національна Академія наук України

Інститут молекулярної біології та генетики

Кордиш Марія Олександрівна

УДК 577.322

577.152.611

Внутрішньомолекулярна конформаційна рухливість та РНК-зв’язувальні властивості С-модуля еукаріотної тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі білкової інженерії та біоінформатики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач відділу білкової інженерії та біоінформатики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач відділу молекулярної та квантової біофізики;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Сиволоб Андрій Володимирович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри загальної та молекулярної генетики.

Захист відбудеться 30 жовтня 2007 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано “28” вересня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аміноацил-тРНК синтетази (ARS) каталізують високо-специфічне аміноацилювання тРНК в процесі біосинтезу білка. Однією з найбільш вивчених ARSаз ссавців є цитоплазматична тирозил-тРНК синтетаза (ТyrRS), яка складається з двох структурних модулів: NH2-кінцевого каталітичного модуля та цитокінподібного СООН-кінцевого домену - гомолога цитокіну ЕМАР ІІ (ендотеліального та моноцитактивуючого поліпептиду ІІ). ЕМАР ІІ є СООН-кінцевим доменом білка р43 - компонента високомолекулярного комплексу ARS вищих еукаріотів. ЕМАР ІІ підсилює прокоагуляційну активність ендотеліальних клітин людини, викликає позитивний хемотаксис у моноцитів та лейкоцитів, здатний викликати апоптоз в культурі клітин і є інгібітором ангіогенезу. Однією з важливих властивостей ЕМАР II є його антипухлинна активність (Schwarz, 2004).

ARS еукаріот, як правило, використовують тРНК-зв’язувальні фактори (tIF), які можуть неспецифічно взаємодіяти з різними тРНК та стабілізувати їхню структуру. С-модуль цитоплазматичної ТyrRS ссавців має подвійну функцію: бере участь у зв’язуванні тРНК як цис-фактор, а після протеолітичного відщеплення від каталітичного ядра синтетази виявляє цитокінову активність, подібну до ЕМАР ІІ. Ізольований С-домен може утворюватися в результаті відщеплення від каталітичного кору ТyrRS по PEST-послідовності в міждоменному лінкері, яка є сигналом для контрольованого внутрішньоклітинного протеолізу. Високогомологічні С-модуль ТyrRS та ЕМАР ІІ зараховують до групи білків що містять ОВ-фолд, представниками якої також є окремі білки Trbp111 у бактерій, Arc1p у дріжджів та р43 у ссавців. Характерними властивостями ОВ-фолд-білків, архітектура яких базується на закритих ?-барелях, є зв'язування з нуклеїновими кислотами та важлива роль консервативних ароматичних амінокислотних залишків у цьому процесі.

До цього часу структурні аспекти внутрішньомолекулярної конформаційної рухливості С-модуля ТyrRS і цитокіну ЕМАР ІІ практично не вивчені. Дослідження структурних властивостей цих білків є актуальним, оскільки цитокін ЕМАР ІІ - це новий продукт генноінженерних біотехнологій, який виробляється фірмами “Cell Sciences” та “PeproTech”, а для С-модуля ТyrRS як нового цитокіну зараз створюється технологія виробництва. Як ЕМАР ІІ, так і С-модуль ТyrRS зараз використовуються в біомедичних дослідженнях як інгібітори ангіогенезу.

Актуальність даної роботи також полягає в необхідності вивчення взаємодії С-модуля ТyrRS з тРНК та встановлення функціональної ролі окремих аміно-кислотних залишків в комплексоутворенні. Слід зазначити, що формування комплексів білків із РНК, як правило, супроводжується взаємними структурними змінами в процесі конформаційної адаптації. Однак до цього часу конформаційні зміни при взаємодії С-модуля ТyrRS із тРНК залишаються ще не вивченими експериментально.

Одним із найчутливіших та інформативних методів дослідження конформаційних змін білків у розчині є флуоресцентна спектроскопія. Ізольований С-модуль ТyrRS та білок ЕМАР ІІ є однотриптофановими білками, які містять

природні флуоресцентні зонди (Trp144 в С-модулі та Trp125 в ЕМАР ІІ), локалізовані в різних ділянках цих гомологічних поліпептидів. Це дозволяє здійснювати моніторинг конформаційної рухливості, вивчаючи характеристики флуоресценції залишків триптофану як репортерних груп у структурі цих білків. Вивчення динаміки білка є необхідним етапом дослідження механізму його функціонування. Методи флуоресцентної спектроскопії дозволяють визначити параметри зв’язування білків із РНК, а при комплексному застосуванні різних експериментальних підходів, в тому числі часороздільної флуоресцентної спектроскопії, здійснити перевірку гіпотез про можливі молекулярні механізми взаємодії білків із РНК та роль конформаційної рухливості при утворенні комплексів. Широкого застосування для дослідження конформаційної рухливості також набули комп’ютерні методи моделювання молекулярної динаміки (МД), що надають інформацію про конформаційні рухи білка на атомному рівні деталізації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у відповідності з планами науково-дослідної роботи відділу білкової інженерії та біоінформатики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України в рамках бюджетної теми 2.2.4.28 “Конформаційна рухливість та динамічний механізм впізнавання РНК еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою” (№ держреєстрації 0103V000073 2003 - 2007 pр.).

Мета і завдання дослідження. Мета дисертаційної роботи - вивчення внутрішньомолекулярної стабільності, конформаційної рухливості та механізмів зв’язування з РНК С-модуля тирозил-тРНК синтетази та цитокіну ЕМАР ІІ.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Провести бактеріальну експресію та очистку гомогенних препаратів C-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ та білків, що містять специфічні амінокислотні заміни.

2. Дослідити внутрішньомолекулярну стабільність та конформаційну рухливість ізольованого С-модуля TyrRS та EMAP II в розчині методами стаціонарної флуоресцентної спектроскопії та кругового дихроїзму (КД) і охарактеризувати вплив температури на ці процеси.

3. Вивчити зв’язування С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ з тРНК та визначити параметри асоціації тРНК з білком у цих комплексах.

4. Проаналізувати конформаційну рухливість С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ в розчині комп’ютерними методами моделювання МД та охарактеризувати рухливість амінокислотних залишків у РНК-зв’язувальному центрі.

5. На основі отриманих експериментальних і теоретичних даних запропонувати можливий механізм конформаційної адаптації С-модуля в комплексі з тРНК.

Об’єкт досліджень: явища внутрішньомолекулярної конформаційної рухливості та РНК-зв’язувальних властивостей С-модуля тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ.

Предмет досліджень: С-модуль тирозил-тРНК синтетази, цитокін ЕМАР ІІ, комплекси С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК.

Методи досліджень: біохімічні методи отримання рекомбінантних білків у бактеріальній системі експресії, методи електрофорезу в поліакріламідному гелі в денатуруючих умовах та в агарозному гелі, метод сайт-спрямованого мутагенезу, методи флуоресцентної спектроскопії (стаціонарної та з роздільністю у часі), методи комп’ютерного моделювання, зокрема, молекулярної динаміки, і метод кругового дихроїзму.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Досліджено внутрішньомолекулярну конформаційну рухливість ізольованого С-модуля TyrRS в розчині методами флуоресцентної спектроскопії та КД. Методом КД отримано експериментальні дані про вміст елементів вторинної структури у складі С-модуля TyrRS, які узгоджуються з даними молекулярного моделювання.

2. Встановлено, що флуорофор Trp144 є екранованим у просторовій структурі С-модуля, проте частково доступним для зовнішніх гасників флуоресценції, що свідчить про наявність швидкої конформаційної рухливості в наносекундному часовому інтервалі.

3. Досліджено внутрішньомолекулярну стабільність та конформаційну рухливість цитокіну EMAP II методами флуоресцентної спектроскопії і КД та охарактеризовано конформаційні зміни цього білка під впливом температури: виявлено локальний конформаційний перехід Trp125 ЕМАР ІІ – його часткову експонованість молекулам розчинника при 37оС та вихід Trp125 з гідрофобного в швидкорелаксуюче водне оточення при 45оС.

4. Проаналізовано формування комплексів С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ з тРНК та визначено параметри зв’язування тРНК з досліджуваними білками.

5. Методом МД виявлено локальні конформаційні переходи в рухливій ділянці інтерфейсу між А- і В-субдоменами С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ, які супроводжуються перепакуванням структури цих білків та подовженням -спіралей в ділянці РНК- зв’язувального центру.

6. Експериментально досліджено ймовірні механізми взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК. Виявлено конформаційні зміни цих білків при взаємодії з тРНК та охарактеризовано можливі механізми таких змін.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в роботі, можуть бути використані для пояснення механізмів функціонування С-модуля та ЕМАР ІІ. На основі розгляду особливостей взаємодії С-модуля з тРНК запропоновано ряд рекомендацій щодо підбору оптимальних умов дослідження взаємодії білка з нуклеїновою кислотою, які забезпечуватимуть отримання більш точної і надійної структурної інформації у флуоресцентних дослідженнях подібних комплексів. Запропоновано методологію та комплекс комп’ютерних програм для розрахунку параметрів зв’язування білків з нуклеїновими кислотами, які можуть з успіхом використовуватися як кількісний інструмент при дослідженні білково-нуклеїнових взаємодій.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у: проведенні експресії та очищенні досліджуваних препаратів рекомбінантних білків; плануванні та визначенні умов проведення експериментів, власноруч проведених

експериментах із застосуванням методів флуоресцентної спектроскопії та спектроскопії КД; аналізі та математичній обробці отриманих результатів; співучасті у обговоренні та інтерпретації результатів; написанні наукових праць та оприлюдненні результатів на наукових конференціях. Розрахунки та аналіз даних МД С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ здійснено спільно з к.б.н. Д.Б. Ковальським. Сайт-спрямований мутагенез залишку Phe127 на Trp127 проведено у співробітництві з Д.О. Мірошниченко. Автор вдячна К.О. Одинцю за побудовану модель cm5 С-модуля TyrRS та к.б.н. Д. Б. Ковальському за надану модель тривимірної структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНКPhe.

Автор висловлює подяку професору І. Мелі та П. Кіннунену за надану технічну та матеріальну базу для проведення експериментів із дослідження РНК-зв'язувальних властивостей С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ методами флуоресцентної спектроскопії, визначення вторинної структури С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ методом КД, а також за допомогу при обговоренні отриманих результатів. Автор щиро вдячна д.б.н., професору, член-кореспонденту НАН України О.І. Корнелюку за керівництво роботою, корисні поради при плануванні проведення експериментів та обговоренні результатів досліджень. Одержані результати представлено у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на ІІІ та IV з’їздах Українського Біофізичного товариства (м.Львів, 2002; Донецьк, 2006), Конференції молодих науковців, аспірантів і студентів з молекулярної біології і генетики, присвяченій золотому ювілеєві подвійної спіралі ДНК та 30-тій річниці Інституту молекулярної та генетики НАН України (м.Київ, 2003), 5-тій Міжнародній конференції з біологічної фізики (м.Гетеборг, Швеція, 2004), Першій Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (м.Харків, 2004), на 15th IUPAB & 5th EBSA Міжнародному біофизичному конгресі (м.Монтпельє, Франція, 2005), Міжнародній літній школі FEBS з питань білкового місфолдингу і фолдингу та вікових хвороб (о.Спетсаі, Греція, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових праць, із них - 7 статей у фахових наукових журналах, та тези 7 доповідей у збірниках матеріалів з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який нараховує 163 найменувань, та 3 додатків. Загальний обсяг дисертації складає 156 сторінок машинописного тексту. Ілюстративний та числовий матеріал дисертації подано у вигляді 56 рисунків і 5 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використовували C-модуль TyrRS та ЕМАР ІІ, експресовані у клітинах E. coli та очищені до гомогенного стану (>95%) за допомогою афінної хроматографії на Ni-NTA-агарозі за схемою, описаною раніше (Дубровский и др., 1998).

Сайт-спрямований мутагенез залишку Phe127 на Тrp127 С-модуля проводили за допомогою методу Quick-Change (“Stratagene”, США) з використанням праймерів F488WS (5’-caagaagaaagtctgggagaaattgcaggc-3’) та F488WAs (5’-caagaagaaagtctgggagaaattgcaggc-3’) (“Sigma-Proligo”, Німеччина).

В експериментах використовували препарат тРНКPhe з дріжджів (“Sigma”, США).

Гель-електрофорез білків у денатуруючих умовах проводили згідно методу Леммлі (Laemmli, 1970).

Концентрації білків та тРНКPhe визначали спектрофотометрично, використовуючи відповідні коефіцієнти їхньої екстинкції. Вимірювання спектрів УФ- поглинання здійснювали за допомогою спектрофотометрів Specord UV VIS (Німеччина) та Cary 4000 UV-Vis (США) у кварцевих прямокутних кюветах.

Спектри флуоресценції реєстрували на спектрофлуориметрах Hitachi Model 850 (Японія), Cary Eclipse (Австралія) і FluoroLog-3 (Jobin-Yvon Horiba, Японія). Отримані спектри випромінювання корегували на Раманове розсіяння, ефекти внутрішнього фільтру та розведення зразків.

Часороздільні флуоресцентні вимірювання проводили в режимі підрахунку поодиноких фотонів за допомогою Ті-сапфірового лазера (Tsunami, Spectra-Physics, США). Аналіз отриманих даних затухання інтенсивності флуоресценції здійснювали за допомогою комерційної програми Pulse5 (Livesey et al., 1987).

Для визначення експонованості Trp144 та Trp125 у білковій глобулі С-модуля та ЕМАР ІІ відповідно використовували явище гасіння власної флуоресценції білків акриламідом та іонним гасником Cs+ (Lakowicz, 1999). Величину гасіння флуоресценції характеризували співвідношенням (?I/I0)·100%, де ?I=I0–I – зменшення інтенсивності флуоресценції в присутності гасника при концентрації 0,3 М, I0 – власна інтенсивність флуоресценції білка у відсутності гасника.

Характеристику динамічних властивостей мікрооточення залишку Trp144 в С-модулі та Trp125 в ЕМАР ІІ здійснювали методом крайового зсуву флуоресценції. Для цього визначали залежності максимуму емісії флуоресценції білка від довжини хвилі збудження в температурному діапазоні 20-60oC; збудження флуоресценції здійснювали в інтервалі 290 - 304 нм. Величину крайового зсуву флуоресценції визначали як ?? = ?максзб304 – ?максзб290 (?максзб304 , ?максзб290– положення максимуму спектра флуоресценції при довжині хвилі збудження 304 та 290 нм, відповідно).

Розрахунки параметрів зв'язування досліджуваних білків з нуклеїновою кислотою здійснювали на основі даних флуоресцентної спектроскопії, як описано в роботі (Roy, 2004), з використанням програми Math Cad2001 Professional.

Спектри КД С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ записували на спектрофотометрі Olis RSM-1000 (США). Реєстрацію УФ-спектрів білків проводили в 20 мМ Na-фосфатному буферному розчині (pH 7,5), що містив 100 мМ NaCl, в діапазоні довжин хвиль 190-240 нм та інтервалі температур 20-55оС, використовуючи кварцову кювету з довжиною оптичного шляху 0,1 см. Кількісний вміст елементів вторинної структури білків проводили за допомогою програм ContinLL, SELCON та K2D з використанням веб-серверу Dichroweb ().

Для проведення розрахунків методом МД С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ використано просторову модель С-модуля cm5 (Одинець та ін., 2003) та кристалічну структуру ЕМАР ІІ (PDB ID: 1EUJ_A). Розрахунок проводили, використовуючи програму GROMACS за загальним протоколом.

Модель тривимірної структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНКPhe люб’язно надана к.б.н. Д. Б. Ковальським.

Візуалізацію та аналіз тривимірної структури білків та тРНК проводили використовуючи програму SwissPDB-Viewer 3.7(b2).

Результати досліджень та обговорення.

Характеристика власної флуоресценції триптофану в структурі С-модуля TyrRS і ЕМАР ІІ та аналіз структурного оточення Trp144 та Trp125. С-модуль TyrRS та ЕМАР ІІ містять у своїх структурах природні флуоресцентні зонди Trp144 та Trp125 (рис. 1), відповідно, що дає можливість досліджувати структурні та молекулярно-динамічні властивості цих білків.

Рис. 1. Тривимірна структура С-модуля TyrRS B. taurus (модель cm5) (а) та ЕМАР ІІ (PDB ID: 1EAJ_A) (б)

Для отримання інформації про локалізацію цих хромофорів у білковій глобулі проаналізовано параметри їхньої флуоресценції при 20оС. Для С-модуля TyrRS положення максимуму спектра флуоресценції (?максзб296) Trp144 при довжині хвилі збудження 296 нм (умова збудження триптофанової флуоресценції) складає 327 нм; ширина спектра випромінювання при ? максимальної інтенсивності (??спектра) – 49 нм. Отримані дані свідчать про екранований стан залишку Trp144 в білковій глобулі згідно моделі Бурштейна (Reshetnyak et al., 2001) та узгоджуються з отриманими нами даними комп’ютерного аналізу моделі сm5 С-модуля, згідно яких величина доступності Trp144 молекулам розчинника становить 1-2%. Для ЕМАР ІІ параметри флуоресценції Trp125 становлять: ?максзб296 = 335 нм; ??спектра = 57 нм, що свідчить про частково експонований характер Trp125 молекулам розчинника згідно (Reshetnyak et al., 2001) та корелює з розрахованою величиною доступності поверхні Trp125 молекулам розчинника (10 ± 1%) в кристалічній структурі ЕМАР ІІ.

Інформацію про експонованість Trp144 в С-домені та Trp125 в ЕМАР ІІ молекулам розчинника та про конформаційну динаміку досліджуваних білків в наносекундному діапазоні отримано за допомогою методу гасіння триптофанової флуоресценції зовнішніми гасниками (акриламідом та іонами Cs+) (рис.2).

Для С-модуля TyrRS величина гасіння флуоресценції Trp144 акриламідом та іонами цезію становить ~38% і ~1%, відповідно (рис. 2 а). Оскільки іони Cs+ гасять флуоресценцію переважно експонованих залишків триптофану, то відсутність гасіння флуоресценції Trp144 цим гасником свідчить про внутрішню локалізацію Trp144 в білковій глобулі. Проте, цей залишок триптофану є доступним для акриламіду. Оскільки акриламід проникає всередину білкової глобули внаслідок динамічних флуктуацій конформації білка (Lakowicz, 1999), то дані гасіння флуоресценції Trp144 акриламідом свідчать про наявність швидкої внутрішньомолекулярної динаміки досліджуваного білка в наносекундному часовому діапазоні.

Для ЕМАР ІІ: величина гасіння флуоресценції Trp125 іонами Cs+ становить ~11% (рис. 2 б), що свідчить про часткове експонування Trp125 молекулам розчинника та корелює з даними молекулярного моделювання. Експериментально отримана величина гасіння флуоресценції Trp125 акриламідом (~54%) (рис. 2 б) свідчить про дифузію акриламіду всередину білкової матриці ЕМАР ІІ внаслідок флуктуацій в наносекундному часовому інтервалі.

Рис. . Графік Штерна-Фольмера гасіння флуоресценції С-модуля TyrRS (а) та ЕМАРІІ (б) іонами Cs+ (1) та акриламідом (2) при 20оС. Білки знаходились в 20 мM трис-HCl буфері, pH 7,5, що містив 150 мM NaCl. Iо та І – власна інтенсивність флуоресценції білка без та в присутності гасника відповідно, при довжині хвилі збудження 296 нм

Температурно-індуковані конформаційні зміни мікрооточення Trp144 С-модуля TyrRS та Trp125 ЕМАР ІІ. З метою дослідження внутрішньомолекулярної стабільності С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ ми проаналізували параметри флуоресценції Trp144 та Trp125, відповідно, в діапазоні температур 20-60оС (рис. 3). Для Trp144 C-модуля положення максимуму спектра флуоресценції (?макс) залежить від температури (рис. 3 а), що супроводжується зменшенням квантового виходу флуоресценції при підвищенні температури. В діапазоні температур 20-37оС ?макс зміщується на 3±0,3 нм в довгохвильову область (рис. 3 а), що вказує на мінорні конформаційні зміни мікрооточення Trp144, обумовлені збільшенням його рухливості при 37оС порівняно з 20оС. Основний конформаційний перехід Trp144 із зануреного в білкову глобулу нативного стану в полярне оточення розчинника зафіксовано в діапазоні температур 37-52oC, що обумовлює зміщення ?макс до 348,5±0,5 нм при 52оС. Для Trp125 ЕМАР ІІ аналіз температурної залежності положення максимуму спектра його флуоресценції (рис. 3 б) виявляє, що в діапазоні температур 20–30оС конформація локального оточення Trp125 є стабільною. При підвищенні температури до 37оС ?макс Trp125 становить 3421 нм, що свідчить про збільшення експонованості цього флуорофору молекулам розчинника, порівняно з температурою 20оС. Подальше підвищення температури до 45оС призводить до зсуву ?макс до 3491 нм, що обумовлено втратою стабільного мікрооточення Trp125 та його виходом в водне оточення.

Важливо зазначити, що виявлені конформаційні переходи залишків триптофану не супроводжуються зміною вторинної структури білків. Про це свідчить розрахований за даними КД кількісний вміст елементів вторинної структури С-модуля та ЕМАР ІІ, який практично не змінюється при 20-54оС.

а | б

Рис. . Залежність положення максимуму (?макс) спектра флуоресценції (1) та величини ефекту крайового зсуву (2) від температури для С-модуля (а) та ЕМАР ІІ (б) в 20 мM трис-HCl, pH 7,5 буфері, що містив 150 мM NaCl. Довжина хвилі збудження для залежності ?макс від температури становила ?зб нм

Динамічні властивості мікрооточення залишку в Trp144 С-модулі та Trp125 в ЕМАР ІІ. Для характеристики динамічних властивостей мікрооточення залишку Trp144 в С-модулі та Trp125 в ЕМАР ІІ та конформаційних змін даних білків використовували в обох випадках метод крайового зсуву флуоресценції. Виявлено, що зі збільшенням довжини хвилі збудження максимум спектра флуоресценції Trp144 С-модуля та Trp125 ЕМАР ІІ при 20оС зміщується в довгохвильову область спектра (рис. 3). Це свідчить про відсутність швидкої структурної релаксації мікрооточення залишку Trp144 та Trp125 при 20оC, жорсткість мікрооточення цих флуорофорів при даній температурі та екранування залишків триптофанів від швидкорелаксуючого водного оточення. Отже, час дипольної релаксації оточення Trp144 та Trp125 є меншим, ніж час життя збудженого стану флуорофора. При підвищенні температури величина ефекту крайового зсуву флуоресценції зменшується і практично зникає при 52оС для Trp144 С-модуля (рис. 3 а, 2) та при 45оС для Trp125 ЕМАРІІ (рис. 3 б, 2), що свідчить про руйнацію специфічного мікрооточення відповідних залишків триптофану при цих температурах. Таким чином, флуоресценція Trp дозволила зареєструвати конформаційні зміни в С-модулі та ЕМАР ІІ, індуковані температурою, та зафіксувати, що вони є різними в цих двох високогомологічних білках.

Дослідження вторинної структури С-модуля TyrRS та ЕМАР II методом КД. Оскільки на сьогоднішній день є експериментальні дані про структуру С-модуля тільки для TyrRS людини, нами було отримано інформацію про вторинну структуру С-модуля Bos taurus за допомогою методу КД. Методом КД також проаналізовано вторинну структуру ЕМАР ІІ.

На основі отриманих КД-спектрів досліджених білків розраховано кількісний вміст елементів їхньої вторинної структури (табл.1) та показано його чітку кореляцію як із даними моделювання для С-модуля TyrRS Bos taurus (cm5) , так і з експериментальними даними рентгеноструктурного аналізу для ЕМАР ІІ з урахуванням похибки розрахунку елементів вторинної структури (± 5%).

Таблиця 1

Вміст елементів вторинної структури С-модуля TyrRS та ЕМАР II, %

Молекулярна динаміка С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ. Для моделювання механізму взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК необхідно мати чітке уявлення про конформаційну рухливість нативної форми білка. З цією метою нами проведено розрахунок МД С-модуля (модель сm5) та ЕМАР ІІ (1EUJ_A) при температурі 25оС та при фізіологічній температурі 37оС. В цілому динаміка С-модуля та ЕМАР ІІ при цих температурах є стабільною, за винятком високої рухливості петлевих ділянок та ?-спіралей, до складу яких входить Phe127 та Trp125, відповідно, що супроводжується перепакуванням структури цих -спіралей та їхнім подовженням (рис. 4). Слід зазначити, що при 37оС нами виявлено високу рухливість залишків Trp125 ЕМАР ІІ та Phe127 С-модуля, що не спостерігалося при 25оС. Отже, дані МД добре корелюють з отриманими даними флуоресцентної спектроскопії для Trp125 ЕМАР ІІ щодо локального конформаційного переходу залишку Trp125.

а |

б | Рис. 4. а- Суперпозиція cm5-моделі та МД-структури С-модуля TyrRS, та подовження ?-спіралі (Val126-Gln131) на три амінокислотні залишки Lys125, Ala132, Asp133. б - Суперпозиція крис-талічної структури (1EUJ_A) та МД-структури ЕМАР ІІ, і подовження ?-спіралі (Ile124-Gln129) на амінокислотні залишки Lys121, Lys122, Lys123

Вивчення тРНК-зв’язувальних властивостей С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ. Відомо, що залишок Trp125 належить до РНК-зв’язувального центру ЕМАР ІІ. Як показано вище, при 37оС відбувається конформаційний перехід в оточенні Trp125, який супроводжується частковою експонованістю цього триптофану молекулам розчинника. Оскільки відомо, що білки, які містять ОВ-фолд та зв'язують нуклеїнові кислоти, як правило, мають у структурі РНК-зв'язувальних центрів консервативні ароматичні залишки, які є функціонально необхідними для формування комплексів білків з РНК (Theobald et al., 2003), ми припустили, що виявлений конформаційний перехід Trp125 може бути функціонально необхідним для подальшої взаємодії з РНК. Така взаємодія може здійснюватися за різними молекулярними механізмами, наприклад, шляхом інтеркаляції ароматичного залишку триптофану між азотистими основами в структурі тРНК чи формуванням стекінгових комплексів без інтеркаляції. Ймовірно, що С-модуль та ЕМАР ІІ взаємодіють з тРНК за подібними механізмами, а консервативний ароматичний залишок Phe127 С-модуля, еквівалентний Trp125 в ЕМАР ІІ, може брати участь у комплексоутворенні з тРНК. Для визначення параметрів зв'язування С-модуля з тРНКPhe, нами було проведено флуориметричне титрування розчину білка тРНКPhe. Виявлено, що залишок Trp144 у структурі С-модуля не є чутливим до утворення комплексу С-модуля з тРНКPhe (рис. 5), що, ймовірно, обумовлено його локалізацією поза РНК-зв’язувальним сайтом у структурі білка.

Рис. . Флуориметричне титрування розчину С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ тРНКPhe при 20оС. Білки та тРНК знаходилися в 20 мM трис-HCl, pH 7,7 буфері, що містив 100 мМ NaCl, 5мМ MgCl2. Довжина хвилі збудження становила lзб нм. Концентрація С-модуля із заміною Phe127>Trp становила 1 мкМ, ЕМАР ІІ – 3 мкМ

-о- - С-модуль із заміною Phe127>Trp

- ЕМАР ІІ, - С-модуль

Сайт-спрямований мутагенез Phe127>Trp в РНК-зв'язувальному центрі С-модуля TyrRS. Методами сайт-спрямованого мутагенезу консервативний аромати-чний залишок Phe127 в РНК-зв'язувальному центрі С-модуля заміщено нами на флуорофор Trp127 (рис. 6). Ефективність проведення сайт-спрямованого мутагенезу було перевірено за допомогою секвенування плазмідної ДНК.

Характеристика власної флуоресценції мутантного С-модуля TyrRS із зміною Phe127>Тrp127. На рис. 7 (крива 2) наведено спектр триптофанової флуоресценції С-модуля із заміною Phe127>Тrp127. Положення максимуму спектра флуоресценції мутантного С-модуля становить 332 нм і є суттєво зміщеним в довгохвильову спектральну область порівняно з нативним С-модулем (327 нм) (крива 1), що обумовлено внеском залишку Тrp127. Введення флуорофора Тrp127 призводить також до зростання квантового виходу флуоресценції білка (від 0,09 для нативного С-модуля до 0,298 для С-модуля із заміною Phe127>Trp), що обумовлено додатковим внеском залишку Тrp127 в загальну емісію білка.

Визначення параметрів зв’язування С-модуля (Phe127>Trp) з тРНКPhe та ЕМАР ІІ з тРНКPhe. На основі отриманих експериментальних даних зміни власної триптофанової флуоресценції С-модуля (Phe127>Trp) ТyrRS та ЕМАР ІІ при титруванні тРНКPhe (рис. 5) були розраховані параметри зв'язування цих білків з тРНК. Константа дисоціації комплексу (Кд) С-модуля з тРНКPhe складає 2,9·10-8 М, стехіометрія комплексу n=1,2; для комплексу ЕМАР ІІ з тРНКPhe – Кд= 3,4·10-7 М, n=1,3. Незмінне положення максимуму спектра флуоресценції як С- модуля ТyrRS,

Рис. 6. Тривимірна структура С-модуля TyrRS із заміною Phe127>Тrp |

Рис. 7. Спектр флуоресценції С-модуля TyrRS (1) та С-модуля TyrRS із заміною Phe127>Тrp (2) при ?зб=296 нм. Білки знаходилися в 20 мM трис-HCl, pH 7,5 буфері, що містив 150 мM NaCl; концентрація білків становила 5 мкМ

так і ЕМАР ІІ, при титруванні тРНКPhe з високою вірогідністю свідчить про відсутність інтеркаляції ароматичних залишків триптофану в структуру тРНК при формуванні комплексів. Отже, зміна інтенсивності флуоресценції при взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК може бути обумовлена іншим механізмом, який, ймовірно, включає специфічні конформаційні зміни в мікрооточенні Trp, що індукуються нуклеїновою кислотою при утворенні комплексу.

Аналіз флуоресцентного перенесення енергії із залишку Trp144 С-модуля TyrRS на Y-нуклеозид тРНКPhe. Нами досліджена можливість флуоресцентного перенесення енергії від Trp144 С-модуля до Y-нуклеозиду тРНКPhe, який локалізований в антикодоновій петлі: це дозволило оцінити відстань між цими флуорофорами. Виявлено, що параметри спектрів флуоресценції та збудження тРНКPhe не змінюються в присутності С-модуля: це свідчить про відсутність перенесення енергії з Trp144 білка на Y-нуклеозид тРНКPhe. Оскільки характеристичний радіус Ферстера для даної донорно-акцепторної пари становить 1,4 нм, то відсутність перенесення енергії свідчить про те, що залишок Trp144 та Y-нуклеозид знаходяться на відстані r>1,4 нм, що добре узгоджується з моделлю комплексу, згідно з якою С-модуль TyrRS взаємодіє в області акцепторного стебла та D-петлі тРНК (рис. 8). |

Рис. 8. Модель структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНКPhe

Дослідження конформаційної рухливості С-модуля, ЕМАР ІІ та їхніх комплексів із тРНК методами часороздільної флуоресцентної спектроскопії. З метою виявлення конформаційних змін С-модуля та ЕМАР ІІ при взаємодії з тРНК та встановлення функціональної ролі їхніх консервативних ароматичних залишків Trp127 та Trp125, відповідно, при утворенні комплексу з тРНК, нами було охарактеризовано затухання інтенсивності флуоресценції цих хромофорів у вільному стані та в присутності тРНКPhe. Отримані параметри затухання флуоресценції Trp144 С-модуля при 20 оС (табл.2) залишаються незмінними при утворенні комплексу цього білка з тРНК, що корелює з даними моделювання про локалізацію даного залишку поза сайтом зв’язування тРНК. Для С-модуля із заміною Phe127>Trp та його комплексу з тРНКРhе параметри затухання флуоресценції відрізняються (табл.2) та характеризуються появою додаткової короткоживучої компоненти в присутності нуклеїнової кислоти (рис. 9). Ця компонента зумовлена гасінням флуоресценції саме залишку Trp127, оскільки параметри затухання Trp144 залишаються незмінними в присутності нуклеїнової кислоти. Для Trp125 в ЕМАР ІІ виявлено аналогічну додаткову короткоживучу компоненту в присутності тРНК (рис. 10, табл. 2).

Рис. 9. Розподіл часів життя флуоресценції С-модуля із заміною Phe127>Trp у вільному стані (__) та в присутності тРНКPhe (- -)при 20оС |

Рис. 10. Розподіл часів життя флуоресценції Trp125 ЕМАР ІІ у вільному стані (__) та в присутності тРНКPhe (- -) при 20оС

Наявність короткоживучої компоненти лише для ~20% залишків триптофанів С-модуля та ~30% Trp125 ЕМАР ІІ свідчить про гетерогенність “популяцій” триптофанів в структурі досліджуваних комплексів цих білків з тРНК, що може бути пояснено динамічним механізмом взаємодії білка з нуклеїновою кислотою, для якого не існує єдиної унікальної конформації білка та єдиного механізму його взаємодії з тРНК. Слід зазначити, що поява короткоживучої компоненти зумовлена гасінням флуоресценції Trp127 та Trp125 безвипромінювальним шляхом, при формуванні комплексів білків з тРНК. Це можна пояснити як стекінгом залишку Trp з нуклеотидами тРНКPhe, так і конформаційними змінами у структурі цих білків, зумовленими їхньою взаємодією з тРНК. Такі зміни можуть призвести до появи нових ротамерних форм триптофанів, що супроводжуватиметься зменшенням відстані між флуорофором і гасником, та до гасіння триптофанової флуоресценції

Таблиця 2

Параметри затухання флуоресценції С-модуля TyrRS, С-модуля TyrRS із заміною Phe127>Trp та ЕМАР ІІ у вільному стані та в присутності тРНКPhe при 20оС

Примітка. У цій таблиці ?і – час життя флуоресценції, нс, ?і – амплітуда компонентів, fi - фракційний внесок кожного часу життя у інтенсивність стаціонарної флуоресценції.

безвипромінювальним шляхом та виникнення короткоживучої компоненти із субнаносекундним часом життя флуоресценції. Для перевірки такої можливості нами проаналізовано мікрооточення Trp127 С-модуля та Trp125 ЕМАР ІІ згідно їхніх тривимірних структур і виявлено можливість виникнення ротамерів цих ароматичних залишків та ймовірні гасники флуоресценції Trp127 С-модуля - Gln131, Cys63 та Cys81; та флуоресценції Trp125 ЕМАР ІІ - Cys65, Cys83.

Аналіз структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНКPhe. Аналіз моделі структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНКPhe дозволив виявити ймовірну РНК-зв’язувальну поверхню С-модуля та ділянки тРНК, що взаємодіють з С-модулем: акцепторне стебло (G1, C70, G71, C72, G71, A5, U7), T-стебло (C63, A64, A62), Т-петля (C61), D-петля (A14, G15, dHU16) та D-стебло (C13). Побудована модель комплексу узгоджується з отриманими нами даними флуоресцентної спектроскопії, згідно яких залишок Trp144 знаходиться поза РНК-зв'язувальним центром С-модуля, а залишок Trp127 приймає участь у взаємодії з тРНК.

Отримані нами результати часороздільної флуоресцентної спектроскопії при дослідженні комплексу С-модуля з тРНКPhe, а саме - появу короткоживучої компоненти з часом життя флуоресценції Trp127 0,09 нс, яка виникає внаслідок безвипромінювального гасіння триптофанової флуоресценції, можна пояснити на основі запропонованої моделі структури цього комплексу. Виявлено, що таке гасіння флуоресценції може здійснюватися шляхом передачі електрону збудженого стану від Trp127 С-модуля в комплексі з тРНКPhe на С=О групу Glu128 за рахунок стабілізації положення цієї карбоксильної групи (рис. 11) чотирма водневими зв’язками, в тому числі з атомами О2’ рибози та N3 аденозину А5 в акцепторному стеблі тРНК.

Рис. 11. Водневі зв’язки (пунктир), що формуються залишком Glu128 С-модуля в комплексі з тРНКPhe

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі вивчено внутрішньомолекулярну конформаційну рухливість та РНК-зв’язувальні властивості С-модуля тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ. Проаналізовано можливі механізми взаємодії цих білків з тРНК та їхні конформаційні зміни при комплексоутворенні.

1. Встановлено внутрішньомолекулярну локалізацію залишку Trp144 в просторовій структурі С-модуля та виявлено швидку конформаційну рухливість мікрооточення Trp144 в наносекундному часовому інтервалі.

2. Mоніторинг залежних від температури конформаційних змін С-модуля з використанням флуоресценції Trp144 виявив конформаційний перехід мікрооточення Trp144 в діапазоні температур 37-52оС, який характеризується виходом Trp144 із зануреного всередину глобули стану до стану, експонованого до швидкорелаксуючого полярного розчинника.

3. Методами флуоресцентної спектроскопії показано, що Trp125 EMAP II є частково експонованим до розчинника при 37оС, а його повний вихід у швидкорелаксуюче водне оточення здійснюється при 45оС.

4. Методами білкової інженерії отримано С-модуль TyrRS із заміною Phe127 на флуорофор Trp127. Досліджено формування комплексів С-модуля і ЕМАР ІІ з тРНК та визначено параметри зв’язування тРНК з білками в цих комплексах. Показано, що на відміну від Trp144 С-модуля, Trp125 EMAP II та Trp127 мутантного С-модуля залучені до взаємодії з тРНК.

5. Аналіз даних флуоресцентного перенесення енергії між флуорофором Trp144 С-модуля та Y-нуклеозидом тРНКPhe вказує на віддаленість Trp144 від Y-нуклеозида на r>1,4 нм, що узгоджується з моделлю тривимірної структури комплексу, в якій С-модуль TyrRS взаємодіє в області акцепторного стебла та D-петлі тРНК.

6. Порівняльний аналіз параметрів затухання флуоресценції вільного С-модуля та його комплексу з тРНК дозволив виявити додаткову короткоживучу компоненту триптофанової флуоресценції в присутності тРНК, яка, ймовірно, обумовлена конформаційними змінами білка. Аналіз запропонованої моделі комплексу свідчить, що механізм гасіння флуоресценції Trp127 може бути обумовлений стабілізацією карбоксильної групи Glu128 за рахунок формування цим залишком нових водневих зв’язків при взаємодії з тРНК.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кордыш М.А., Одынец К.А., Корнелюк А.И. Trp144 как флуоресцентный зонд для изучения конформационной подвижности С-модуля эукариотической тирозил-тРНК синтетазы // Біополімери і клітина.–2003.–Т. 19, № 5.–С. 436-439. Особистий внесок здобувача: автором охарактеризовано та проаналізовано мікрооточення залишку Trp144, виявлена його швидка конформаційна рухливість за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії та комп’ютерного моделювання.

2. Кордыш М.А., Корнелюк А.И. Флуоресценция и динамика структурного окружения флуорофора Trp125 в цитокине EMAP II // Вестник Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина.: Биофизический вестник.–2003.–Т.2, №13.–С.86-90. Особистий внесок здобувача: охарактеризовано мікрооточення залишку Trp125 та степінь доступності поверхні даного залишку молекулам розчинника на основі власноруч отриманих даних флуоресцентної спектроскопії та комп’ютерного моделювання.

3. Кордыш М.А., Корнелюк А. И. Мониторинг конформационного изменения окружения флуорофора Trp144 в С-модуле тирозил-тРНК синтетазы при тепловой денатурации // Доповіді НАН України.–2004.–№1.- С. 156-161. Особистий внесок здобувача: проведено та проаналізовано температурно індуковане гасіння флуоресценції Trp144.

4. Кордиш М.О., Дубровський О.Л., Корнелюк О.І. Локальний конформаційний перехід флуорофора Trp125 в цитокіні EMAP II, індукований фізіологічною температурою // Фізика живого. - 2005. – Т. 13, №1. – С. 79-85. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано ефект крайового зсуву флуоресценції Trp 125 EMAP II при тепловій денатурації.

5. Kordysh M., Kornelyuk A, Conformational flexibility of cytokine-like C-module of tyrosyl-tRNA synthetase monitored by Trp144 intrinsic fluorescence // J. Fluoresc. – 2006. – Vol. 16 – P. 705-711. Особистий внесок здобувача: проведено експресію С-модуля TyrRS; отримано та проаналізовано: параметри флуоресценції Trp144, дані гасіння флуоресценції білка зовнішніми гасниками, дані температурно-індукованих конформаційних змін мікрооточення Trp144 методом крайового зсуву флуоресценції.

6. Кордиш М.О., Корнелюк О.І. Вивчення взаємодії С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методами флуоресцентної спектроскопії // Біополімери і клітина.–2006.–Т. 19, № 5.–С. 436-439. Особистий внесок здобувача: за безпосередньої участі автора проведено сайт-спрямований мутагенез Phe127 на Trp127 С-модуля, експресію та очистку даного білка, визначено параметри зв’язування комплексу С-модуля з тРНКPhe.

7. Кордиш М.О., Кирюшко Г.В., Мелі І., Корнелюк О.І. Дослідження конформаційної рухливості С-модуля тирозил-тРНК синтетази та його комплексу з тРНК методами часороздільної флуоресцентної спектроскопії // Біополімери і клітина. –2007. –Т. 23, № 2.– С. 130-136. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано параметри затухання флуоресценції С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ без та в присутності тРНКPhe.

8. Кухар М.О., Одинець К.О., Корнелюк О.І. Флуоресценція Trp144 як зонд для вивчення конформаційної динаміки С-кінцевого цитокіноподібного модуля еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази // Тези доповідей: ІІІ З’їзд Українського біофізичного товариства. – Львів. - 2002. - С. 59. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано температурну залежність триптофанової флуоресценції С-модуля.

9. Kordysh M., Kornelyuk A. Fluorescence spectroscopic study of the conformational changes in EMAP II cytokine // Abstract book: Conference for Students, PhD-students and young scientists on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine. – Kyiv.- 2003.–P. 84. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано спектри флуоресценції Trp125 ЕМАР ІІ при тепловій денатурації.

10. Kordysh M., Kornelyuk A. Monitoring of temperature-induced conformational changes of a Trp 144 microenvironment in cytokine-like C-module of mammalian tyrosyl-tRNA Synthetase // Abstract book: 5th International Conference on Biological Physics. - Gothenburg, Sweden. -2004. - P.99. Особистий внесок здобувача: автором проведено моніторинг температурно-індукованих конформаційних змін С-модуля, використовуючи власну флуоресценцію Trp144.

11. Кордиш М.О., Корнелюк О.І. Локальний конформаційний перехід та експонування Trp125 в цитокіні ЕМАР ІІ при фізіологічній температурі // Тези доповідей: Перша Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”. – Харків.- 2004.- С.31. Особистий внесок здобувача: методами флуоресцентної спектроскопії виявлено локальний конформаційний перехід залишку