НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

КУЗНЄЦОВА

Лариса Володимирівна

УДК: 612.017:615.834:615.83+615.34:547:616.24

ПОРУШЕННЯ ІМУННОГО СТАТУСУ З УРАХУВАННЯМ ФАКТОРІВ МІЖКЛІТИННОЇ КООПЕРАЦІЇ У ХВОРИХ НА БРОНХІАЛЬНУ АСТМУ ТА РОЗРОБКА СПОСОБІВ СИСТЕМНОЇ ТА РЕГІОНАРНОЇ ІМУНОМОДУЛЯЦІЇ В КОМПЛЕКСНІЙ ТЕРАПІЇ ХВОРИХ

14.03.08. – імунологія та алергологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ:

доктор медичних наук, професор

МЕЛЬНІКОВ Олег Феодосійович,

Інститут отоларингології АМН України, завідувач лабораторії патофізіології та імунології

доктор медичних наук, професор

ПУХЛИК Борис Михайлович,

Вінницький Національний медичний університет ім. М.І.Пирогова, завідувач кафедри фтизіатрії, клінічної імунології та алергології, головний імунолог та алерголог України

доктор медичних наук, професор

ЧУМАК Анатолій Андрійович,

Інститут клінічної радіології наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії молекулярної біології відділу клінічної імунології та алергології

Провідна установа: Луганський Державний медичний університет , м. Луганськ

Захист дисертації відбудеться 22.03.2007 року о 13 годині на засіданні Спеціалізованої Вченої Ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця (м. Київ, вулиця Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2, (аудиторія кафедри шкірних та венеричних хвороб)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця, 03057, м. Київ, вулиця Зоологічна, 3.

Автореферат розісланий 20.02. 2007 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор С.Г.Свирид

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останні 20-30 років характеризуються ростом та тяжкістю перебігу алергічних захворювань (бронхіальна астма, поліноз, кропив"янка, атопічний дерматит, медикаментозна алергія і т.д.). За соціальним значенням бронхіальна астма виходить на одне із перших місць серед захворювань органів дихання (Ю.І.Фещенко, 2001; Г.Б. Федосєєв, 2000; К.Ф.Чернушенко, 2002). Дослідження останніх років показали, що симптоми бронхообструкції при цій патології, як правило, з"являються одночасно з симптомами інфекційного процесу і залишаються після одужання, загострюючись при наступній інфекції (А.Г.Чучалін, 2003). Враховуючи важливу роль реакцій імунної системи в патогенезі алергічних захворювань, порушень загального та локального імунітету, а також змін в цитокіновому профілі, що неминуче виникають на певному етапі розвитку захворювання, в значній мірі є фактором, який викликає прогресування захворювання. Важливе та конкретизуюче значення має генетична детермінованість. Для успішного проведення лікувальних заходів, спрямованих на поліпшення функціонування імунної системи та стан цитокінів запального та протизапального генезу, необхідно чітко визначити роль окремих її ланок у розвитку процесу, встановити чіткі критерії характеру імунодефіциту, характер його можливої корекції, що залежить від генетичного детермінування основних локусів HLA, що відповідають за перебіг різноманітної алергічної патології та взаємодію з окремими показниками системного та локального імунітету.

Важливим аспектом проблеми є оцінка імунорегуляторної активності легень, які мають лімфоїдний апарат, що дозволяє певною мірою вважати їх імунокомпетентним органом. До теперішнього часу одержані переконливі докази наявності порушень імунологічної реактивності при різноманітній алергічній патології, які проявляються Т-клітинним імунодефіцитом, дисфункцією В-ланки імунітету, різноманітними порушеннями цитокінового профілю як в сироватці крові, так і на фоні локального імунітету. Але центральна роль Т- та В-лімфоцитів у регуляції функціонування імунної системи при різноманітній алергічній патології,

2

зв"язки системного та локального імунітетів з генетичним розподілом генів, що відповідають за ці процеси та мають різний ступінь імунологічної відповідальності за імунітет, висвітлені недостатньо. Недостатньо вивчені і аспекти, які стосуються субпопуляційного складу Т-лімфоцитів та ролі хелперів в запальному процесі, вмісту IgE, що є важливим показником в оцінці імунного статусу з метою застосування імунотропної терапії, а також системи фагоцитуючих клітин, яким відводиться провідна роль в розвитку запальних та протизапальних ефектів в організмі людини. Мало також робіт, які містять комплексні дослідження взаємозв’язків та взаємозалежностей різноманітних ланок імунної системи та цитокінів, їх генетичної детермінованості, що дасть можливість використання імунологічних досліджень як додаткової діагностики, при прогнозуванні перебігу вказаного захворювання, оцінки його активності та направленості запального та алергічного процесу.

Порушений стан імунної системи при алергічній патології потребує певного імунокоригуючого впливу в складі лікувальних комплексів, але коло імуномодуляторів все ще недостатньо широке і багато з них мають побічну дію (Г.М.Драннік, 2006; У.Пол, 2000; Р.А.Томпсон, 2000; І.Ройт, 2002). Зокрема питання про застосування тимогену при бронхіальній астмі висвітлено лише в поодиноких роботах (В.Х.Хавінсон, В.М.Морозов, 1991, 1992, 1993). Недостатньо вивчене також питання про застосування нового поверхнево-активного засобу мірамістину, який поряд з антимікробною дією має і імуноад”ювантні властивості. Специфічна імунотерапія бронхіальної астми за допомогою алергенів є також малоефективною, тому що не враховує імунорегуляторну дію імунокомпетентних органів підгрудинної залози та селезінки у формуванні імунної відповіді. Механізми дії основних препаратів, які використовуються для лікування бронхіальної астми – глюкокортикоїдів, в достатній мірі не розкриті, хоча і є ряд робіт, які висвітлюють їх вплив на функції лімфоцитів (В.Я.Аріон, 1998, 1999, 2000, 2001; Л.Бастен, 2000).

3

Перспективним є вивчення фізіотерапевтичного впливу електромагнітних хвиль дециметрового діапазону на Т- та В-ланки імунітету у хворих на алергічні захворювання (В.М.Євстропов, Т.В.Ковальова, 2002), проте ще недостатньо обґрунтовані клінічні та імунологічні критерії для їх застосування.

Таким чином, вивчення закономірностей змін системного та локального імунітету у хворих на бронхіальну астму (БА) з метою обґрунтування застосування специфічної та неспецифічної імуномодуляції є новим напрямком у розвитку імунокоригуючої терапії, має значне науково-практичне та фундаментальне значення. Вищезазначе-ним визначається необхідність проведення наукових досліджень, що складають предмет даної роботи та обґрунтовується її актуальність.

Зв"язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності до планів науково-пошукових робіт кафедри клінічної імунології та алергології Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика “Розробити нові методи діагностики та лікування імунозалежної патології на основі вивчення механізмів їх розвитку з врахуванням факторів міжклітинної кооперації” (№ держреєстрації 01030005082).

Мета роботи: Підвищення ефективності лікування хворих на БА шляхом оптимізації методів застосування системної та локальної імуномодуляції на фоні комплексної терапії хворих і з врахуванням генетичної передумовленості, дисфункції імунної системи та факторів клітинної кооперації.

Для досягнення вказаної мети були поставлені такі конкретні задачі:

1.

2. Розробити схеми локальної та системної імунокоригуючої терапії при лікуванні хворих на БА з урахуванням індивідуальної чутливості імунокомпетентних клітин хворого і дозозалежного ефекту лікувальних препаратів.

4

3. Розробити принципи імунотерапії хворих на алергензалежну БА з помірно вираженими змінами показників клітинного, гуморального та локального імунітету з урахуванням факторів міжклітинної кооперації, носіями антигенів HLA A1, B8, В16, DR3 на фоні низької концентрації ІЛ-4 та високого рівня специфічного IgE, гістамінних та прозапальних цитокінів за допомогою дії дециметрових хвиль (ДМХ).

4. Вивчити клінічну ефективність комплексної імуномодулюючої терапії з включенням мірамістину в ди-наміці лікування хворих алергеннезалежною БА при помірних порушеннях системного імунітету та значних порушеннях з боку локального імунітету, а також при бактеріальній сенсибілізації на фоні низької концентрації ІЛ-4 та ІНФ-г та підвищенному рівні специфічного IgE при наявності антигенів HLA DR2, DR3, DR6, DR52, B27.

5. Розробити схеми імунотерапії за допомогою тимогену при лікуванні хворих алергеннезалежною БА, у яких спостерігаються значні порушення системного імунітету, що мають в фенотипі антигени HLA DR8, DR 52, B5.

6.Розробити ефективний алгоритм лікування хворих на БА з урахуванням тяжкості запального процесу, генетичної схильності до захворювання та ступеня імунодефіциту за допомогою імунотропного препарату тимоген, преформованого природного фактора дециметрових хвиль та імуноад”юванта мірамістину.

7. Вивчити кореляційну залежність тяжкості перебігу патологічного процесу у хворих на БА з цитокінами, які забезпечують міжклітинні кооперативні процеси та реакції запалення (ФНП-?, ІЛ-1?, ІЛ-2, ІЛ-4, ІНФ-?).

Об’єкт дослідження - імунний статус та імуногенетичні характеристики хворих на бронхіальну астму, які мають різну етіологію та ступень тяжкості патологічного процесу.

Предмет дослідження - вивчення імунологічних (клітинних, гуморальних, інтерфероногенезу і цитокінового профілю) та генетичних показників в процесі лікування хворих на БА, випробовування нових терапевтичних підходів до їх корекцій на засадах використання імуноактивних препаратів.

5

Методи дослідження - загально клінічні, функціональні, рентгенологічні, імунологічні та генетичні обстеження. Все необхідне обладнання, а також комп’ютер з програмним забезпеченням та інші прилади і реактиви є в розпорядженні кафедри, де проводилось обстеження пацієнтів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено теоретичне узагальнення та розроблено нове вирішення поставленої проблеми шляхом розробки методів імунокорекції хворих на БА з різним ступенем тяжкості патологічного процесу та різними етіологічними факторами на підставі клініко - імуно - генетичних обстежень. При здійсненні аналізу результатів комплексного імуно – генетичного обстеження встановлено, що стан системних та локальних імунних реакцій, клітинних кооперацій залежить від генетичної схильності до розвитку захворювання.

Вперше доведена можливість підвищення ефективності терапії хворих на БА шляхом включення в комплекс лікування медикаментозної імуномодуляції в поєднанні з імуномодулюючими властивостями фізичних преформованих факторів (ДМХ) при лікуванні хворих на БА з урахуванням індивідуальної чутливості імунокомпетентних клітин хворого і дозозалежного ефекта лікувальних препаратів.

Вперше розроблено принципи специфічної імунотерапії при лікуванні хворих на алергензалежну БА з помірно вираженими змінами показників клітинного, гуморального та локального імунітету з урахуванням факторів міжклітинної кооперації, що мають в фенотипі антигени HLA A1, B8, В16, DR3, за допомогою дії ДМХ-випромінювання.

Вперше встановлено, що при застосуванні комплексної імуномодулюючої терапії з включенням мірамістину в ди-наміці лікування хворих на алергеннезалежну БА при помірних порушеннях системного імунітету та значних порушеннях локального імунітету з урахуванням міжклітинної кооперації, які мають в фенотипі антигени HLA DR2, DR3, DR6, DR52, B27, вірогідно підвищується клінічна ефективність .

6

Вперше удосконалені принципи імунотерапії за допомогою тимогену при лікуванні хворих на БА, у яких спостерігаються значні порушення системного імунітету, що мають в фенотипі антигени HLA DR8, DR 52, B5.

Обґрунтована доцільність алгоритму лікування хворих на БА з врахуванням тяжкості запального процесу, генетичної схильності до захворювання, ступеня імунодефіциту за допомогою імунотропного препарату тимогену, преформованого природного фактора дециметрових хвиль та імуноад”юванта мірамістину.

Вперше вивчена та доведена кореляційна залежність між тяжкістю перебігу патологічного процесу у хворих на БА з рівнем цитокінів, які забезпечують міжклітинні кооперативні процеси та реакції запалення (ФНП-?, ІЛ-1?, ІЛ-2, ІЛ-4, ІНФ-?).

Практичне значення отриманих результатів: Основні результати досліджень впроваджено в лікувальну практику алергологічних, терапевтичних та імунореабілітаційних відділень лікувальних установ м. Донецька, Вінниці, Одеси, Львова, Києва, а також використовуються у навчальному процесі на кафедрах клінічної імунології та алергології в Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця, Донецькому, Одеському, Вінницькому, Львівського державних медичних університетах; Київській, Харківській та Запорізькій медичних академіях післядипломної освіти, а також - в профільних клініках м. Улан-Батора (Монго-лія), в І та ІІ алергологічних відділеннях Київської міської лікарні №8 та в Київському міському алергологічному центрі. Резуль-тати досліджень включені в лекційний матеріал кафедри клінічної імунології та алергології НМАПО ім. П.Л.Шупика.

За результатами даної роботи одержані авторські свідоцтва "Спосіб діагностики хронічного бронхіту" №425900. 1986: "Спосіб лікування інфекційно-залежної бронхіальної астми" №5008001, 1982: "Спосіб лікування хворих з неспе-цифічними захворюваннями легень" №736901. 1986; "Спосіб лікуван-ня хворих із захворюваннями легень" №741800. 1988: "Спосіб ліку-вання хворих на хронічний бронхіт" №935590. 1989: "Спосіб ліку-вання хворих на поліноз" №1818738. 1990: "Спосіб лікування алергії" №1760452. 1992. Матеріали роботи використані при

7

виданні методичних рекомен-дацій: "Мікрохвильова імунокорекція в комплексному лікуванні хворих полінозом" (м. Київ. МОЗ України. 1991): "Мікрохвильова імунокорекція у комплексному лікуванні хворих на інфекційно-залежну бронхіальну астму" (Київ. МОЗ України. 1991): "Застосування мірамістину в комплексному лікуванні хворих з неспецифічними за-пальними захворюваннями органів дихання, які працюють в умовах металургійного виробництва (Київ. МОЗ України. 1991). МОЗ та Фармакологічним комітетом України 26.09.96 р. видана інструкція клінічного вивчення нового фармакологічного засобу 0,01% водного розчину мірамістину для лікування хворих на бронхіальну астму.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено у повному обсязі імунологічні та генетичні дослідження по темі дисертації, клінічне обстеження щодо ефективності розроблених засобів імунокорекції хворих на БА. Здійснено статистичну обробку отриманих результатів та їх аналіз, написано текст дисертації, сформульовано висновки роботи та практичні рекомендації, проведено їх упровадження до клінічної практики.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були повідомлені на Республіканській конференції з імунології (Мінськ, І99І); на ІІ Міжнародному симпозіумі з імунології (Цхалтубо. 1990); на ІІ Всесоюзному конгресі по захворюваннях органів дихання (Че-лябінськ, 1991); на Міжнародному симпозіумі з алергології та клінічної імунології (Київ, 1992); на науковій конференції "Швид-ке старіння і зв'язок з віковою патологією" (Київ. 1992); на ІУ конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Хар-ків, 1992); на науковій сесії “Актуальні проблеми екологічної іму-нології та алергології" (Київ-Луганськ. 1992); на Інтернаціо-нальному конгресі з імунореабілітації (Сочі-Дагомис, 1995); на 12 Європейському конгресі з імунології (Барселона, 1994); на 12 кон-гресі світової федерації фізичної медицини та реабілітації (Сід-ней, Австралія,1995); на міжнародній конференції “Туберкульоз та легеневі захворювання" (Париж, Франція. 1995); на науково-практичних конференціях Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації (Київ

8

- 2002, 2003, 2004, 2005, 2006); 1 з’їзді алергологів України (Київ, 2002), 11 з"їзді алергологів України (Одеса, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 68 наукові праці: 30 статей у виданнях, атестованих ВАК України, 27 статей в інших виданнях, 1 монографія, 1 методично-учбовий посібник, 9 винаходів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 338 сторінках машинопису; включає вступ, огляд літератури, 6 розділів власних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновки та практичні рекомендації. Список використаних джерел складають 112 робіт кирилицею та 197 латиницею. Матеріал дисертації ілюстровано 77 таблицями, 3 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань було обстежено 448 хворих на БА у віці від 18 до 65 років, серед них було 244 жінки та 204 чоловіки. У 164 хворих була алергензалежна БА, а у 284 – алергеннезалежна. Тривалість захворювання у хво-рих коливалось від 6 місяців до 10 років і більше. При цьому до 2-х років було 100 осіб (22,З%), від 2 до 5 - 90 (20,0%), від 5 до 10 – 10 чол. (2,2З%) та найчисленніша група хворих, які страждали на БА від 10 до 30 років - 248 осіб (55,0%). У цього контингенту хворих з'ясовані супутні захворювання: з ЛОР-патологією 120 осіб (26,7%), із захворюваннями печінки – 50 чол. (11,5%). Як контроль при імунологічних дослідженнях були обстежені 20 здорових донорів крові. Усім пацієнтам у клініці проводились загально клінічні, функціональні, рентгенологічні, алергологічні, імунологічні та генетичні дослідження (а саме - загальний аналіз крові і харкотиння, біохімічне дослідження крові, бактеріологічне дослідження мокро-ти, реєстрували функцію зовнішнього дихання на апараті "Пневмоскрін-2" фірми "Еріх Егер" та електрокардіограму, при необхідності - рентген дослідження органів грудної порожнини. Проводились шкіряні алергологічні проби).

9

Комплексне імунологічне обстеження включало вивчення зрілих Т-лімфоцитів (CD3+) та їх субпопуляцій (CD4+, CD8+), а також В-лімфоцитів (CD20+) за загальноприйнятою методикою за допомогою моноклональних антитіл з урахуванням результатів на люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ-ІЗ, визначення функціональної активності Т-лімфоцитів, їх субпопуляцій, а також В-лімфоцитів за допомогою реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) з ФГА, Кон-А, ліпополісахаридами Е.соli за рівнем включення ДНК, поміченого Н3-тимідином (В.В.Хоробрих,1983). Визначалась також чутливість Т-лімфоцитів до різних доз імуномодулюючих препаратів: тимогену (0,002; 0,02 та 0,2 мкг/мл): мірамістину 0,01%; 0,005% та 0,001% розчину; вілозену – 0,04; 0,004 та 0,0004 мг/мл; ДМХ-випромінювання 20 мВт/см2, 60 мВт/см2, 100 мВт/см2 (Е.В.Гюллінг, 1990; К.Ф.Чернушенко, Л.С.Осипова (1992). Для оцінки В-ланки імун-ної системи вивчали вміст Ig класу М, G, А. (Маnсіnі еt аl., 1965), імуноферментним методом визначали вміст ІgЕ та алергенспецифічних (пилкових) імуноглобулінів цього класу. Стан фагоцитуючих клітин в крові та бронхоальвеолярному змиві (БАЗ), (М.М.Маянський, 1989), оцінювали за процентом фагоцитозу (ПФ), фагоцитарним числом (ФЧ) в альвеолярних макрофагах (АМ) та нейтрофільних гранулоцитах (НГ); тестом відновлення нітросинього тетразолію (НСТ) в АМ та НГ, який свідчить про рівень кисневозалежного метаболізму. Рівень циркулюючих імунних комплексів визначали за методом (М. Digeon, 1977). Сироватковий вміст цитокінів ІЛ-1?, ІЛ-2, ІЛ-4, ІФН-? виявлявся спектрофотометричним методом з використовуванням набору реактивів для імуноферментного аналізу (ІФА) фірм ІВL (Гамбург, Германія) і Innogenetics N V (Бельгія) - для виявлення ФНП-?. Антигени локусів А, В, С головного комплексу гістосумісництва (HLA) виявляли за допомогою мікролімфоцитотоксичного тесту (K. K. Mittal еt al., 1968) на типуючих панелях (ЗАТ Межрегіонального центру імуногенетики та гістотипуючих реагентах “Гіганс”, Санкт-Петербург).

10

Результати одержаного цифрового матеріалу були оброблені із застосуванням методів варіаційної статистики, вірогідність результатів обчислювали по Ст”юденту , використовували кореляційний аналіз.

Отримані результати та їх обговорення. З метою визначення зв’язків виявлення генетичних маркерів головного комплексу гістосумісництва (HLA) локусів А, В, С, DR з захворюваністю на БА проведено обстеження 63 пацієнтів, контрольними даними були результати імуногенетичного тестування 87 здорових осіб.

Проведеними дослідженнями виявлена відсутність особливостей в частоті реєстрації у хворих на БА вивчених антигенів HLA локусу С. Поряд з цим, ряд розбіжностей виявлено по відношенню розподілу алоантигенів HLA локусів А і В. Серед хворих на БА встановлено зменшення питомої ваги носіїв HLA А10 (P<0,01). HLA В8, B27, навпаки, реєструвалися значно частіше (Р<0,05). В групі здорових алоантигени В8 та В27 зустрічались відповідно в 11,5 % та 8,1 % випадків, серед хворих їх частота становила відповідно 27,0 % та 22,2 %. В зв"язку з цим, серед хворих на БА 47,6 % осіб мали HLA B8 або B27, а серед донорів аналогічний показник становив 17,2 % (Р<0,05).

Серед маркерів локусу DR з підвищеною частотою (P<0,05) у хворих на БА реєструвався HLA DR3.

Вивчення показників імунологічної реактивності у хворих на БА виявило суттєві зміни в гуморальній та клітинній ланках імунної системи.

Низька експресія мононуклеарами крові молекул CD4+ у осіб з HLA В5 і В13 і підвищений рівень експресії CD8+ у носіїв HLA В12 поєднувались у даних хворих із зниженими (P<0,05) середніми значеннями індексу CD4+/CD8+. Низький середній рівень проценту Т-супресорів - цитотоксичних клітин асоціювався з HLA A1, B8, B27, A1B8, DR1. Значення CD8+ клітин в межах <M-1 частіше реєструвались у хворих з HLA B8 (P<0,05) і HLA DR3 (P<0,001) і менше у носіїв HLA A2 (P<0,01) і HLA DR4 (P<0,05). Низькі (<M-1) рівні абсолютної кількості в крові Т-супресорів - цитотоксичних лімфоцитів з підвищеною частотою виявлялись у хворих на БА, що

11

мають HLA DR6. Аналіз взаємозв"язків Т-зрілих лімфоцитів з генетичними маркерами показав, що HLA B5 (P<0,001) і HLA DR8 (P<0,05) мали асоціації з низькими процентними показниками CD3+ лімфоцитів. Хворі з HLA DR8 (P<0,01) і DR52 (P<0,05) мали більш низькі в порівнянні з загальною групою, середні рівні абсолютного складу в крові Т-лімфоцитів. HLA B40 зв"язаний (P<0,05) із збільшенням середнього значення як процентного, так і абсолютного складу Т-зрілих клітин.

Таким чином, генетична гетерогенність реактивності у хворих на БА свідчить про необхідність виявлення генетичних маркерів поряд із імунологічними та алергологічними показниками для індивідуалізації лікування хворих на БА.

В групі хворих на БА (100 осіб), у яких спостерігались значні порушення системного імунітету, що відповідають розподіленню алоантигенів HLA DR8, DR52, B5 були вивчені особливості впливу тимічних iмуномодуляторів (тимогену, тималіну, Т-активіну) на імунокомпетентні клітини в залежності від рівня імунологічної реактивності організму, а також обґрунтування підбору дози тимогену для курсу імуномодуляції (К.Ф.Чернушенко, 1992, 1996, 2003): ти-моген та тактивін у концентраціях – 0,002; 0,02 та 0,2 мкг/мл; тималін – 0,2; 2,0; 20 мкг/мл: вілозен – 0,0004; 0,004 та 0,04 мкг/мл. Друга або середня доза кожного препарату відповідає стандартній, мінімальна використовувалась для з'ясування високої чутливості імунокомпетентних клітин до препаратів, максимальна - для з'ясування низької чутливості. Враховували стимулю-ючий або пригнічуючий ефект препаратів (ефект розцінювали як пози-тивний або негативний при умові, що різниця з величиною конт-ролю перевищувала 20%). У здорових осіб не було відзначено зміни кількості Еа-РУК після преінкубації лімфоцитів з тимогеном ні з однією до-зою. У осіб з нормальним вмістом Еа-РУК (28,38 ± 0,45%) стимулюючий вплив виявляла тільки стандартна (середня доза тимогену (36,12 ± 1,04%; Р<0,05). В групах хворих з помірно (19,41 ± 0,47%) і значно зниженим (11,02 ± 0,37%) відносним вмістом Еа-РУК в крові вживання тимогену виявляло стимулюючу дію на рівень Еа-РУК на всіх досліджених дозах (Р < 0,05). Отже,

12

тимоген in vitro виявляє імуномодулюючу дію на розеткоутворюючу здатність Т-лімфоцитів хворих на БА, що проявляється мінімальним впливом на нормальні показники вивченої функції та вираженою стимуляцією при по-чатково низькому рівні. Тому, застосування даного препара-ту в комплексній терапії хворих на БА доцільно при наявності імунодефіциту. Для вивчення впливу препаратів тимусу (тимогену, тималіну, тактивіну і вілозену) на імунокомпетентні клітини хворих на БА in vitro в процесі імуномодулюючої терапії були досліджені 100 хворих. 50 з них одержували традиційну терапію (контрольна група), а 50 хворим в комплексне лікування додатково був включений тимоген (основна група). У всіх хворих вивчали чутливість лімфоцитів до препаратів тимусу у ви-щеописаних концентраціях в реакції Еа-РУК до і після курсу імуномодулюючої терапії, хворим контрольної групи проводились обстеження в стро-ки, відповідні закінченню курсу імуномодуляції. До лікування інтенсивність Еа-РУК після преінкубації лімфоцитів з препаратами збільшувалась в обох групах однаково, тобто до лікування у всіх досліджених достовірний стимулюючий ефект виявляли всі три дози тимогену, середня і максимальна дози ти-маліну і Т-активіну та середня доза вілозену. Причому, найбільший стимулюючий ефект викликала друга доза (відповідна стандартній терапевтичній кожного з препаратів). У групі хворих, які одержува-ли тільки традиційну терапію, така ж тенденція зберігалась і після лікування. В основній групі, пацієнти якої одержували курс імуномодуляції тимогеном, відзначалась зовсім інша динаміка по-казників. Після курсу тимогену збільшився початковий рівень Еа-РУК з (І5,75 ± 1,36% до 27,31 ± 0,98%: Р<0,05), і вже вірогідно не відрізнявся від рівня здорових (29,6 ± 11,8%; Р<0,05). Змінився і характер впливу різних доз препаратів на Еа-РУК. Так, в реакціях з тимогеном, тималіном і Т-активіном найбільший стимулюючий ефект спостерігався під впливом мінімальної дози цих препаратів. Засто-сування середньої і максимальної доз цих же препаратів не викли-кало вірогідної стимуляції в цілому по групі, а у деяких хворих максимальна доза дещо знижувала інтенсивність Еа-розеткоутворення.

13

Вплив вілозену на лімфоцити до і після курсу імуномодуляції не змінювався, тобто, найбільший стимулюючий ефект до і після лікування викликала середня доза препарату. Можливо ця неодноз-начність дії препаратів на лімфоцити хворих залежить від різної хімічної структури препаратів, так як тимоген, тималін і Т-активін - пептидні препарати, а вілозен має іншу хімічну структуру.

Таким чином, після проведення імуномодулюючої терапії тимоге-ном у хворих на БА підвищувалася чутливість лімфоцитів in vitro до препаратів тимусу пептидної природи. Ґрунтуючись на одержаних даних, ми припустили, що повторний курс імуномодуляції тимогеном у хворих з неповним відновленням імунологічної реактивності передбачає застосування меншої, а саме половинної індивідуальної початкової дози препарату, для поперед-ження імунодепресії надмірними дозами імуномодулятора.

Паралельно було обстежено склад в сироватці крові цитокінів ІЛ-1? , ІЛ-2, ІЛ-4, ФНП-? і ІНФ-? в процесі лікування. Отримані дані демонструють вірогідну залежність рівня протизапальних та прозапальних цитокінів в сироватці крові від ступеня тяжкості приступу у хворих на БА. Особливо виражені порушення відмічені у пацієнтів під час тяжкого приступу. Тому для зменшення запального процесу та стимулювання імунітету у хворих на БА використовували імуномодуляцію тимогеном. Клітини крові інкубували на протязі 7 годин при 37оС (спонтанний синтез) і стимулювали ЛПС Eschеrichia coli (серотип 055:В5, 10 мкг/мл), “Sigma”. Кількісне визначення рівня синтезу цитокінів проводили через 3 години від початку інкубації з інтервалом в 1 год. Спочатку були виділені оптимальні параметри часу стимуляції синтезу цитокінів клітинами крові, що дозволяє завершити першу фазу експерименту на протязі 6-8 годин. Було доказано, що за 6 годин інкубації клітини здібні виділяти суттєву кількість цитокінів з тенденцією до їх збільшення. Знайдений час інкубації являється достатнім для виділення рівня синтезу цитокінів, що дозволяє порівнювати рівні імунокомпетентних клітин у хворих на БА та здорових людей до наступу динамічної рівноваги між секрецією та активацією цитокінів. Здібність клітин крові хворих синтезувати ФНП-? при стимуляції клітин

14

ЛПС був значно вищим в порівнянні з такими ж клітинами у здорових людей (показники ФНП-? – спонтанний - здорові люди: 25,1 ± 0,1 пг/мл; хворі люди: 56,1 ± 12,2 пг/мл; показники ФНП-? – індукований – здорові люди: 501 ± 11,1 пг/мл; хворі люди: 630 ± 11,2 пг/мл ).

При лікуванні простежується закономірність нормалізації показників цитокінів, які ми вивчали в результаті лікування тимогеном на фоні рутинної терапії. Звертає на себе увагу нормалізація рівня ІЛ-4 (41,34 ± 1,06 пг/мл ) і збільшення кількості ІЛ-1? (47,31 ± 0,54 пг/мл), що пояснюється кількістю алергенів, які попали в організм людини, що являється одним з варіантів захисної функції людини і проявом специфічного імунітету.

Було проведено порівняння складу в сироватці крові ІЛ-1?, ФНП-? , ІНФ-? і клінічної характеристики критеріїв тяжкості нападів у хворих на БА. Були обстежені хворі на БА при різному ступені тяжкості патологічного процесу: при тяжкому процесі було обстежено 15 осіб, при середньому ступеню тяжкості - 20 чоловік, при легкому – 20 чоловік та в стані ремісії – 55 хворих.

Одержані показники демонструють вірогідну залежність концентрації рівнів до запальних цитокінів в сироватці крові від тяжкості хворих на БА, особливо під час тяжкого його прояву.

При тяжкому приступі БА відмічається десятикратне збільшення рівні ІЛ-1? в сироватці крові в порівнянні з ремісією захворювання, трьохразове підвищення рівня даного цитокіну при приступі БА середньої тяжкості. Не знайдено вірогідних розходжень в складі ІЛ-1? у пацієнтів, які знаходяться в ремісії при легкому приступі БА. Відмічено знижений, в порівнянні з контрольною групою, рівень ІНФ-? при приступі БА любого ступеня тяжкості.

Таким чином, при аналізі рівня прозапальних цитокінів в сироватці крові хворих на БА в приступному періоді різного ступеня тяжкості відмічено значне підвищення ІЛ-1? і ФНП-б при тяжкій формі БА та помірне підвищення їх у сироватці крові при приступі БА середнього ступеня тяжкості.

15

Таблиця 1

Рівень ФНП-?, ІЛ-1?, ІНФ-? (M±m) в сироватці крові при приступі БА різного ступеня тяжкості (пг/мл)

Цитокіни | Тяжкий ступінь тяжкості БА

(n=15) | Середній ступінь тяжкості БА (n=20) | Легкий ступінь тяжкості БА (n=20) | Ремісія (n=55)

ФНП-? | 227,9±75,96* | 117,16 ± 38,45** | 60,91 ± 14,61*** | 56,09 ± 9,23

ІЛ-1? | 354,2± 152,9* | 108,12 ± 60,23** | 48,57 ± 32,49*** | 47,67 ± 5,38

ІНФ-? | 84,71± 10,25* | 87,18 ± 17,51** | 84,98 ±18,15*** | 127,18 ±24,05

Примітка: вірогідність одержаних результатів в порівнянні тяжкості процесу та стану ремісії; *- тяжкий ступінь; ** - середній ступінь; *** - легкий ступінь

Кореляційний аналіз між концентраціями цих цитокінів в приступному періоді БА різного ступеня тяжкості (таблиця 2), підтвердив взаємозв"язок між вмістом в сироватці крові ІНФ-? і ІЛ-1?. Встановлено, що сила цього зв"язку має зворотню пропорційну залежність від тяжкості БА. Так, якщо в період ремісії БА коефіцієнт кореляції був близький до одиниці (r =0,949), то при легкому і середньому перебігу його значення становили відповідно r = 0,726 та r = 0,59, а при тяжкому перебігу було встановлено найменший зв"язок цих показників (r=0,369).

Отримані дані свідчать про зниження концентрації сироваткового рівня ІНФ-? в період загострення БА і мають відношення до алергічного запалення та до порушення синтезу ІЛ-1?, опосередкованої продукції ІНФ-? Тh1-клітинами. Ступінь вираженості цих порушень прямо пропорціональний тяжкості процесу запалення. Про запальні явища у хворих на БА свідчить підвищення в сироватці крові типових прозапальних цитокінів – ІЛ-1? і ФНП-?, тоді як

16

зниження ІНФ-? може свідчити про те, що при алергічному запаленні він являється протизапальним.

Таблиця 2

Кореляційні зв’язки між вивченими цитокінами (r)

Хворі на БА з приступами | ФНП-? | ІЛ-1?

ІНФ-?***

ІЛ-1?* | ІНФ-?**

Тяжкі приступи (n=15)

Середні приступи (n=20) | -0,12

-0,15 | -0,15

-0,11 | 0,369

0,59

Легкі приступи (n=20) | 0,021 | 0,123 | 0,726

Стан ремісії (n=55) | 0,191 | 0,124 | 0,949

Примітка: кореляційні зв"язки: *- між ФНП-? і ІЛ-1?; **- між ФНП-? та ІНФ-?; *** між ІЛ-1в і ІНФ-?.

Таким чином, після проведеного лікування тимогеном на фоні базисної терапії виявлено зниження активності Тh-2 та нормалізація рівня ІЛ-4 в сироватці крові. При оцінюванні клінічної ефективності лікування хворих на БА в комплексному лікуванні з тимогеном встановлено, що в основній групі хворих відмінні та добрі результати отримано у 84% випадків, а в конт-рольній групі - у 60% спостережень. Задовільні результати в ос-новній групі спостерігались у 25% хворих, а в контрольній – у 35% випадків, незадовільний клінічний ефект був у 1% пацієнтів в ос-новній групі і у 15% випадках у контрольній групі.

Вивчення особливостей впливу мірамістину на показники імунологічної реактивності хворих на БА з різко вираженими змінами в системному та локальному імунітеті з урахуванням міжклітинної кооперації при наявності антигенів HLA DR2, DR3, DR6, DR52, B27, було зроб-лено з метою визначення найбільш ефективних доз препарату, спо-собу його введення та терміну лікування. Рішенням

17

Фармакологічного комітету МОЗ СРСР №146 від 31.05.91 та постановою Фармкомітету МОЗ України, протокол №9 від 24.11.94 р. мірамістин був доз-волений для клінічного застосування у вигляді 0,01% водного роз-чину як антисептичний засіб. МОЗ України та Фармакологічним комітетом дозволено з 26.09.96 р. застосовувати 0,01% водний роз-чин мірамістину для лікування хворих на БА.

Імунологічне обстеження проводилось у 200 хворих на БА, контрольну групу склали 50 хворих на БА, яким прово-дилась традиційна терапія без мірамістину та 20 здорових осіб (донорів крові).

Спираючись на дані клініко-імунологічних досліджень, хворі були розподілену на 2 групи: І група –150 хворих на БА; ІІ група - 50 осіб (контроль) - хворі на БА, які не одержували мірамістину на фоні традиційної базової терапії. Курс мірамістину включав інгаляції 0,005% водного розчину. Інгаляції проводили кожного дня, курс лікування становив 10 інга-ляцій. Для з"ясування найбільш активної дози мірамістину досліджено порівняльний вплив трьох доз препарату (0,001%; 0.005%: 0,01%) в реакції Еа-РУК. Доведено, що середня доза мірамістину відповідає стандартній, мінімальна використовувалась для з"ясування високої чутливості імунокомпетентних клітин до препарату, максимальна низької. Враховували сти-мулюючий або пригнічуючий ефект мірамістину (враховували різницю з величиною контролю, яка перевищувала 20%). Виявилось, що найбільш активною була дія середньої дози препарату 0,005%, яка відповідала стандартній. Дія препарату оцінювалась з урахуванням початкової кількості Еа-РУК в периферичній крові. Для цього всі обстежені особи були розподілені на групи з нормальним (28,38 ± 0,45%), помірно (19,41 ± 0,47%) та значно зниженим (11,02 ± 0,37%) вмістом “активних” розеткоутворюючих клітин. У здорових осіб не було відзначено змін у кількості Еа-РУК після інку-бації з мірамістином ні з однією дозою. У хворих рівень Еа-РУК під впливом мірамістину змінювався в залежності від її початкової кількості. У осіб з нормальним вмістом

18

Еа-РУК в крові стимулююча дія відзначена під впливом тільки се-редньої (0,005%) дози (з 28,38 ± 10,45% до 36,12 ± 11,04%; Р < 0,05).

Таким чином, мірамістин виявляє значну імуномодулюючу дію на розеткоутворюючу здатність Т-лімфоцитів хворих на БА, що проявляється мінімальним впливом на нормальні показники імунологічної реактивності та стимуляцією при початково низькому рівні у пацієнтів.

Отже, критерієм для раціонального використання мірамістину є попереднє дослідження лімфоцитів хворо-го з трьома дозами (0,001%; 0,005% та 0,01%) в реакції Еа-РУК, що дозво-ляє індивідуалізувати схему його призначення. На фоні традиційної базисної терапії 150 хворим на БА проводили лікування мірамістином, контрольну групу склали 50 хворих, що одержували тільки традиційну терапію. Одер-жані дані порівнювались між собою та з показниками імунного ста-тусу організму 20 здорових донорів крові. Хворі були рандомізовані за статтю, віком та перебігом захворювання. Вивчення фенотипу лімфоцитів у всіх хво-рих до лікування виявило низький рівень відносного числа Т-клітин (в основній групі 19,1 ± 2,2%; в контрольній 17,7 ± ,7%; у здорових 41,3 ± 1,8%; Р<0,05). Після закінчення терапії мірамістином від-значалось вірогідне підвищення числа Т-лімфоцитів у І групі (до 38,8 ± 2,21; Р < 0,05), в той же час в контрольній групі спосте-рігалась лише тенденція до підвищення рівня Т-клітин (25,І ± 1% з результатом до лікування (Р>0,05). Вираженість РБТЛ на ФГА у всіх групах обстежених була суттєво нижчою за норму (48,4 ± 3,2%) і вірогідно не відрізнялась у всіх обстежених хворих. Після прове-деної терапії було відзначено вірогідне підвищення інтенсивності РБТЛ на ФГА. На кінець лікування у хворих з БА відзначалась найбільш ви-сока інтенсивність бластоутворення (75,8 ± 4,1%) на неспецифічний мітоген (ФГА), що підтверджує активацію функціональних власти-востей Т-лімфоцитів.

Отже, комплексне лікування хворих на БА із застосуванням мірамістину призво-дить до нормалізації показників кількісної та функціональної ак-тивності імунокомпетентних клітин.

19

При вивченні впливу комбінованої терапії на реактивність базофілів крові у хворих на БА, які мали порушення локального імунітету (дисфункція НГ та АМ), було проаналізовано результати дії різних концентрацій мі-рамістину на функціональну активність М та АМ у 17 хворих на БА до та після 30-хвилинної інкубації клітин з препаратом. При цьому було встановлено значні порушення функції АМ, які проявлялись у зниженні поглинаючої здатності клітин: ФП - 52,6 ± 4,2%; ФЧ - 3,4 ± 0,09 ум.од.; Р<0,001 у порівнянні з контролем (ФП - 73,6 ± 3,9%; ФЧ – 5,2 ± 0,31ум.од.). Показники НСТ-тесту у хворих були незначно вищими (42,9 ± 3,55%), ніж в контролі (38,1 ± 3,4%), що свідчить про не-достатню напруженість внутрішньоклітинних кисневозалежних механіз-мів бактерицидності. Після дії на клітини 0,005% розчину міраміс-тину показники ФП і ФЧ змінювались не вірогідно у порівнянні з їх початковим рівнем. Максимальний стимулюючий вплив на погли-наючу здатність НГ (ФП – 71,6 ± 4,0%; ФЧ - 5,1 ± 0,27) відзначався при обробці клітин 0,005% розчином мірамістину. Більш високі кон-центрації ПАР

(0,01%) розчину виявляли незначну стимулюючу дію, а при дії на НГ 0,1% розчину препарату була виявлена тенденція до пригнічення поглинаючої здатності фагоцитів у порівнянні з початковими значеннями показників. При вивченні впливу мірамістину на НСТ - відновлюючу здатність альвеолярних макрофагів було встановлено, що дія на клітини пре-парату в концентрації 0,005% призводила до вірогідного підвищення показників НСТ-тесту (62,4±4,3%; Р < 0,001 у порівнянні з контро-лем (38,1±3,4%), що свідчить про активацію кисневозалежних ме-ханізмів бактерицидності фагоцитів. Обробка клітин мірамістином в інших вищезазначених концентраціях не викликала суттєвих змін (Р > 0,5) показників НСТ тесту.

Для порівняння був вивчений вплив імуномодулятора тималіну, який використовується для лікування хворих на БА, та функціональну активність НГ та АМ у хворих. Проведені дослідження довели, що різні концентрації тималіну при безпосередній дії на АМ, виділені з БАЗ не виявляли вірогідних змін показників функціональної активності бронхоальвеолярних НГ та АМ. Лікування мірамістином впливало стимулююче на аль-веолярні НГ та АМ хворих на БА, причому,

20

максимальний стимулюючий ефект відзначався при дії на фагоцити 0,005% розчину препарату. При БА формується вторин-ний імунодефіцит, який проявляється пригніченням Т-ланки імуніте-ту та дисфункцією фагоцитуючих клітин. Слід відзначити, що мето-ди корекції порушень локального імунітету, а саме дисфункції НГ у вогнищі запалення у хворих на БА розроблені недостатньо.

З цією метою була вивчена можливість застосування мірамістину в комплексній терапії хворих на БА.