ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

КОЧЕШКОВА НАТАЛІЯ СЕРГІЇВНА

УДК 612.016.2.015.7

ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ВЛАСТИВОСТІ

ІОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ АТР-ГІДРОЛАЗ СПЕРМАТОЗОЇДІВ ЧОЛОВІКІВ

ЗА УМОВ ОЛІГОЗООСПЕРМІЇ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник — доктор біологічних наук, професор

ВОРОБЕЦЬ Зіновій Дмитрович,

Львівський національний

медичний університет

імені Данила Галицького,

завідувач кафедри медичної біології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

СТОЙКА Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції

проліферації клітин і апоптозу;

доктор біологічних наук, професор

ОСТАПЧЕНКО Людмила Іванівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії,

декан біологічного факультету.

Захист відбудеться “  ” грудня 2007 р. о 10 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .368.01 в Інституті біології тварин УААН (79034 м. Львів, вул. Стуса, 38).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “ 16 ” листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої радиО. І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Питання репродуктивного здоров’я населення сьогодні є особливо актуальним, оскільки число бездітних шлюбів постійно зростає. В Україні 10–15сімей є безплідними (Статистичний щорічник України, 2004 р). Причиною цього у 40–60випадків є порушення статевої функції чоловіків, зокрема олігозооспермія — зниження вмісту сперматозоїдів в еякуляті менше 60 млн/мл (Нишлаг Э. и др., 2005).

Важливим показником функціонального стану сперматозоїдів є іонний гомеостаз. У спермальних мембранах наявні декілька АТРазних систем: Са2+,2+-, Na+,+-, “базальна” Mg2+-АТРази плазматичної мембрани (ПМ) (Wooet2000), Н+-АТРаза мітохондрій (МХ) (Halangket1985), Са2+,2+-АТРаза ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) (Dorvalet2002). Порушення їх функціонування призводить до пригнічення процесу Капа-цитації, акросомної реакції, зниження рухливості клітин (Schuhet2004).

Численні функції сперматозоїдів також опосередковуються оксидом азоту (NO) та його стабільними метаболітами, які виступають модуляторами їх рухливості, стійкості до змін умов середовища тощо (Wuet2004). Зміни їх концентрацій корелюють із розвитком багатьох патологічних станів, зокрема астено- та тератозооспермій (Ozbeyet2002).

Каліксарени (макроциклічні олігомери фенолів) здатні утворювати комплекси з молекулами та іонами (Doddset al., 2005), що обумовлює їх вплив на активність АТРазних систем у певних тканинах, зокрема, в міометрії матки (Векліч Т. О. та ін., 2005). Питання впливу цих сполук на АТРазні системи у сперматозоїдах є мало вивченим, а вирішення його особливо актуальним.

Згідно офіційних статистичних даних майже у 30випадків причина чоловічого безпліддя залишається не встановленою (Нишлаг Э., 2005). Тому існує необхідність створення нових чутливих методів діагностики, що дозволить проводити ефективніше лікування даних патологій.

Вивчення особливостей функціонування АТР-гідролазних систем сперматозоїдів, їх ролі в розвитку олігозооспермії дозволить поглибити знання про механізми іонного гомеостазу в сперматозоїдах, особливості розвитку патологічних станів чоловічої репродуктивної системи, створить теоретичні основи для розробки нових методів їх діагностики, лікування та профілактики.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у рамках двох тем: “Роль іонів кальцію, калію, натрію і транспортних АТФаз у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів” (шифр державної реєстрації № U024411) та “Регуляторна роль іонів кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин” (шифр теми: ІН.07.00.0001.04) в якій автор вивчала особливості функціонування АТР-гідролаз сперматозоїдів у нормі та при олігозооспермії.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було: на інтактних та пермеабілізованих сперматозоїдах чоловіків ідентифікувати АТР-гідролазні активності іон-транспортувальних систем, що мають зовнішньо- та внутрішньоклітинну локалізацію активних центрів, провести дослідження особливостей їх функціонування в нормі та при олігозооспермії, а також встановити зміни концентрації нітритів при розвитку даної патології.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1.  Вивчити морфологічні та фізико-хімічні особливості еякуляту і сперматозоїдів чоловіків у нормі та при олігозооспермії.

2.  Підібрати оптимальні умови для визначення “екто”- та “ендо”-АТРазних ферментативних активностей у сперматозоїдах.

3.  Ідентифікувати та вивчити зміни ферментативних активностей Са2+-залежних та Са2+-незалежних “ендо”-АТРазних систем сперматозоїдів у нормі та при олігозооспермії, із використанням селективних інгібіторів.

4.  Дослідити вплив макроциклічних сполук — каліксаренів С-97, С-99 та С-107 на Na+, K+-АТРазну активність сперматозоїдів.

5.  Вивчити зміни концентрації нітритів за умов деяких патологічних станів чоловічої репродуктивної системи.

6.  Розробити біохімічний тест на наявність олігозооспермії.

Об’єкт дослідження. Функціонування іон-транспортувальних АТР-гідролазних систем у сперматозоїдах чоловіків.

Предмет дослідження. Роль Са2+-залежних та Са2+-незалежних АТРазних систем із зовнішньо- та внутрішньоклітинною орієнтацією їх активних центрів у сперматозоїдах чоловіків при олігозооспермії.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети використовувались методи препаративної біохімії (одержання відмитих від плазми еякуляту сперматозоїдів), ензимології (визначення АТРазної активності сперматозоїдів), спектрофотометрії (вимірювання вмісту неорганічного Рі та концентрації білка), лазерно-кореляційної спектроскопії (ЛКС, визначення ефективного гідродинамічного діаметру та швидкості руху сперматозоїдів), світлової (встановлення показників якості сперми) та електронної мікроскопії (морфометричні дослідження), хімічної та біохімічної кінетики (визначення ефективності впливу ефекторів на АТРазну активність), статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексні дослідження з вивчення особливостей функціонування Са2+-залежних та Са2+-незалежних “ендо”-АТРаз сперматозоїдів чоловіків у нормі та при олігозооспермії. Виявлені зміни ферментативних активностей сперматозоїдів чоловіків при олігозооспермії, відносно фізіологічного стану розширюють уявлення про роль іон-транспортувальних АТРазних систем у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів та механізми розвитку чоловічого безпліддя.

Вперше досліджено вплив циклічних олігомерів фенолів — каліксаренів (С-97, С-99, С-107) на Na+, K+-АТРазну активність сперматозоїдів. Показано, що каліксарени С-97 та С-107 є ефективнішими, ніж уабаїн, селективними, високоафінними інгібіторами активності даної ферментативної системи.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, за допомогою методів електронної мікроскопії, ЛКС та ензимології, ефективність пермеабілізації спермальних мембран детергентом сапоніном. Модель перфорованих сперматозоїдів є зручним об’єктом для тестування впливу нових ефекторів АТРазних систем.

Розроблено, із залученням селективних та неселективних інгібіторів АТР-гідролазних систем (уабаїн, тапсигаргін, NaN3, LaCl3, п-ХМБ, о-ванадат, еозиноптимальні умови тестування “екто”- та “ендо”-АТРазних активностей у чоловічих гаметах. Запропонована методологія є перспективною для проведення досліджень властивостей, механізмів регуляції та функціональної ролі мембранозв’язаних АТР-гідролаз сперматозоїдів чоловіків.

Зниження еозинчутливої АТРазної активності сперматозоїдів при олігозооспермії у 2,5–3 рази відносно нормоспермії, може слугувати основою для розробки стандартизованого методу діагностики даного захворювання.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка самостійно опрацювала літературу за темою дисертаційної роботи, виконала експериментальну частину, за винятком методів електронної мікроскопії (виконано спільно з к. б. н. О. Р. Кулачковським на базі міжфакультетської лабораторії електронної мікроскопії, Львівського національного університету ім. І. Франка) та ЛКС (виконано спільно з к. ф.-м. н. В. Ф. Горчевим на базі лабораторії оптичних методів дослідження, Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна). Частина досліджень з вивчення АТРазних систем була виконана дисертанткою у відділі біохімії м’язів ІБХ ім. О. В. Палладіна НАН України (зав. відділу — член-кор. НАНУ, проф. С. О. Костерін). Одержані результати висвітлено у спільних публікаціях. Дисертантка самостійно провела кінетичний та статистичний аналіз результатів, підготувала до друку матеріали за результатами дисертаційної роботи. Аналіз отриманих результатів, формулювання основних висновків було проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на: конференції-конкурсі робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006” (Київ, 2006 р.), ХІ конгресі СФУЛТ (Полтава, 2006 р.), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.), ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2007), V Міжнародному симпозіумі “Актуальные проблемы биофизической медицины” (Київ, 2007), 6-й Міжнародній Парнасівській конференції (м. Краків, Польща, 2007), Міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (м. Пущино, Росія, 2007 р.). Про результати роботи також доповідали на наукових семінарах в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (Київ, 2005) та Інституті біології тварин УААН (Львів, 2007).

Публікації. Результати досліджень висвітлено у 12 друкованих роботах, з них 5 статей у фахових наукових виданнях та 7 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів та результатів досліджень, їх аналізу й обговорення, висновків та списку використаної літератури із 224 джерел. Матеріал надруковано на 128 сторінках, проілюстровано 26 рисунками та 3 таблицями, які займають 16 сторінок.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури присвячений біохімічним, фізико-хімічним властивостям еякуляту і сперматозоїдів за фізіологічних та патологічних станів. Охарактеризовано системи транспорту іонів у сперматозоїдах. Проаналізовано основні властивості каліксаренів, описано роль оксиду азоту та його стабільних метаболітів у функціонуванні сперматозоїдів, а також біохімічні механізми функціональної активності чоловічих гамет.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Еякулят чоловіків відбирали від пацієнтів віком 25–44 роки
з дотриманням правил безпеки для здоров’я обстежених, збережені прав та канонів людської гідності пацієнтів, а також морально-етичних норм.

Клінічний матеріал аналізували за основними показниками якості сперми (метод спермограм). Сперматозоїди чоловіків відмивали від плазми еякуляту 3-разовим центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. Кількість білка в клітинному препараті визначали методом О. Lowry та ін. (Lowry О. et al., 1951).

Для електронно-мікроскопічних досліджень клітини фіксували та поміщали в епоксидну смолу Epon-812, зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-6. Перегляд і фотографування зразків проводили на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100 при прискорювальній напрузі 75 kV (Holstein., 1975).

Визначення середнього гідродинамічного діаметра проводили на лазерно-кореляційному спектрофотометрі PCS у суспензії сперматозоїдів концентрацією 1 мг білка/мл (Лебедев А. Д. и др., 1987).

АТР,2+-залежну “екто”-АТРазну активність визначали у суспензії сперматозоїдів (0,5–1,5 мг білка/мл) у середовищі інкубації наступного складу (мМ): 1203052, 52, 3 АТР, 30Трис-буфер (рН ,4); так зване “зовнішньоклітинне” середовище (ЗКС).

Загальну Na+,+,2+-залежну “ендо”-АТРазну активність визначали у “внутрішньоклітинному” середовищі (ВКС) інкубації (мМ): 3012052, 3 АТР, 30Трис-буфер (рН ,4), 0,5сапонін, 0,5–1,5 мг білка/мл. Визначення Са2+-залежних “ендо”-АТРазних активностей проводили в присутності 0,01 мМ СаCl2, а Са2+-незалежних — 1 мМ ЕГТА (Karaki Н. et al., 1997). Час інкубації — 5 хв при 37 С. Вміст фосфату неорганічного Рі визначали за методом W.V. (Векліч Т. О. та ін., 2002).

Для визначення впливу інгібіторів на АТРазну активність сперматозоїдів до середовища інкубації додавали їх аліквоту у відповідній концентрації (мМ): 1 еозин(Костерин С. А. и др., 1998), 13 (Левицкий Д. О. и др., 1990), 1 орто-ванадат (о-ванадат (Robinson 1981)), 1 пара-хлор меркурій-бензоат (п-ХМБ (Костерин С. А., 1990)), 1 уабаїн (Valenteet al., 2003), 1 NaN3, 0,1 мкМ тапсигаргін (Flynn et al., 2001).

Уявні кінетичні параметри, щодо реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР — константу активації (Ka) та коефіцієнт Хілла (nH) обчислювали за методом Хілла (Курганов В. И., 1978) у координатах {lg[(Am-A)/]; lg[S]}, де A та Am — питомі ферментативні активності у відсутності та в присутності в середовищі інкубації досліджуваної речовини в концентрації [S]. При визначенні ефективності впливу інгібіторів на АТРазну активність (константи інгібування Ki та nH) лінеаризовані криві концентраційних залежностей будували у координатах {lg[(А0-A)]; lg[І]}, де A та A0 — питомі ферментативні активності у відсутності та в присутності відповідного інгібітору в концентрації [І]. У випадку таких графіків значення коефіцієнта кореляції R2 становило 0,95–0,99.

Статистичний аналіз одержаних даних проводили із використанням критерію Стьюдента (Кокунин В. А., 1975). Кінетичні та статистичні розра-хунки здійснювали в режимі програмного забезпечення на персональному комп’ютері IBM PC.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вивчення морфологічних та фізико-хімічних особливостей еякуляту і сперматозоїдів чоловіків в нормі та при олігозооспермії.

Аналіз спермограм. В умовах лабораторії дослідили 239 еякулятів чоловіків, що зверталися з проблемами безпліддя протягом 2004–2007 років. Вік пацієнтів становив 25–44 роки (30,9 ± ,4 роки). Аналіз еякулятів за основними критеріями спермограм показав, що 94 еякуляти належать здоровим чоловікам (нормоспермія), а 145 зразків характеризуються наявністю патологій (рис. ). З них 43 пацієнти страждали на олігозооспермію (29,7патологічних випадків). Серед комбінацій захворювань найпоширенішою виявилась оліготератозооспермія — 12,9всіх еякулятів, а поєднання трьох видів патологій (олігоастенотератозооспермія) становить 5,4від загальної кількості досліджених зразків.

Рис. .  Розподіл даних спермограм досліджених зразків еякулятів чоловіків протягом 2004-2007 років (n )

Для проведення досліджень еякуляти пацієнтів ділили на дві групи: контрольна група (нормозооспермія) та група (олігозооспермія). Середній вік у групах становив 31,6 ± ,7 та 30,4 ± ,5 років для груп 1 та 2 відповідно.

Морфометричні дослідження сперматозоїдів. Результати електронно-мікроскопічних досліджень показали, що як в нормі, так і при олігозооспермії основна частина сперматозоїдів характеризуються типовою будовою (рис. , а): плоска головка з чітко окресленою акросомою, джгутик рівний, з аксіальним типом прикріплення до головки, ПМ є суцільною, без розривів.

Рис. . Ультраструктура типових інтактних (а) та оброблених сапоніном (б) сперматозоїдів чоловіків (дані електронної мікроскопії): а) х 4000, б) х 3000.

A – акросома,

ПM – плазматична мембрана.

Для вивчення особливостей функціонування АТР-гідролазних систем, що мають внутрішньоклітинну орієнтацію активних центрів, необхідно перфорувати мембрану. При додаванні до суспензії сперматозоїдів 0,5розчину детергенту сапоніну виявилося (рис. .б), що ПМ втрачає свою структурованість, цілісність, відшаровується від акросоми та інших клітинних структур. Це спричиняє руйнування сперматозоїдів: головки відокремлюються від тіла, хвостики руйнуються, в результаті зменшуються їх розміри.

Ефективність впливу сапоніну на спермальні мембрани була також показана шляхом визначення середнього гідродинамічного діаметру сперматозоїдів методом ЛКС. Одержані результати свідчать на користь того, що ефективний діаметр сперматозоїдів здорових чоловіків становить 10–15 мкм. Додавання до клітинної суспензії 0,5розчину сапоніну призводить до зменшення їх розмірів до 2–3 мкм (середній розмір міцел суспензії детергенту — 0,6–0,8 мкм), при чому для основної частини (37,1утворених фрагментів діаметр становить 2,5 мкм.

Отже, відмиті від плазми еякуляту сперматозоїди зберігають свою структурну цілісність та функціональну активність, а детергент сапонін ефективно пермеабілізує спермальні мембрани, зменшуючи ефективний діаметр клітин. Такий експериментальний підхід є перспективним для вивчення “латентних” АТРазних активностей сперматозоїдів.

Пошук оптимальних умов для визначення “екто”- та “ендо”-АТР-гідролазних ферментативних активностей у сперматозоїдах чоловіків.

Оптимальні умови визначення “екто”- та “ендо”-АТРазних активностей. У мембранах сперматозоїдів присутні “екто”-АТРази, що мають зовнішньоклітинну орієнтацію активних центрів та “ендо”-АТРази, активні центри яких розміщенні у внутрішньоклітинному просторі. Тому метою наступного етапу досліджень було підібрати оптимальні умови для визначення даних ферментативних активностей у випадку використання інтактних та пермеабілізованих сперматозоїдів, тобто двох експериментальних моделей для визначення “екто”- та “ендо”-АТРазних активностей відповідно.

В ході досліджень було встановлено, що оптимальним детергентом, який призводить до максимального зростання АТРазної активності пермеабілізованих сперматозоїдів відносно інтактних клітин у ЗКС є 0,05% розчин сапоніну, а при використанні ВКС інкубації — 0,5розчин детергенту. Оптимальний час інкубації в обох типах середовищ для всіх досліджуваних АТРазних активностей – 5 хв., концентрація білка — 0,5-1,5 мг/мл проби, [АТР]опт. — 3 мМ, [Mg2+]опт. — 5 мМ. Експерименти проводили при фізіологічних значеннях температури (37 С) та рН (7,4). Одержані результати дали змогу вивчати окремі АТР-гідролазні системи сперматозоїдів із використанням інгібіторів різного спектра дії при нормо- та олігозооспермії.“

Екто”-АТРазна активність сперматозоїдів чоловіків. Оскільки, достовірно не відома структура та хімічна природа АТР-гідролаз із зовнішньоклітинною локалізацією активних центрів, для їх дослідження використовували ЗКС інкубації та неспецифічні інгібітори АТР-гідролазної активності: еозинлантану хлорид (LaCl3), о-ванадат та п-ХМБ.“

Екто”-АТРазна активність інтактних сперматозоїдів здорових чоловіків (контрольне значення, прийнято за 100становить 30,9 ± ,5 нмоль Ріхв. мг білка)-1, (M ±n ). Результати показали, що неспецифічний інгібітор активностей АТРазних систем різних типів еозин(Gattoet al., 1995), у концентрації 1 мМ інґібує “екто”-АТРазну активність сперматозоїдів на 38,8 ± ,6відносно контрольного значення (M ±n ) (рис. , стовпчик ). Менш ефективними виявилися LaCl3, о-ванадат та п-ХМБ, які знижували “базальну” Mg2+-залежну “екто”-АТРазну активність сперматозоїдів на 29,1  ,923,5± ,6та 18,8± ,7відповідно відносно контролю (М ±n ) (рис. , стовпчики –4). З одержаних результатів можна зробити висновки, що іони La вельми слабо конкурують з Mg2+ за утворення хелатного комплексу з нуклеотид три-фосфатом; чутливість “екто”-АТРаз до о-ванадату значно менша, ніж до Са2+-транспортувальних систем ЕПР та МХ, активність яких пригнічується о-ванадатом на 80–100(Костерин С. А. и др., 1996). А також SH-групи присутні в активних центрах “екто”-АТРаз сперматозоїдів у не значній кількості, оскільки чутливість їх актив-ності до п-ХМБ досить низька. Інгібітор-нечутлива компонента “екто”- АТРазної активності обумовлена наявністю таких АТРазних систем, які володіють високою активністю, але нечутливі до дії даних інгібіторів.

Рис. . Вплив різних інгібіторів на “екто”-АТРазну активність інтактних сперматозоїдів чоловіків, відносно контролю без інгібітору, прийнято за 100(М ±n ).

1 –ЗКС + 1 мМ еозин Y,

2 –ЗКС + 1 мМ LaCl3,

3 –ЗКС + 1 мМ п-ХМБ,

4 –ЗКС + 1 мМ о-ванадат,

5 – ЗКС + 100 нМ тапсигаргін,

6 –ЗКС + 1 мМ азид натрію.

Як контроль на цілісність ПМ сперматозоїдів використовували селективні інгібітори активності Са2+, Mg2+-АТРази ЕПР — тапсигаргін (Bassaniet al., 2003) та мітохондріальної Н+-АТРази — азид натрію (Baldet al., 1998), оскільки дані АТРази мають внутрішньоклітинну локалізацію активних центрів. Обидва інгібітори не чинили достовірного впливу на АТР-гідролазну активність не оброблених детергентом сперматозоїдів (рис. 3, стовпчики , 5). Отже, можна стверджувати, що в даному випадку бар’єрна функція ПМ сперматозоїдів не порушена.

Ідентифікація та вивчення особливостей функціонування Са2+-залежних та Са2+-незалежних “ендо”-АТРаз сперматозоїдів чоловіків в нормі та при олігозооспермії із використанням селективних інгібіторів.

Ідентифікація “ендо”-АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків. Згідно літературних даних у спермальних мембранах наявні Са2+-залежні (Са2+, Mg2+-АТР-гідролазні ферменти) (Schuhet al., 2004) та Са2+-незалежні (Na+, K+-, “базальна” Mg2+-АТРази ПМ, та Н+-АТРаза МХ сперматозоїдів) (Blancoet al., 2000; Wooet al., 2000) АТРазні системи. Тому подальші дослідження проводили відповідно у кальційвмісному та безкальцієвому ВКС інкубації.“

Загальна” АТРазна активність пермеабілізованих сперматозоїдів (контрольне значення, прийнято за 100у кальцієвому середовищі інкубації становить 31,7  ,4 та 40,4  ,3 нмоль Ріхв. мг білка)-1 для груп та 2 відповідно (M ±m, n ). Величина Са2+-незалежної АТРазної активності без додавання інгібіторів становить 68,7 ± ,0 в контрольній групі та 50,6 ± ,5 нмоль Рі (хв. мг білка)-1 для групи (M ±m, n –6). Отже, за умов розвитку олігозооспермії Са2+-залежна ферментативна активність має певну тенденцію до зростання, а Са2+-незалежна — до зниження. У кальцієвому середовищі інкубації уабаїн та азид натрію не чинили достовірного впливу на дану ферментативну активність (рис. , а, стовпчики , 2). При додаванні до аліквоти тапсигаргіну (рис. , а, стовпчик ) активність у групі достовірно знижувалась на 15,3  ,6а у групі – на 27,2  ,2відносно контролю.

Рис. . Вплив інгібіторів на Са2+-залежну (а) та Са2+-незалежну (б) АТРазну активність сперматозоїдів, відносно контролю без інгібіторів, прийнято за 100(M ± m, n –6).

*/ – відмінність щодо нормозооспермії (група ) є достовірною (р ? ,05, M ±n ).

1 – ВКС + 1 мМ уабаїн,

2 – ВКС + 1 мМ уабаїн, 1 мМ азид натрію,

3 – ВКС + 1 мМ уабаїн, 1 мМ азид натрію, 100 нМ тапсигаргін,

4 – ВКС + 1 мМ уабаїн, 1 мМ азид натрію, 100 нМ тапсигаргін, 1 мМ еозин

Додавання уабаїну до безкальцієвого середовища (рис. , б, стовпчик ) призводило до зниження ферментативної активності у сперматозоїдах здорових чоловіків на 21,3 ± ,5У випадку олігозооспермії (група ) уабаїн-чутлива компонента є достовірно меншою, ніж у контрольній групі і становить 8,8 ± ,2(р ? ,05, M ±n ). Додавання до середовища інкубації азиду натрію (1 мМ) призводило до подальшого зниження АТРазної активності сперматозоїдів на 40,3 ± ,1 та 20,3 ± ,1в групах 1 та 2 відповідно, відносно контролю без інгібіторів, прийнято за 100(рис. , б, стовпчик ). При цьому в дослідній групі активність у 1,3–1,5 разів є меншою, ніж у контрольній (р ? ,05, M ±n ). Тапсигаргін (100 нм) не чинив достовірного впливу на АТРазну активність в обох групах. Додавання еозинумайже повністю знижувало ферментативну активність (залишкова активність становила 3–5у всіх випадках (рис. , а, б, стовпчики ).

Отже, ми виявили Са2+-залежну тапсигаргін-чутливу АТРазну активність, а також Са2+-незалежні уабаїн- та азид натрію-чутливі компоненти АТР-гідролазної ферментативної активності суспензії пермеабілізованих сперматозоїдів чоловіків в нормі та при олігозооспермії. Це дозволило ідентифікувати активності окремих АТР-гідролазних систем, що локалізовані у спермальних мембранах.

АТРазна активність ЕПР сперматозоїдів у нормі становить 4,3 ± ,2 нмоль Ріхв. мг білка)-1, що складає 10–12Са2+,2+, АТР-залежної ферментативної актив-ності (рис. , стовпчик ). При олігозооспермії (група ) активність Са2+,2+-АТРази ЕПР достовірно зростає в 1,8–2 рази, відносно групи (р  ,05, М ±n ).

Активність Са2+-незалежної Na+,+-АТРази ПМ сперматозоїдів достовірно знижується (р  ,05) у 5–6 разів при олігозооспермії (рис. , стовпчик ). У сперматозоїдах здорових чоловіків (група ) вона дорівнює 18,7 ± ,5 нмоль Рі (хв. мг білка)-1 та складає лише 7–9від загальної Са2+-незалежної, Mg2+, АТР- залежної активності сперматозоїдів у випадку групи (М ±n ). Активність Н+-АТРази МХ також знижується у 3–3,2 раза при олігозооспермії (стовпчик ) від 12,5 ± ,7 до 3,9 ± ,8 нмоль Ріхв. мг білка)-1 (М ±n ). Також ідентифіковано уабаїн-, NaN3-резистентну, так звану, “базальну” Са2+-незалежну, Mg2+-АТРазну активність ПМ (стовпчик ), яка в нормі складає 52,4 ± ,2від величини Mg2+,АТРазної активності сперматозоїдів та знижується при олігозооспермії у 2,5–3 рази до 6,9 ± ,6 нмоль Ріхв. мг білка)-1 (М ±n ).

Рис. . Ідентифікація активностей Са2+-залежних (стовпчик ) та Са2+-незалежних (стовпчики ) АТРаз сперматозоїдів чоловіків (M ±n ), відносно контролю без інгібіторів, прийнято за 100

*/ – відмінність щодо нормозооспермії (група 1) є достовірною (р ? ,05, M ±n ).

1 – тапсигаргін- чутлива Са2+, Mg2+-АТРаза ЕПР,

2 – уабаїн-чутлива Na+, K+-АТРаза,

3 – NaN3-чутлива Н+-АТРаза МХ,

4 – уабаїн-, NaN3-резистентна “базальна” Mg2+-залежна Са2+-незалежна АТРаза.

Вплив селективних інгібіторів на активність АТР-гідролаз сперматозоїдів. На наступному етапі досліджень вивчали концентраційні залежності впливу селективних інгібіторів на активність ідентифікованих нами АТРазних систем сперматозоїдів чоловіків.

Тапсигаргін (терпеновий лактон), зв’язуючись з трансмембранним сегментом М3 вільної від іонів Са формою Са2+,2+-АТРази ЕПР, утворює каталітично неактивну конформацію помпи (Flynnet al., 2001). Результати наших досліджень показали, що тапсигаргін дозозалежно (в діапазоні концентрацій  М) та ефективно інгібує активність Са2+,2+-АТРази ЕПР сперматозоїдів чоловіків до рівня 3,6  ,5відносно контролю без інгібітору, прийнято за 100 (M ± m; n ). Методом лінеаризації концентраційних залежностей у координатах Хілла (рис. , крива ) було встановлено високу афінність тапсигаргіну до даного ферменту (Kі становить 7,1 ± ,1 нМ) та практичну відсутність кооперативності у його дії (коефіцієнт Хілла nH ? ).

Рис. . Кінетичний аналіз за методом Хілла концентраційних залежностей впливу інгібіторів на АТРазні активності у сперматозоїдах чоловіків (M± m; n ).

1 – вплив тапсигаргіну на активність Са2+, Mg2+-АТРази ЕПР,

2 – вплив уабаїну на активність Na+,+-АТРази ПМ,

3 – вплив азиду натрію на активність Н+-АТРази МХ.

Уабаїн, кардіоактивний глікозид, є абсолютним інгібітором Na+,K+-АТРази, блокуючи фермент у стані Р-Е2 і, таким чином, гальмуючи перехід на рівні конформерів Е2>Е1 (Valenteet al., 2003). Результати досліджень показали, що уабаїн, в діапазоні концентрацій  М дозозалежно та абсолютно пригнічує активність Na+,+-АТРази сперматозоїдів чоловіків; для даного ефекту властива помірна спорідненість до ферменту (Kі ,7 ± ± ,8 мкМ) та виражена позитивна кооперативність — значення коефіцієнту Хілла nH становить майже 2 (рис. , крива ).

Азид натрію — ефективний інгібітор електрон-транспортного ланцюга внутрішньої мембрани мітохондрій (Flynnet al., 2001). Результати показали, що інгібувальний ефект азиду натрію на активність Н+-АТРази МХ має місце в діапазоні концентрації  М. Ефективність його впливу характеризується помірною спорідненістю (Kі ,2  ,1 мкМ) та практично відсутнім явищем кооперативності (nH ? 1) (рис. , крива ).

Дослідження впливу каліксаренів С-97, С-99 та С-107 на Na+,+-АТРазну активність суспензії сперматозоїдів чоловіків.

Каліксарени (макроциклічні олігомери фенолів), що мають внутрішньо-молекулярні ліпофільні порожнини, виступають ефекторами різних ферментативних систем (Gutsche1998). Спираючись на літературні дані, ми підібрали три речовини: С-97, С-99 та С-107 (наведено шифри), оскільки вони є ефективнішими, ніж уабаїн, інгібіторами активності Nа+,+-АТРази ПМ міометрію матки (Векліч Т. О. та ін., 2006). Препарати каліксаренів були синтезовані у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України (зав. відділу — член-кор. НАН України, проф. В. І. Кальченко).

Nа+,+-АТРазна активність розраховується по різниці між величинами “загальної” Mg2+,а+,+- та “базальної” Mg2+-АТРазних активностей, тому також вивчався вплив досліджуваних каліксаренів на активність Mg2+-АТРази сперматозоїдів.

Результати досліджень показали, що каліксарени С-97 та С-107 (100 мкМ) повністю інгібують Na+,+-АТРазну активність сперматозоїдів (залишкова активність — 1–2відносно контрольного значення без інгібітору, прийнято за 100Натомість каліксарен С-99, який за своїми хімічними властивостями є більш гідрофільним, не чинив достовірного впливу на активність даного ферменту, пригнічуючи Na+,+-АТРазну активність сперматозоїдів лише до 80–85відносно контрольного значення (n ). При чому всі досліджувані каліксарени практично не впливають на “базальну” Mg2+-АТРазну активність (має місце зменшення активності лише до 90–95від контрольного значення).

При вивченні концентраційних залежностей впливу каліксаренів С-97 та С-107 на Nа+,+-АТРазну активність сперматозоїдів було знайдено, що в діапазоні концентрацій  М обидва дозозалежно та ефективно інгібують ([Imax]  М) дану ферментативну активність (рис. , а). Лінеаризовані криві концентраційних залежностей впливу досліджуваними каліксаренами Na+,+-АТРазної активності сперматозоїдів (рис. , б) дозволили розрахувати кінетичні показники їх впливу. Виявилося, що каліксарени С-97 та С-107 є ефективнішими, ніж уабаїн, високоафінними інгібіторами, оскільки константа інгібування для них становить близько 20–30 нМ, а для уабаїну — 115–120 мкМ. При чому дія уабаїну характеризується наочною позитивною кооперативністю (nH ? ), каліксарену С-97 — слабкою негативною (nH ? ,7), а ефект каліксарену С-107 практично некооперативний (nH ? ).

Рис. . Залежність Na+,+- та Mg2+-АТРазних активностей сперматозоїдів чоловіків від концентрації каліксаренів С-97 та С-107 (а) та кінетичний аналіз за методом Хілла концентраційних залежностей впливу каліксаренів на Na+,+-АТРазну активність (б) (M± m; n ).

1 та 3 – дія каліксарену С-97 на активність Na+,K+- та Mg2+-АТРази відповідно,

2 та 4 – дія каліксарену С-107 на активність Na+,K+- та Mg2+-АТРази відповідно.

Вміст нітритів у сперматозоїдах за деяких патологічних станів.

Особливої уваги серед вторинних месенджерів, що опосередковують численні функції сперматозоїдів, заслуговує оксид азоту та його стабільні метаболіти (нітрати, нітрити) (Balerciaet al., 2004). Тому на наступному етапі досліджень вивчали вміст нітритів в нормі та при деяких патологіях.

Результати показали, що вміст нітритів у сперматозоїдах здорових чоловіків становить 0,4 ± ,02 нмоль/106 клітин, достовірно не змінюється при олігозооспермії, але при астенозооспермії (зниженні рухливості сперматозоїдів) їх вміст зростає до рівня 0,8 ± ,1 нмоль/106 клітин (М ±n ). Очевидно, що активні сполуки азоту суттєво впливають на функціональний стан ПМ, зокрема на мембранозв’язані іон-транспортувальні системи (Данилович Ю. В., 2001). Отже, можна зробити висновок, що встановлена нами зміна ферментативних активностей АТРазних систем сперматозоїдів чоловіків при олігозооспермії не пов’язана із впливом на них даних азотовмісних сполук. Натомість при астенозооспермії можливо саме за рахунок впливу на АТРазні системи зростання вмісту нітритів призводить до зниження рухливості гамет.

Розробка біохімічного діагностичного тесту на олігозооспермію

При олігозооспермії змінюється ліпідний склад спермальних мембран, що може призводити до змін функціонування АТРазних систем (Zarintoshet al., 1996). Тому доцільним є вивчення особливостей Mg2+-залежного гідролізу АТР в нормі та при олігозооспермії з метою розробки нових діагностичних тестів.

З літературних джерел відомо, що еозин(2,4,5,7-тетрабромфлуоресцеїн) ефективно пригнічує активність транспортних АТРаз за рахунок адсорбції на АТР-зв’язуючому центрі ферменту (Костерин С. А. и др., 1996). В подальшій роботі досліджували концентраційну залежність впливу еозинуна Mg2+, АТР-залежний ферментативний процес у двох типах інкубаційних середовищ — ЗКС та ВКС.

Виявилося, що еозину діапазоні концентрацій 10-610-3 М дозозалежно та повністю пригнічує АТРазну активність в обох типах інкубаційних середовищ в нормі та при олігозооспермії. В усіх випадках були одержані біфазні залежності (точка перегину в діапазоні концентрацій 0,4–0,6 мМ). Із використанням лінеаризованих у координатах Хілла {ln[А/(A0-A)]; ln[I]кривих концентраційних залежностей було ідентифіковано фазу високої (Ki ? 100 мкМ) та низької спорідненості (Ki ? –400 мкМ) еозинудо АТРазних систем сперматозоїдів (таблиця ), при чому для високоафінної компоненти характерна вельми слабка позитивна кооперативність (nH? ,1–1,3), а низькоафінної — суттєва негативна (nH? ,4–0,5).

Таблиця

Кінетичні показники впливу еозинуна питому

ферментативну АТРазну активність (M ±; n ).

Група | Група  | Група  | Компонента | Високоафінна | Низькоафінна | Високоафінна | Низькоафінна | Зовнішньоклітинне середовище | Ki, М | (0,1 ± 0,02)10-3 | (0,4 ± 0,1)10-3 | (0,1 ± 0,02)10-3 | (0,2 ± 0,1)10-3 | nН | 1,3 ± 0,1 | 0,4 ± 0,04 | 1,1 ± 0,2 | 0,5 ± 0,1 | Внутрішньоклітинне середовище | Ki, М | (0,1 ± 0,01)10-3 | (0,4 ± 0,1)10-3 | (0,1 ± 0,01)10-3 | (0,3 ± 0,1)10-3 | nН | 1,3 ± 0,1 | 0,4 ± 0,04 | 1,2 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | Примітка. Кінетичні параметри були розраховані із лінеарізованих графіків відповідно до емпіричного рівняння Хілла: ln[A/(A0-A)]– nH lni nH, де A0 та A – питомі АТР-гідролазні активності у відсутності (“нульова точка”) та у присутності в середовищі інкубації еозинув концентрації [I]. У випадку таких графіків типове значення коефіцієнта кореляції R2 становило 0,96–1,0.

Результати показали, що величина “загальної” АТРазної активності при інкубації суспензії сперматозоїдів без додавання детергенту сапоніну (контрольне значення, прийнято за 100у ЗКС становить 7,8 ± ,0 та 7,7 ± ,3 нмоль Ріхв. мг білка)-1 для груп та 2 відповідно; а у ВКС — 6,0 ± ,2 та 11,7 ± ,1 нмоль Ріхв. мг білка)-1 в групах та 2 відповідно (М ±n –8).

Рисунок .  Концентраційна залежність впливу сапоніну на значення еозин Y-чутливої АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків у випадку використання внутрішньоклітинного середовища інкубації (М ±n ).

Контрольне (у відсутності обробки детергентом) значення ферментативної активності прийнято за 100Концентрація еозину Y – 1 мМ.

При інкубації сперматозоїдів у ЗКС при додаванні 0,05розчину сапоніну “загальна” АТРазна активність зростає в обох групах у 2–2,3 раза, відносно контролю. У випад-ку використання ВКС інкубації (оптимальна концентрація сапоніну 0,5величина даної активності для груп і 2 відповідно зростає до 18,0 ± ,5 та 16,5 ± ,2 нмоль  Рі (хв. мг білка)-1 (рис. ). Тобто при титруванні сперматозоїдів сапоніном у ВКС в нормі еозинчутлива АТРазна активність вірогідно зростає у 3,8-4 раза, а за умов олігозооспермії — лише в 1,3–1,5 раза (М ±n –8). Виявлена різниця між величинами “загальної” АТР-гідролазної актив-ності сперматозоїдів у нормі та при олігозооспермії, може бути використана для розробки стандартизованого біохімічного тесту на наявність даної патології.

Таким чином, у даній роботі показано, що олігозооспермія є поширеною патологією чоловічої репродуктивної системи. Підібрано оптимальні умови визначення АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків, ідентифіковано активності “екто”- та “ендо”-АТРаз. Встановлено, що Са2+-залежна АТРазна активність достовірно зростає при олігозооспермії, а Са2+-незалежна — знижується. Розраховано ефективність впливу класичний інгібіторів та нових ефекторів (каліксаренів) на окремі АТР-гідролазні системи. Показано, що вміст нітритів у сперматозоїдах не змінюється при наявності олігозооспермії, відносно нормоспермії. Запропоновано новий біохімічний тест на наявність даного захворювання чоловічої репродуктивної системи.

ВИСНОВКИ

На моделях інтактних та пермеабілізованих сперматозоїдів чоловіків, ідентифіковано та досліджено властивості Мg2+, АТР-залежних іон-транспортувальних систем у нормі та при олігозооспермії, патології, що зустрічається у 30випадків чоловічого безпліддя. З одержаних результатів можна зробити наступні висновки:

1.  Показано, що сапонін є ефективним детергентом спермальних мембран та зменшує середній гідродинамічний діаметр сперматозоїдів у 4–5 разів при додаванні 0,5його розчину.

2.  “Екто”-АТРазна активність інтактних сперматозоїдів, яка становить 30,9 ± ,5 нмоль Ріхв. мг білка)-1 інгібується на 40еозиномта менш ефективно іонами La3+, о-ванадатом та п-ХМБ.

3.  Сперматозоїди проявляють Са2+-залежну тапсигаргін-чутливу Са2+,2+-АТРазну активність ендоплазматичного ретикулуму, величина якої становить для здорових чоловіків 4,3 ± ,2 нмоль Ріхв. мг білка)-1 і достовірно зростає в 2 рази при олігозооспермії.

4.  Активність Са2+-незалежних АТРаз сперматозоїдів знижується при олігозооспермії: уабаїн-чутливої Nа+,+-АТРази та “базальної” Mg2+-АТРази плазматичної мембрани — в 4–4,5 та 2,5–3 рази відповідно та азид-чутливої мітохондріальної Н+-АТРази — в 3–3,2 рази.

5.  Каліксарени С-97 та С-107 значно ефективніше, ніж уабаїн, інгібують активність Na+,+-АТРази сперматозоїдів чоловіків та володіють досить високою спорідненістю до даного ферменту — Ki =–3)10-8 М.

6.  Вміст нітритів у сперматозоїдах здорових чоловіків становить 0,4 ± ,02 нмоль/10  клітин і достовірно не змінюється за умов олігозооспермії, але позитивно корелює з розвитком астенозооспермії.

7.  Еозинє ефективним інгібітором “загальної” “екто”- та “ендо”-АТРазної активності сперматозоїдів в нормі та при олігозооспермії. Криві концентраційних залежностей в усіх випадках мають біфазну залежність: фаза високої спорідненності (Ki ? ,110-3 М) характеризується слабкою позитивною кооперативністю, а низькоафінна (Ki ?,3–0,4)10-3 М) — суттєвою негативною.

8.  На основі визначення “загальної” еозин чутливої АТРазної активності нативних та пермеабілізованих сапоніном (0,5розчин) сперматозоїдів запропоновано новий чутливий біохімічний діагностичний тест на наявність олігозооспермії.

Список робіт за темою дисертації

1. Кочешкова Н. С., Воробець З. Д. Системи транспортування Са2+ у сперматозоїдах. Біохімічні механізми капацитації та акросомної реакціїУкраїнський біохімічний журнал. — 2006. — Т. , № . — С. –79. (Дисертант проводила пошук, систематизацію та аналіз літературних даних, створення на їх основі схем біохімічних механізмів процесу капацитації та акросомної реакції).

2. Кочешкова Н. С., Воробець З. Д. Еозин-чутлива АТРазна активність у сперматозоїдах чоловіків як біохімічний тест на олігозоосперміюУкраїнський біохімічний журнал. — 2007. — Т. , № . — С. –55. (Дисертант проводила дослідження, аналіз літературних даних, статистичну, кінетичну та графічну обробку результатів, приймала участь в написанні статті).

3. Порівняльне дослідження впливу каліксаренів на Na+,+-АТРазну активність в плазматичній мембрані скоротливих та рухливих клітин / Т. О. Векліч, Н.С. Кочешкова, Р.В. Родік, В.І. Бойко, З.Д. Воробець, С.О. Костерін // Український біохімічний журнал. — 2007. — Т. , № . — С. –29. (Дисертантка проводила дослідження та кінетичні розрахунки впливу інгібіторів на АТРазні активності сперматозоїдів, приймала участь в аналізі літературних даних, написанні статті, статистичній, кінетичній та графічній обробці результатів).

4. Вплив детергентів на ферментативну активність та ультраструктуру сперматозоїдів / Н.С. Кочешкова, З.Д. Воробець, В.Ф. Горчев, О.Р. Кулачковський // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. — 2007. — Т. , № . — С. –29. (Дисертанту належить аналіз спермограм, одержання суспензії сперматозоїдів, проведення досліджень активності АТРазних систем сперматозоїдів, аналіз літературних даних, участь у написанні статті, статистична, кінетична та графічна обробка отриманих результатів).

5. Кочешкова Н. С., Воробець З. Д., Оліферчук Л. П. Вплив інгібіторів на Са2+-залежні та Са2+-незалежні АТРазні системи сперматозоїдів // Світ медицини та біології. — 2007. — № . — С. –70. (Дисертантка проводила дослідження, кінетичну, статистичну, аналіз даних літератури та приймала участь в аналізі результатів та написанні статті).

6. Кочешкова Н. С. Активність АТРазних систем сперматозоїдів за умов олігозооспермії // Матеріали ХІ Конгресу СФУЛТ. – Полтава, 2006. – С. . (Дисертантка проводила аналіз даних літератури, дослідження, аналіз їх результатів та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

7. Кочешкова Н. С. Визначення еозин-чутливої АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків // Матеріали ІХ з’їзду Українського біохімічного товариства. — Харків, 2006. — С. –137. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів та їх статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

8. Кочешкова Н. С. Еозинчутлива АТРазна активність сперматозоїдів чоловіків у нормі та за олігозооспермії / Матеріали конференції “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006” // Український біохімічний журнал. — 2006. — Т. , № . — С. . (Дисертантка проводила дослідження, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

9. Кочешкова Н. С. Вплив каліксаренів С-97, С-99 та С-107 на Na+,K+- та Mg2+-АТРазну активність сперматозоїдів // Збірник тез ІІІ міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ в біології”. — Львів, 2007. – С. –70. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

10. Кочешкова Н. С. Розробка діагностичного тесту на розвиток олігозооспермії – патології чоловічої репродуктивної системи // Материалы V международного симпозиума “Актуальные проблемы биофизической медицины”. — Киев, 2007. — С. –91. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

11. KocheshkovaVorobets Identification of ATP-hydrolases systems of spermatozoids and its role in development of oligozoospermia // Abstracts of the 6th Parnas conference Molecular Mechanism of Cellular Signalling. — Krakow, Poland, 2007. — P. . (Дисертантка приймала участь у проведенні досліджень, аналізі літературних даних, статистичній обробці та аналізі результатів, написанні та оформленні тез, презентувала роботу на конференції).

12. Кочешкова Н. С. Активность систем Mg2+,АТР-зависимого транспорта ионов в сперматозоидах мужчин при развитии олигозооспермии // Материалы международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”. – Пущино, Россия, 2007. — С. –319. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

Анотації

Кочешкова Н. С. Ідентифікація та властивості іон-транспортувальних АТР-гідролаз сперматозоїдів чоловіків за умов олігозооспермії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 — біохімія. Інститут біології тварин УААН, Львів, 2007.

Дисертація присвячена ідентифікації активностей АТРазних систем, із зовнішньо- та внутрішньоклітинну локалізацію активних центрів у сперматозоїдах чоловіків, вивченню особливостей їх функціонування в нормі та при олігозооспермії, встановленню змін вмісту нітритів при розвитку даної патології.

Встановлено, що олігозооспермія зустрічається у 30випадків чоловічого безпліддя. Розроблено оптимальні умови (щодо детергенту, концентрації АТР, іонів Mg, сапоніну, білка, часу інкубації) реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР у сперматозоїдах.

Ідентифіковано “екто”- та “ендо”-АТРазні активності у мембранах чоловічих гамет. Показано, що Са2+-залежна АТРазна активність достовірно зростає при розвитку олігозооспермії, а Са2+-незалежна – знижується. Проведено кінетичний аналіз методом Хілла ефективності впливу інгібіторів на відповідні АТРазні системи сперматозоїдів чоловіків.

Встановлено, що каліксарени С-97 та С-107 є ефективними, селективними інгібіторами активності Nа+,+-АТРази сперматозоїдів чоловіків. Вміст нітритів у сперматозоїдах не змінюється при олігозооспермії, відносно нормоспермії.

Запропоновано новий біохімічний тест на наявність олігозооспермії, який ґрунтується на визначенні величини “загальної” еозинчутливої АТРазної активності сперматозоїдів при додаванні 0,5розчину сапоніну.

Ключові слова: активність Са2+, Mg2+-, Nа+, K+-, Н+- та “базальної” Mg2+-АТР-гідролаз, каліксарени, нітрит-іони, сперматозоїди, еякулят, олігозооспермія.

Кочешкова Н. С. Идентификация и свойства ион-транспортных АТР-гидролаз сперматозоидов мужчин в условиях олигозооспермии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. Институт биологии животных УААН, Львов, 2007.

Диссертация посвящена идентификации ион-транспортных АТР-гидролазных систем сперматозоидов мужчин, с внешне- и внутриклеточной локализацией активных центров ферментов, изучению особенностей их функционирования в норме и при олигозооспермии. А также определению изменений концентрации нитритов в условиях данной патологии.

Анализ данных спермограмм мужчин, состоявших в бесплодном браке, проводимый на протяжении 2004–2007 годов показал, что олигозооспермия (снижение концентрации сперматозоидов в сперме) характерна для 30случаев мужского бесплодия.

С помощью методов электронной микроскопии и лазерно-корреляционной спектроскопии был найден оптимальный детергент для пермеабилизации спермальных мембран – сапонин. Он эффективно нарушает барьерную функцию мембран сперматозоидов, раскрывая их “латентные” АТРазные активности, уменьшая при этом средний гидродинамический диаметр фрагментов практически в 5 раз.

Найдены оптимальные условия (относительно концентрации АТР, ионов Mg, сапонина, белка, времени инкубации) реакции Mg2+-зависимого ферментативного гидролиза АТР в суспензии нативных и пермеабилизированых сперматозоидов. Идентифицировано “экто”- и “эндо”-АТР-гидролазные системы, локализованные в мембранах мужских гамет. Показано, что активность Са2+-зависимой транспортной Са2+,2+-АТРазы эндоплазматического ретикулума достоверно увеличивается при развитии олигозооспермии в 1,8-2 раза. В отличии от этого активность Са2+-независимых АТРазных систем достоверно снижается в условиях данной патологии: Nа+,+- и “базальной” Mg2+-АТРаз плазматической мембраны в 4,5–5 и 2,5–3 раза соответственно, а Н+-АТРазы митохондрий — в 3–3,2 раза. Методом линеаризации кривых концентрационных зависимостей охарактеризовано эффективность действия селективных (тапсигаргин, уабаин, азид натрия) и неселективного (эозинингибиторов.

Впервые показано, что макроциклические олигомеры фенолов – каликсарены С-97 и С-107 в концентрации 100 мкM на 97–99% ингибируют Na+,+­ATPазную активность сперматозоидов мужчин. Данные каликсарены более эффективные, чем уабаин, высокоафинные и селективные ингибиторы