішемічних порушень когнітивних функцій.
На моделі неповної циркуляторної гіпоксії головного мозку щурів показано, що внутрішньом’язове введення пірацетаму (200 мг/кг) й мемантину (10 мг/кг) один раз на добу сприяє зниженню вмісту МДА й активності каталази в головному мозку щурів на 5 добу після операції. ІЕМ-1460 (10 мг/кг) і ІЕМ-1755 (6 мг/кг) також знижували активність каталази, не впливаючи на вміст МДА. Введення ІЕМ-1592 (3 мг/кг) призводило тільки до зменшення вмісту МДА. Усі речовини сприяли збереженню кількості пірамідних нейронів в одиниці площі СА1 зони дорсального гіпокампа справа після перев’язування правої загальної сонної артерії, що свідчить про церебропротекторні властивості речовин серії ІЕМ.
Встановлено залежність антиамнестичних і церебропротекторних властивостей лігандів NMDA/AMPA-Rs від їх будови.
Ключові слова: адамантилвмісні поліаміни (серія ІЕМ), амнезія, ішемія, церебропротекція.
АННОТАЦИЯ
Журавский А. В. Церебропротекторные свойства адмантилсодержащих диаминов. – Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Институт фармакологии и токсикологии Академии медицинских наук Украины, Киев, 2007.
В работе показано, что бис-ониевые, адамантилсодержащие дамины (ИЭМ-1460, ИЭМ-1490, ИЭМ-1755, ИЭМ-1592), обладающие “очень быстрой” кинетикой блокады/деблокады глутаматных рецепторов, не нарушают выработку и воспроизведение условнорефлекторных поведенческих навыков у крыс, а, наоборот, способствуют их сохранению при угашении амнезирующими факторами (кроме ИЭМ-1592). ИЭМ-1592 (3 мг/кг), ИЭМ-1460 (10 мг/кг) и ИЭМ-1755 (6 мг/кг) способствуют сохранности пирамидных нейронов СА1 области дорсального гиппокампа справа, а ИЭМ-1592 (3 мг/кг) препятствует свободнорадикальному окислению липидов нервных клеток при ишемии
17
головного мозга. Антиамнестический и церебропротекторный эффекты этих веществ мы связываем со сперминоподобными свойствами (ИЭМ-1460), а
также с “очень быстрой” кинетикой блокады/деблокады открытой формы канала глутаматных рецепторов. Церебропротекторные свойства неконкурентних блокаторов глутаматных рецепторов (кетамин, фенциклидин, мемантин) хорошо известны, однако ИЭМы отличаются более высокой безопасностью применения, имеют более высокий терапевтический индекс и, соответственно, среди неконкурентных блокаторов NMDA/AMPA-глутаматных рецепторов наиболее перспективны как церебропротекторные средства.
Установлена зависимость антиамнестических и церебропротекторных свойств лигандов глутаматных рецепторов от их структуры.
Ключевые слова: адамантилсодержащие полиамины (серия ИЭМ), амнезия, ишемия, церебропротекция.
ABSTRACT
Zhuravsky A.V. The cerebroprotective properties of adamantly containing diamins. – Manuscript.
The dissertation for scientific degree of candidate of medical sciences on speciality 14.03.05 – pharmacology. – The Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev, 2006.
The actuality of the investigation is conditioned by the requirements of modern medicine in absolutely new high effective antiamnesic and cerebroprotective agents. The positive effect of these agents on the higher integrative brain functions is the basis of their wide use in the clinical practice, especially in the treatment of the psychoorganic syndrome, conditioned by hypoxia or brain trauma, neuroinfection or neurointoxication.
During the last decade the new facts appeared as the evidence of the leading role of the brain glutamatergic synapses in the processes of neurodegeneration, education and memory. Thus, phencyclidine and dysocylpine (MK-801) - high-affinity channel blockers of NMDA receptors – resist the ischemic brain injuries. They, nevertheless, possess the high narcogene potential and cause neurodegenerative changes in the central nervous system. Dextromethorphan and memantine are more prospective, as in doses, resisting excitotoxic brain injuries, these agents which possess the properties of “quick” blockers of the ionic channels of NMDA-receptors, do
