НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

КРЕМІНСЬКА ІРИНА БОГДАНІВНА

УДК 616-071 + 616.13-004.6 + 616.717 + 616-08

ВПЛИВ ФІЗИЧНИХ НАВАНТАЖЕНЬ РІЗНОЇ ІНТЕНСИВНОСТІ НА

АТЕРОГЕНЕЗ У ЩУРІВ

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Івано-Франківському державному медичному університеті МОЗ

України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

ЛЕВИЦЬКИЙ Володимир Андрійович,

Івано-Франківський державний медичний університет МОЗ

України, завідувач кафедри анатомії людини.

Офіційні опоненти: заслужений діяч науки і техніки України,

доктор медичних наук, професор

ГОЖЕНКО Анатолій Іванович,

Одеський державний медичний університет МОЗ

України, завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної

фізіології.

кандидат медичних наук

ПОРТНИЧЕНКО Володимир Ілліч,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

старший науковий співробітник

Захист дисертації відбудеться “_ 4_” __грудня__ 2007 року

о __14___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 198. 01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_3_” __листопада__ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26. 198. 01

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальність теми. Сьогодні особливу увагу дослідників викликає проблема вивчення особливостей будови та властивостей судинного ендотелію, який відіграє важливу роль у судиннорухових реакціях (Марков Х.М., 2005; Bolli R.M. et al., 2001), володіє антиагрегаційними, антитромботичними (Guzik T.J. et al., 2000), антикоагуляційними (Muller B. et al., 2000) і антипроліферативними (Smirin B.V. et al., 2000) властивостями, приймає участь у ремоделюванні судин та ангіогенезі (Амосова Е.Н. и соавт., 2007; Frellin C. et al., 2000). Ендотеліальні клітини реагують на зміни гемодинаміки, є чутливими до нейрогуморальних факторів, серед яких не тільки нейромедіатори та гормони, а і цілий ряд інших циркулюючих і місцевих вазоактивних речовин, які продукуються різними клітинами, в тому числі, і клітинами крові. Під дією цих факторів ендотеліальні клітини синтезують і секретують біологічно активні субстанції, які модулюють судинний тонус і структуру складових компонентів судинної стінки. Серед таких субстанцій особливо важливу роль відіграють оксид азоту і ендотеліни (Мойбенко А.А. и соавт., 2003; Гоженко А.И. и соавт., 2005; Ватутин Н.Т. и соавт., 2006; Liauder L. et al., 2000).

Порушення функції ендотелію - ендотеліальна дисфункція - виявляється уже на початкових стадіях цілого ряду захворювань, відіграє провідну роль у патогенезі різноманітних патологічних станів, зокрема таких як атеросклероз, ішемічна хвороба серця, гіпертонічна хвороба, серцева недостатність, дифузні захворювання сполучної тканини, печінкова недостат-ність, облітеруючі захворювання нижніх кінцівок (Затейников Д.А. и соавт., 2000; Малая Л.Т. и соавт., 2000; Лутай М.И. и соавт., 2001; Корж А.Н., 2003; ).

Доведено, що ендотеліальні клітини є надзвичайно чутливими до різних ушкоджуючих факторів, таких як гіперхолестеринемія, вільні радикали, цитокіни, циркулюючі імунні комплекси, паління, підвищення артеріального тиску та ін. (Залесский В.Н. и соавт., 2003; Поливода С.Н. и соавт., 2004, Llorens S. et al., 2003). Ці фактори, в першу чергу, ведуть до порушення синтезу ендотелійзалежних субстанцій релаксації і сприяють розвитку атеросклерозу (Лутай М.И. и соавт., 2004, Halcox J., 2002), який є складним патологічним процесом, пов'язаним не тільки з ушкодженням ендотелію, а і з модифікацією цілого ряду клітинних компонентів судинної стінки (Марцинкевич Г.И. и соавт., 2000).

Зростає інтерес до вивчення ендотелію як мішені для лікувальних та профілактичних впливів на патологічні процеси, які лежать в основі розвитку захворювань серцево-судинної системи (Корж А.Н., 2003). З цього приводу привертає до себе увагу питання про вплив на структурний і функціональний стан ендотеліоцитів судин не тільки фармакологічних середників, а і фізичних факторів, зокрема, фізичних навантажень різної інтенсивності. На сьогодні зустрічаються поодинокі літературні дані про позитивний вплив на судинну стінку фізичних навантажень помірної інтенсивності, тоді як інтенсивні фізичні навантаження в цьому аспекті відіграють негативну роль (Аронов Д.М. и соавт., 2003; Бубнова М.Г. и соавт., 2003; Zhang R. et al., 2001). Обмеженими є свідчення про зміни синтезу ендотеліоцитами при фізичних навантаженнях тонусрегулюючих факторів судин (Бубнова М.Г. и соавт., 2005).

Важливо відмітити, що на даний час практично є відсутніми свідчення стосовно ознак ендотеліальної дисфункції судин нижніх кінцівок. Зокрема, не вивченими залишаються питання розвитку ендотеліаьної дисфункції і атерогенез стегнових артерій при гіперхолестеринемії, викликаній атерогенною дієтою, при фізичних навантаженнях різної інтенсивності та їх поєднанні.

Ці аспекти вимагають подальшого вивчення і дискусії і є предметом нашого дисертаційного дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер-таційне дослідження виконано відповідно до плану Івано-Франківського дер-жав-ного медичного університету і є фрагментом науково-дослідної роботи кафедри патологічної фізіології “Механізми ендотеліальної дисфункції мікро-циркуляторного русла міокарда, аорти та судин нижніх кінцівок при емоцій-ному стресі, гіперхолестеринемії, фізичному навантаженні та їх поєднанні” (номер держреєстрації 01050004976). Здобувач є співвиконавцем даної наукової теми.

Мета та завдання дослідження: встановити загальні закономірності розвитку ендотеліальної дисфункції та атерогенезу у стегнових артеріях при аліментарній гіперхолестеринемії, фізичному навантаженні різної інтенсивності та їх поєднанні.

Завдання дослідження:

1. Дослідити зміни ліпідного спектра сироватки крові у щурів, які перебували на атерогенній дієті, піддавалися впливу фізичних навантажень високої інтенсивності та при поєднанні цих факторів.

2. Визначити активність про- та антиоксидантних процесів і вміст ендотелійзалежних факторів (метаболітів оксиду азоту і ендотеліну-1) у крові тварин, які перебували на атерогенній дієті, піддавалися впливу фізичних навантажень високої інтенсивності та при їх поєднанні.

3. Дослідити морфологічні зміни стінки стегнових артерій щурів, які перебували на атерогенній дієті, піддавалися впливу фізичних навантажень високої інтенсивності та при поєднанні цих факторів.

4. Визначити вміст ліпідів різних класів, продуктів активності про- та антиоксидантних процесів, рівень метаболітів оксиду азоту і ендотеліну-1 у крові та морфологічний стан стегнових артерій досліджуваних тварин під впливом фізичних навантажень помірної інтенсивності.

5. Дослідити зміни ліпідного спектра, показників про- та антиоксидантної систем, рівня метаболітів оксиду азоту і ендотеліну-1 крові під впливом фізичних навантажень помірної інтенсивності у тварин, які перебували на атерогенній дієті.

6. Дослідити вплив фізичних навантажень помірної інтенсивності на процеси атерогенезу стегнових артерій у щурів, які перебували на атерогенній дієті.

Об’єкт дослідження: права і ліва стегнові артерії, плазма і сироватка крові щурів.

Предмет дослідження: показники про- та антиоксидантної систем, ліпідний спектр сироватки крові, метаболіти оксиду азоту та ендотеліну у плазмі крові при ендотеліальній дисфункції на фоні аліментарної гіперхолестеринемії, фізичного навантаження різної інтенсивності та їх поєднання, гістологічні та ультраструктурні прояви ендотеліальної дисфункції та атерогенезу у стегнових артеріях.

Методи дослідження: біохімічні, імуноферментні, розрахункові, морфологічні, морфометричні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Пріоритет дослідження полягає у новому морфофункціональному підході до проблем вивчення ендотеліальної дисфункції судин. Вперше, поєднавши використання біохімічних, імуноферментних, морфологічних та морфометричних методів дослідження, вивчено ознаки ендотеліальної дисфункції та атерогенезу у стегнових артеріях щурів при аліментарній гіперхолестеринемії, фізичних навантаженнях різної інтенсивності та їх поєднанні.

Новими є дані про значне порушення балансу у про- і антиоксисидантній системі крові при гіперхолестеринемії аліментарного походження та фізичних навантаженнях високої інтенсивності. При цьому вперше відмічено, що поєднання цих факторів проявляється вираженим накопиченням у крові продуктів активації ПОЛ та значним виснаженням ферментів антиоксидантного захисту. Крім того, фізичні навантаження високої інтенсивні супроводжуються змінами ліпідного спектра крові атерогенного характеру із збільшенням вмісту загальних ліпідів, загального холестерину та холестерину ліпопротеїнів низької щільності.

Вперше встановлено, що аліментарна гіперхолестеринемія та фізичні навантаження високої інтенсивні проявляються змінами вмісту у плазмі крові ендотеліальних факторів регуляції тонусу судин: оксиду азоту та ендотеліну-1. Відмічено, що концентрація метаболітів оксиду азоту, як вазодилятаційних факторів, знижується, а концентрація ендотеліну-1, як вазоконстрикторної субстанції, зростає. Особливо такі зміни є характерними для поєднання гіперхолестеринемії з фізичними навантаженнями високої інтенсивності.

На основі морфологічних досліджень встановлено, що атерогенна дієта та фізичні навантаження високої інтенсивності і особливо їх поєднання проявляється розвитком атеросклерозу стегнових артерій. Відмічено, що у цьому процесі важливу роль відіграють видозмінені (“темні”) міоцити м‘язової оболонки стегнових артерій, які є потенційними міоінтимоцитами та пінистими клітинами.

Вперше відмічено, що фізичні навантаження помірної інтенсивності сприяють укріпленню антиоксидантної системи крові, ведуть до збільшення вмісту у крові ліпопротеїнів з антиатерогенними властивостями, підвищення концентрації метаболітів оксиду азоту в сироватці крові, а на фоні атерогенної дієти призводять до обмеження проявів ендотеліальної дисфункції та атеросклеротичного ушкодження стегнових артерій.

Проведені дослідження уточнюють та доповнюють дані стосовно впливу гіперхолестеринемії і фізичних навантажень на біохімічні показники крові та морфологічну перебудову судин.

Практичне значення одержаних результатів. Виконане дослідження доповнює існуючі уявлення про етіологію і патогенез ендотеліальної дисфункції судин, з нових позицій висвітлює механізми ушкоджуючого впливу на струк-турні компоненти стінки стегнових артерій атерогенної дієти, фізичних навантажень високої інтенсивності та їх поєднання.

Результати дисертаційної роботи можуть використовуватись в кардіології, лікувальній фізкультурі та спортивній медицині, судинній хірургії, оскільки вони під-тверджують позитивний вплив помірних фізичних навантажень на ліпідний спектр крові та стан ендотелію судин, а високоінтенсивні фізичні наванта-ження, навпаки, проявляють атерогенну дію, поглиблюють атеросклеротичні зміни стегнової артерії. Систематичні фізичні тренування в помірному режимі у здорових людей підтримують оптимальний транспорт ліпідів, а при різних дисліпіднеміях та атеросклерозі сприяють нормалізації ліпідного обміну.

Визначення вмісту у плазмі крові ендотелійзалежних факторів регуляції судинного тонусу при судинній патології дають можливість розробити більш ефективні методи їх фармакокорекції.

Результати роботи можуть стати базовими для подальшого поглиблення вивчення ендо-теліальної дисфункції та її локальних проявів в інших магістральних судинах організму.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею здобувача, яким самостійно проаналізована наукова література і обгрунтована ідея, визначена тема і складені план та робоча програма дослідження. Самостійно здійснено підбір тварин, проведено моделювання гіперхолесте-ринемії, фізичних навантажень, проведено забір матеріалу для біохімічних, імуноферментних, морфологічних і морфометричних досліджень. Проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення отриманих результатів. Сформульовано висновки, відредаговано і оформлено роботу, подано практичні рекомендації. Провідною є участь здобувача в підготовці наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на науковій конференції Одеського відділення наукового товариства патофізіологів України IV читання ім. В.В.Підвисоцького (Одеса, 2005); на 75 міжвузівській науковій конференції молодих вчених і студентів (Івано-Франківськ, 2006); на науково-практичній конференції “Проблеми, досягнення і перспективи розвитку медико-біологічних наук і практичної охорони здоров’я” (Сімферополь, 2006); на всеукраїнській науково-практичній конференції (з міжнародною участю) “Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики“ присвячена пам’яті академіка Л.Т. Малої (Харків, 2006); на 79-й міжвузівській науково-практичній конференції студентів і молодих вчених „Теоретичні і практичні аспекти сучасної медицини” (Сімферополь, 2007), на 3-й міжнародній науковій конференції „Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка” (Одеса, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 7 статей у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України та 6 тез у збірниках праць з’їздів і конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Роботу викладено на 169 друкованих сторінках. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3-х розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел. Дисертація ілюстрована 13 таблицями і 35 рисунками. Бібліографічний показник включає 288 джерел, з них – 199 кирилицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 120-ти білих безпородних статевозрілих щурах-самцях, масою 180-240 г, які утримувалися в умовах кафедрального віварію і були поділені на 6 груп: 1-ша – контрольна (інтактні тварини, які приймали звичайну для цих тварин їжу); 2-га – тварини, які перебували на атерогенній дієті; 3-тя – тварини, які приймали звичайну їжу і піддавалися впливу фізичних навантажень високої інтенсивності (ФНВІ); 4-та – тварини, які приймали звичайну їжу і піддавалися впливу фізичних навантажень помірної інтенсивності (ФНПІ); 5-та – тварини, які перебували на атерогенній дієті і зазнавали впливу ФНВІ; 6-та – тварини, які перебували на атерогенній дієті і зазнавали впливу ФНПІ.

Для моделювання аліментарної гіперхолестеринемії (ГХЕ) у щурів використову-вали атерогенну дієту, запропоновану Косицьким Г.І. і співавт. (1979), до якої входить 1,5 г холестерину і 10 г маргарину з розрахунку на 1 кг маси тіла або до дієти замість маргарину включався свинячий жир у такому ж розрахунку (Одушко Н.П., 1982). В обох випадках до дієти обов’язково додавалися жовчні кислоти із розрахунку 0,1 г на 1 кг маси тіла. Така суміш вводилася зондом у глибину ротової порожнини тварин щоденно натще протягом 60 діб.

Фізичні навантаження помірної інтенсивності у інтактних тварин та у тварин, які перебували на атерогенній дієті, моделювали щоденним 1-годинним бігом у широко-стрічковому тредбані зі швидкістю 24 м/хв протягом 60 діб. Таким же чином моделювалося фізичне навантаження високої інтенсивності, але швидкість бігу тварин у тредбані складала 36 м/хв (Талько В.И., 1989).

Матеріал забирався під нембуталовим наркозом з розрахунку 40 мг на кг ваги тварини через 60 діб з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції захисту тварин (Страсбург, 1985). Визначення вмісту у сироватці крові загальних ліпідів (ЗЛ), загального холестерину (ЗХС) та холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ХС-ЛПВЩ) проводили з використанням стандартного набору реактивів ООО “Ольвекс Диагностикум” (Росія, Санкт-Петербург), тригліцеридів (ТГ) - за допомогою стандартного набору реактивів фірми PVIVA-Lachema a.s. (Чехія). Вміст у сироватці крові холестерину ліпопротеїнів низької щільності (ХС-ЛПНЩ) розраховували за формулою Фрідвальда (Абидова К.Р., 2001), а коефіцієнт атерогенності (КА) - за формулою Клімова А.Н. (Целуйко В.И. и соавт., 2001).

Вивчали вміст вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) – малонового диальдегіду (МДА), які реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-АП) (Коробейникова Е.Н., 1989). Стан антиоксидантної системи (АОС) оцінювали за активністю ферментів церулоплазміну та трансферину (Бабенко Г.О., 1962, 1965).

Визначення концентрації ендотеліальних факторів, а саме ендотеліну-1 в плазмі крові проводили за допомогою стандартного набору реактивів Endothelin (1-21) EIA kit виробника Biomedica (Австрія), за протоколом А: безпосереднє визначення ендотеліну у взірцях плазми з етилендіамінтетраоцтовою кислотою, а вмісту нітрит-аніону в плазмі крові - за допомогою набору реактивів Total NO ASSA Y KIT фірми ROS (Україна). Після декапітації тварин для дослідження забиралися права і ліва стегнові артерії, починаючи від пахової зв‘язки і закінчуючи їх входом у підколінну ямку. Обидві артерії поділялися на верхню, середню та нижню третини. Мікроскопічна оцінка атеросклеротичних змін стегнових артерій проводилася на гістологічних препаратах, зафарбованих гематоксиліном і еозином та пікрофуксином за загальноприйнятими методиками. Після заключення зрізів у канадський бальзам препарати вивчали під мікроскопом “Біолам” при різних збільшеннях (окуляр 10, об’єктив 10, 20, 40). За допомогою мікрометричної лінійки на поперечних гістологічних зрізах стегнових артерій на довжині 100 мкм окружності цих артерій підраховували кількість складок внутрішньої еластичної мембрани, вимірювали їх глибину. Для електронномікроскопічних досліджень ділянки стегнових артерій попередньо фіксували в 2,5% розчині глютарового альдегіду, а потім 2 години дофіксовували в 2% розчині тетраокису осмію на 0,1 М фосфатному буфері з рН 7,4. Після дегідратації в спиртах матеріал заливали в епоксидні смоли. Отримані на ультрамікротомі зрізи вивчали на електронному мікроскопі ПЗМ-125 К з наступним фотографуванням при збільшеннях від 6000 до 30000 разів. Напівтонкі зрізи вивчали під бінокулярним мікроскопом МБР-3.

Результати дослідження та їх обговорення.

Результати проведених досліджень показали, що атерогенна дієта протягом 60 діб супроводжується зміною ліпідного спектра крові експериментальних тварин та розвитком вираженої ендотеліальної дисфукції, що проявляється атеросклеротичним ушкодженням стегнових артерій. Нами відмічено, що достовірне збільшення концентрації загальних ліпідів в сироватці крові цієї групи тварин пов’язане з підвищенням вмісту в ній тригліцеридів і загального холестерину та збагаченням холестерином ліпопротеїнів низької щільності. Так, рівень тригліцеридів у порівнянні з інтактними тваринами зростає з 1,21±0,03 до 3,15±0,02 ммоль/л (р<0,001), вміст загального холестерину збільшується з 1,27±0,01 до 2,15±0,03 ммоль/л (р<0,001), а концентрація холестерину в складі ЛПНЩ підвищується з 0,45±0,01 до 0,82±0,01 ммоль/л (р<0,001). При цьому наші дані до деякої міри є співзвучними з результатами досліджень інших авторів (Абидова К.Р., 2001; T.F. Luscher et al., 1996). При цьому вміст холестерину у складі ЛПВЩ зростає незначно (з 0,29±0,02 до 0,34±0,02 ммоль/л, р>0,05) і є свідченням порушення транспорту холестерину від клітин різних органів до печінки (Братусь В.В. и соавт., 2004). Вирахувавши коефіцієнт атерогенності, який відображає співвідношення між холестерином ЛПНЩ і холестерином ЛПВЩ, ми відмітили його значне збільшення, що є опосередкованим свідченням підвищення атерогенних властивостей ліпідів сироватки крові та розвитку атеросклерозу з ознаками ушкодження ендотелію судин (Rissioni, 2007).

Крім безпосереднього ушкодження ендотеліоцитів атерогенними формами ліпопротеїнів, при атерогенній дієті відбувається включення інших молекулярних механізмів ушкодження клітин. Зокрема, нами відмічені ознаки активації пероксидного окиснення ліпідів, що підтверджується збільшенням вмісту у крові МДА (на 34,7%, р<0,001) та помітним зниженням активності ферментів антиоксидантного захисту – церулоплазміну і трансферину, відповідно з 0,19±0,01 до 0,12±0,01 у.о. (р<0,001) та з 0,18±0,01 до 0,11±0,01 у.о. (р<0,001). Слід думати, що метали цих ферментів, які здатні змінювати свою валентність, широко використовуються у реакціях, під час яких утворюються нові вільні радикали (Нейко Є.М. і співав., 2005; Nilsson et al., 2007).

Ушкодження ендотеліоцитів проявляється порушенням ендотелійзалежної вазодилятації, що є наслідком зменшення синтезу цими клітинами оксиду азоту, при збереженій продукції ендотеліальних факторів вазоконстрикції (Марков Х.М., 2005; Osto, 2007). У нашому випадку, перебування тварин на атерогенній дієті супроводжується зниженням рівня нітрит-аніону (NO2) в плазмі крові з 17,21±0,47 до 12,26±0,51 мкМоль/л (р<0,001) та підвищенням вмісту ендотеліну-1 з 0,64+±0,12 до 1,83±0,09 фМоль/мл (р<0,001) у порівнянні з інтактними тваринами. В результаті виникає дисбаланс між вазодилятаторними і вазоконстрикторними ендотеліальними факторами регуляції судинного тонусу, що призводить до спазму артерій, в тому числі і стегнових, та підтверджується проведеними нами гістологічними і електронномікроскопічним дослідженнями цих судин.

В результаті атерогенної дієти в судинній стінці відбувається комплекс структурно-функціональних перебудов, який відображає клітинну відповідь на вплив патогенних для судинної стінки чинників. При гістологічному дослідженні різних відділів стегнових артерій виявляється їх спазм, що проявляється збільшенням кількості складок внутрішньої еластичної мембрани (з 10±2 у контролі до 15±2,51 на 100 мкм окружності цих судин) та їх поглибленням (з 8,3±0,55 мкм до 10,6±0,71 мкм). Спостерігається локальний набряк та розшарування цієї мембрани, а в деяких ділянках навіть її повне руйнування. В таких місцях відбувається відшарування ендотеліального шару судин та набряк їх м’язової оболонки. На субмікроскопічному рівні у цитоплазмі окремих ендотеліоцитів виявляється велика кількість мікропіноцитозних везикул і дрібних вакуоль, що є свідченням підсилення трансендотеліальних транспортних процесів. Такі клітини містять підвищену кількість вільних і фіксованих рибосом та мітохондрії з ущільненим матриксом і упорядкованими кристами, що є морфологічним маркером їх активного функціонального стану. За рахунок трансцитозу ліпопротеїни масово надходять і накопичуються в субендотелії, де утворюються пінисті клітини - наповнені холестерином макрофаги моно- та міоцитарного походження. Значна частина їх руйнується, в результаті чого утворюються позаклітинні відкладення цієї сполуки. Поряд з цим, багато ендотеліальних клітин є ушкодженими, вони відшаровуються від внутрішньої еластичної мембрани, яка в цих місцях набрякає і розволокнюється, частково руйнується. До її зовнішньої поверхні прилягають за нашою класифікацією нормальні („світлі”) та видозмінені („темні”) гладенькі м’язові клітини. Серед останніх є потенційні макрофагоподібні міоінтимоцити, які мігрують через внутрішню еластичну мембрану в субендотелій, де поряд з моноцитами швидко насичуються модифікованими ліпопротеїнами і перетворюються у пінисті клітини, які частково руйнуються, в результаті чого в інтимі накопичуються позаклітинні відкладення холестерину – основи атероматозних бляшок. Крім того, під впливом цитокінів підсилюється синтез активованими міоінтимоцитами складових компонентів сполучної тканини - глікозаміногліканів, глікопротеїнів, волокнистих білків (еластину і колагену) (Анестиади В., 1991), із-за чого у стінці стегнових артерій активуються склеротичні процеси.

Фізичні навантаження високої інтенсивності, як і атерогенна дієта, мають негативний вплив на біохімічні показники крові та структуру судинної стінки. У порівнянні з контолем вони призводять до збільшення вмісту в сироватці крові щурів загальних ліпідів (з 3,88±0,01 до 4,90±0,02 г/л, р<0,001), тригліцеридів (з 1,21±0,03 до 3,10±0,04 ммоль/л, р<0,001), загального холестерину (з 1,27±0,01 до 2,05±0,04 ммоль/л, р<0,001), холестерину ЛПНЩ (з 0,45±0,01 до 0,77+±0,01 ммоль/л, р<0,001) та холестерину ЛПВЩ (з 0,29±0,02 до 0,36±0,03 ммоль/л, р>0,05). В результаті таких змін ліпідного спектра крові суттєво підвищується коефіцієнт атерогенності (з 3,84±0,33 до 5,78±0,61, р<0,001), що свідчить про атерогенне спрямування таких навантажень і є співзвучним з даними інших наукових досліджень (Бубнова М.Г. и соавт., 2003; Nih, 1996). Підвищення рівня загального холестерину і тригліцеридів в сироватці крові при динамічних фізичних навантаженнях високої інтенсивності, як стверджують окремі автори (Аронов Д.М. и соавт., 2006), є компенсаторною реакцією, направленою на енергозабезпечення скелетної мускулатури, що працює в режимі максимального напруження.

Стрес та гіпоксія перенапруження, які виникають при фізичних навантаженнях високої інтенсивності, призводять до надмірної активації пероксидного окиснення ліпідів. При цьому ПОЛ ініціюється великою кількістю вільних радикалів, які утворюються в крові, мембранах клітин скелетних м’язів та інших тканин при фізичних навантаженнях (Подгаєцька О.Є. і співав., 2007; R. Andel, 2007; Landmesser, 2007]. Це підтверджується результатами проведених нами досліджень. Зокрема, відмічено, що в крові експериментальних тварин накопичується велика кількість одного із кінцевих продуктів ПОЛ - малонового диальдигіду, концентрація якого зростає з 4,58±0,07 до 6,19±0,05 нмоль/мл (р<0,001). Поряд з цим, в результаті виснаження антиоксидантної системи, відбувається зниження активності церулоплазміну з 0,19±0,01 до 0,13±0,01 у.о. (р<0,001) та трансферину - з 0,18±0,01 до 0,12±0,01 у.о. (р<0,001).

Виражена гіперхолестеринемія та оксидативний стрес при високоінтенсивних фізичних навантаженнях призводять до розвитку ендотеліальної дисфункції судин, що проявляється різким зниженням рівня нітрит-аніону і підвищенням вмісту ендотеліну-1 в плазмі крові. Нами вперше визначено рівень цих ендотелійзалежних субстанцій у плазмі крові при фізичних навантаженнях високої інтенсивності і встановлено, що рівень нітрит-аніону знижується з 17,21±0,47 до 13,62±0,09 мкМоль/л (р<0,001), а концентрація ендотеліну-1 зростає з 0,64±0,12 до 1,62±0,10 фМоль/мл (р<0,001).

Наслідком таких змін є виражений спазм артеріальних судин, в тому числі і досліджуваних нами стегнових артерій. Так, на 100 мкм окружності цих артерій у порівнянні з контролем нараховується в 1,6 рази більше складок внутрішньої еластичної мембрани, в 1,3 рази зростає їх глибина. Гістологічні та електронномікроскопічні методи дослідження дозволили нам виявити не тільки спазм цих артерій, але й виражене їх атеросклеротичне ушкодження, яке є аналогічним до описаного при аліментарній гіперхолестеринемії. Зокрема, виявляється набряк ендотеліоцитів, морфологічні ознаки підвищеної активності ядер та мітохондрій, збільшення кількості мікропіноцитозних везикул та дрібних вакуолей, що є свідченням підсилення трансендотеліального транспорту ліпопротеїнів. Крім того, спостерігається повне руйнування окремих ендотеліоцитів, їх десквамація, оголення внутрішньої еластичної мембрани, її локальні потовщення та стоншення, часткове руйнування. В субендотелії накопичуються пінисті клітини моно- і міоцитарного походження, екстрацелюлярні депозити холестерину. У м‘язовій оболонці виявляється велика кількість “темних” міоцитів, частина яких мігрує через внутрішню еластичну мембрану і трансформується у міоінтимоцити. У стінці досліджуваних артерій активуються склеротичні процеси, а в просвіті цих судин виявляються еритроцитарні сладжі, тромбо- і лейкоцитарні агрегати.

На противагу фізичним навантаженням високої інтенсивності, навантаження помірної інтенсивності характеризуються позитивним впливом на біохімічні показники крові та структуру стінки стегнових артерій експериментальних тварин. Яскравою ознакою ФНПІ є зниження рівня холестерину в складі ЛПНЩ з 0,45±0,01 до 0,33±0,02 ммоль/л (р<0,001) та збільшення його вмісту в складі ЛПВЩ з 0,29±0,02 до 0,48±0,03 ммоль/л (р<0,001). Це призводить до помітного зменшення коефіцієнту атерогенності (з 3,84±0,33 до 1,64±0,18, р<0,001), що підтверджує антиатерогенний вплив таких фізичних навантажень. Як стверджують окремі автори (Аронов Д.М. и соавт., 2006), фізичні навантаження такого роду призводять до посилення активності ліпопротеїнліполізу і характеризуються зниженням рівня тригліцеридів, підвищенням швидкості утилізації холестерину ЛПНЩ і активацією зворотного транспорту холестерину в складі ЛПВЩ. На нашу думку, появі позитивних змін в холестеринтранспорній системі крові при ФНПІ сприяє більш економне використання кисню тканинами організму, яке дозволяє виконувати фізичну роботу без розвитку гіпоксії перенапруження і тим самим забезпечує аеробні умови для окиснення ліпідів (Бубнова М.Г. и соавт., 2005; Todd J., 1999).

На основі активації аеробних процесів при фізичних навантаженнях помірної інтенсивності підтримується характерний для інтактних тварин баланс у про- та антиоксидантній системі. Із-за цього зміни показників вмісту малонового диальдигіду (4,58±0,07 проти 4,32±0,05 нмоль/мл), активності церулоплазміну (0,20±0,01 проти 0,19±0,01 у.о.) та трансферину (0,19±0,01 проти 0,18±0,01 у.о.) у цієї групи експериментальних тварин у порівнянні з контролем є невірогідними.

Антиатерогенні зміни ліпідного спектра крові, оптимальний рівень активності ПОЛ та антиоксидантних ферментів обумовлюють збереження ендотеліальної функції судин. Це підтверджується збільшенням вмісту у крові нітрит-аніону з 17,21±0,47 до 18,4±0,11 мкМоль/л (р<0,001) та ендотеліну-1 з 0,64±0,12 до 0,92±0,06 фМоль/мл (р<0,001), що характеризує збалансованість вазодилятаційної та вазоконстрикційної функцій ендотеліоцитів.

Позитивний вплив ФНПІ на судини підтверджується морфологічним та морфометричним дослідженням стегнових артерій експериментальних тварин. На 100 мкм окружності цих судин нараховується 9,6±1,8 складок внутрішньої еластичної мембрани (проти 10±2,1 в контролі), глибина яких складає 7,8±0,42 мкм (проти 8,3±0,55 мкм у контролі) на фоні цілковитого збереження структури їх стінки.

Важливим, на нашу думку, є вивчення особливостей розвитку ендотеліальної дисфункції під впливом фізичних навантажень різної інтенсивності не на здоровий організм, а з супутньою серцево-судинною патологією, а саме, гіперхолестеринемією аліментарного походження. Застосування фізичних навантажень різної інтенсивності у тварин, які перебували на атерогенній дієті, в першу чергу дозволило нам виявити цілий ряд принципово різних реакцій ліпідтранспорної системи, оксидантної і антиоксидантної систем крові, самих ендотеліоцитів кровоносних судин.

З цієї точки зору особливо небезпечними є фізичні навантаження високої інтенсивності. Так, у крові щурів 5-ї експериментальної групи у порівняні з 2-ю спостерігається збільшення вмісту загальних ліпідів з 5,37±0,02 до 5,68±0,03 г/л (р<0,001), тригліцеридів з 3,15±0,02 до 3,43±0,05 ммоль/л (р<0,001), загального холестерину з 2,15±0,03 до 2,31±0,02 ммоль/л (р<0,001), холестерину ЛПНЩ з 0,82±0,01 до 0,91±0,02 ммоль/л (р<0,001). У порівнянні з контролем такі зміни різних фракцій ліпідів сироватки крові є ще більш вираженими. Вони є наслідком не тільки екзогенного надходження холестерину, а і результатом підсилення ліполізу жиру в жирових депо на фоні пригнічення ліпопротеїнліпази (Mueller, 2007). При цьому вміст холестерину в складі ЛПВЩ знижується з 0,34±0,02 до 0,31±0,02 ммоль/л (р>0,05). Якщо при окремо взятих ФНВІ і ГХЕ збільшення рівня холестерину в складі ЛПВЩ ще свідчить про підвищення інтенсивності відтоку холестерину від тканин (Бубнова М.Г. и соавт., 2003), то поєднання цих впливів гальмує цей важливий процес. В результаті збільшення вмісту холестерину в складі ЛПНЩ і його зменшення у структурі ЛПВЩ різко підвищується коефіцієнт атерогенності. Він збільшується в 1,55 рази, а в порівнянні з контролем - в 1,97 рази.

Поєднання ФНВІ з атерогенною дієтою, у порівнянні з окремо взятими ГХЕ і ФНВІ, більш суттєво впливає на порушення балансу у про- та антиоксидантній системі, про що свідчить значне накопичення в крові малонового диальдегіду та виснаження активності церулоплазміну і трансферину. Порівнюючи ці показники у даній групі з показниками групи щурів, які перебували на атерогенній дієті, спостерігається збільшення рівня малонового диальдегіду з 6,17±0,04 до 6,66±0,07 нмоль/мл (р<0,001) та незначне зниження концентрації церулоплазміну і трансферину (відповідно - з 0,12±0,01 до 0,11±0,01 у.о. та з 0,11±0,01 до 0,10±0,01 у.о. У порівнянні ж з контролем вміст малонового диальдегіду зростає аж в 1,45 рази (р<0,001), а активність церулоплазміну і трансферину знижується відповідно в 1,72 (р<0,001) та 1,80 (р<0,001) рази.

Активація молекулярних механізмів призводять до вираженого ушкодження ендотеліоцитів та значного порушення їх функції. Свідченням цьому є суттєве зменшення у плазмі крові тварин 5-ї експериментальної групи, у порівнянні з 2-ю, вмісту нітрит-аніону (з 12,26±0,47 до 9,35±0,11 мкМоль/л, р<0,001) та збільшення рівня ендотеліну-1 (з 1,83±0,09 до 1,96±0,18 фМоль/мл, р>0,05). У порівнянні з контролем зміни концентрації цих важливих ендотелійзалежних субстанцій є ще більш помітними.

Поєднання атерогенної дієти з фізичними навантаженнями високої інтенсивності, порівняно з окремо взятими ГХЕ та ФНВІ, проявляється більш глибокими структурними змінами стінки стегнових артерій, що підтверджується гістологічними і електронномікроскопічними методами дослідження. Є більш вираженим спазм цих судин, на що вказує збільшення кількості складок внутрішньої еластичної мембрани з 15±2,5 до 18±1,8 на 100 мкм їх окружності та збільшення глибини цих складок з 10,6±0,71 мкм до 12,3±0,7 мкм. На фоні вираженого руйнування ендотелію досліджуваних судин, виявляються обширні атероматозні та атеросклеротичні бляшки, ознаки медіасклерозу, який є наслідком підвищення синтетичної активності “темних” міоцитів. Крім того, велика кількість “темних” м‘язових клітин підлягають вакуольній дегенерації із послідуючим заміщенням сполучною тканиною. В просвіті артерій підсилюються агрегаційні процеси.

На противагу цьому, вплив фізичних навантажень помірної інтенсивності, що виконувалися на фоні атерогенної дієти, до певної міри корегує порушення ліпідного спектра крові. Зокрема, у сироватці крові тварин 6-ї експериментальної групи у порівнянні з 2-ю, відмічається зменшення вмісту загальних ліпідів з 5,37±0,02 до 4,31±0,01 г/л (р<0,001), тригліцеридів - з 3,15±0,02 до 2,17±0,04 ммоль/л (р<0,001), загального холестерину - з 2,15±0,03 до 1,75±0,05 ммоль/л (р<0,001), холестерину ЛПНЩ - з 0,82±0,01 до 0,60±0,03 ммоль/л (р<0,001). Поряд з цим вміст холестерину в складі ЛПВЩ зростає з 0,34±0,02 до 0,42±0,03 ммоль/л, р>0,05. Такі зміни рівня транспортних форм ліпідів у крові ведуть до суттєвого зменшення (в 1,46 рази, р<0,001) коефіцієнту атерогенності.

Таким чином, вираженність змін системи ліпідного транспорту при атерогенній дієті у великій мірі модифікується фізичними навантаженнями різної інтенсивності. Фізичні навантаження високої інтенсивності посилюють негативні зміни в системі зворотного транспорту холестерину, а навантаження в помірному режимі, навпаки, усувають негативні ознаки атерогенної дієти, стимулюють транспорт холестерину від органів до печінки.

За таких умов відбувається пригнічення процесів ПОЛ та підвищення активності окремих ферментів антиоксидантної системи. Внаслідок цього в сироватці крові з 0,12±0,01 до 0,16±0,01 у.о. (р<0,001) зростає активність церулоплазміну, з 0,11±0,01 до 0,15±0,01 у.о. (р<0,001) – активність трансферину, а вміст МДА зменшується з 6,17±0,04 до 5,02±0,05 нмоль/мл (р<0,001).

Пригнічення активації процесів вільнорадикального окиснення ліпідів при динамічних фізичних навантаженнях помірної інтенсивності в умовах атерогенної дієти запобігає вираженому ушкодженню ендотелію судин із порушенням його функції, що підтверджується змінами вмісту у плазмі крові окремих вазодилятаційних та вазоконстрикторних факторів, а саме, метаболітів оксиду азоту і ендотеліну-1. Нами вперше встановлено, що поєднання атерогенної дієти з ФНПІ сприяє зниженню вмісту ендотеліну-1 (з 1,83±0,09 до 1,14±0,11 фМоль/мл, р<0,001) та підвищенню концентрації нітрит-аніону в плазмі крові (з 12,26±0,51 до 15,02±0,11 мкМоль/л, р<0,001).

Отже, фізичні навантаження помірної інтенсивності при гіперхолестеринемії сприяють обмеженому ушкодженню ендотелію судинної стінки. Особливо важливим є відновлення продукції ним оксиду азоту.

При гістологічних та електронномікроскопічних дослідженнях стегнових артерій за таких умов в першу чергу відмічається зменшення кількості (з 15±2,5 до 14±2,3) та глибини (з 10,6±0,71 мкм до 9,8±0,57 мкм) складок внутрішньої еластичної мембрани, що свідчить про ослаблення спазму цих судин. Атеросклеротичні ушкодження стінки судин стають менш обширними, вони локалізуються переважно в нижній третині досліджуваних артерій. Частково відновлюється структура значної кількості ендотеліоцитів, їх ядра набувають чітких контурів. Відновлюється структура переважної більшості мітохондрій, цистерн та везикул гранулярної ендоплазматичної сітки ендотеліоцитів. Значно зменшується кількість мікропіноцитозних пухирців, що свідчить про нормалізацію трансмембранних транспортних процесів. Помітно зменшується набряк внутрішньої еластичної мембрани та м‘язової оболонки. Мембрана та міоцити набувають чіткіших контурів, серед останніх переважають “світлі” клітини. Значно пригнічуються внутрішньосудинні агрегаційні процеси серед тромбоцитів, лейкоцитів та еритроцитів.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведене теоретичне обґрунтування механізмів розвитку ендотеліальної дисфункції та її проявів в стегнових артеріях щурів, які перебували на атерогенній дієті та піддавалися впливу фізичних навантажень різної інтенсивності.

1. Перебування тварин на атерогенній дієті, застосування до них фізичних навантажень високої інтенсивності і, особливо, поєднання цих факторів супроводжується вираженими змінами ліпідного спектра сироватки крові, що проявляється значним підвищенням концентрації загальних ліпідів, тригліцеридів, загального холестерину і холестерину ліпопротеїнів низької щільності та значним зниженням вмісту холестерину ліпопротеїнів високої щільності, наслідком чого є збільшення коефіцієнту атерогенності та ураження ендотелію.

2. Атерогенна дієта, фізичні навантаження високої інтенсивності і їх поєднання супроводжуються активацією пероксидного окиснення ліпідів – одного із молекулярних механізмів ушкодження ендотеліоцитів, що підтверджується збільшенням вмісту у крові малонового диальдегіду та зменшенням активності антиоксидантних ферментів церулоплазміну і трансферину. Наслідком ушкодження ендотеліоцитів є порушення їх тонусрегулюючої функції судин, що проявляється зменшенням рівня нітрит-аніону та збільшенням вмісту ендотеліну-1 в організмі щурів.

3. Морфологічним проявом ендотеліальної дисфункції при атерогенній дієті, фізичних навантаженнях високої інтенсивності та їх поєднанні є атеросклеротичне ушкодження судин, що підтверджується гістологічними та електронномікроскопічними методами дослідження стегнових артерій щурів.

4. Фізичні навантаження помірної інтенсивності забезпечують збереження структурної цілісності ендотеліоцитів, їх тонусрегулюючої функції судин; володіють антиатерогенним впливом, оскільки зменшують вміст в сироватці крові загального холестерину, холестерину ЛПНЩ та збільшують його вміст в складі ЛПВЩ, із-за чого знижується коефіцієнт атерогенності; підтримують баланс у про- та антиоксидантній системі; не супроводжуються розвитком атеросклерозу стегнових артерій.

5. Фізичні навантаження помірної інтенсивності у тварин, які перебували на атерогенній дієті, призводять до зменшення вмісту у сироватці крові загальних ліпідів, тригліцеридів, загального холестерину, холестерину ЛПНЩ, ведуть до збільшення його вмісту в складі ЛПВЩ, пригнічують пероксидне окиснення ліпідів, що проявляється зменшенням концентрації в сироватці крові МДА, підвищують активність церулоплазміну і трансферину, супроводжуються збільшенням рівня метаболітів оксиду азоту та зменшенням рівня ендотеліну-1 в плазмі крові.

6. Фізичні навантаження помірної інтенсивності при гіперхолестеринемії гальмують розвиток атеросклеротичних ушкоджень стегнових артерій. Під їх впливом частково відновлюється структурна організація стінки стегнових артерій у верхній та середній частині, а атеросклеротичні ушкодження локалізуються переважно в нижній їх третині, що підтверджується гістологічними та електронномікроскопічними методами дослідження.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Нейко Є.М., Левицький В.А., Кремінська І.Б. Ендотеліальна дисфункція судин при гіперхолестеринемії, фізичному навантаженні та їх поєднанні // Галицький лікарський вісник. – 2005. - № 2. – С. 103-107 (Особистий внесок здобувача: проведено пошук і аналіз літературних джерел).

2. Кремінська І.Б., Левицький В.А. Оцінка ролі ендотеліну-1 та оксиду азоту (NO) в розвитку ендотеліальної дисфункції при аліментарній гіперхолестеринемії, фізичному навантаженні та їх поєднанні // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. – 2006. - № 2. – С. 76-80 (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів).

3. Кремінська І.Б. Пероксидне окислення ліпідів в умовах гіперхолесте-ринемії і максимального фізичного навантаження // Галицький лікарський вісник. – 2006. - № 4. – С. 37-38.

4. Кремінська І.Б., Левицький В.А. Вплив фізичних навантажень і експериментальної гіперхолестеринемії на ліпідний спектр сироватки крові і стан ендотелію стегнової артерії щурів // Клінічна та експериментальна патологія. – 2007. – Том 6, № 1. – С. 66-70 (Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, оформлення статті).

5. Кремінська І.Б., Левицький В.А. Структурно-метаболічні аспекти системної реакції судинного ендотелію при експериментальній гіперхолестеринемії, фізичних навантаженнях різної інтенсивності та їх поєднання // Архів клінічної медицини. – 2007. - № 1 (11). – С.22-25 (Особистий внесок здобувача: експериментальні дослідження, статистична обробка результатів, оформлення статті).

6.