НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

.............................................................................................................................

КРИШТАЛЬ ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 577.3+591.463.6:599.323.41

ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛІЄВИХ ІОННИХ СТРУМІВ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН СІМ’ЯВИВІДНИХ ПРОТОКІВ ЩУРА

03.00.02 – Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук,

професор

Шуба Михайло Федорович ,

зав. відділом нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: чл.-кор. НАН України, доктор біологічних наук,

професор

Веселовський Микола Сергійович,

зав. відділом фізіології нейронних мереж

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

кандидат біологічних наук

Любанова Ольга Петрівна,

старший науковий співробітник

Міжнародного центру молекулярної фізіології

НАН України

Захист відбудеться “_4_” грудня 2007 р. о “14 00” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_2_” листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження механізмів регуляції скоротливої активності безумовно є однією з найактуальніших проблем сучасної фізіології та фармакології гладеньких м’язів. Відомо, що скорочувальна активність гладеньком’язових клітин (ГМК) корелює з рівнем вільного цитозольного Са2+ (Bolton et al. 1999). Са2+ може потрапляти всередину клітини з позаклітинного середовища, та/або вивільнюватись із цистерн саркоплазматичного ретикулуму (Somlyo, Himpens 1989). Хоча вивільнення внутрішньоклітинного Са2+ є необхідним для ефективного скорочення, деякі літературні дані (Ozaki et al. 1991) вказують на те, що і потенціалкерований вхід кальцію через плазматичну мембрану відповідає за активацію скоротливого апарату в гладеньких м’язах (Vogalis et al. 1991). Завдяки входу Са2+ до ГМК через потенціалкеровані канали, рівень мембранного потенціалу є одним із основних факторів, що модулює скоротливу активність гладеньких м’язів.

Калієві канали є важливими регуляторами мембранного потенціалу в різних типах живих клітин. Набір К+ каналів плазматичної мембрани детермінує тривалість потенціалу дії, визначаючи кількість іонів Са2+, які проникають в клітину з позаклітинного середовища. При фізіологічних умовах мембранний потенціал гладеньких м’язів звичайно лежить в області більш додатних значень, ніж потенціал реверсії для К+ (близько -80 мВ). Отже, збільшення мембранної проникності для іонів калію призводить до появи струму вихідного напрямку, який протидіє деполяризації мембрани і, таким чином, і збудженню та скороченню ГМК. Калієві канали демонструють значну молекулярну та функціональну різноманітність, і електричні властивості певного типу гладеньких м’язів значною мірою зумовлені тим, який набір калієвих каналів присутній на клітинній мембрані ГМК (Amberg et al. 2003). Відмінності в електричній активності різних типів гладеньких м’язів є, таким чином, наслідком різниці в експресії різних типів іонних каналів, в тому числі – калієвих, присутніх у цих тканинах.

У сучасній фармакотерапії використання модуляторів калієвої провідності є одним із методів лікування певних захворювань (Jahangir et al. 2001). Отже, ідентифікація компонентів калієвої провідності плазматичної мембрани та дослідження їх фармакологічних та біофізичних властивостей для певного типу ГМК є дуже важливими для створення адекватної схеми лікування.

Відомо, що в сім’явивідних протоках епідидимальна частина найбільшою мірою відповідає за скорочувальну активність всієї гладеньком’язевої тканини (всього протоку) в цілому (Vladimirova et al. 2003). Саме цим фактом і був обумовлений вибір об’єкту наших досліджень. Проведена робота, присвячена вивченню властивостей калієвої провідності плазматичної мембрани ГМК епідидимальної частини сім’явивідних протоків (vas deferens) щура, допомагає глибше зрозуміти механізми та шляхи регуляції скоротливої активності вісцеральних гладеньких м’язів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах наукових програм відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин” (№ держ. реєстрації 0198U001935), “Мембранні та внутрішньоклітинні механізми регуляції скорочення і активності іонних каналів гладеньком’язових клітин нейромедіаторами” (№ держ. реєстрації 0101U002636) та “Мембранні та метаболічні механізми збуджувальної та гальмівної дії нейромедіаторів на гладенькі м’язи” (№ держ. реєстрації 0105U003235).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження фармако-біофізичних характеристик складових калієвого струму мембрани поодиноких ГМК vas deferens щура та з’ясування їх функціональної ролі в регуляції скоротливої активності даного типу гладеньких м’язів. Для досягнення цієї мети було поставлено наступні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше, за допомогою методу “patch-clamp”, були детально досліджені фармакологічні та біофізичні властивості трансмембранного іонного струму вихідного напрямку плазматичної мембрани ГМК сім’явивідних протоків щура. Показано, що вихідний калієвий струм складається з трьох основних компонент - кальційзалежного струму, струму затриманого випрямлення та швидкого (транзієнтного) струму А-типу.

Показано здатність блокатора кальційзалежних калієвих каналів великої провідності (ВКСа) паксиліну викликати деполяризацію плазматичної мембрани ГМК vas deferens щура. Також вперше для даного типу ГМК показано здатність клофіліуму блокувати потенціалкерований струм затриманого випрямлення.

Вперше було досліджено дію блокатора Са2+/кальмодулінзалежної протеїнкінази ІІ КN-93 на кінетику потенціалкерованого струму А-типу мембрани ГМК vas deferens щура. КN-93 прискорював інактивацію А-струму та значно уповільнював вихід з інактивації, що свідчило про те, що А-струм ГМК vas deferens щура може модулюватись активністю кальмодулінзалежної протеїнкінази.

Теоретична і практична цінність роботи. Результати, отримані в даній дисертаційній роботі, мають перш за все фундаментальну цінність, оскільки для даного об’єкту вперше було детально описано та досліджено фармакологічні та біофізичні властивості компонентів трансмембранного іонного струму вихідного напрямку, та з’ясовано їх можливу роль у регуляції скоротливої активності цього типу гладеньких м’язів. Отримані дані сприяють більш глибокому розумінню процесів функціонування гладеньких м’язів сім’явивідних протоків та вказують можливі шляхи регуляції активності цієї тканини за допомогою фармакологічного впливу на окремі компоненти калієвого струму, що може бути використано, наприклад, при розробці нових препаратів для лікування захворювань, пов’язаних із порушенням функціонування даного типу гладеньких м’язів. Зокрема, досить перспективними в даному випадку можуть виявитись відомості про модуляцію швидкого компонента калієвого струму за допомогою кальцій/кальмодулінзалежної протеінкинази ІІ, оскільки було встановлено, що цей потенціалкерований компонент струму може також регулюватись за допомогою хімічного препарату.

Особистий внесок. Переважна більшість експериментів, описаних в дисертаційній роботі, розробка методики та виділення функціонально повноцінних гладеньком’язових клітин, обробка, аналіз та узагальнення експериментального матеріалу були виконані особисто автором.

Дослідження характеристик потенціалкерованих калієвих каналів, а також біофізичних властивостей Са2+-залежних К+ каналів та їх участі у регуляції мембранного потенціалу проводились разом з к.б.н. Хархуном М.І.

Частина досліджень, присвячених вивченню фармако-біофізичних властивостей Са2+-залежних калієвих каналів, проводилась разом з м.н.с. Несіним В.В.

В розробці концепції роботи, її обговоренні та формулюванні висновків активну участь приймали інші співавтори публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались та обговорювались на XVІ з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002), 46-му щорічному з’їзді Біофізичного товариства США (Сан-Франциско, 2002), на міжнародній спеціалізованій школі нейронаук IBRO “Рецептори, канали, месенджери” (Ялта, 2004), міжнародній конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004), 3-й міжнародній конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2005), на семінарах відділу нервово м’язової фізіології (2002–2007) та інститутському семінарі Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (2007).

Публікації. Матеріали роботи опубліковано в чотирьох наукових статтях та тезах доповідей п’яти наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 144 найменувань. Робота викладена на 110 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 26 рисунками та 2 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Виділення ізольованих гладеньком’язових клітин. Експерименти проводились на поодиноких гладеньком’язових клітинах, ізольованих з епідидимальної частини сім`явивідних протоків щура. В експериментах використовували дорослих тварин чоловічої статі лінії Вістар масою 200-300 г.

Поодинокі міоцити отримували за допомогою методу ферментативно-механічної ізоляції. Сім’явивідні протоки вирізали та відділяли від жирової та сполучної тканини в номінально безкальцієвому розчині такого складу (у мМ): NaCl 135; KCl 5,8; MgCl2 1,2; D-глюкоза 5; HEPES 10; pH 7,35, при кімнатній (22 – 24 оС) температурі, та відділяли епідидимальну частину від простатної. Шматки епідидимальної частини розрізали вздовж та видаляли внутрішній епітеліальний шар, потім розрізали на шматочки довжиною 1,5 – 2 мм та поміщали на 10 хвилин в свіжий гіпокальцієвий розчин наступного складу (у мМ): NaCl 135; KCl 6; CaCl2 0,1; MgCl2 1,2; D-глюкоза 5; HEPES 10; pH 7,35 – NaOH при температурі 36С. Після цього шматки переносили в номінально безкальцієвий розчин, що містив 1,5 мг/мл колагенази ХІ типу, 0,5 мг/мл протеази Х типу та 1,5 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, де їх інкубували на протязі 20-25 хвилин при температурі 36С. Після інкубації шматочки тканини ретельно відмивали в безкальцієвому розчині. Функціонально повноцінні ізольовані ГМК отримували шляхом багаторазового пропускання шматочків тканини через пастерівську піпетку в свіжому номінально безкальцієвому розчині, який містив 0.1% бичачого сироваткового альбуміну. На протязі всього екперименту ізольовані міоцити зберігали в цьому ж розчині при температурі 5С.

Електричні вимірювання. Для реєстрації калієвих струмів ізольованих гладеньком’язових клітин епідидимальної частини сім`явивідних протоків щура було застосовано модифікацію “perforated patch” методу “patch-clamp” з використанням антибіотика амфотеріцину Б. Опір піпеток, заповнених внутрішнім розчином, складав 1-3 МОм. Досліди проводили при кімнатній температурі (22–24С). Фіксація потенціалу та реєстрація струмів здійснювалась за допомогою підсилювача EPC 7 (List Electronics, Німеччина) з опором зворотнього звязку перетворювача струм-напруга 500 МОм. Сигнал з виходу підсилювача потрапляв на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200A (Axon Instruments, США) та далі в комп’ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програми “pCLAMP 5.5”. Результати статистичної обробки даних представлені в тексті та на малюнках як середнє арифметичне стандартне відхилення від середнього арифметичного. Дані порівнювали парним t-тестом Стьюдента для чисельних порівнянь. Відмінності вважали статистично достовірними при значенні Р0.05.

Розчини. Для реєстрації калієвих струмів використовували зовнішньоклітинний розчин наступного складу (у мМ): NaCl 135; KCl 5,8; CаCl2 2,5; MgCl2 1,2; D-глюкоза 5; HEPES 10; pH 7,35, доводили за допомогою NaOH. При дослідженні потенціалкерованих компонентів вихідного струму 2,5 мМ CаCl2 замінювали на 2 мМ MgCl2 та 0,5 мМ CdCl2 – для виключення впливу потенціалкерованих Са2+ каналів та зменшення Са2+-залежного калієвого струму. Крім того, щоб заблокувати можливу участь потенціалкерованого Na+ струму, у зовнішній розчин додавали 1 мкМ тетродотоксину, а також додавали 5 мМ 4-амінопіридину (4-АП) при дослідженні властивостей струму затриманого випрямлення, або 10 мМ ТЕА – при дослідженні властивостей А-струму. При дослідженні кальційактивованого калієвого струму використовували розчин наступного складу (у мМ): NaCl 135; KCl 5,8; CaCl2 2,5; MgCl2 1,2; D-глюкоза 5; HEPES 10; pH 7,35 – NaOH. Внутрішньопіпетковий розчин для дослідження потенціалкерованих вихідних калієвих струмів відповідав наступному складу (у мМ): KCl 120; KH2PO4 5; MgSO4 1; EGTA 1; HEPES 10; pH 7,3 – KOH), a при дослідженнях Са2+-активованого калієвого струму використовували такий піпетковий розчин: KCl 140; MgCl 2; EGTA 1; HEPES 10; pH 7,3 – KOH. Амфотеріцин Б кількістю 1 мг розчиняли в 10 мкл діметилсульфоксиду (ДМСО) та розводили в піпетковому розчині, поступово збільшуючи відсоток піпеткового розчину, до кінцевої концентрації амфотеріцину Б 200 мкг/мл.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Загальна характеристика трансмембранного струму вихідного напрямку ГМК сім’явивідних протоків щура. У відповідь на ступінчасті деполяризуючі зміщення мембранного потенціалу з інкрементом 20 мВ від підтримуваного потенціалу -80 мВ на мембрані ізольованих ГМК vas deferens щура виникали струми вихідного напрямку, зображені на рис. 1.А. Амплітуда та швидкість зростання струму збільшувались при збільшенні рівня деполяризації. Струм, поріг активації якого становив близько -40 мВ, швидко активувався та досягав максимуму впродовж декількох мілісекунд, після чого інактивувався. Кінетика інактивації мала складний характер, що свідчило про наявність декількох компонентів у складі загального інтегрального струму.

Рис. 1. Вихідний струм ГМК vas deferens щура.

Вихідні струми отримані у відповідь на ступінчасті деполяризуючі зміщення мембранного потенціалу в контролі (А), та в присутності 200 нМ харібдотоксину (Б). В - харібдотоксин-чутливі струми, отримані шляхом віднімання струмів на рис.Б від струмів на рис. А.

Аплікація у зовнішній розчин 200 нМ харібдотоксину, селективного блокатора кальційзалежних калієвих каналів великої провідності (ВКСа), помітно зменшувала амплітуду вихідного струму (рис 1.Б). Зображені на рис. 1.В харібдотоксин-чутливі струми в чистому вигляді є результатом віднімання кривих струмів на рис. 1.Б із кривих, зображених на рис. 1.А.

Властивості Са2+-залежного К+ струму ГМК сім’явивідних протоків щура. На першому етапі нами було досліджено властивості Са2+-залежного калієвого струму. Вилучення Са2+ із зовнішнього розчину призводило до значного зменшення амплітуди сумарного вихідного струму. Струм, отриманий внаслідок віднімання струмів в безкальцієвому розчині від відповідних струмів у контролі, мав досить повільну кінетику активації та інактивації і був ідентифікований як Са2+-залежний К+ струм. Отримані дані свідчили про те, що досить велика частка сумарного вихідного калієвого струму припадає на Cа2+-залежний калієвий струм. Цей струм активувався при рівнях деполяризації, вищих за –40 мВ (при підтримуваному на мембрані потенціалі –80 мВ), і при деполяризації до +80 мВ мав максимальну амплітуду, що становила близько 70% від максимальної амплітуди сумарного струму. В той же час, наприкінці тестового імпульсу амплітуда Са2+-залежних струмів складала лише близько 30-35% від сумарного струму, що свідчило про більшу участь на цьому етапі потенціалкерованого К+ струму затриманого випрямлення.

Нами було проведено дослідження блокуючої дії паксиліну на вихідний трансмембранний калієвий струм. Паксилін - мікотоксин, який вважається одним із найбільш ефективних небілкових блокаторів ВК(Са) каналів у васкулярних гладеньком`язових клітинах. При підтримуваному потенціалі –60 мВ паксилін дозозалежно пригнічував вихідний струм (рис. 2.А), при цьому пригнічення спостерігалось вже при концентрації блокатора 10 нМ, а при концентрації 1 мкМ досягало максимального значення.

Залежність доза-ефект для паксиліну добре описувалась сигмоідальною кривою (рис. 2.Б), отриманою за допомогою методу найменших квадратів. Значення ЕС50 для паксиліну становило 705 нМ.

З метою охарактеризувати фармакологічні властивості досліджуваного струму, нами було проведено дослідження дії неселективного блокатора калієвих каналів ТЕА на вихідний трансмембранний іонний струм, та порівняння її з блокуючою дією паксиліну. ТЕА дозозалежно блокував вихідний струм, що виникав при деполяризації мембрани, при цьому в концентрації 1 мМ блокатор викликав пригнічення струму більше ніж на 50%.

Для порівняння блокуючого ефекту ТЕА і паксиліну криві доза-ефект були побудовані по точках, значення яких являли собою середні значення струмів для кожної з відповідних концентрацій блокаторів наприкінці тестового імпульсу (останні 50 мс деполяризуючого зміщення загальною тривалістю 500 мс), що було зроблено з метою виключити вплив швидкого струму А-типу, оскільки за 450 мс тестового імпульсу цей струм фактично повністю інактивувався. Порівняння отриманих кривих показало, що концентрація ТЕА, необхідна для пригнічення вихідного струму, аналогічного пригніченню, викликаному аплікацією паксиліну в концентрації 1 мкМ, становить 0,3 мМ. При додаванні 1 мкМ паксиліну до зовнішнього розчину, що містив 0,3 мМ ТЕА, вихідний струм фактично не зменшувався, з чого можна зробити висновок про те, що навіть відносно низькі концентрації ТЕА, менші за 0,5 мМ, ефективно блокують ВКСа канали у клітинах vas deferens щура, аналогічно до паксиліну.

Рис. 2. Дія паксиліну на вихідний струм у ГМК сім`явивідних протоків щура.

А – вихідні струми в контролі та за присутності в зовнішньому розчині 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 та 1 мкМ паксиліну. Б – крива залежності доза-ефект блокуючої дії паксиліну на Са2+-залежний калієвий струм. ЕС50 = 705 нМ (n=4). | Рис. 3. Порівняння блокуючої дії паксиліну та ТЕА на вихідний Са2+-залежний калієвий струм.

А і Б - криві залежності доза-ефект блокуючої дії відповідно ТЕА та паксиліну на Са2+-залежний калієвий струм. Помітно, що ~0.3 мМ ТЕА пригнічують ~50% вихідного струму, аналогічно до 1мкМ паксиліну.

Також, з метою з’ясування участі Са2+-залежного К+ струму в регуляції мембранного потенціалу спокою, нами було проведено ряд експериментів з використанням методики “patch clamp” в режимі фіксації струму.

Рис. 4. Дія паксиліну на мембранний потенціал ГМК сім`явивідних проток щура.

Паксилін у концентрації 1 мкМ не впливав помітно на мембранний потенціал клітин у межах -60…-45 мВ. Однак при значеннях мембранного потенціалу, вищих за –45 мВ, аплікація паксиліну в зовнішній розчин значно (до 20 мВ) деполяризувала клітинну мембрану (рис. 4). Отримані дані дозволяють припустити, що ВКСа канали гладеньком`язових клітин сім`явивідних протоків щура безпосередньо не приймають участі у підтриманні потенціалу спокою, однак можуть служити в якості гіперполяризуючого механізму мембранного потенціалу при значних деполяризаціях клітинної мембрани.

Характеристика потенціалкерованих калієвих струмів ГМК сім’явивідних протоків щура. У всіх експериментах, присвячених вивченню властивостей потенціалкерованих калієвих струмів, у зовнішньому розчині був присутній харібдотоксин в концентрації 200 нМ з метою блокування струму, що переноситься через ВКСа канали.

Виходячи з відмінностей у фармакологічних властивостях та кінетичних характеристиках, було ідентифіковано дві потенціалкерованих компоненти вихідного калієвого струму ГМК vas deferens щура – струм А-типу (IK,f) , що мав швидку кінетику активації та інактивації і був чутливим до блокуючої дії 4-амінопіридину (4-АП), та ТЕА-чутливий струм затриманого випрямлення (ІK,dr), інактивація якого була значно повільнішою.

Фармако-біофізична характеристика струму затриманого випрямлення ГМК сім’явивідних протоків щура. У всіх дослідженнях, присвячених вивченню електрофізіологічних характеристик калієвого струму затриманого випрямлення ГМК vas deferens щура, до зовнішнього розчину додавали 5 мМ 4-АП, що дозволило повністю заблокувати складову швидкого струму А-типу. В цих умовах крива наростання струму затриманого випрямлення добре апроксимувалася однією експонентою, як це видно з рис. 5.А (криві апроксимації позначені пунктирними лініями). Постійна часу була потенціалзалежною, і її значення зменшувалось із збільшенням деполяризації мембранного потенціалу. На рис. 5.Б показано залежність середнього значення констант часу від величини тестового потенціалу. Середнє значення константи часу зменшувалось від 56,66,7 мс при тестовому потенціалі -20 мВ до 12,60,8 мс при потенціалі +60 мВ (n=7). Потенціалзалежність постійної часу активації струму затриманого випрямлення характеризувалась зменшенням у е разів при збільшенні деполяризації клітинної мембрани на 21 мВ.

Рис. 5. Потенціалзалежність кінетики активації ІK,dr.

А – залежність від часу ІK,dr, викликаних деполяризуючими зміщеннями мембранного потенціалу від підтримуваного потенціалу –80 мВ. Б – залежність середнього значення стандартне відхилення констант часу активації ІK,dr від тестового потенціалу (n=7).

Стаціонарну інактивацію струму затриманого випрямлення було досліджено за допомогою протоколу, зображеного на вставці до рис. 6.А. На рис. 6.А зображено струми, викликані тестовим зміщенням мембранного потенціалу. Рис. 6.Б зображує усереднені експериментальні значення стаціонарної інактивації та активації струму затриманого випрямлення ГМК vas deferens щура. Для отримання значень стаціонарної інактивації використовували середні значення струмів на протязі останніх 50 мс із 300-мілісекундного тестового імпульсу, нормалізовані відносно максимального значення струму. Експериментальні значення добре описувалися кривою, побудованою за рівнянням Больцмана:

I/IK,max=(1+exp(V-V0.5)/k)-1), (1)

де I - значення струму для кожного потенціалу кондиціонуючого передімпульсу V, V0.5 – значення потенціалу половинної інактивації, IK,max – максимальне середнє значення струму, k – фактор нахилу кривої стаціонарної інактивації. Значення V0.5 та k для інактивації струму затриманого випрямлення становили відповідно -56,1±1,5 мВ та 9,8±0,5 мВ.

Потенціалзалежність активації струму затриманого випрямлення було розраховано наступним чином: середні значення струмів впродовж останніх 100 мс тестового зміщення потенціалу тривалістю 500 мс було перетворено в провідність (g) відповідно до рівняння

gK=IK/(V-ЕK), (2)

де gK – провідність мембрани при потенціалі V, IK– середнє значення струму на протязі останніх 50 мс тестового зміщення, і ЕK – розрахований рівноважний потенціал для К+, який дорівнював -80 мВ. Отримані значення були нормалізовані відносно максимального значення провідності і представлені як функція потенціалу впродовж тестового імпульсу. Експериментальні точки потенціалзалежної активації струму затриманого випрямлення добре описувалися кривою, побудованою за рівнянням

gK/gK(max)=1/(1+exp[V0.5-V]/k), (3)

де значення V0.5 та k складали відповідно 26,1±1,2 мВ і -15,4±0,7 мВ.

Рис. 6. Потенціалзалежність стаціонарних характеристик ІK,dr.

А - струми були викликані тестовим імпульсом до +60 мВ після кондиціонуючих передімпульсів. Б - експериментально отримані значення стаціонарної інактивації (, n=5) та активації (, n=14). Суцільні лінії – криві, отримані за допомогою методу найменших квадратів за рівнянням Больцмана з V0.5=-56.1±1,5 мВ і k=9.8±0,5 мВ для інактивації та V0.5=26.5±1,2 мВ і k=-15.4±0,7 мВ для активації IK,dr. |

Рис. 7. Відновлення після інактивації IK,dr.

A – струми були отримані з використанням протоколу, наведеного внизу рисунка. Б – усереднена крива часу відновлення після інактивації струму затриманого випрямлення описувалась моноекспоненційною функцією із константою часу близько 1 с (n=4).

Рис. 7 ілюструє вихід з інактивації струму затриманого випрямлення. Для дослідження було використано протокол, наведений на вставці до рис. 7.А. Всі точки на рис. 7.Б являють собою середні пікові значення струмів впродовж тестового зміщення потенціалу, нормалізовані відносно пікових значень впродовж кондиціонуючого зміщення. Отримана крива добре апроксимувалась однією експонентою із значенням постійної часу відновлення 1 с.

Рис. 8. Дія клофіліуму на ІK,dr.

А - струми, викликані деполяризуючими зміщеннями мембранного потенціалу від –80 мВ до +40 мВ за відсутності та в присутності 0.1, 1, 10, 100 та 500 мкМ клофіліуму. Б – доза-ефект блокуючої дії клофіліуму на ІK,dr (ЕС50 = 12±0,6 мкМ (n=5))

Було також досліджено дію клофіліуму на струм затриманого випрямлення ГМК vas deferens щура. Аплікація до зовнішнього розчину 100 нМ клофіліуму викликала незначне пригнічення досліджуваного струму. При збільшенні концентрації клофіліуму ступінь пригнічення струму дозозалежно зростала. На рис. 8.А показано залежність блокуючої дії клофіліуму на струм затриманого випрямлення від концентрації діючої речовини. Рис. 8.Б зображує криву залежності доза-ефект блокуючої дії клофіліуму на струм затриманого випрямлення. Середні значення струмів на протязі останніх 100 мс деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу було нормалізовано відносно значення струму в контролі. Сигмоідальна крива побудована за допомогою методу найменших квадратів. Концентрація клофіліуму, яка спричиняла 50% пригнічення досліджуваного струму, складала 12±0,6 мкМ.

Фармако-біофізичні характеристики струму А-типу. На першому етапі було досліджено чутливість швидкого струму А-типу до 4-АП. При додаванні до зовнішнього розчину 4-АП дозозалежно пригнічував досліджуваний струм. На рис. 9.А зображено залежність амплітуди струму А-типу від зростання концентрації 4-АП. Рис. 9.Б зображує криву залежності доза-ефект блокуючої дії 4-АП на А-струм. Експериментально отримані значення амплітуди А-струму при дії різних концентрацій 4-АП були нормалізовані відносно максимального значення, крива побудована за допомогою методу найменших квадратів. Концентрація 4-АП, яка спричиняла 50% пригнічення досліджуваного струму, складала 0.32±0,07 мМ.

Виділення струму А-типу із загального вихідного трансмембранного струму проводилося фармакологічно, шляхом додавання у зовнішній розчин 10 мМ неселективного блокатора калієвої провідності ТЕА. Цієї концентрації ТЕА було цілком достатньо для повного пригнічення складової струму затриманого випрямлення.

Рис. 9. Залежність IK,f від концентрації 4-АП у зовнішньому розчині.

А – криві, отримані шляхом віднімання кривої в присутності 10.0 мМ 4-АП від кривих у контролі і в присутності 0.1, 0.5, 1.0 та 4 мМ 4-АП. Б – відношення доза-ефект для блокуючої дії 4-АП на швидкий вихідний струм (ЕС50 = 0,32±0,07 мМ (n=5)) | Рис. 10. Інактивація та відновлення після інактивації IK,f

А – струми, отримані в результаті віднімання струму в присутності 10 мМ 4-АП від кривих у контролі. Б – струми були отримані з використанням протоколу, наведеного внизу рисунка. В – усереднена крива часу відновлення після інактивації швидкого вихідного струму апроксимувалась моноекспоненційною функцією із константою часу близько 90 мс (n=4).

На рис. 10.А представлений аналіз кінетики інактивації струму А-типу. Зображені струми були викликані 500-мс зміщенням мембранного потенціалу до +20, +40 та +60 мВ від підтримуваного потенціалу -80 мВ. Спад струму добре апроксимувався двома експонентами, не виявляючи суттєвої залежності від величини деполяризуючого імпульсу при деполяризації більше 0 мВ. Значення постійних часу експонент складали для швидкої та повільної компонент відповідно 26 та 111 мс при +20 мВ, 20 та 99 мс при +40 мВ, і 29 та 109 мс при +60 мВ.

Вихід струму А-типу з інактивації було досліджено за допомогою двох-імпульсного протоколу, який зображено на вставці до рис. 10.Б. Пікові значення струмів, отриманих впродовж тестової деполяризації, були нормалізовані відносно пікових значень струму впродовж кондиціонуючого зміщення мембранного потенціалу, і представлені як функція тривалості відновлюючого інтервалу. Отримана сумарна крива добре апроксимувалася однією експонентою, значення постійної часу відновлення при цьому складало близько 90 мс (рис. 10.Б).

Для дослідження стаціонарної інактивації струму А-типу було використано протокол, який зображено на вставці до рис.11.А. На рис. 11.А зображено струми, які виникали впродовж тестового зміщення потенціалу.

Рис. 11. Потенціалзалежні стаціонарні характеристики IK,f

A – струми, викликані тестовим зміщенням потенціалу до +60 мВ після кондиціонуючих передімпульсів. Схематичний протокол наведено у верхній частині рисунка. Б – експериментально отримані значення стаціонарної інактивації (, n=6) та активації (, n=5). Суцільні лінії – криві, отримані за допомогою методу найменших квадратів за рівнянням Больцмана з V0.5 = -73.1±2,1 мВ і k = 10.1±0,9 мВ для інактивації та V0.5 = -3.5±1,2 мВ і k = -20.6±0,7 мВ для активації IK,f.

Пікові значення струмів, отриманих впродовж тестової деполяризації, були нормалізовані відносно пікового значення струму при рівні кондиціонуючого зміщення мембранного потенціалу -120 мВ і представлені як функція потенціалу кондиціонуючого зміщення.Отримані експериментально значення стаціонарної інактивації струму А-типу (рис. 11.Б) добре погоджувалися з кривою, побудованою за рівнянням Больцмана (1). Значення V0.5 та k для інактивації швидкого струму А-типу складали відповідно -73,1±2,1 мВ і 10,1±0,9 мВ.

Також на рис. 11.Б представлено криву стаціонарної активації струму А-типу. Крива була отримана подібно до кривої стаціонарної активації для струму затриманого випрямлення. Пікові значення струмів було розраховані як провідність (g) відповідно до рівняння (2), отримані значення були нормалізовані відносно максимального значення провідності і представлені як функція потенціалу впродовж тестового імпульсу. Експериментальні точки потенціалзалежної активації струму А-типу добре описувались рівнянням (3), із значеннями V0.5 та k відповідно -3,5±1,2 мВ і -20,6±0,7 мВ.

Участь Са2+/кальмодулінзалежної протеїнкінази ІІ у регуляції калієвого струму А-типу у ГМК сім’явивідних протоків щура. У відповідь на деполяризуючі імпульси з інкрементом 20 мВ від підтримуваного потенціалу -80 мВ на мембрані ізольованих гладеньком’язових клітин vas deferens щура виникав трансмембранний вихідний струм з порогом активації близько -40 мВ. Аплікація у зовнішній розчин ТЕА в концентрації 10 мМ, достатній, як нами було раніше показано, для повного пригнічення компоненту струму затриманого випрямлення у досліджуваному типі клітин, викликала помітні зміни у динаміці інактивації загального трансмембранного струму, не змінюючи при цьому суттєво його пікову амплітуду. При деполяризуючому зсуві мембранного потенціалу до рівнів, позитивніших за 0 мВ, інактивація отриманих струмів добре апроксимувалася двома експонентами. Так, при зсуві тестового потенціалу до рівня +40 мВ відповідні константи часу інактивації становили 23±4 мс для швидкого компоненту (фf, n=6) та 121±16 мс – для повільного (фs, n=6) (рис. 12.Б). Додавання до зовнішнього розчину 5 мкМ KN-93, високоспецифічного мембранопроникного інгібітору Са2+/кальмодулінзалежної протеїнкінази ІІ, призводило до значного прискорення інактивації отриманого струму А-типу, а також дещо (приблизно на 20 %) зменшувало значення його пікової амплітуди (рис. 12.А). Показники констант часу інактивації при значенні деполяризуючого імпульсу +40 мВ становили в цьому випадку відповідно 14,7±2,5 мс для фf та 51,4±9 мс для фs (n=6) (рис. 12.Б).

Рис. 12. Вплив KN-93 на IK,f .

А – струми від однієї і тієї самої клітини до та після аплікації у зовнішній розчин 5 мкМ KN-93. Спадаюча фаза струмів добре апроксимувалась двоекспоненційними кривими (лінії на вставці показують фактичні криві апроксимації). Б – вплив KN-93 на зміну середніх (n = 6) значень констант часу інактивації (фf та фs) досліджуваного струму. Світлі стовпчики відповідають значенням ф в контролі, темні – за присутності в розчині KN-93.

Для дослідження дії KN-93 на кінетику стаціонарної інактивації А-струму було використано протокол, який зображено на рис. 13. Криві інактивації (рис. 13.В) були побудовані як залежність пікових значень струмів впродовж тестового зсуву мембранного потенціалу, нормалізованих відносно величини пікового струму при рівні кондиціонуючого зсуву –100 мВ, від значення потенціалу кондиціонуючого передімпульсу. Суцільні лінії являють собою криві, отримані за рівнянням Больцмана (1) за допомогою методу найменших квадратів. При цьому значення V0,5 становило -68,7±0,8 мВ для струмів у контролі, і -74,4±0,2 мВ – при додаванні до зовнішнього розчину 5 мкМ KN-93 (n=4), що вказувало на незначний, але достовірний вплив KN-93 на стаціонарну інактивацію струму А-типу у даному типі ГМК. Нами також було досліджено потенціалзалежність активації даного струму в контролі, та при додаванні KN-93, але достовірної зміни кінетичних характеристик активації виявлено не було.

Також було проведено експерименти щодо дослідження впливу KN-93 на швидкість виходу з інактивації калієвого струму А-типу у клітинах vas deferens щура. Для дослідження було застосовано двох-імпульсний протокол, схему якого зображено на вставці до рис. 14. Від підтримуваного потенціалу -80 мВ подавався кондиціонуючий зсув мембранного потенціалу тривалістю 500 мс до рівня +40 мВ, далі потенціал повертався до початкового значення на різні проміжки часу, після чого подавався тестовий імпульс, по тривалості та зміні рівню потенціалу аналогічний кондиціонуючому.

Рис. 13. Вплив KN-93 на IK,f . Струми у відсутності (А), та в присутності (Б) у зовнішньому розчині 5 мкМ KN-93. В – усереднені експериментально отримані значення стаціонарної інактивації в контролі (0) та у присутності у зовнішньому розчині KN-93 (?), (n=4). Суцільні лінії – криві, отримані за допомогою методу найменших квадратів за рівнянням Больцмана. Значення V0,5 становило відповідно -68,7 ± 0,8 мВ у контролі, та -74,4 ± 0,2 мВ – при додаванні KN-93. |

Рис. 14. Вплив KN-93 на відновлення після інактивації IK,f. А – струми в контролі, Б – за присутності у зовнішньому розчині 5 мкМ KN-93. В – узагальнені криві (n=4) часу відновлення А-струму після інактивації в контролі (Д), і в присутності KN-93 (^). Отримані криві добре описувались моноекспоненційними функціями зі значеннями ф відповідно 120 та 517 мс.

При аплікації до зовнішнього розчину KN-93 у концентрації 5 мкМ, спостерігалось значне уповільнення швидкості відновлення струму після інактивації у порівнянні із контролем (рис. 14.А, Б). Відновлення струму після інактивації задовільно апроксимувалось моноекспоненційною кривою, значення ф при цьому складало відповідно 120 мс для А-струму в контролі, та 517 мс – в умовах присутності у зовнішньому розчині 5 мкМ KN-93 (рис. 14.В).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Робота присвячена розділенню сумарного трансмембранного калієвого іонного струму вихідного напрямку плазматичної мембрани ізольованих ГМК сім’явивідних протоків щура на компоненти та вивченню фармако-біофізичних властивостей цих компонент. Як відомо, у вісцеральних гладеньких м’язах розрізняють декілька типів потенціалкерованих калієвих каналів, що відіграють важливу роль у модуляції електричної збуджуваності в цих клітинах. Також виділяють два типи Са2+-залежних калієвих каналів – канали великої провідності (ВКСа), провідність яких у різних типах клітин варіює від 100 до 250 пСм, і малої провідності (SKСа) – провідність останніх зазвичай не перевищує 6 – 18 пСм. Останнім часом деякі дослідники схильні виділяти третій тип - Са2+-залежні калієві канали середньої провідності (32 - 37 пСм.) У ряді публікацій висловлюється думка, що калієві канали затриманого випрямлення (IK,dr) (Buryi et al. 1987), вхідного випрямлення (Kir) (Flynn et al. 1999) та Са2+-залежні калієві канали великої провідності (ВКСа) (Sui & Kao 1997) можуть регулювати мембранний потенціал вісцеральних ГМК, або приймати участь у підтриманні потенціалу спокою. Функція каналів струму А-типу досі чітко не визначена, але за деякими даними ці канали можуть відігравати важливу роль у регуляції ритмічної електричної активності (Koh et al. 1999) або також приймати участь у підтриманні потенціалу спокою (Akbarali et al. 1995).

Як було показано раніше, епідидимальна і простатна частини vas deferens відрізняються за своїми скоротливими та електричними відповідями на аплікацію різних агоністів (Sneddon et al. 1992, Ventura et al. 1997). Присутність ВКСа каналів у клітинній мембрані епідидимальної частини vas deferens щура було показано в одній роботі (Huang et al. 1997), в якій високоспецифічний блокатор ВКСа каналів харібдотоксин повністю знищував зростання вихідного струму, викликане аплікацією імовірного активатора ВКСа каналів NS 1619. Більше того, у багатоклітинних препаратах BaCl2 дозозалежно викликав фазові скорочення vas deferens щура (Huang 1995). Цей ефект скоріш за все був викликаний блокадою калієвих каналів, чутливих до Ва2+.

Молекулярна природа потенціалкерованих калієвих каналів у мембрані ГМК vas deferens щура досі не була достатньо вивчена. Останнім часом з’являлись відомості про експресію різних типів потенціалкерованих калієвих каналів у тканині vas deferens щура, демонструючи, що і струми затриманого випрямлення, і струми А-типу можуть бути експресовані в даному типі тканини (Ohya et al.1997, 2000). Однак прямих електрофізіологічних доказів існування різноманітності потенціалкерованих калієвих каналів у мембрані ізольованих ГМК даного типу досі представлено не було.

Раніше було показано (Belevych et al. 1999), що потенціалкерований вхідний струм ізольованих ГМК епідидимальної частини vas deferens щура переноситься через кальцієві канали L-типу, а також через класичні тетродотоксин-чутливі натрієві канали. Нами було з’ясовано, що вихідний калієвий струм в даному об’єкті складається з Са2+-залежного та потенцалкерованого компонентів. Було зроблено висновок, що Са2+-залежний компонент представляв собою струм через ВКСа канали, оскільки цей струм блокувався специфічними блокаторами ВКСа каналів харібдотоксином та паксиліном. В умовах блокування обох вхідних провідностей, а також за наявності в зовнішньому розчині 200 нМ харібдотоксину, що дозволяло максимально зменшити внесок Са2+-залежного калієвого струму, в ізольованих ГМК епідидимальної частини vas deferens щура нами було ідентифіковано два типи потенціалкерованих вихідних калієвих струмів: струм із швидкою кінетикою активації та інактивації (А-типу) (ІК,f) та струм затриманого випрямлення (IK,dr).

Са2+-залежний К+ струм. Характерною ознакою струмів даного типу є підвищення імовірності відкритого стану у відповідь на зростання концентрації вільного Са2+ всередині клітини. Базуючись на величині провідності поодинокого каналу, КСа канали прийнято розділяти на три групи: канали великої, середньої та малої провідності.

Нами було проведено порівняння ефективності блокуючої дії на Са2+-активовані калієві канали ГМК епідидимальної частини vas deferens щура паксиліну та ТЕА, який є широко відомим неселективним блокатором калієвої провідності. В наших дослідах ТЕА, доданий до зовнішнього розчину, ефективно блокував вихідний струм аналогічно до паксиліну, при цьому концентрація ТЕА, необхідна для пригнічення струму аналогічно до 1 мкМ паксиліну, складала 0,3 мМ. Оскільки при додаванні 1 мкМ паксиліну в зовнішній розчин, що містив 0,3 мМ ТЕА, амплітуда вихідного струму фактично не змінювалась, було зроблено висновок про те, що навіть відносно низькі концентрації ТЕА є цілком достатніми для ефективного блокування струму через Са2+-залежні калієві канали великої провідності в досліджуваних ГМК.

Дослідження дії паксиліну на мембранний потенціал гладеньком`язових клітин епідидимальної частини сім`явивідних протоків щура показали, що при значеннях потенціалу у межах -60…-45 мВ (тобто близьких до значення потенціалу спокою в даному типі ГМК) паксилін у концентрації 1 мкМ не впливав на мембранний потенціал. Однак при значеннях потенціалу, вищих за –45 мВ, аплікація паксиліну в зовнішній розчин викликала помітну деполяризацію клітинної мембрани. Це дозволяє зробити висновок про те, що КСа канали великої