Національна Академія Наук України
Інститут молекулярної біології і генетики
на правах рукопису
Лукаш Любов Леонідівна
УДК : 627.03.51
575.224
577.21
ВПЛИВ ЕКЗОГЕННИХ ВІРУСІВ І ДНК
НА СПОНТАННИЙ ТА ІНДУКОВАНИЙ МУТАГЕНЕЗ В СОМАТИЧНИХ КЛІТИНАХ ССАВЦІВ
03.00.26 - молекулярна генетика
дисертацiя на здобуття вченого ступеня
доктора біологічних наук
Київ - 1999
Дисертація є рукопис
Робота виконана у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України м. Київ
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук,
Соломко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, зав. відділом біохімічної генетики
доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України
Дяченко Наталія Сергіївна, Інститут мікробіології і вірусології НАН України, м. Київ, зав. відділом молекулярної біології вірусів
доктор медичних наук, ст.наук.співроб.,
Пілінська Марія Андріївна, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, м. Київ, зав. лабораторією цитогенетики
Провідна установа: Київський університет ім. Тараса Шевченко, м. Київ
Захист відбудеться " 12 " липня 1999 року о 10 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради 266.237.01
Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за
адресою: 252143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України
Автореферат розісланий 11 червня 1999 року
В. о. вченого секретаря спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук С.І.Черних
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Дисертаційна робота присвячена проблемі біологічного мутагенезу в соматичних клітинах ссавців. Регуляція мутаційного процесу в клітинах вищих еукаріот при дії екзогенних біологічних чинників є однією з найактуальніших і найменш вивчених проблем, що мають загальнобіологічне значення. Незважаючи на те, що можливість контролювання частоти мутацій, як у бік підвищення, так і зниження, була принципово показана, фундаментальних досліджень в цій галузі явно недостатньо.
На нинішній час стало очевидним, що рівень генетичної мінливості і стабільності біосистем визначається взаємодією двох протилежно спрямованих процесів - мутагенезу і антимутагенезу. Здатність до мутування закодована в структурі самого геному і визначається точністю і ефективністю роботи клітинних систем реплікації, рекомбінації та репарації (Жестяніков, 1979). Таким чином, певний рівень мутацій в про- та еукаріотичних системах підтримується функціонуванням внутрішньоклітинних макромолекул та їх комплексів. Крім того, на відкриті біосистеми здійснюють вплив як природні, так і синтетичні макромолекули оточуючого середовища. Серед біологічних чинників, що здійснюють локалізовану і загальну дію на геном вищих еукаріот, виокремлюються мобільні генетичні елементи (McClintock, 1980) та онкогенні віруси (Шапіро, 1981, Хесін, 1984).
Через дванадцять років після відкриття Меллером у 1927 році індукованого мутагенезу було показано явище дестабілізації геному під дією екзогенних нуклеїнових кислот на дрозофілі (Гершензон і Тарнавський, 1939). Ефект індукції генних мутацій під впливом вірусу SV40 на соматичних клітинах ссавців in vitro було встановлено значно пізніше завдяки переносу мікробіологічної техніки на новий об'єкт (Шапіро, Варшавер, Маршак, 1973). З 1976 року ми розпочали спільні дослідження з лабораторією генетики соматичних клітин Інституту молекулярної генетики РАН по вивченню мутагенної дії ДНК-геномних онкогенних вірусів у рамках Всесоюзної програми "Онкогенетика". Ці дослідження були пізніше відзначені в книзі "Непостійність геному" (Хесін, 1984) та в журналі "Trends in genetics" (Sassone-Corsi, 1986) як новий напрямок, присвячений дослідженню мутагенної активності трансформуючих вірусних генів та їх регуляції.
Залишалося багато невирішених питань, що стали предметом досліджень даної роботи, а саме: чи є спільні закономірності в мутагенній дії онкогенних та неонкогенних вірусів, які ділянки вірусного геному відповідальні за мутагенну активність, яка справжня роль вірусних онкогенів у мутаційному процесі. Яким чином екзогенні ДНК здійснюють мутагенну дію на клітини: через продукти експресії, інтеграційну взаємодію геномів або вплив на репаративні системи. Далі виникало питання про роль клітинних генів і регуляторних елементів, що активуються під впливом вірусів, у мутаційному процесі. І, у зв'язк, з цим уявлення про інформаційно-регуляторний вплив екзогенних біомолекул на генетичні процеси.
Вирішення цих питань важливе для розуміння механізмів мутаційного процесу, індукованого екзогенною ДНК в еукаріотичних системах, можливостей його регуляції за допомогою певних нуклеотидних послідовностей і в підсумку - для створення загальної теорії біологічного мутагенезу.
З'вязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота Лукаш Л.Л. відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України: бюджетні теми "Вивчення частоти мутацій, що знову виникають, у дітей та в модельних системах" (№ держ. реєстрації 80061026, 1980-1982рр.), "Оцінити генетичні ефекти впливу ряду біологічних факторів забруднення оточуючого середовища на людину та в модельних системах" (№ держ. реєстрації 01.83.0005627, 1983-1987рр.), "Вивчити можливу трансформуючу та мутагенну дію генноінженерних конструкцій, що містять гени людини" (№ держ. реєстрації 01.88.0081989, 1988-1992рр.), "Розробка експериментальних підходів до захисту геному людини від токсичних та мутагенних дій з використанням модельних систем" (№ держ. реєстрації 0193U026687, 1993-1997рр.).
Частково робота виконувалась в рамках отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів: "Регуляція мутаційного процесу в клітині" (програма "Фонд фундаментальних досліджень" ДКНТ України, шифр 5.2/22, 1993-1994рр.), "Комплексна оцінка частоти мутацій в геномі ссавців і розробка засобів їх захисту від шкідливих дій" (програма "Захист генофонду населення України", ДКНТ України, шифр 1.01.01/041-92, 1992-1995рр.), "Розробка способу одержання білків людини (інсулін та інш.) в культурі клітин ссавців (программа "Біотехнологія", ДКНТ України, шифр 1.11.04/012-92, 1992-1995рр.), гранти DHHS CA21253 (V.M.M.), CA18137 (A.E.P.) та CA47228 (M.E.D.) від Національного Інституту Рака, США.
Мета і задачі дослідження. Основною метою дисертаційної роботи було виявити зв'язок індукованого мутагенезу в системі екзогенна ДНК - клітина ссавців з експресією трансформуючих генів вірусного і клітинного походження та пригніченням репаративних клітинних ферментів. При цьому вивчався вплив екзогенних вірусів, активних або інактивованих тим чи іншим способом молекул ДНК та О6-бензилгуаніну на спонтанний та індукований хімічними агентами мутагенез в соматичних клітинах ссавців.
Для досягнення мети були сформульовані основні завдання дослідження:
1) На основі аналізу літературних та власних даних встановити особливості, що характеризують мутаційний процес, індукований вірусами та вірусними ДНК, у клітинах ссавців.
2) Вивчити зв'язок індукованого мутагенезу в популяціях соматичних клітин in vitro з трансформуючою та онкогенною активністю досліджуваних аденовірусів або фрагментів їх геному (при співставленні з дією деяких хімічних агентів).
3) Дослідити вплив деяких регуляторних факторів (пухлинний промотор ТРА, вірусний енхансер, ДНК-повтори, нуклеотидтрифосфати), що підсилюють або послаблюють експресію ранніх вірусних генів, на індукований мутагенез.
4) З'ясувати можливість прояву генетичної дії гена препроінсуліну людини, що активується під впливом аденовірусної інфекції, при введенні його в клітинну систему у вигляді лінійного фрагменту або в складі різних молекулярних конструкцій.
5) Вивчити вплив на мутаційний процес в системі екзогенна ДНК - клітина нестабільного генетичного елемента Аlu з області помірних повторів геному людини, де локалізуються сайти переважної інтеграції ДНК-вмісних вірусів.
6) Перевірити можливість інгібування репаративних ферментів (на прикладі О6-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази) при введенні в клітини активних або інактивованих алкілуванням ДНК, а також вільної модифікованої основи - О6-бензилгуаніну.
7) Здійснити молекулярний аналіз спектру та локалізації мутацій в локусі hprt, індукованих монофункціональним алкілуючим агентом нітрозогуанідином, за умов активної та пригніченої репаративної активності.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що трансформуючі гени і генетичні елементи екзогенного походження (ранні оперони аденовірусу, ген тимидинкінази вірусу герпеса, мутантний ген препроінсуліну людини, ретропозон Аlu), які беруть участь у стимуляції реплікації клітинної ДНК та інших матричних процесів одночасно впливають на ймовірність виникнення мутацій в соматичних клітинах ссавців. На основі узагальнення одержаних експериментальних даних розроблено концепцію регуляції мутаційного процесу під впливом екзогенних нуклеотидних послідовностей.
На моделі аденовірус - клітина ссавців in vitro показано залежність індукованого мутагенезу від експресії та взаємодії ізольованих ранніх оперонів Е1А, Е1В та Е4 і встановлено деякі закономірності прояву цього процесу на клітинно-популяційному рівні.
Встановлено, що універсальний генетичний елемент Аlu з геному людини, який має структуру ретропозона і є переважним місцем інтеграції екзогенних ДНК, спричиняє індукцію генних і хромосомних мутацій при введенні його в клітини в складі рекомбінантних плазмід. Цей мутагенний ефект можна співставити з дією ранніх вірусних оперонів і хімічного супермутагену.
Показано, що мутантний ген препроінсуліну людини екзогенного походження проявляє генетичну активність, яка залежить від рівня його експресії в клітинних системах in vitro та in vivo. Білковий продукт цього гена, інсулін, у певній концентрації здійснює антимутагенну дію стосовно рекомбінантної плазміди pHB320, яка містить мутагенно активні нуклеотидні послідовності вірусного та бактеріального геномів.
На основі аналізу власних та літературних даних зроблено висновок про те, що не тільки екзогенні віруси, а також ДНК і навіть окремі модифіковані основи здатні до інгібування активності репаративних ферментів. Вперше показано ефект підсилення мутагенезу, індукованого монофункціональним алкілуючим агентом MNNG, у присутності молекул активної та/або алкілованої ДНК екзогенного походження. Встановлено, що О6-бензилгуанін, який практично повністю пригнічує репаративну активність ферменту О6-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази (АГТ), спричиняє максимальне підвищення мутагенного ефекту нітрозогуанідину.
Молекулярний аналіз мутацій в кодуючій частині гена hprt, індукованих MNNG за умов активної та пригніченої репарації, дозволив встановити деякі особливості роботи АГТ: однакову ефективність стосовно транскрибованої та нетранскрибованої ниток ДНК і підвищену точність виправлення пошкоджень на ГЦ-багатих ділянках, що мають значно вищу температуру плавлення і довше зберігають двониткову структуру ДНК.
Розроблено підхід, що дозволяє оцінювати мутагенний та онкогенний потенціал генів, генетичних елементів та векторних молекул різного походження при введенні їх в клітини ссавців у комбінації з пухлинним промотором ТРА. На прикладі фізичних, хімічних та біологічних чинників продемонстровано, що ТРА вибірково підсилює мутагенний ефект тільки тих із них, що мають канцерогенну активність. І, таким чином, одержано додаткові дані, які підтверджують існування спільних механізмів в процесах мутагенезу і злоякісної трансформації клітин ссавців, незалежно від природи діючих чинників.
Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Розроблена нами концепція регуляції мутагенезу в соматичних клітинах ссавців під впливом екзогенних нуклеотидних послідовностей вносить суттєвий вклад в розвиток теорії мутагенезу, що має загальнобіологічне значення.
На основі аналізу літературних і власних даних в галузі біологічного мутагенезу та антимутагенезу сформовано уявлення про те, що активні макромолекули екзогенного походження (трансформуючі гени, генетичні елементи, окремі білки та інш.) здійснюють регуляторно-інформаційний вплив на мутаційний процес через втручання в процеси, що протікають на матриці клітинної ДНК. Залежно від структури і умов функціонування в клітинній системі вони можуть сприяти як підвищенню, так і зниженню частоти спонтанних та індукованих іншими агентами мутацій.
Практичне значення даної роботи полягає у використанні одержаних результатів і розроблених методичних підходів у дослідницькій роботі в галузі експериментального мутагенезу і генної інженерії. Так, індукція генних мутацій в клітинах ссавців під впливом аденовірусів з різним онкогенним та інфекційним потенціалом (поряд з іншими розповсюдженими ДНК- та РНК-геномними вірусами) є свідченням універсальності цього явища і вказує на роль вірусів у формуванні мутаційної складової генетичного вантажу популяцій. Наявність кореляції мутагенної активності з інфекційними і онкогенними властивостями аденовірусів дозволяє передбачати генетичні наслідки вірус-клітинної взаємодії. Зазначено, що під впливом генетичних досліджень останнім часом спостерігається позитивна тенденція конструювання векторних молекул на основі аденовірусів з видаленням ранніх вірусних оперонів, які є генетично небезпечними.
Одержані нами дані про генетичну активність гена препроінсуліну з делецією частини регуляторної зони та широко розповсюдженого Аlu-елемента в чужорідному нуклеотидному оточенні (бактеріальні плазміди), вказують на необхідність тестування на мутагенність нових рекомбінантних конструкцій, що пропонуються для генної терапії.
Розроблений і апробований нами комплексний методичний підхід: конструювання спеціальних модельних систем екзогенна ДНК - клітина з використанням регуляторних факторів (генетичні елементи, пухлинний промотор ТРА, нуклеотидтрифосфати) - пропонується для вивчення онкогенних та мутагенних властивостей екзогенних нуклеотидних послідовностей, а також молекулярних механізмів їхньої дії. Його застосування дозволяє вивчати залежність прояву мутагенезу від низки параметрів у системі та проводити математичне моделювання цього процесу.
Одержані в рамках дисертаційної роботи результати і методичні прийоми створили основу для розробки спільно з Інститутом медицини праці АМН України експериментальних підходів до захисту геному людини від дії мутагенних чинників професійної шкідливості.
Ряд резистентних до 6-меркаптопурину клітинних клонів використано в експериментах із вивчення внутрішньогенної комплементації в Інституті молекулярної генетики РАН і надано в розпорядження лабораторії канцерогенезу Мічіганського університету США.
Результати роботи використовуються при читанні курсу лекцій з молекулярної генетики студентам Київського національного університету ім. Тараса Шевченка і стажерам кафедри медичної генетики Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П. Л. Щупика МОЗ України.
Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні та експериментальні ідеї, що розроблялися в дисертації, належать автору. Основні експериментальні результати, викладені в дисертації, одержані автором самостійно. У виконанні окремих експериментів брали участь співробітники відділу генетики людини, регуляторних механізмів клітини та інших відділів ІМБіГ НАНУ, Інституту експериментальної патології, онкології і радіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ, а також співробітники Інститутів молекулярної генетики та молекулярної біології РАН, Мічіганського та Пенсильванського державних університетів США. Це відзначено на сторінках дисертації. Одержані в співробітництві з колегами результати опубліковано в спільних наукових працях, які наведені в переліку робіт за темою дисертації.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на II и III Всесоюзних нарадах з питань генетики соматичних клітин в культурі (м. Звенігород Московської обл., 1983, м. Черніголовка, 1993), на II Республіканській науковій конференції (м. Полтава, 1983), на XIV щорічній конференції Європейського товариства по мутагенам зовнішнього середовища (м. Москва, 1984), на I Всесоюзному з'їзді медичних генетиків (м. Київ, 1984), на VIII радянсько-французькому симпозіумі "Молекулярна біологія білків та нуклеїнових кислот" (м. Москва, 1986), на VII Республіканській нараді з питань генетичної інженерії (м. Київ, 1986), на V з'їзді Всесоюзного товариства генетиків та селекціонерів ім. М. І. Вавілова (м. Москва, 1987), на Всесоюзній конференції "Молекулярна біологія генів вищих організмів (м. Москва, 1987), на Всесоюзній робочій нараді "Молекулярна біологія ДНК-вмісних вірусів, що мають практичне значення для сільського господарства і медицини" (м. Київ, 1987), на XVIII Міжнародному генетичному конгресі (м. Торонто, 1988), на Всесоюзній конференції "Генна і клітинна інженерія в рішенні фундаментальних проблем біотехнології" (Тарту-Кяерику, 1988), на I з'їзді медичних генетиків УРСР (м. Львів, 1988), на XII щорічній конференції Американського товариства по мутагенам зовнішнього середовища (Флорида, 1991), на Гордонівській конференції по репарації ДНК ссавців (Каліфорнія, 1991), на V Міжнародній конференції по канцерогенним та мутагенним сполукам (м. Вюрцбург, 1992), на Міжнародних симпозіумах "Досягнення в генній технології" (Маямі, 1994, Монако, 1994), на II з'їзді медичних генетиків України (м. Львів, 1995), на Міжнародному симпозіумі з питань клітинних і молекулярних механізмів канцерогенезу та мутагенезу (м. Іст-Лансинг, 1997), на міжнародних конференціях "Моделювання дінамічних систем" (м. Київ, 1997, 1999).
Публікації. Матеріали дисертаційної роботи в повному об'ємі надруковано в 3 розділах монографій і 32 статтях у вітчизняних та міжнародних фахових виданнях: з них 29 - у наукових журналах і 3 - у збірниках наукових праць.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, 6 розділів (огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень та їх обговорення), підсумків, висновків та списку літератури, який охоплює 495 посилань. Робота викладена на 266 сторінках машинописного тексту і містить 60 таблиць та 38 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи. Для роботи використовували 14 основних культур клітин ссавців і похідні генетично змінені клони, а також щурів лінії Wistar. Лінії фібробластів шкіри людини SL68 та XP12BE одержано від Дж.Маккормика та В.Махер (Мічіганський державний університет США), стандартні лінії клітин людини (ЛЕЛ та HeLa) і миші (C3H10T1/2Cl8 та C3НLtk-) - з колекції клітинних культур Інституту вірусології ім. Д.І.Івановського, культуру нирок великої рогатої худоби MDBK - від О.С.Залманзон (Інститут молекулярної біології РАН), стандартну лінію фібробластів китайського хом'ячка Blld-ii-FAF28Cl237A - з колекції клітинних культур Інституту медичної генетики РАМН, а похідний від нього клон Blld-ii-FAF28Cl237-8Glu-ts - з колекції Інституту молекулярної генетики РАН, трансформовану BAV3 культуру сірійського хом'яка КОХ - від М.М.Стрижаченка (ветеринарна академія ім. К.М.Скрябіна). Первинні культури клітин людини ФЕЛ та ГЕЛ одержано О.М.Сухорадою, а трансформовані культури миші (ВТ та 5DT) і клони, резистентні до аналогів пуринових основ та оубаїну, - Л.Л.Лукаш (ІМБіГ НАНУ).
Клітини ссавців in vitro культивували і клонували на середовищі Ігла з додаванням 10-30% сироватки великої рогатої худоби, антибіотиків і відповідних селективних агентів (Шапіро, Варшавер.,1975). Умови утримання і годування самців Wistar були стандартними (Западнюк і співавт.,1983). Перед ін'єкцією рекомбінантної ДНК з геном препроінсуліну в експериментальних тварин викликали стан інсулінозалежного діабету введенням стрептозотоцину (Титок і співавт., 1990,1993).
Всього було досліджено 27 біологічних агентів з різним рівнем експресії в соматичних клітинах ссавців. Серед них три аденовірусних клони, два препарати лінійних вірусних ДНК, окремі рестрикційні фрагменти ДНК вірусного і клітинного походження і клоновані в складі плазмід pBR325 та pBR322. Неонкогенний аденовірус людини типу 1 (Ad1) одержано з Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Низькоонкогенний клон аденовірусу великої рогатої худоби типу 3 (BAV3-3), виділений методом подвійного клонування з штаму WBR-1, було надано О.С.Залманзон. Високоонкогенний клон цього ж вірусу BAV3-1 одержано від Sugino з Японіі. Рекомбінантні плазміди, що включають фрагменти аденовірусної ДНК, надано Калініним В.Н. (Інститут вірусології ім. Д.І.Івановського РАМН). Рекомбінантні ДНК, що містять геном вірусу гепатиту В, ген препроінсуліну та Alu-повтор геному людини (всього 10 препаратів) надано з відділу регуляторних механізмів клітини ІМБіГ НАНУ. Рекомбінантна плазміда pGins на основі pHB320 сконструйована Л.М.Неборачко і І.С.Варзановою, pAins, що містить Alu-повтор з геному людини і ген препроінсуліну, - І.Е. Костецьким, pBR322insN, що містить вставку з 4 нуклеотидів в області ініціації трансляції гена препроінсуліну, - Ю.В.Пацковським (ІМБіГ НАНУ). Алкілування pAins диметилсульфатом проведено Ю.В.Пацковським за методом (Leng et al., 1968). Рекомбінантна плазміда рAL1 - похідна pUC18, одержана з колекції Інституту цитології РАН, С.-Пітербург).
Серед основних хімічних речовин, використаних у роботі, є О6-бензилгуанін, інгібітор активності репаративного ферменту О6-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази АГТ (наданий A.Пегом з Пенсильванського державного університету США), монофункціональний метилюючий агент N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідин (нітрозогуанідин або MNNG), синтезований в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАНУ, пухлинний промотор 12-О-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетат (TPA, фірма Sigma), галогенізований аналог тимідину 5-бромдезоксиуридин, який не проявляє канцерогенної дії (фірма Serva).
Вірус концентрували і очищували за стандартною методикою (Green і Pina, 1963). Напрацювання вірусних та плазмідних ДНК з відповідного біологічного матеріалу проводили за стандартними методами (Маніатіс і співавт., 1984). Рестрикцію здійснювали за допомогою ендонуклеаз XBA1 та EcoR1. Рестрикційні фрагменти ДНК розділяли в пластинчастих агарозних гелях з додаванням 0.6 мкг/мл бромистого етидію.
Комплексні методи, що використано при обробці клітин агентами різної природи в умовах in vitro та in vivo і схеми проведення експериментів з генетичної трансформації та мутагенезу, детально описано нами раніше (Бужиєвська і співавт., 1986, Титок і співавт., 1993, Лукаш і співавт., 1995). Множинність інфікування клітин вірусами становила від 0,01 до 80,00 БУО/кл., а діапазон концентрацій ДНК у різних експериментах - від 0.5 до 10 мкг/мл (10 - 700 тисяч молекул на клітину). Для трансфекції клітин ДНК застосовували оригінальний "кальцій-фосфатний" метод (Graham, van der Eb,.1973, 1980). Хімічні речовини в концентраціях, що знижували виживання клітин на 10-90%, додавали в ростове середовище. Контрольні клітини зазнавали тих же процедур, що й дослідні, але без вживання мутагенів.
При дослідженні експресії екзогенної ДНК визначали продукцію відповідного білка імуноферментним методом (Van Wyke et al.,1980). Облік фокусів трансформації в культурі клітин С3Н10Т1/2Cl8 проводили за методикою Гейдельбергера і співроб. (1973). При дослідженні здатності клітин до клоноутворення в "м'якому" агарі використовували стандартну методику (MacPherson., Montagnier., 1964). З метою вивчення пухлиноутворюючої здатності, трансформовані клітини вводили під шкіру новонароджених сингенних тварин за умов імунодепресії і вели спостереження протягом 5 місяців. Індикацію пухлин проводили візуально та пальпацією з наступним гістологічним аналізом.
Для встановлення мутагенної активності чинників різної природи на генному рівні як модель використовували прямі мутації стійкості до аналогів пуринових основ (Шапіро, Варшавер.,1975) та стійкості до оубаїну (Landolph, 1980). В окремих експериментах вивчали ts-реверсії від ауксотрофності до прототрофності за глютаміном (Варшавер і співавт., 1976). Препарати метафаз готували за загальноприйнятою методикою (Moorheed et al., 1960). Для одержання метафаз з клітин костного мозку використовували метод Форда і Вольмана (1963). Метафази для аналізу відбирали за рекомендаціями Бочкова (1974).
Клітини мутантних клонів випробовували на перехресну стійкість до різних аналогів пуринових основ і аміноптерину, а також на середовищі HAT (Волкова, Какпакова, 1972). Молекулярний аналіз мутантних клонів проводили на базі лабораторії канцерогенезу Мічіганського університету США. Синтез однониткової кДНК на матриці тотальної полі(А)-мРНК з клітинного лізату, утворення двониткової кДНК гену hprt, ампліфікацію кодуючої частини гена за допомогою процедури полімеразної ланцюгової реакції (30 циклів) та пряме сиквенування здійснено за методом (Yang, Maher, McCormick, 1989). Рівень активністі О6-алкілкуанін-ДНК-алкілтрансферази (АГТ) визначали в клітинних екстрактах у fмолях О6-метилгуаніну, звільненого з ДНК на мг білку (Dolan et al., 1990).
Статистичний аналіз одержаних даних проводився за методом Фішера та Ст'юдента (Урбах, 1964, Плохинський, 1980). Для порівняння величин, що спостерігаються та очікуються, застосовували критерій "c2". Апроксимуючі лінії на рисунках були розраховані за методом найменших квадратів. При побудові математичної моделі прояву мутагенезу в клітинній системі in vitro були використані методи нелінійної термодинаміки відкритих систем, статистичної фізики, інтегрального та дифференціального обчислення.
Індукція генних мутацій в клітинах ссавців під впливом екзогенних аденовірусів та їх ранніх оперонів. У дисертації на основі аналізу та узагальнення літературних даних в галузі біологічного мутагенезу зроблено висновок, що активні макромолекули екзогенного походження (трансформуючі гени, генетичні елементи, окремі білки та інше) здійснюють регуляторно-інформаційний вплив на мутаційний процес через втручання в основні матричні процеси, що протікають на клітинній ДНК. В залежності від структури і умов функціонування в даній клітинній системі, вони можуть сприяти як підвищенню, так і зниженню частоти спонтанних та індукованих іншими агентами мутацій.
Відправним припущенням було те, що ранні оперони аденовірусу, які беруть участь у стимуляції реплікації клітинної ДНК та інших матричних процесів, є первинним індуктором мутаційних пошкоджень. Якщо це так, то індукований мутагенез в системі аденовірус - клітина безпосередньо залежить від рівня експресії вірусних генів і дії регуляторних чинників, що його змінюють. В непермісивних клітинах гризунів спостерігається експресія ранніх оперонів Е1А, Е1В та Е4 аденовірусу, які відповідальні за злоякісну трансформацію клітин (рис. 1). Прояв мутагенного ефекту в часі може бути пов'язаний з максимальною експресією неінтегрованих молекул вірусної ДНК безпосередньо після обробки клітин, а також з експресією інтегрованих нуклеотидних послідовностей у порівняно віддалені терміни, що узгоджується з уявленням про певну еволюцію
Рис. 1. Рестрикційна карта геному BAV3-3. 1. E1A, E1B та E4 - ранні оперони, що експресують в непермисивних клітинах . 2. A, B та C - фрагменти геному, одержані за допомогою рестриктази XBA1. 3. A, B, C, D, F та G - фрагменти геному, одержані за допомогою рестриктази EcoR1. 4. Схематичне зображення геному BAV3. Рис.2. Фрагменти геному BAV3, одержані за допомогою рестриктази EcoR1: 1)BAV3-3, 2)BAV3-4, 3)BAV3-1, 4)pBR325-5D, 5)pBR325-9D, 6)BAV3-6, 7)BAV3-5, 8) та 9) - вихідний штам WBR1.
Рис.3. Стимуляція поділу клітин китайського хом'ячка під впливом BAV3-3.
екзогенної генетичної інформації в клітинах ссавців. При цьому виокремлюються
стадії: 1) транзиторної експресії, що передує інтеграції; 2) становлення інтегрованого стану та 3) стабільної генетичної трансформації (Томілін, 1983, Агеєнко, 1986). На основі цих міркувань нами зроблено математичне моделювання прояву мутагенезу в системі вірусна ДНК - клітина.
Експериментів у галузі мутагенезу з прямим введенням окремих вірусних генів і взагалі нуклеотидних послідовностей екзогенного походження до наших робіт проведено не було. Не вивчались кількісні характеристики індукованого мутагенезу, особливо динаміка процесу, взаємодія екзогенних генів-мутаторів.
На першому етапі вивчення феноменології мутагенезу ми розробили і апробували комплексний методичний підхід: конструювання спеціальних модельних систем екзогенна ДНК - клітина, з використанням регуляторних факторів (генетичні елементи, пухлинний промотор ТРА, нуклеотидтрифосфати), для вивчення онкогенних та мутагенних властивостей різних нуклеотидних послідовностей, а також механізмів їх дії. Застосування цього підходу дозволяє вивчати залежність прояву мутагенезу від низки параметрів в даній клітинній системі за певних умов і проводити математичне моделювання процесу.
У спеціальних експериментах було досліджено ефективність інфекції та трансфекції клітин під впливом біологічних чинників, а також здатність їх до стимуляції поділу та/або до злоякісної трансформації клітин в умовах in vitro та in vivo. Для цього використовувались вірусні часточки, а також лінійні та клоновані в бактеріальних плазмідах фрагменти ДНК вірусного і клітинного походження (рис. 2,3). Діапазон доз знаходився в межах, що встановлені для експериментів з генетичної трансформації (Томілін,1983). Проведено порівняння трансформуючої та онкогенної активності цих чинників з дією хімічних мутагенів з метою подальшого дослідження їх генетичних ефектів.
На прикладі фізичних, хімічних та біологічних факторів продемонстровано, що ТРА вибірково підсилює мутагенний ефект тільки тих із них, що мають канцерогенну активність. Ці дані вказують на існування спільних механізмів в процесах мутагенезу і злоякісної трансформації, індукованих чинниками різної природи.
Показано, що аденовіруси з різними онкогенними та інфекційними властивостями здатні трансформувати клітини гризунів in vitro та спричиняти статистично достовірне підвищення частоти мутацій в унікальних послідовностях клітинної ДНК (на прикладі трьох генних локусів), та областях помірних ДНК-повторів (хромосомні розриви) в ранні терміни після інфікування. Частота індукованих мутацій корелює з інфекційністю вірусних клонів, тобто, чим повніше виявляється вірусна генетична інформація, тим значнішим є мутагенний ефект. Це узгоджується з результатами, одержаними іншими авторами (Блюмкін, Жданов, 1973, Бужиєвська, 1984).
Статистично достовірний мутагенний ефект вірусних часточок (клони BAV3-1, BAV3-3) та вірусної ДНК виявлено нами на 2-3 добу після інфікування клітин (рис. 4). Цей ефект співпадає в часі з тимчасовою експресією вірусоспецифічних Т-антигенів. Різке зниження частоти індукованих мутацій в подальші терміни, ймовірно, пояснюється деградацією неінтегрованих молекул ДНК екзогенного походження.
Вперше доведено, що аденовірус є комплексним мутагеном, результуючий мутагенний ефект якого в непермісивній системі визначається взаємодією лінійних фрагментів геному, що містять ранні оперони Е1А, Е1В та Е4 (рис. 5).
Рис. 4. Залежність мутагенного ефекту вірусних часточок та вірусної ДНК від часу. Множинність інфікування клітин вірусом 10 БУО/кл. Концентрація ДНК - 1 мкг/мл. Рис. 5. Частота мутантів при дії рестрикційних фрагментів BAV3-1 (ряд 1) та BAV3-3 (ряд 2). Позначення: DNA - вірусна ДНК; В - фрагмент ХВА1-В; D - фрагмент EcoR1-D; C - фрагмент XBA1-C; (B+C) - фрагменти XBA1-B+XBA1-C; (D+C) - фрагменти EcoR1-D+XBA1-C.
Максимальний мутагенний ефект повної трансформуючої області Е1 BAV3-3 (фрагмент XBA1-B) спостерігався у віддалені терміни після трансфекції клітин in vitro (рис.6) і збігався в часі (3 тижні) з виявленням пухлиноутворення при тестуванні трансформованих клітин in vivo (рис. 7). За цих же умов трансформуюча і мутагенна активність фрагменту EcoR1-5D з делецією регуляторних послідовностей (енхансер і перший екзон гена Е1А) суттєво знижена (рис. 6). Рестрикційний фрагмент ДНК, який містить пізню ділянку вірусного геному, що не експресується в непермісивній клітинній системі, взагалі не підвищував рівень мутацій.
Секвенування клонованих рестрикційних фрагментів геному високо- та низькоонкогенного вірусних клонів BAV3-1 та BAV3-3, проведене О.С.Залманзон і Р.Л.Турецькою (1985), дозволило виявити нестабільну ділянку ДНК-повторів між оперонами Е1А та Е1В (рис. 1,2). Це дало підстави припустити, що різниця в онкогенності та мутагенності досліджуваних аденовірусних клонів, можливо, пов'язана з внутрішньою гетерогенністю їх популяцій внаслідок відбору домінуючих варіантів вірусних часточок з різним рівнем експресії онкогену.
При використанні клонованих у бактеріальній плазміді EcoR1-фрагментів вірусного геному нами було доведено, що нестабільна ділянка дійсно впливає на онкогенний та мутагенний ефекти оперону Е1В (рис. 8, фрагменти 9D,LD,5D)). В популяції викокоонкогенного клону BAV3-1 є один мажорний варіант оперону Е1В з ДНК-повторами: відповідний рестрикційний фрагмент геному LD проявляє онкогенну та мутагенну активність з високою достовірністю. В популяції низькоонкогенного клону BAV3-3 є два мажорних варіанти: 1) фрагмент геному 5D має більшу за величиною ділянку ДНК-повторів і характеризується онкогенною та мутагенною активністю; 2) фрагмент геному 9D з найменшою вставкою порівняно з двома попередніми фрагментами зовсім не проявляє онкогенної та мутагенної активності без використання регуляторних підсилювачів.
Рис. 6. Залежність мутагенного ефекту рестрикційних фрагментів ДНК BAV3-3 від часу після трансфекції. Цифрами позначено: 1 - фрагмент XBA1-B; 2 - фрагмент XBA1-C; 3 -фрагмент EcoR1-5D. Рис. 7. Залежність пухлиноутворюючої здатності клітин від часу після обробки клітин вірусом BAV3-3. Множинність інфікування клітин вірусом 10 БУО/кл.
Підвищення трансформуючої активності оперону Е1В за допомогою пухлинного промотору ТРА призводить до зростання частоти індукованих мутантів у клітинній системі під впливом фрагментів ДНК, що містять оперон Е1В з різним числом ДНК-повторів (рис. 8). Навіть у випадку фрагмента геному 9D спостерігається достовірне зростання частоти мутантів і пухлин відносно контролю, тобто йому властива внутрішня біологічна активність. За цих же умов вихідна плазміда pBR325 та рекомбінантна плазміда, що містить пізні гени BAV3-3 (фрагмент С), не спричиняє підвищення частоти мутантів по досліджуваному локусу.
Мутаторну природу раннього оперону Е1В, відповідального за здатність до пухлиноутворення трансфікованих клітин, остаточно підтверджено в експериментах по встановленню мутаційного темпу в популяції трансформованих клітин за допомогою флуктуаційного тесту. Лінія 5DT, що містить інтегровану вірусну послідовність, відрізняється підвищеним мутаційним темпом на локус на генерацію (13 x 10-8) порівняно з вихідною клітинною лінією (1 x 10-8) та пухлинною лінією спонтанного походження (2 x 10-8). Аналогічні дані одержано раніше для клітинніх ліній, трансформованих під впливом паповавірусу, SV40 (Goldberg, Defendi, 1979).
Рис. 8. Вплив пухлинного промотору ТРА на трансформуючу (1) і мутагенну (2) дію ДНК BAV3 та клонованих у плазміді pBR325 фрагментів вірусного геному, що містять оперон Е1В.
Концентрація ДНК - 3.0 мкг/мл ТРА - 0.1 мкг/мл
Таким чином, нами було доведено, що в непермісивних для аденовірусу клітинах мутагенний ефект залежить від експресії та взаємодії системи ранніх оперонів Е1А, Е1В та Е4, які відповідають за злоякісну трансформацію клітин. Зміна онкогенної активності раннього оперону Е1В за допомогою генетичних регуляторних елементів (енхансеру, оперону Е1А) та пухлинного промотору ТРА призводить до відповідного впливу на мутагенний ефект.
За нашими даними не тільки регуляторні оперони аденовірусу, а також ранні гени інших вірусів (ген тимідинкінази вірусу герпеса, онкогени ретровірусів) здатні індукувати генні мутації в соматичних клітинах гризунів. Раніше при використанні чутливого до температури вірусу SV40 було показано, що ранній ген А, відповідає як за злоякісну трансформацію клітин, так і за індукцію мутацій (Горбунова і співавт., 1980). Аналогічні дані одержано іншими авторами для трансформуючих генів аденовірусу людини типу 12 (Durnam et al., 1986, Shramayr et al., 1990), вірусу групи герпесу (Shilitoe et al., 1993).
Сукупність даних свідчить про те, що ранні гени ДНК-геномних вірусів, які стимулюють реплікацію клітинної ДНК (та інші матричні процеси), дійсно є індукторами мутагенезу. Індукований мутагенез на 2-3 добу після трансфекції, очевидно, пов'язаний з періодом тимчасової експресії і залежить від рівня експресії ранніх вірусних генів. У дещо віддалені терміни (2-3 тижні), ймовірно, додаються такі дестабілізуючі чинники як інтеграційний процес (Газарян, 1985) та зміна активності клітинних генів при перепрограмуванні геному під впливом вірусної генетичної інформації.
Індукція генних мутацій і хромосомних мутацій під впливом клітинних нуклеотидних послідовностей екзогенного походження. Припуcкається, що зміна активності клітинних генів та генетичних елементів (ген препроінсуліну, Alu-елемент), що стимулюються під впливом аденовірусної інфекції, також вносить певний вклад у мутаційний процес. Відомо, що білкові продукти оперонів Е1А та Е1В суттєво впливають на експресію клітинних генів (Агеєнко, 1986, Babiss et al., 1995).
В експериментах на клітинах гризунів було виявлено мутагенний ефект екзогенного лінійного фрагменту геному людини, що містить ген препроінсуліну з делетованим регуляторним елементом, який забороняє експресію в неспеціалізованих клітинах. Мутагенний ефект варто визнати слабким, оскільки він проявляється при концентрації ДНК в десять разів більший (10 мкг/мл), ніж при використанні лінійних фрагментів геному BAV3. При цьому частота індукованих мутантів на третю добу після трансфекції була значно нижча, ніж при дії трансформуючого фрагменту BAV3, (кратність перевищення контрольного рівня в першому випадку 1.49 - 1.68, в другому - 3.26-17.00). У віддалені терміни після трансфекції (9-24 доба) мутагенний ефект, індукований фрагментом геному людини, не вдавалося зареєструвати. Одержані нами дані було підтверджено при використанні рекомбінантної конструкції pBR322ins, що містила ту ж мутантну алель гена препроінсуліну. Кратність перевищення частоти мутантів за середніми даними трьох експериментів становила 1.65 (табл. 1).
Таблиця 1
Частота мутантів, стійких до 6-МП, після трансфекції клітин рекомбінантною ДНК pBR322insN
Варіанти Число молекул Вибірка Частота Відношення
ДНК на клітину, х105 Клітин, х103 мутантів, х10-5 Р досл../ контроль
Контроль - 1800 6.57 - -
pBR322 7 1875 8.01 >0.05 1.22
pBR322ins 7 1475 10.86 <0.001 1.65
pBR322insN 7 1650 8.69 >0.05 1.32
Примітки: 1. В таблиці представлено усереднені дані трьох дослідів.
2. Час експресії мутацій - 3 доби.
Для з'ясування ролі експресії гена препроінсуліну в цьому ефекті було одержано конструкцію pBR322insN, що містила інсерцію з 4 нуклеотидів, яка повинна була призвести до його інактивації. На відміну від pBR322ins після трансфекції клітин ДНК pBR322insN частота мутантів не відрізнялась суттєво від контрольного рівня (табл. 1). Якщо брати до уваги те, що інактивуюча мутація знаходиться в зоні ініціації трансляції, то можна сказати, що вирішальну роль в прояві генетичної активності має присутність у клітинах білка-продукту, а не РНК-транскриптів. Додатковим підтвердженням ролі активованого гена препроінсуліну в мутаційному ефекті є те, що лінійні фрагменти ДНК з клітин сірійського хом'яка не спричиняли генних мутацій.
Подальше зростання рівня експресії гена препроінсуліну під впливом вірусних регуляторних елементів призвело не до підвищення, а до зниження його мутагенної активності (рекомбінантна конструкція pGins). Можливо, в цьому випадку ми маємо справу з явищем антимутагенезу, характерного для тіолових сполук (Ранчялис, Бальчунене, 1995). Мутагенний ефект цих сполук пов'язаний з індукцією нестабільного продукту, перекису водню, який за певних концентрацій проявляє мутагенну активність. При підвищенні концентрації ця сполука швидко розпадається, і це відповідно призводить до зниження частоти мутацій. Наші попередні дані з білковим продуктом, інсуліном, не виключають такого механізму. Таким чином, генетична активність екзогенного гена препроінсуліну залежить від рівня його експресії.
В експериментах з використанням рекомбінантних ДНК, що містили Alu-повтор, ставилось два питання. По-перше: з'ясувати, чи має мутагенну активність цей мобільний генетичний елемент, який сам по собі має здатніть до транспозицій і є найкращим місцем для інтеграції ДНК-геномних вірусів. По-друге: чи впливають на мутагенний ефект один одного Alu-повтор та ген препроінсуліну. За нашими даними рекомбінантна ДНК pAins, яка містить Alu-повтор, має приблизно такий же рівень вираження цього гену, як і плазміда pBR322ins, тобто, присутність Alu-елемента не впливає на його експресію.
Таблиця 2
Порівняння мутагенної активності рекомбінантних плазмід pAL1 та pAins
Варіанти Час після Вибірка Частота Відношення
трансфекції, діб клітин, х103 мутантів, х10-5 Р дослід/ контроль
контроль 400 9.26 - -
pUC-18 3 500 10.16 >0.05 1.10
pAL1 150 29.63 <0.001 3.20
pAins 400 35.94 <0.001 3.88
контроль 500 6.43 - -
pUC-18 9 500 4.57 >0.05 0.71
pAL1 500 6.47 >0.05 1.01
pAins 450 9.88 >0.05 1.54
контроль 500 17.89 - -
pUC-18 3 500 19.13 >0.05 2.07
pAL1 500 50.59 <0.001 2.83
pAins 500 54.28 <0.001 3.03
контроль 1000 4.22 - -
pUC-18 10 400 2.54 >0.05 0.60
pAL1 500 0.94 <0.001 0.22
pAins 500 0.97 <0.001 0.23
Примітка. Концентрація ДНК - 10 мкг/мл.
Показано, що досліджувані рекомбінантні плазміди pAL1 та pAins здатні спричиняти статистично достовірне підвищення частоти мутацій (табл. 2). Спостерігалась пряма залежність мутагенного ефекту цих ДНК від концентрації у діапазоні доз 0.5 - 10 мкг/мл, і навіть при найменшій концентрації 0.5 мкг/мл різниця між дослідом і контролем була статистично достовірна. Мутагенний ефект pAL1 та pAins був значно вищим, ніж при використанні лінійного фрагменту з геном препроінсуліну та рекомбінантної плазміди pBR322ins і наближався до дії ранніх
