Міністерство охорони здоров’я україни

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КУДРЯВЦЕВА іРИНА ГЕОРГІЇВНА

УДК 616-006.001.6: 615.54.546:18.32.33.38

ПОШУК та ВИВЧЕННЯ ПОТЕНЦІЙНИХ ПРОТИпухлинних

ЗАСОБІВ – ПОХІДНИХ КИСЛОТ ФОСФОРУ

(ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі онкофармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України

Науковий консультант: | доктор медичних наук, професор

Шарикіна Надія Іванівна,

Інститут фармакології та токсикології АМН України,

завідувачка відділу онкофармакології.

Офіційні опоненти: | доктор фармацевтичних наук, професор

Яковлєва Лариса Василівна,

Національний фармацевтичний університет,

завідувачка кафедри фармакоекономіки,

завідувачка ЦНДЛ

доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України ім. Р.Є. Кавецького, завідувач відділу ензимології

доктор медичних наук, професор

Драннік Георгій Миколайович,

Інститут урології АМН України,

завідувач лабораторії імунології та вірусології

Захист відбудеться 05.10.2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету за адресою: 61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4.

Автореферат розісланий 04.09. 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасна протипухлинна терапія визнана у світі одним з необхідних методів лікування хворих з онкозахворюваннями поряд з хірургічним і променевим методами. Але і дотепер, пошук цитостатиків проводиться переважно емпірично, у зв'язку з чим існуючі засоби не мають високої селективності і чинять побічну дію на нормальні, насамперед інтенсивно проліферуючі тканини.

Найбільш поширеною групою сучасних хіміотерапевтичних засобів, що застосовуються для лікування онкологічних захворювань, є цитостатики алкілуючої дії. До їх числа належить окрема група активних протипухлинних сполук і препаратів (бензотеф, хлофіден і ін.), у хімічній структурі яких присутні фосфоровмісні фрагменти. Загальними властивостями цих сполук є зміна спектру дії у порівнянні з традиційними цитостатиками, зниження токсичності та підвищення вибірковості дії. Наявність фосфорної кислоти в молекулі алкілуючих агентів визначає їх здатність утворювати транспортні латентні форми діючого початку, що забезпечують проникнення до клітин природних носіїв, чинити політропний вплив на організм і пухлинний ріст (Chaber B.A., Collins J.M., 1990; Шарикіна Н.І. і співавт., 1998, 2000).

Доведення значимої ролі фосфоровмісних сполук при пухлинному рості стало обґрунтуванням цілеспрямованого пошуку оригінальних протипухлинних засобів серед фосфорильованих похідних різних класів органічних сполук, який протягом тривалого часу проводиться науковцями відділу онкофармакології Інституту фармакології і токсикології АМН України.

На підставі результатів широкого фармакологічного скринінгу відібрано 5 груп фосфоровмісних сполук (гідразиди кислот фосфору, фосфорильовані уреїди, уретани, урацили, моно- і бісфосфонати), що володіють вираженою протипухлинною активністю, з числа яких 10 сполук були піддані подальшому поглибленому вивченню. Особливу увагу дослідників привернули похідні бісфосфонових кислот. Тотожність хімічної структури останніх з пірофосфатом визначає їхню участь у значній кількості біохімічних реакцій як антиметаболітів фосфорного обміну (Комиссаренко С.В. и соавт., 1977; Котык А., Янычек К., 1980). Важливою є здатність бісфосфонатів до комплексоутворення (Г.И. Фомовская, 1986), зниженню вмісту Са2+ у сироватці крові. Зазначений механізм може сприяти гальмуванню передачі мітогенних сигналів у пухлинній клітині завдяки впливу на рівень Са2+ та на систему “остеобласт-остеокласт” (Fleish H., 1995; Фитз Б.Л. и соавт., 2000).

У ході досліджень, проведених у ІФТ АМН України, виявлено перспективну речовину М-1 (Мебіфон), яка запропонована як потенційний протипухлинний засіб. Проведене її доклінічне вивчення та клінічна апробація. Препарат рекомендований до клінічного застосування і зареєстрований в Україні (реєстраційне посвідчення № Р.07.02/04973 від 01.07.02).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках НДР ІФТ АМН України: № держреєстрації 0193И013185 (1991-1995 рр.); 0196U003198 (1997-1999 рр.); 100V000301 (2000-2002 рр.).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – пошук похідних кислот фосфору з протипухлинною активністю, розробка на основі найбільш перспективної речовини препарату для впровадження в медичну практику та вивчення механізмів його дії. Для досягнення поставленої мети необхідно виконати наступні завдання:

1. Провести пошук нових протипухлинних речовин серед похідних кислот фосфору.

2. Встановити протипухлинну активність відібраних груп фосфоровмісних сполук при експериментальному пухлинному рості в умовах відтворення наступних референс-систем: саркома 45, саркома 180, карциносаркома Уокера, епідермоїдна карцинома легенів Льюїс, карцинома молочної залози (Са755), лейкемія L-1210, лімфолейкоз Р-388, карцинома Герена і лімфосаркома Пліса.

3. Вивчити токсичні властивості фосфоровмісних сполук у гострому експерименті з визначенням значення DL50 .

4. Вивчити залежність "структура – дія" і визначити раціональні шляхи пошуку нових протипухлинних засобів.

5. Провести поглиблене вивчення перспективних протипухлинних речовин.

6. У рамках доклінічного вивчення Мебіфону як потенційного протипухлинного засобу провести дослідження:

- загальнотоксичних властивостей та окремих видів специфічної токсичності препарату;

- токсикологічних характеристик Мебіфону в умовах хронічного експерименту;

- протипухлинної активності на культурах нормальних і пухлинних клітин та на моделях експериментальних пухлин у лабораторних тварин;

- механізмів протипухлинної дії, а саме: вплив Мебіфону на імунну систему і процеси запалення; вплив на обмін кальцію, стромальні стовбурні клітини та кісткову тканину.

Об'єкти дослідження:

1. Похідні кислот фосфору (всього 57 сполук): гідразиди кислот фосфору, фосфорильовані уреїди, фосфорильовані уретани; фосфорильовані урацили, похідні кислот фосфору та фосфорани.

2. Протипухлинний препарат „Мебіфон”.

Предмет дослідження: фармакологічна активність, токсикологічні характеристики фосфоровмісних сполук в адекватних модельних системах; доклінічне вивчення препарату „Мебіфон” відповідно до рекомендацій ГФЦ МОЗ України.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, електрофізіологічні, токсикологічні, гематологічні, імунологічні, гістологічні, електрохімічні методи дослідження та методи математичної статистики. Усього використано 79 методів дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначено ряд фізіологічно активних речовин серед похідних гідразидів кислот фосфору, фосфорильованих похідних сечовини, уретану та урацилу, похідних фосфорної кислоти та фосфоранів, що володіють вираженою протипухлинною дією та помірною токсичністю, перспективних для подальшого вивчення і впровадження. Отриманий масив даних використаний для вивчення залежності "структура-дія" з визначенням шляхів пошуку нових протипухлинних засобів. Вперше у рамках доклінічного вивчення препарату „Мебіфон” встановлено багатовекторний характер його впливу на пухлинний ріст, показана безпека при короткочасному і тривалому застосуванні. Вперше показано, що новий цитостатичний препарат „Мебіфон” на відміну від існуючих цитостатиків не пригнічує систему кровотворення, не змінює адгезивних властивостей стовбурових клітин кісткового мозку, коригує онкогенні впливи на кісткову тканину.

Наукова новизна отриманих результатів підтверджена 10 патентами на винахід та 1 заявкою на патент на винахід.

Практичне значення роботи. За результатами вивчення протипухлинної активності 57 хімічних речовин визначено 10 нових молекул перспективних для подальшого дослідження з метою створення нового протипухлинного засобу. Найперспективніша з них отримала назву „Мебіфон” і стала об’єктом доклінічного дослідження. Матеріали доклінічного вивчення Мебіфону стали підставою для його клінічної апробації і впровадження у клінічну практику. Препарат „Мебіфон” зареєстрований в Україні (реєстраційне посвідчення № Р.07.02/04973 від 01.07.02) як засіб для лікування онкологічних хворих з метастазами в кістках.

Проводяться дослідження з розширення показань до застосування Мебіфону та включення його у фармакотерапевтичні схеми, які застосовуються при різних формах пухлинної хвороби (ІІІ – ІV фази клінічного вивчення).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. За участю консультанту проведено вибір напрямку і планування досліджень, підбір методичних підходів. Особисто автором проведений патентно-інформаційний пошук, узагальнений світовий досвід науковців за темою дисертації, виконання експериментальних досліджень, аналіз отриманих результатів, формулювання висновків роботи та практичних рекомендацій. У наукових публікаціях, виданих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися та представлялися на ІІ з'їзді фармакологів УРСР (Харків, 1990 р.); науково-практичній конференції “Лікарські засоби України, синтез, наукові дослідження, виробництво, реалізація” (Харків, 1992 р.); науково-практичній конференції “Перспективи створення і виробництва лікарських засобів в Україні” (Одеса, 1993 р.); науково-практичній конференції “Сучасні проблеми фармації” (Харків, 1994 р.); І національному з'їзді фармакологів України (Полтава, 1995 р.); науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації - у медичну практику” (Харків, 1996 р.); Республіканській науково-практичній конференції “Нове в медикаментозній терапії раку молочної залози” (Київ, 1998 р.); Europian Congress of Pharmacology (Hungary, Budapest, 1999); ІІ з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000 р.); ІІ національному з'їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001 р.); Х Російському національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, 2003 р.).

Публікації. За темою дисертації опублікована 31 наукова праця, з них 17 статей у фахових виданнях,10 патентів на винаходи, 1 заявка на патент та 3 тезів доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, п'яти розділів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків і переліку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 382 сторінки друкованого тексту. Робота ілюстрована 71 таблицею, 22 рисунками. Перелік використаних джерел містить 422 найменування (170 кирилицею і 252 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Усього у ході первинного фармакологічного скринінгу досліджено 57 сполук, які представлені похідними 5-ти груп фосфоровмісних речовин:

- гідразидів кислот фосфору;

- фосфорильованих уреїдів;

- фосфорильованих уретанів;

- фосфорильованих урацилів;

- кислот фосфору та фосфоранів.

Для поглибленого фармакологічного вивчення, яке здійснювалось у рамках доклінічних досліджень, обрано сполуку під шифром М-1– натрієву сіль метилендифосфонової кислоти (препарат “Мебіфон”) (рис.1).

Рис. 1. Хімічна будова препарату “Мебіфон” (натрієва сіль
метилендифосфонової кислоти)

Вивчення токсичності 57 сполук проведено на білих нелінійних щурах, білих нелінійних мишах при різних шляхах введення, для мебіфону додатково на мишах лінії СВА та С57В1/6 (Беленький М.Д., 1963; Прозоровский В.Б. и соавт., 1978).

При вивченні протипухлинної дії використані 10 моделей експериментальних пухлин: саркома 45, лімфосаркома Пліса, саркома М-1, сарко-ма 180, епідермоїдна карцинома легенів Льюїс, меланома В-16, аденокарцинома молочної залози " Са755, карцинома Уокера, лімфоїдна лейкемія L-1210 та лімфоцитарна лейкемія Р-3 88. Штами отримували з банків штамів Інституту фармакології та токсикології АМН України при відділі онкофармакології, Онкологічного наукового центру Російської Федерації та Інституту патології, онкології та радіобіології НАН України ім. Р.Є. Кавецького.

Пасажі пухлин та вивчення протипухлинної дії проведені згідно з іс-нуючими вимогами (Софьина З.П. й др., 1980; Шарикіна H.I., Шляховенко В.О. та співавт.,2001).

Вивчення залежності "структура-активність" проведено з використанням дисперсійного, кореляційного аналізу, визначення електронної будови сполук, основи яких наведені у ряді робіт (Кадыров Ч.Ш. и соавт.,1989; Машковский М.Д., 1994; Недоступ В.И., Дацюк О.Е., 1999; Макеев Г.М. и соавт.,1998).

При поглибленому вивченні протипухлинної дії мебіфону in vitro використані одношарова культура лейкемічних клітин (лінія L-41) та культура клітин пухлини гортані (НЕР-2) (Софьина З.П. и соавт., 1980). Активність препарату на пухлинах молочної залози людини визначалась в підкапсульному тесті (Bogden A.E.et al.,1981).

Доклінічні токсикологічні дослідження мебіфону проведені у відповідності до вимог ДФЦ МОЗ України (Стефанов О.В. та співавт., 2001).

Вивчення комплексоутворюючих властивостей Мебіфону проведено методом полярографії in vitro з використанням ртутно крапаючого електроду (Kostyuk P.G.et al.,1981).

Дія препарату на кальцієві, натрієві та калієві канали вивчалася на нейронах спінальних та тригемінальних гангліїв щура (Hammill OP. et al.,1981; Moraidis I., Bingman D.,1994; Kramer, R. et al.,1994; Usachev Y.et al., 1995; Reiser MA.et al.,1996; Shirokova N., Rios E.,1996; Yao SL.et al.,1996; Mentz F. et al.,1996).

Вплив мебіфону на остеогенні клітини кісткового мозку людини, їх трансформацію та диференціювання in vivo проведено методом клонування стромальних клітин-попередників кісткового мозку (Астахова B.C., 2000).

Для оцінки впливу препарату на гістологічну структуру кістки щурів та гістоморфометричні показники компактної та губчастої кісткової тканини використаний комплекс методик гістоморфометрії з описовою гістологією (Baak JPA., Oort J.,1983; Parfitt AM.,1988; Ревелл П.А., 1993).

Різнобічне дослідження впливу Мебіфону на ранні етапи імуногенезу та імунну відповідь включало визначення мітостатичної та лімфотоксичної дії, впливу на міграцію стовбурових клітин з кісткового мозку, міграцію Т- та В-лімфоцитів, їхню кооперативну взаємодію за схемою, запропонованою авторами (Петров Р.В., Манько М.М., 1971).

Аналіз впливу Мебіфону на імунорегуляторні клітини крові та селезінки проведений з використанням моноклональних антитіл фірми “Becton Diskinson” (США): Anty-Lyt-1 - мічені FITC (Т-лімфоцити); Anti-Thy-1 - мічені FITC (Т-лімфоцити); Anty-Lyt-2 - мічені FITC (Т-кілери/супресори); Anty-L3T4 - мічені фікоеритрином (Т-хелпери), а також тест-панелей Simultest, мічених двома різними флуорохромами зі світінням в зеленій (FITS-флуорисцентізоціанат) та червоній (РЕ-фікоеритрин) частинах видимого світла: Simultest CDЗ+/CD8+ (Т-лімфоцити/Т-лімфоцити:кілери/ супресори); 2. Simultest CDЗ+/CD\6+CD56' (Т-лімфоцити / NK-клітини); Simultest CDЗ+/HLA-DR+ (Т-клітини / активовані Т-клітини).

При визначенні цитотоксичної активності NK-клітин клітинами-мішенями були лінія пухлинних клітин УАС-1 (Н-2).

Вивчення антиексудативної дії Мебіфону проведено на моделі формалінового набряку (Тринус А.П. и соавт.,1976).

Анальгетична дія вивчалася при термічному (Komlos Е. et al., 1950) та хімічному подразненні (Chemow H.J. et al., 1961), жарознижувальна - на моделі пірогеналової лихоманки (Тринус А.П. и соавт., 1976].

Усього у дослідах використано 3173 білі нелінійні щури, 1448 білих нелінійних мишей, 100 мишей лінії С57 В1/6, 145 мишей лінії СВА х С57 BV6,130 мишей лінії СВА, 94 миші лінії P1/BALB(C.C57 B1), 50 мишей лінії BALBc, 43 миші лінії CC57W, 3О мишей лінії ДВА, 172 морські свинки, 6 кроликів. Маса і стать тварин відповідали застосованим методичним підходам, що викладені у відповідних розділах роботи. Тварини утримувалися на звичайному харчовому раціоні, отримували їжу та пиття ad libitum.

Отримані результати опрацьовані методами варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента (Беленький М.Д., 1963; Сепетлиев Д., 1965; Прозоровский В.Б., Прозоровская В.М. и соавт.,1978).

Пошук фосфоровмісних речовин, активних при експериментальному пухлинному рості, та визначення залежності “структура-дія” у ряду похідних фосфорної кислоти. Фосфоровмісні сполуки посідають визначене місце в пошуках нових високоселективних протипухлинних засобів (Шарыкина Н.И., 1969, 1980; Бухтиарова ТА., 1984; Donald L., Hill Ph.D., 1975; Кузьменко И.И., 1967, 1979). Ці речовини мають ряд важливих особливостей, які детермінують наявність у них протипухлинної дії та її вибірковість, а саме:

- сполуки, що мають тетраедричну систему фосфору, практично не проникають через неушкоджені клітинні мембрани, що припускає доцільність використання фосфорильованих носіїв для створення про-ліків з доставкою та проникненням діючого фрагмента молекули всередину клітини;

- фосфоровмісні молекули та їх фосфоровмісні фрагменти можуть проникати через змінені кліткові мембрани за різних патологічних станів, у тому числі при пухлинному рості, діючи як метаболіти або антиметаболіти фосфорного обміну;

- фосфоровмісні молекули зі структурною подібністю до неорганічного пірофосфату або неорганічних фосфатів можуть проникати всередину клітини з використанням механізму активного транспорту або полегшеної дифузії.

Відзначені особливості фосфоровмісних сполук визначили напрямок пошуку нових протипухлинних засобів серед фосфорильованих функціональноактивних реагентів, антиметаболітів піримідинового обміну, біс- та монофосфонатів.

Ряд фосфорильованих функціонально активних реагентів були отримані в Інституті фармакології та токсикології АМН України і дозволені для клінічного застосування (бензотеф, хлофіден та ін.).

Наші дослідження цього напрямку були продовжені з заміною фосфорильованих хлоретиламінів, фосфорильованих етиленімінів, тобто традиційних алкілуючих агентів, фосфорильованими функціонально активними реагентами з латентною алкілуючою активністю (похідні гідразину, уретану та сечовини). У дослідження були включені також фосфорильовані антиметаболіти пуринового обміну – транспортні форми 5-фторурацилу, а також аналоги неорганічного пірофосфату та неорганічних фосфатів.

Пошук нових протипухлинних засобів серед наведених структур хімічних сполук (усього обрано 57 оригінальних сполук) здійснювався з використанням загальноприйнятих методичних підходів до вивчення основних фармакологічних властивостей речовин з передбачуваною протипухлинною дією (токсичність, протипухлинна активність) (Софьина З.П. и соавт., 1980). Сполуки синтезовані в Інституті фармакології та токсикології АМН України (відділ синтезу функціонально активних речовин, відділ технології синтезу та аналізу лікарських засобів) та в Інституті органічної хімії НАН України.

З 57 вивчених сполук за рівнем протипухлинної дії привернули увагу 10 сполук:

- -метилгідразид під шифром Ф-433;

- фосфорильовані сечовини під шифрами Ф-550, Ф-551 і Ф-555;

- фосфорильовані урацили під шифрами ФП-10, ФП-12;

- бісфосфонати під шифрами М-1 і О-1;

- похідні фосфорної кислоти під шифрами 160189, 350189 ( табл.1).

Таблиця 1

Хімічна будова перспективних протипухлинних засобів у ряду похідних
фосфорної кислоти

Лабораторний шифр | Формула | Хімічна назва

Ф-433 | -Метилгідразид-О,О'-ди (п-метилфеніл) фосфорної кислоти

Ф-550 | -Фенілгідразид уреїдометилфосфорної кислоти

Ф-551 | -Бензоїлгідразид уреїдометилфосфорної кислоти

Продовж. табл. 1

Ф-555 | О,О'-Диметиловий ефір уреїдофосфорної кислоти

ФП-10 | N-4,5-бензо-1,3,2-діоксафосфоленкарбамоїл-5-фторурацил

ФП-12 | N-4,5-бензо-1,3,2-діоксафосфоленкарбамоїлурацил

М-1 | Динатрієва сіль метилендифосфонової кислоти

О-1 | Динатрієва сіль оксалідендифосфонової кислоти

160189 | Натрієва сіль фенілфосфонистої кислоти

350189 | Динатрієва сіль гідроксиметилфосфонової кислоти

Всі відібрані сполуки виявляють активність 90% гальмування росту одного і більше із використаних штамів пухлин, і 70,0 % (або на рівні прийнятого критерію значимості для певної моделі) на кожній з 8-ми моделей

Таблиця 2

Протипухлинна активність перспективних фосфоровмісних сполук

Штами пухлин | Відсоток гальмування пухлинного росту

Ф-433 | Ф-550 | Ф-551 | Ф-555 | ФП-10 | ФП-12 | М-1 | О-1 | 160189 | 350189

Лімфосаркома Плісса | 90,3 | 78,4 | 92,0 | 86,3 | 97,5 | 90,3 | 81,1 | 52,9 | 0 | 0

Карцинома Герена | 51,0 | - | - | - | 70,0 | 52,0 | - | - | - | -

Саркома 180 | 96,0 | 96,0 | 28,0 | 89,9 | - | - | 71,1 | 90,0 | - | -

Саркома 45 | - | 62,4 | - | 93,5 | - | 70,0 | 48,7 | 50,7 | 50,4 | 50,4

Карцинома Уокера | - | 55,8 | 86,8 | - | 72,2 | 86,5 | 46,2 | 24,5 | - | 91,1

Епідермоїдна карцинома легенів Льюїс | - | - | - | - | - | - | 72,5 | 45,1 | 91,1 | 84,3

Меланома В-16 | - | - | - | - | - | - | 55,0 | - | 93,4 | 93,4

Аденокарцинома молочної залози | - | - | - | - | - | - | 99,2 | - | - | -

пухлинного росту (табл. 2). Такий рівень протипухлинної активності задовольняє існуючим вимогам до потенційних цитостатиків (90,0 % гальмування - 1 штам; 70,0 % - 3 штами) (Софьина З.П. и соавт., 1980; Шарикіна Н.І. та співавт., 2000) і обгрунтовує доцільність їх подальшого вивчення як протипухлинних засобів.

Так, метилгідразид Ф-433 (-метилгідразид-о,о’-ди (п-метилфе-ніл)фосфорної кислоти) показав активність 90,0 % гальмування росту лімфосаркоми Плісса і саркоми 180, перевищуючи активність тест-стандарта натулана (78,0 %, 65,0 %, відповідно).

Виражену протипухлинну активність на ряді експериментальних пухлин проявили фосфорильовані сечовини:

- Ф-550 (-фенілгідразид уреїдометилфосфорної кислоти) – 1 штам 90,0 % гальмування росту пухлини (саркома 180); 3 штами, з урахуванням саркоми 180, 70,0 % гальмування росту пухлини;

- Ф-555 (о,о’-диметиловий ефір уреїдофосфорної кислоти) – 1 штам 90,0 % гальмування росту пухлини (саркома 45); 2 штами 90,0 % гальмування росту пухлини (лімфосаркома Плісса, саркома 180);

Ф-551 (-бензоїлгідразид уреїдометилфосфорної кислоти) – 1 штам 90,0 % гальмування росту пухлини (лімфосаркома Плісса); 1 штам 90,0 % гальмування росту пухлини (карциносаркома Уокера).За виявленою здатністю до пригнічення пухлинного росту два похідних фосфорильованих урацилів також відповідають вимогам до потенційних протипухлинних засобів:

- ФП-10 (N-4,5-бензо-1,3,2-диоксафосфоленкарбамоїл-5-фторурацил) – 1 штам 90,0 % гальмування пухлинного росту (лімфосаркома Плісса); 3 штами, з урахуванням лімфосаркоми Плісса, – 70,0 % гальмування пухлинного росту (карцинома Герена, карциносаркома Уокера);

- ФП-12 (N-4,5-бензо-1,3,2-диоксафосфоленкарбамоїлурацил) – 1 штам 90,0 % гальмування пухлинного росту (лімфосаркома Плісса); 1 штам 90,0 % гальмування пухлинного росту (карциносаркома Уокера); 3 штами, з урахуванням двох попередніх, – 70,0 % гальмування росту пухлин.

Значущий протипухлинний ефект у наших дослідах проявили два похідних бісфосфонатів – аналогів неорганічного пірофосфату – сполуки О-1 і М-1. Сполука О-1 (динатрієва сіль оксаліденбісфосфонової кислоти) показала 90% гальмування пухлинного росту на 1 штамі (саркома 180). Сполука М-1 (динатрієва сіль метиленбісфосфонової кислоти) виявилася значно активнішою, ніж попередня: на 1 штамі 90% (аденокарцинома 755) і на 4-х штамах, з урахуванням попереднього, – 70% гальмування пухлинного росту (лімфосаркома Плісса, саркома 180, епідермічна карцинома Льюїс). На інших використаних моделях активність речовини знаходилась в межах критерію значимості штамів (саркома 45, меланома В-16, карциносаркома Уокера).

Сполука О-1 (динатрієва сіль оксаліденбісфосфонової кислоти, ОБФК; натрій-калієва сіль під назвою “Ксидіфон”), за даними літератури, після наших досліджень впроваджена в практику охорони здоров'я по ряду показань, зокрема, для лікування остеопатій (виключаючи пухлинну хворобу) (Золотухина М.М. и соавт., 1993).

Що стосується динатрієвої солі метиленбісфосфонової кислоти (сполука М-1), то дані літератури засвідчують лише незначний ступінь вираженості її протипухлинної активності (Золотухина М.М. и соавт., 1993). Проведене нами поглиблене фармакологічне дослідження дозволило довести наявність у даної сполуки протипухлинного ефекту, який відповідає сучасним вимогам до хіміотерапевтичних засобів, що застосовуються для лікування онкологічних захворювань.

Таким чином, нами вивчено і описано перший бісфосфонат з вираженою протипухлинною активністю, який, під назвою “Мебіфон”, впроваджено в практику охорони здоров‘я як засіб, активний при злоякісних новоутвореннях молочної та передміхурової залоз з метастазами у кістки. Дещо пізніше була описана аналогічна дія у іншого представника бісфосфонатів – золадронату (зомети) (Berenson JR. et al., 2001; Ali SM. et al., 2001), що підтверджує правильність обраного нами напрямку пошуку нових ефективних і достатньо безпечних цитостатиків.

У ході наших експериментів досліджувались також аналоги неорганічного фосфату – оригінальні сполуки на основі монофосфонової кислоти (шифри 160189 і 350189). Їх протипухлинна активність високого рівня на ряді експериментальних моделей описана вперше:

- сполука 160189 (натрієва сіль фенілфосфонистої кислоти) – 2 штами 90,0 % гальмування пухлинного росту (епідермоїдна карцинома Льюїс, меланома В-16);

- сполука 350189 (динатрієва сіль гідрооксиметилфосфонової кислоти) – 2 штами 90,0 % гальмування пухлинного росту (епідермоїдна карцинома Льюїс, меланома В-16); 1 штам 90,0 % гальмування пухлинного росту (карциносаркома Уокера).

Зазначені речовини стали предметом подальших поглиблених досліджень відділу онкофармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України зі створення нових протипухлинних засобів з полівалентним механізмом дії (8 нових молекул).

Отриманий масив даних з вивчення фармакологічних властивостей 57 фосфоровмісних сполук став підґрунтям для проведення аналізу з визначення залежності “структура-дія”, метою якого є визначення напрямку подальшого пошуку ефективних протипухлинних засобів (Кадыров Ч.Ш. и соавт., 1989; Машковский М.Д., 1994; Макеев Г.М. и соавт., 1998; Недоступ В.И., Дацюк О.Е., 1999).

Насамперед був проведений аналіз параметрів гострої токсичності сполук (ЛД50) і зіставлення її з вивченими хімічними класами, дескрипторами і молекулярною масою. Речовини були розділені на хімічні групи і представлені в порядку зростання ЛД50. Перші результати дозволили встановити приблизно однакові показники середніх значень ЛД50 сполук в групах (мМ/кг).

Далі була зроблена спроба оцінити відмінності токсичності сполук в групах за допомогою дисперсійного аналізу. Низьке значення критерію Фішера (F=1,81) і рівня значимості (=0,13) свідчили про недостатньо істотні відмінності токсичності сполук порівнюваних хімічних класів. Тобто, токсичність речовин, загалом, не обумовлюється їх належністю до конкретного класу хімічних сполук, а визначається сукупністю різних структурних чинників.

Для вивчення впливу структурних факторів на токсичність сполук, останні були формалізовані за допомогою дескрипторів, якими служили: наявність або відсутність гідразидного, сечовинного, уретанового фрагментів, карбонільної групи, ароматичних груп, особливості радикалів у атома фосфору тощо. Результати розрахунків висвітлили наступну тенденцію: найбільший вплив на токсичність чинить сечовинний фрагмент число ароматичних груп наявність додаткової карбонільної групи уретановий фрагмент молекулярна маса.

Дослідження впливу молекулярної маси на загальнотоксичні властивості речовин проведене за допомогою кореляційного аналізу. Констатована відсутність лінійної залежності між ЛД50 і молекулярною масою, про що свідчить розрахований коефіцієнт кореляції (Ккор=0,20 при рівні значимості =0,15). Тобто, зв'язок токсичності з молекулярною масою речовин носить більш складний характер.

Оскільки значні відмінності у хімічній будові досліджуваних фосфорорганічних сполук перешкоджають встановленню глобальних залежностей "структура – дія", основна увага була зосереджена на встановленні цієї залежності всередині окремих класів.

В межах вивчених груп сполук відзначені наступні закономірності:

- токсичність метилгідразидів пов'язана з наявністю одного з ароматичних ядер і замісників, особливо електроноакцепторних, які зменшують токсичність сполук;

- у гідразидів уреїдофосфорних кислот (Ф-550 та інш.), які відрізняються одним радикалом біля атома кисню, заміна метильної групи на ізопропільну призводить до підвищення, а введення замісників до гідразидного фрагменту (карбонільна група) – до зменшення токсичності;

- серед ефірів уреїдофосфорних кислот найменш токсичними є речовини з парною кількістю атомів вуглецю в ефірному фрагменті з довжиною ланцюга С4-С6;

- похідні уретанфосфорних кислот, загалом, менш токсичні за аналогічні уреїди;

- на токсичні властивості аддуктів солей урацилу з фосфорними кислотами впливає природа замісника в 5 положенні урацилового циклу і в ароматичному залишку фосфорної кислоти;

- дифосфонові кислоти менш токсичні, ніж монофосфонові.

Аналіз протипухлинної активності фосфоровмісних сполук показав, що кожна група характеризується значним розкидом значень протипухлинної активності, що свідчить про наявність залежності “структура-активність”.

Для кількісної оцінки розбіжності у вираженості протипухлинної активності між групами був проведений дисперсійний аналіз даних, отриманих при відтворенні лімфосаркоми Пліса. Визначені середні значення протипухлинної дії становили: фосфорильовані гідразиди, солі та ефіри кислот фосфору, фосфорильовані сечовини - 60,0 %; фосфоровмісні урацили - 70,0 %, фосфорильовані уретани і фосфорани 40,0 % і 30,0 %, відповідно. Низькі значення критерію Фішера і рівня значимості (F=1,76; =0,15) вказують на те, що відмінність у виразності протипухлинної активності між групами не дуже суттєва.

Попарне порівняння груп показало істотну відмінність між гідразидами і фосфоранами (t=2,01; =0,08), урацилами і фосфоранами (t=3,28; =0,007), урацилами і уретанами (t=2,42; =0,03).

Порівняння протипухлинної активності сполук в межах одного класу, визначеній на лімфосаркомі Пліса, дозволило встановити наступні закономірності:

- введення атомів фтору, метильних груп в молекулу похідних гідразидів призводить до підвищення протипухлинної активності;

- встановлена висока протипухлинна активність уреїдофосфорних кислот, яка знижується при заміні метильного радикала і введенні замісників в бензольний фрагмент; бензоїлгідразиди цього класу активніші за фенілгідразиди і фосфорильовані уретани;

- відзначається висока протипухлинна активність аддуктів 5-фтор- і 5-бромурацилу з фосфорними кислотами; ефекти калієвих і натрієвих солей близькі за вираженістю; помітно знижує активність введення замісників в бензольне кільце, заміна дифенілового ефіру диметиловим;

- у карбамоїлурацилів додавання другої карбамоїльної групи знижує протипухлинний ефект;

- у дифосфонатів зміна вуглецевого радикала неорганічного пірофосфату призводить до зниження протипухлинної активності; подібний ефект спостерігається і у монофосфатів.

При аналізі протипухлинної активності фосфоровмісних сполук (n=19) на іншій моделі пухлини – саркомі 180– показано:

- у метилгідразидів, як і на попередній моделі, введення атома фтору позначається підвищенням протипухлинної активності; у той же час, на відміну від лімфосаркоми Пліса, введення електронодонорних замісників різко знижує протипухлинну дію на саркомі 180;

- в уреїдах кислот фосфору визначальну роль відіграє уреїдний фрагмент, введення замісників мало змінює виразність протипухлинної дії;

- аналогічно як і на лімфосаркомі Пліса активність аддуктів 5-фтор-урацилу з фосфоровмісними кислотами зменшується при введенні замісників в бензольне кільце і заміні дифенілового ефіру диметиловим;

- похідні бісфосфонових кислот активніші за монофосфонати; спостерігається зниження протипухлинної активності за наявності замісників в метиленовому містку (О-1 порівняно з М-1).

При відтворенні меланоми В-16 монофосфонати показали вищий рівень активності, ніж бісфосфонати. Ця закономірність зберігається на карциномі легенів Льюїс: 160189 – 91,1 % гальмування пухлинного росту; 350189 – 84,3 %.

На карциномі Герена метилгідразиди при невисокій протипухлинній активності зберігають закономірність, відзначену на лімфосаркомі Плісса і саркомі 180: підвищення протипухлинної активності при введенні атомів фтору і її зниження при заміні електроноакцепторних замісників на електронодонорні. Похідні уреїдо- і уретанфосфорної кислоти практично не виявляють активності на цьому штамі. Низька протипухлинна активність відзначена для аддуктів 5-фторурацилу з диарілфосфорними кислотами.

На карциномі Уокера активними виявилися бензоїлгідразиди уретано-і уреїдофосфорної кислоти (Ф-554 - 91,0 %; Ф-551 - 85,0 %). При цьому наявність бензилгідразидного фрагмента є визначальною, оскільки фенілгідразидний аналог протипухлинної активності практично не має.

На саркомі 45 фосфоровмісні сполуки не володіють високою протипухлинною активністю (4 речовини з 22 мають протипухлинний ефект 50,0 % гальмування пухлинного росту). При порівнянні сполук однієї групи визначено, що у ряді диалкілових ефірів уреїдофосфорної кислоти похідні з парним числом вуглецевих атомів в алкільному радикалі (С4Н9 і С6Н13) активніші за похідні з непарним числом атомів (С3Н4, С5Н11 і С7Н15). Протипухлинна дія аддуктів 5-фторурацилу з диарилфосфорними кислотами залежить від характеру замісників у фенільному радикалі.

При узагальненні результатів вивчення біологічної активності 57 сполук з потенційним протипухлинним ефектом (токсичність, протипухлинна дія) був проведений кореляційний аналіз між визначеним ефектом на різних штамах пухлин з включенням молекулярної маси сполук. Враховували коефіцієнт кореляції (Ккор), число сполук (N) і рівень значимості (р).

Цілковита кореляція токсичності (ЛД50) з відсотком гальмування характерна для досліджень на карциномі Уокера (Ккор=0,997). Графічно ця кореляція зображається прямою лінією і описується рівнянням: ПТ=102,968-24,755ЛД50. Помітна кореляція має місце відносно саркоми 180 і карциносаркоми Уокера. Для цих моделей, ймовірно, із зростанням токсичності зростатиме протипухлинний ефект відповідно до визначеної залежності.

За наслідками кореляційного аналізу сполук досліджених груп можна відзначити такі системи оцінки протипухлинної дії :

- активність на лімфосаркомі Пліса корелює з протипухлинним ефектом на саркомі 45, саркомі 180;

- протипухлинна дія на карциномі легенів Льюїс корелює з такою на меланомі В-16 і саркомі 180. При цьому активність на перших двох моделях тісно корелює з молекулярною масою речовин, яка є лімітуючим фактором для проникнення сполук через мембранні структури цих пухлин;

- карциному Герена і саркому М-1 недоцільно використовувати у дослідних системах, як такі, що не дають значущої кореляції з іншими моделями; можливе їх застосування за умови розширення спектру пухлин при вивченні речовин з виявленою активністю.

Варто звернути увагу на 2-і важливі характеристики активності речовин на конкретних моделях пухлинного росту: середнє значення протипухлинної дії і максимальне значення цієї дії. Середні значення протипухлинної активності для більшості вивчених сполук, як правило, зростають із зростанням максимальної активності. Це є свідченням універсальності їх дії. Проте, є невелика група речовин, для яких ця залежність не витримується, що дозволяє говорити про специфічність їх дії на окремі моделі пухлинного росту.

Порівняння розподілу максимальних значень протипухлинної дії вивчених сполук по групах проведене з використанням методу дисперсійного аналізу. У ході аналізу визначені достатньо високе значення критерію Фішера (F=3,84) і рівня значимості (р=0,0053).

Середні значення активності відносно пухлинного росту кожної з груп сполук: метилгідразиди (61,96 %); урацили (75,02 %); уретани (61,60 %); моно- і дифосфонати (79,77 %); урацили (75,02 %); уреїди (48,82 %); фосфорани (28,27 %).

Зазначені підходи, на додаток до викладеного, дозволили виявити найбільш перспективні групи фосфоровмісних сполук.

Вивчення залежності “протипухлинна активність – електронна будова”, необхідне для можливого дизайну нових речовин, проведене у такому ряді сполук:

- фосфорильованих сечовин з алкільними замісниками у фосфатному фрагменті;

- фосфорильованих сечовин з арильними замісниками у фосфатному фрагменті;

- фосфорильованих сечовин з алкільним і гідразидними замісниками у фосфатному фрагменті;

- фосфорильованих сечовин з двома сечовинними і одним алкільним (або арильним) замісниками у фосфатному фрагменті.

Наведені сполуки сконструйовані з функціонально активних фрагментів, що детермінують властивості складної молекули. Важливим параметром в цьому плані є енергія і локалізація граничних молекулярних орбіталей (нижньої вакантної – НВМО і верхньої зайнятої - ВЗМО), які визначають характер перенесення електронної щільності в реакціях. Для розрахунку електронної і просторової будови молекул був використаний напівемпіричний метод РМЗ і пакет програм HyperChem.

Перша група – фосфорильовані сечовини з алкільними замісниками у фосфатному фрагменті. Як відомо, оксисечовина є інгібітором переходу рибонуклеотидів в дезоксирибонуклеотиди, тобто пригнічує синтез ДНК (Elford H.I.,1968). Вивчені нами речовини містять уреїдний фрагмент, що припускає наявність у механізмі їхньої дії аналогічної складової. Поєднання сечовинного і диалкілфосфатного фрагментів з різною довжиною і розгалуженістю алкільних груп супроводжується відповідними зсувами гідрофобно-ліпофільного балансу, що зображається зміною відповідних показників. Враховували розраховані дані дипольного моменту (Д), поверхні і об'єму молекули S (Е2), V (Е3), коефіцієнти ліпофільності Log P, молярної рефракції MR (см3/моль).

За результатами дослідів показано, що зміна вуглеводневого алкільного радикалу у фосфатній групі впливає на гідрофобні, стеричні і електронні властивості молекул. При цьому квантово-хімічні характеристики сполук близькі до таких у метилнітрозосечовини. Локалізація ВЗМО сполук, зокрема найбільш активної Ф-555, на сечовинному фрагменті, напевно, є визначальною в їхньому протипухлинному ефекті.

При заміні алкільних замісників на арильні у фосфатному фрагменті протипухлинна активність виражена досить незначно. Особливістю цих речовин є локалізація ВЗМО на атомах ароматичних груп.

Фосфорильовані сечовини з алкільним і гідразидним замісниками у фосфатному фрагменті характеризуються близькими значеннями квантово-хімічних характеристик з прокарбазином і гідрооксисечовиною. Величини енергій ВЗМО відповідно дорівнюють: Ф-550 - 7,75 еВ; прокарбазин - 9,21 еВ; гідрооксисечовина - 9,47 еВ. Загальною властивістю сполук ряду є переважна локалізація ВЗМО на -NHNHR при значно меншій участі в утворенні ВЗМО сечовинного фрагмента.

Фосфорильовані сечовини з двома сечовинними і одним алкільним або арильним замісниками у фосфатному фрагменті можуть чинити свою біологічну дію за рахунок як гідразидного, так і сечовинного фрагментів.

Таким чином, для наявності вираженої протипухлинної дії фосфорильованих сечовин необхідна наявність в їх структурі алкільних замісників у фосфатному фрагменті, локалізація ВЗМО на сечовинному, або гідразидному фрагменті. При поєднанні в молекулі сечовинного і гідразидного фрагментів функція сечовинного фрагмента ослаблюється.

Отримані дані вказують на можливість прогнозування активності сполук за результатами на одному з відзначених штамів пухлин 2-х наведених систем;

- для виявлення перспективних груп сполук в масивах біологічних даних можливий аналіз середніх і максимальних значень протипухлинної дії;

У окремих групах:

- введення атома фтору в метильні групи метилгідразидів підвищує протипухлинну активність, заміна електроноакцепторних замісників на електронодонорні призводить до зниження протипухлинного ефекту;

- у фосфорильованих сечовин протипухлинний ефект знижується при заміні метильного радикала, введенні замісників в бензольний фрагмент; бензоїлгідразиди активніші за фенілгідразиди (лімфосаркома Пліса); в активності на саркомі 180 важливу роль відіграє уреїдний фрагмент; на саркомі 45 активніші сполуки з парним числом вуглецевих атомів в алкільному радикалі (С4Н9 і С6Н13), ніж з непарним числом атомів вуглецю (С3Н7, С5Н11 і С7Н15);

- серед фосфорильованих сечовин значною протипухлинною активністю володіють речовини з локалізацією ВЗМО на сечовинному або гідразидному фрагментах;

- протипухлинна активність адуктів 5FU з фосфоровмісними кислотами знижується при введенні замісників в бензольне кільце, заміні дифенілових ефірів на диметилові (лімфосаркома Пліса, саркома 180), практично відсутня активність цих речовин на карциномі Герена;

- у карбамоїлурацилів введення 2-ої карбамоїльної групи знижує протипухлинний ефект;

- введення замісників в метиленовий місток бісфосфонатів призводить до зниження їх протипухлинної активності (лімфосаркома Пліса).

Загалом, отримані матеріали з вивчення залежності “структура-дія” 57 сполук дозволили звернути увагу на ряд важливих фактів, які можуть бути використанні в подальшому конструюванні нових біологічно активних сполук у зазначених напрямах.

Аналіз літератури та дослідження, проведені в 70-і роки у відділі онкофармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України, дозволили акцентувати увагу на бісфосфонатах, зокрема на метиленбісфосфоновій кислоті і оксалідендифосфоновій кислоті (Корнберг А.О., 1964; Янимирский К.Б. и соавт., 1983; Фомовская Г.Н., 1986; Комиссаренко С.В., 1989; Золотухина М.М. и соавт., 1993;). Виходячи з близької структурної аналогії бісфосфонатів з неорганічним пірофосфатом, була проведена оцінка протипухлинної активності динатрієвих солей метиленбісфосфонової і оксаліденбісфосфонової кислот відповідно до існуючих вимог (Софьина З.П и соавт, 1980; Шарикіна Н.І. зі співавт., 2001). Отримані нами дані про фармакологічні властивості динатрієвої соли метиленбісфосфонової кислоти дозволили розглядати цю сполуку як потенційний лікарський засіб для лікування хворих із злоякісними новоутвореннями з метастазами до кісток, яка зберігає властивості бісфосфонатів і володіє вираженою протипухлинною дією в експерименті (Шарикіна Н.І. зі співавт., 1987,1998; Досенко І.В. зі співавт., 2002) Сполука вивчена відповідно до вимог ДФЦ МОЗ України. Підтверджена перспектива її впровадження, успішно пройшли клінічні випробування. Препарат під назвою “Мебіфон” зареєстрований в Україні як засіб лікування хворих зі злоякісними новоутвореннями молочної і передміхурової залоз з метастазами до кісток (Комісаренко С.В.,1986).

Дослідження із створення нового лікарського засобу “Мебіфон”.

При вивченні основних фармакологічних властивостей препарату (токсичність, протипухлинна активність) було показано, що за рівнем гострої токсичності він належить до класу середньотоксичних речовин (ДЕСТ 12.1. 007-76,1990). ЛД50 для мишей при внутрішньовенному, внутрішньочеревинному, підшкірному і внутрішньошлунковому введеннях складає відповідно 129, 148, 187 і 235 мг/кг. Спостерігаються відмінності у видовій чутливості препарату Найменш чутливі – миші-гібриди першого покоління СВА С57В1/6 і щури, для яких ЛД50 препарату при внутрішньоочеревинному введенні складає 282 мг/кг. Звертає на себе увагу факт, що картина отруєння тварин на тлі мебіфону відповідає такій у класичних цитостатиків. Спостерігається кишковий тип загибелі (Шарикіна Н.І.,