МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ ім. М. ГОРЬКОГО

НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГІЇ ТА ОРТОПЕДІЇ

КОРЧАК ОКСАНА МИХАЙЛІВНА

УДК 616.14-002.44-036.12-097

ФУНКЦІОНАЛЬНО-ФЕНОТИПІЧНА МОДИФІКАЦІЯ ФІБРОБЛАСТІВ ХРОНІЧНИХ ВЕНОЗНИХ виразок ІЗ ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДІВ КЛІТИННОГО КУЛЬТИВУВАННЯ

14.03.08 - імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН України.

Науковий керівник – доктор медичних наук, старший науковий

співробітник Трунова Ольга Арнольдівна,

Донецький державний медичний університет

ім. М. Горького, професор кафедри мікробіології,

вірусології та епідеміології.

Офіційни опоненти - доктор медичних наук Білозоров Олексій Павлович,

Інститут дерматології та венерології АМН України,

завідувач лабораторією патофізіології, імунології та

патоморфології,

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Нікольський Ігор Сергійович,

Інститут експериментальної радіології Наукового

центру радіаційної медицини АМН України,

завідувач лабораторією імуногенетики.

Провідна установа - Інститут геронтології АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться „_18_”___травня__ 2007 р. о ___11____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.04 у науково-дослідному Інституті травматології та ортопедії Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (83048, м. Донецьк, вул. Артема, 106).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16).

Автореферат розісланий „__11__” _____квітня____2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, доцент Колесніков А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основне місце в загальній структурі виразок нижніх кінцівок різного генезу (більше 70%) займають трофічні виразки, які виникають внаслідок хронічного порушення венозного відтоку. Таке ускладнення зустрічається приблизно в 2% дорослого населення індустріально розвинених країн, а в людей похилого віку ця цифра досягає 4-5Слід зазначити, що в 40% пацієнтів перша виразка виникає в працездатному віці і ці стани супроводжуються стійкою та тривалою інвалідизацією (Савельев В.С. и соавт., 2001).

Трофічні порушення при хронічній венозній недостатності провокує флебогіпертензія, що призводить до каскаду різноманітних патологічних реакцій на молекулярному, клітинному і тканинному рівнях (Бок И. Ли и соавт., 2003,

В.С. Савельев и соавт., 2001).

За останні роки велику кількість робіт присвячено вивченню популяції фібробластів виразкового дефекту - одного з основних клітинних типів, що відіграють критичну роль у процесах репарації ран (Stanley A.C. et al.,1997, Hasan A. et al., 1997, Agren M. S. et al., 1999, Norgauer J. et al., 2002). В експериментах доведено, що в умовах хронічного запалення проліферативний потенціал цих клітин зазнає різкого зниження (Stanley A. et.al., 2001), порушується відповідь на дію регуляторних сигналів, змінюється біохімічна та секреторна активність фібробластів, помітно знижується ступінь проліферативної відповіді на дію мітогенних факторів, зокрема, факторів росту й інтерлейкінів (Agren M.S. et al., 1999, Loots et al., 2002, Byung-Chul Kim et al., 2003). Крім того, доведено, що у виразковому дефекті відзначаються зміни з боку тканинного мікрооточення, зокрема, на рівні кількісного вмісту факторів росту та дисбалансу між протеазами і їхніми інгібіторами, які можуть викликати зміни складу й структури міжклітинного матриксу, порушення процесу міграції та проліферації клітин (Trengove N.J. et al., 1999, Parks W.C., 1999).

Сукупність цих змін, можливо, є однією з причин тривалого загоєння хронічних ран, а також резистентності їх до традиційних методів терапії. Саме цим і обумовлений пошук нових підходів у терапії трофічних виразок венозної етіології, які враховували б дані аспекти патогенезу (Falanga V., 2001). Як відомо, одним із провідних напрямків терапії хронічних виразок є перемикання запального процесу у фазу проліферації і репарації, коли основним завданням стає стимуляція росту й дозрівання сполучної тканини (Васютков В.Я. и соавт., 1999).

Удосконалення технологій одержання рекомбінантних препаратів дозволило застосувати в якості лікувальних заходів такі методи модифікації клітинного пулу хронічних виразкових дефектів нижніх кінцівок, як топічне використання рекомбінантних цитокінів: фактора росту фібробластів (Richard J. L. et al., 1995,

Robson M.C. et al., 1992,), епідермального фактора росту (Falanga V. et al., 1992, Schultz G. et al., 1991), гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого

фактора (Da Costa R. M. et al., 1997), трансформуючого фактора росту-?

(Robson M.C. et al., 1995), інтерлейкіну-1 (Robson M.C. et al., 1994).

Однак дані про ефективність цих підходів неоднозначні, оскільки немає точних спостережень відносно патологічних змін рецепторного апарату фібробластів хронічного виразкового дефекту, залишається невизначеною незворотність цих змін, потребують на уточнення можливості терапевтичного впливу з урахуванням застосування технологій клітинно-тканинного культивування.

Одним з найбільш перспективних напрямків створення адекватних терапевтичних схем є застосування трансплантатів культур клітин і тканинних еквівалентів при лікуванні даної патології, причому спостерігається підвищений інтерес до використання фетальних тканинних препаратів, що ґрунтується на їхній здатності до відновлення процесів фізіологічної регенерації як за рахунок стовбурових клітин різного рівня потентності, так і відновлення тканинних дефектів за рахунок стимуляції проліферації збережених диференційованих клітинних популяцій (Trent J.F. et al., 1998, Богачев В.Ю. и соавт., 2001, Veves A.

et al., 2001, Harding K.G. et al., 2002).

У цьому напрямку особливого значення набуває вивчення взаємодій між фетальними клітинами як клітинами - індукторами репаративних процесів і клітинними популяціями тканини-мішені. На сьогодні визнаним є факт передачі інформації від клітини до клітини за допомогою рецепторного апарату, що здатний визначати не тільки тип та стадію диференціювання клітини, але і її функціональний стан. Тому виявлення антигенів клітинної поверхні фетальних фібробластів (ФФ) і фібробластів хронічного виразкового дефекту (ФХВД), взаємодій між цими клітинними популяціями є одним з важливих завдань у вивченні спрямованості дії ембріональних препаратів на патологічний процес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана в лабораторії клітинного та тканинного культивування Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН у рамках науково-дослідницької роботи за планом АМН України "Розробити клітинно-тканинні технології для хірургічної профілактики й лікування хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок" (№ держреєстрації 0104U006347, термін виконання 2004-2006 р.р.)

Мета дослідження: визначити функціонально-фенотипічні зміни фібробластів хронічної венозної виразки нижніх кінцівок і можливості їхньої корекції з використанням методів клітинного культивування.

Завдання дослідження:

1. Визначити поверхневі рецептори культивованих фетальних фібробластів і фібробластів здорової шкіри (ФЗШ).

2. Вивчити особливості рецепторного апарату та проліферативної активності фібробластів хронічного виразкового дефекту.

3. Розробити культуральну модель для вивчення процесів спрямованої модифікації рецепторного апарату фібробластів хронічного виразкового дефекту іn vіtro.

4. Визначити резервні можливості відновлення рецепторного апарату фібробластів хронічного виразкового дефекту з використанням методів сукупного культивування з фетальними фібробластами.

5. Оцінити отримані результати для теоретичного обґрунтування можливості клінічного використання запропонованої методики.

Об'єкт дослідження - комплекс мембранних антигенів культивованих фетальних фібробластів, фібробластів здорової шкіри та фібробластів хронічного виразкового дефекту. Мікс-культури фетальних фібробластів та фібробластів хронічного виразкового дефекту.

Предмет дослідження - функціонально - фенотипічна модифікація фібробластів хронічного виразкового дефекту у мікс-культурі з фетальними фібробластами.

Методи дослідження: для одержання культур клітин і створення мікс-культур використовувався метод культивування.

Для визначення фенотипу клітин застосовувалися методи імунофлуоресцентного маркування поверхневих клітинних структур з використанням моноклональних антитіл (МКА), які були рекомендовані для специфічного маркування поверхневих антигенів на 7-мій Міжнародній робочій нараді з питань лейкоцитарних антигенів (Harrogate, UK, 2000): адгезивні молекули міжклітинної взаємодії - CD22, CD44, CD50, CD54, CD56, CD166, молекули адгезії до ендотеліальних клітин й адгезивні молекули ендотеліоцитів - CD31, CD106, CD62E, CD62P, CD62L, молекули, що забезпечують адгезію до міжклітинного матриксу - CD11a, CD11b, CD11c, CD29, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD41a, CD51, CD104, молекули, відповідальні за активацію імунокомпетентних клітин - CD1a, CD2, CD23, CD24, CD36, CD40, CD58, CDw60, CD95, CD141, CD147, CLA, рецептори факторів росту і інтерлейкінів - CD140?, CD140в, ІL-1б-R, ІL-1в -R, CD126, CD128, молекули МНС (Major Histocompatibility Complex) - HLA A,B,C, HLA-DR, CLІР, HLA-DQ.

Для кількісного виміру клітинної проліферації був використаний МТТ(methylthіazoletetrazolіum) – аналіз.

Для вивчення клітинних елементів мікс-культур був застосований метод фарбування клітин вітальними РКН-барвниками (запатентовані барвники, тропні до ліпідних регіонів мембрани клітини - РКН67 та РКН26), а також одночасне маркування PKH-пофарбованих клітин специфічними МКА.

Наукова новизна роботи. Уперше описані фенотипи ФФ, ФЗШ та ФХВД відповідно до панелі МКА, що використовувалась. Уперше визначені функціонально-фенотипічні особливості цих типів клітин. На мембрані ФХВД, у

порівнянні з ФЗШ, знижений рівень експресії або відсутні молекули костимуляції та активації міжклітинних взаємодій (CD58, CDw60, CD141), рецептори адгезії (СD166, CD56, CD54) та б2, б4, б6 ланцюги інтегринів, які необхідні для формування повноцінних рецепторів до колагену, ламініну та фібронектину.

Уперше розроблено культуральну модель для вивчення процесів спрямованої модифікації рецепторного апарату фібробластів іn vіtro.

Уперше доказано можливість модифікації рецепторного апарата ФХВД (відновлення б2 та б4 ланцюгів інтегринових рецепторів на поверхні) та стимуляції проліферативної активності у мікс-культурі з ФФ.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих даних зроблено патогенетичне обґрунтування використання культивованих фетальних фібробластів для підвищення медичної ефективності лікування хронічних венозних виразок. Результати проведених досліджень дали змогу доповнити схему лікування хворих із хронічними виразками нижніх кінцівок венозної етіології методами трансплантації культивованих фетальних фібробластів.

Впровадження результатів дослідження в практику. Матеріали дисертаційної роботи включені до програми навчання на кафедрі комбустіології, пластичної хірургії та урології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (акт впровадження від 28.08.2006 р.), матеріали Деклараційного патенту на винахід № 68580 А (51) UA, МПК А61К38/39 „Спосіб стимуляції проліферативних процесів у рані шляхом внесення до неї колагенового гелю з культивованими фібробластами” впроваджені в лікувальний процес у відділенні загальної хірургії, опіковому відділенні та у відділенні судинної хірургії ІНВХ ім. В.К. Гусака АМН (акт впровадження від 02.02.2006 р.), матеріали дисертаційної роботи і Деклараційного патенту на корисну модель № 8551 UA, МПК А61В5/00 „Спосіб імунофлуоресцентного маркування поверхневих антигенів зафіксованих на скельцях адгерентних клітин у культурі з використанням моноклональних антитіл для флуоресцентної мікроскопії” включені в програму навчання на кафедрі мікробіології, вірусології та епідеміології Донецького державного медичного університету (акт впровадження від 23.08.2006 р.), а також прийняті до практичного використання в лабораторії фундаментальних досліджень відділу експериментальної хірургії ІНВХ ім. В.К. Гусака АМН України (акт впровадження від 14.02.2006 р.).

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником професором

О.А. Труновой розроблена концепція роботи, сформульовані мета та

завдання роботи. Дисертанткою особисто створено методичну основу роботи,

адекватну меті та завданням дослідження. Власне здобувачкою проведено удосконалення методу маркування структур клітинної поверхні в культурі адгерентних клітин, а також всі дослідження з фенотипування культивованих

клітин, МТТ-аналіз, розробка експериментальної культуральної моделі (мікс-культури) та маркування поверхневих антигенів РКН-розділених культур, математична та статистична обробка матеріалу, його аналіз і узагальнення, підготовка та впровадження методичних документів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи було представлено та обговорено на конференціях: Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 45-річчю Донецького опікового центру "Сучасні питання лікування термічних уражень і їх наслідків" (Донецьк, 2005), науково-практичній конференції з міжнародною участю "Рани м’яких тканин та ранова інфекція" (Київ, 2005), Всеукраїнській хірургічній науково-практичній конференції "ІІ Скліфосовські читання" (Полтава, 2006), VІІІ науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації знайшли відображення в 17 роботах: опубліковано 5 статей у виданнях, занесених до переліку ВАК України, у тому числі самостійно - 1 стаття, 9 тез, отримано 2 Деклараційних патенти України на винахід і 1 Деклараційний патент України на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 143 сторінках машинописного тексту й складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3 розділів власних спостережень, обговорення, висновків, списку використаних джерел. Дисертація ілюстрована 25 таблицями та 68 малюнками. У бібліографічному покажчику на 18 сторінках міститься 187 джерел (з них 74 вітчизняних і російськомовних та 113 зарубіжних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали й методи дослідження. Фібробласти трофічних виразок було отримано від 20-ти пацієнтів із хронічними венозними виразками нижніх кінцівок. Біопсійний матеріал забирали під час висічення виразкових дефектів із крайових неепітелізованих частин виразок.

Біоптати для одержання культури ФЗШ відбиралися під час планових операцій грижосічення з приводу вентральних гриж у 10 пацієнтів віком від 45 до 56 років.

ФФ виділяли з абортивного матеріалу, отриманого в ході планових операцій з переривання вагітності при строках гестації 6-8 тижнів.

Клітинні культури: культуру ФХВД і культуру ФЗШ одержували методом експлантатів. Зразки було подрібнено до розмірів приблизно 1 мм2 і вміщено в

культуральні флакони 25 см2 (Сostar, США) у середовище Ігла (Інститут поліомієлітів і вірусних енцефалітів, Москва) з 10% ембріональною телячою сироваткою (ЕТС) (Біолот, Росія). Зміну середовища проводили кожні 3-4 доби

культивування. Після візуальної оцінки можливості перенесення мігруючих та/або проліферуючих клітин за щільністю клітин навколо експлантата, фібробласти знімалися з культурального флакона з використанням трипсин / ЕДТА - суміші (Sіgma, США) у співвідношенні 0,050,02% у ФСБ (рН=7,4). Культивування проводили з використанням живильного середовища Ігла з додаванням 10% ЕТС в CO2-інкубаторі при 37ос і 5CO2. Пасируванню піддівали лише культуру ФЗШ, використовуючи трипсин / ЕДТА - суміш у співвідношенні 0,05% : 0,02% у ФСБ (рН=7,4). Коефіцієнт пасирування становив 1:2.

Культуру ФФ одержували після виділення фібробластів шляхом східчастої трипсинізації 0,25% розчином трипсину (Інститут поліомієлітів і вірусних енцефалітів, Москва) фрагментів шкірно-м'язової тканини ембріону при температурі 37оС. Інгібування трипсину здійснювали за допомогою сироватки великої рогатої худоби (Біолот, Росія). Культивування проводили у живильному середовищі Ігла, додаючи 10% ЕТС, в CO2-інкубаторі при 37ос і 5 % CO2. Пасирування здійснювали аналогічно культурі ФЗШ.

Мікроскопічний контроль культивування здіснювався за допомогою інвертованого мікроскопа LEІCA DM ІL і системи відеодокументації зображення LEІCA QWіn500 Standart (Germany).

Мікс-культуру ФФ і ФХВД (mіx-культура) для проведення МТТ-аналізу одержували в такий спосіб: ФФ 5 пасажу змішували з ФХВД у співвідношенні 1:2. Сукупне культивування проводили на протязі 5 діб з використанням 5 ліній культур ФХВД та 5 ліній ФФ.

Для фарбування вітальними барвниками та мікроскопії: ФФ 5 пасажу, які були попередньо пофарбовані барвником РКН67 Green (Sіgma, США), змішували з попередньо пофарбованими ФХВД барвником РКН26 Red (Sіgma, США) у співвідношенні 1:2. Фарбування вітальними барвниками клітинних культур

проводилося відповідно до інструкції фірми-виробника Sіgma-Aldrіch, Іnc. Далі культивування здійснювали у культуральних флаконах 25 см2 (Сostar, США) за стандартною методикою, оцінку ступеня проліферації виконували візуально з використанням флуоресценції на мікроскопах LEІCA DM ІL і LEІCA DM LS, фотодокументування результатів проводили за допомогою програми ІM50 і Leіca QWіn Standart.

Для порівняння динаміки росту та проліферації культур клітин ФФ, ФЗШ і ФХВД був використаний метод кількісного аналізу проліферативної активності з

використанням диметиліазол-дифенілтетразолію броміду (МТТ-аналіз). Оптичну густину рідини вимірювали спектрофотометрично, визначаючи поглинання як функцію від концентрації перетвореного барвника, кількість якого прямо пропорційно залежить від кількості метаболічно активних клітин у культурі.

В експерименті був використаний барвник МТТ (Sіgma, США) та ізопропанол (Merck, Німеччина). Сукупне культивування ФХВД і ФФ проводилося в 24-ямкових полістиролових планшетах Costar (США) в 5 серіях, оптична густина отриманого розчину вимірялася з використанням фотометра для багатофункціонального аналізу Synergy HT Bіo-Tek® Іnstruments (США) за допомогою програми КС4.

Імунофенотипування клітинних культур виконували за допомогою МКА у культурі ФФ, ФЗШ і ФХВД з обов'язковим використанням ізотип-контролів. У роботі були використані МКА та ізотип-контролі виробництва BD PharMіngen (США).

Для вивчення складу мембранних антигенів, що експресуються на поверхні фібробластів, було проведено фенотипування 10 ліній ФФ 1-10 пасажів, 10 ліній ФЗШ 1-10 пасажів і 20 культур ФХВД, отриманих після пересівання первинної культури та культивування до утворення моношару без пасирувань.

Статистична обробка отриманих результатів проводилась із застосуванням статистичних пакетів “Stadia 6.0” (Куланчев А.П., 1998, посвідчення госрегістрації №0115-97.1.0 Rus, ліцензійний №1206), “MedStat” (Лях Ю.Е. и соавт., 2004, версія 3, серійний №MS000027) з використанням адекватних методів біостатистики (описової статистики, кореляційного, регресійного та дисперсійного аналізу). Кількісні характеристики випадкових величин представлені в матеріалах дисертації переважно у вигляді середніх значень та помилок середніх значень. Для вибірок з розподілом, відмінним від нормального (за критерієм ?2) використовувалися критерії медіанних зрушень. Факторні ефекти оцінювалися за критеріями Н-статистики непараметричного однофакторного дисперсійного аналізу Крускала – Уоллиса (Гланц С., 1999).

Для аналізу отриманих даних фенотипування клітинних культур був використаний підхід перекладу якісних показників у напівкількісні – бали.

Для порівняння проліферативної активності клітинних ліній використовувався метод оцінки розходжень параметрів регресій лінійних моделей з обчисленням t-статистики Ст'юдента (Гланц С., 1999).

Отримані результати і їх обговорення. Аналіз показників часу, коли можливе пересівання первинної культури ФХВД, показав, що одержання достатньої

кількості клітин з експлантату ФЗШ можливе на 15,1±0,4 доби, а у випадку введення біоптату ФХВД у ростовому середовищі достатня кількість проліферуючих/мігруючих клітин для пересівання й подальшого культивування досягається лише на 27,5 ±1,1 доби. Таким чином, проліферація/міграція клітин з

біоптату хронічної венозної виразки відбувається практично в 2 рази повільніше (р<0,001). Аналогічні темпи росту спостерігаються при подальшому культивуванні після пересівання. Так, час формування моношару в культурі ФЗШ становить 7,5±0,4 доби, а для ФХВД цей показник дорівнює 16,3±0,4 доби. ФФ здатні

сформувати повноцінний клітинний моношар уже на 1,8±0,1 доби. Аналіз кількісних показників доводить достовірні розбіжності (р<0,001) проліферативної активності ФФ, ФЗШ і ФХВД.

Відзначено значні морфологічні відмінності як безпосередньо самих клітин ФЗШ і ФХВД, так і клітинного шару протягом усього періоду культивування. Фібробласти, отримані з хронічної виразки, були дещо більшими за розміром, мали неправильну форму, багатоядерність, помітне було нагромадження великої кількості детриту в культурі. Культура фібробластів, отриманих зі здорової шкіри, відрізнялася правильною спрямованістю моношару, а також відсутністю візуальних морфологічних змін.

Таким чином, з огляду на значні труднощі при одержанні первинної культури з експлантату ФХВД у порівнянні з ФЗШ, які обумовлені частими бактеріальними й мікотичними проростами, низькою здатністю до адгезії в культуральних флаконах, можна говорити про пригнічення життєздатності ФХВД, а також значне зниження проліферативної активності при подальшому культивуванні в стандартних для фібробластів умовах.

Для кількісного аналізу показників проліферації був проведен МТТ-аналіз. Установлено, що темп росту культури ФХВД значно нижчий, ніж культури ФЗШ (див. рис.1).

Примітка: * - р<0,01

**, *** - р<0,001

Рис. 1 Динаміка росту культур ФФ, ФЗШ і ФХВД. Залежність оптичної густини розчину після візуалізації формазану ізопропанолом від часу культивування клітин

Ґрунтуючись на параметрах рівнянь регресії, зображених на рис.1, коефіцієнт нахилу прямої у моделі ФХВД складає (21±2)х10-4 од.опт.густини/доба проти (190±12)х10-4 од.опт.густини/доба для ФЗШ, р<0,001. При порівнянні темпів росту культур ФЗШ і ФФ також показана наявність статистично значущих відмінностей

швидкості проліферації (коефіцієнти нахилу (190±12)х10-4од.опт.густини/доба для ФЗШ і (250±17)х10-4 од.опт.густини/доба для ФФ, р<0,01). Найбільші відмінності мають в темпах росту культури ФФ і ФХВД (коефіцієнти нахилу (250±17)х10-4 од.опт.густини/доба для ФФ проти (21±2)х10-4 од.опт.густини/доба для ФХВД, р<0,001).

Результати кількісної оцінки проліферативної активності підтверджують дані, отримані при візуальному моніторингу культивування ФФ, ФЗШ і ФХВД.

Таким чином, найбільшу проліферативну активність мають фетальні клітини. Культури фібробластів, які були отримані від здорових донорів, істотно відрізняються за темпами росту від фібробластів хронічних венозних виразок, що вказує на значне пригнічення здатності до проліферації останніх.

Фенотип культивованих ФФ, відповідно до використаної панелі маркерів з урахуванням проведеного статистичного аналізу, можна представити в такий спосіб: СD44+/СD147+/СD166+/СDw60+/СD58+/CD95+/СD29+/CD49b+/CD49c+/СD49e+/

CD49f+/CD140б+/CD141+/CD56+/CD54+/СD1alow/ HLA A,B,C low.

Фенотип культивованих ФЗШ: СD44+/СD147+/СD166+/СDw60+/СD58+/

CD95+/CD29+/CD49b+/CD49c+/CD49d+/СD49e+/CD49f+/CD140? +/CD141+/CD56+/

CD54+/ СD1alow HLA A,B,C low.

Фенотип ФХВД у первинній культурі клітин, отриманих з біоптату хронічної венозної виразки: СD44+/СD147+/СD166+/CD29+/CD49c+/СD49e+/CD140?+/ CD141+/CD54.

Для аналізу результатів типування кожної клітинної лінії було проведено порівняння вибірок, що характеризують стан кожної окремої ознаки в певній клітинній популяції в порівнянні з прийнятим еталоном, тобто ФЗШ.

Дані зіставлення рівня експресії антигенів клітинної поверхні культивованих ФФ у порівнянні з ФЗШ дорослої людини відображено в таблиці 1.

Таблиця 1

Порівняльна характеристика рівня експресії антигенів клітинної поверхні культивованих ФФ і ФЗШ (± m, бали)

CD (антиген / МКА) | ФФ | ФЗШ

58 (LFA-3 / 1C3 (AICD58.6) | 2,64 ± 0,161 | 1,65 ± 0,272* | 49d (Integrin б4 / 9F10) | 0,01 ± 0,011 | 4,10 ± 0,072*** | 141 (Fetomodulin / V1 E013R) | 2,23 ± 0,172 | 4,12 ± 0,151** | 95 (Fas, Apo-1 / DX2) | 1,27 ± 0,191 | 0,87 ± 0,163* | Примітка: * - р <0,05, ** - р < 0,01, *** - р <0,001

Як видно з табл. 1, статистично значущі відмінності відзначені лише в експресії окремих маркерів: CD58, CD141, CD95, а також найбільш показові розбіжності в рівні експресії ?4 - ланцюга інтегрину. Експресія інших маркерів не відрізнялась. Поверхня ФЗШ більш насичена деякими молекулами, зокрема CD141 і CD49d, що може бути доказом функціональної зрілості фібробластів дорослої

людини, а наявність додаткового рецептора до фібронектину може бути свідченням деяких відмінностей складу екстрацелюлярного матріксу (ЕЦМ) порівнюваних клітинних культур.

При зіставленні показників, що характеризують експресію мембранних маркерів на поверхні клітин ФХВД і ФЗШ, відзначено ряд особливостей, відображених у таблиці .

Таблиця 2

Порівняльна характеристика рівня експресії антигенів клітинної поверхні культивованих ФЗШ і ФХВД (± m, бали)

CD (антиген / МКА) | ФЗШ | ФХВД

44 (HCAM / L178) | 4,77 ± 0,111 | 3,85 ± 0,111** | 166 (ALCAM / 3A6) | 4,04 ± 0,121 | 3,15 ± 0,182** | 56 (NCAM / V NK75) | 2,13 ± 0,142 | 0,15 ± 0,074** | 54 (ICAM-1/ LB-2) | 4,77 ± 0,081 | 3,85 ± 0,103** | w60 (Ganglioside G3 / UM4D4) | 2,28 ± 0,123 | 0*** | 58 (LFA-3 / 1C3 (AICD58.6)) | 1,65 ± 0,272 | 0,08 ± 0,052*** | 49b (Integrin б2 / AK-7) | 3,71 ± 0,121 | 0,04 ± 0,021*** | 49c (Integrin б3 / C3 II.1) | 2,81 ± 0,131 | 3,58 ±1,151* | 49d (Integrin б4 / 9F10) | 4,10 ± 0,072 | 0,04 ± 0,011*** | 49e (Integrin б5 / IIA1) | 4,81 ± 0,064 | 2,42 ±0,133*** | 49f (Integrin б6 / GoH3) | 1,73 ± 0,172 | 0,04 ± 0,024** | 141 (Fetomodulin / V1 E013R) | 4,12 ± 0,151 | 2,54 ± 0,171** | 95 (Fas, Apo-1 / DX2) | 0,87 ± 0,162 | 0,15 ± 0,071** | (HLA A,B,C / G46-2.6) | 0,18 ± 0,053 | 0*

Примітка: * - р <0,05, ** - р < 0,01, *** - р <0,001

Дані, відбиті в табл. 2, свідчать про більш широкий діапазон антигенних поверхневих структур, відмінності в експресії яких на ФХВД є статистично значущими в умовах проведеного експерименту. Відсутність або зниження рівня експресії зафіксовано в групах молекул костимуляції та активації міжклітинних взаємодій, таких як CD58, CDw60 і CD141, відносне зниження насиченості клітинної поверхні адгезивними молекулами різних класів (ІCAM, ALCAM, HCAM, NCAM), відсутність молекули HLA-A,B,C, а також значні розбіжності в спектрі альфа-ланцюгів інтегринів, що експресуються. Експресія інших маркерів не відрізнялась.

На ФЗШ рецептори до компонентів ЕЦМ - колагену, ламініну та фібронектину дубльовані (є 2 або 3 комбінації), що створює своєрідний фізіологічний резерв або розширює сферу компетентності фібробластів неушкодженої шкіри. На ФХВД практично відсутні б2, б4 і б6-ланцюги VLA-інтегринових рецепторів при збереженні на поверхні ФХВД в1-ланцюга (CD29). Тому є лише 2 інтегринових

рецептори: в1б3-інтегрин, що має забезпечити всю схему взаємодії з трьома компонентами ЕЦМ - колагеном, фібронектином і ламініном, та в1б5-інтегрин, лігандом якого є тільки фібронектин, причому рівень CD49e майже наполовину знижений. Можливо, деяке збільшення експресії б3-інтегринового ланцюга на

ФХВД можна розглядати як компенсаторне, однак без достатньої кількості СD29 (а його експресія на ФХВД не посилена) повноцінний VLA-рецептор не може сформуватися і бути функціонально повноцінним. Не виключено, що підвищений рівень фібронектину у зоні хронічного запалення й порушення його молекулярної структури можуть бути пов'язані з порушенням рецепторної регуляції фібробластами процесів синтезу та деградації даного компонента ЕЦМ. Не виключається, що "збідніння" клітинної поверхні інтегриновими ланцюгами створює передумови для порушення кооперації з клітинами імунної системи, ослабленням або припиненням активації популяцій лімфоцитів і переходу запалення в хронічний перебіг. Ці дані дають підставу припускати, що ФХВД синтезують неповний або змінений спектр компонентів ЕЦМ у клітинній культурі, а також взаємодії в системі "клітина-ЕЦМ-клітина" значно пошкоджені.

Отримані дані свідчать про існування відмінностей в спектрі поверхневих рецепторів ФЗШ і ФХВД, що може бути як наслідком, так і причиною функціональної неповноцінності пулу фібробластів хронічної виразки нижніх кінцівок венозної етіології.

Було створено культуральну модель іn vіtro - мікс-культуру, що складається з ФХВД і ФФ, на прикладі якої за допомогою МТТ-аналізу показано, що при сукупному культивуванні ушкодженої клітинної лінії фібробластів виразкового дефекту й фетальних фібробластів можливе прискорення проліферації ФХВД.

Аналіз результатів МТТ-експерименту для мікс-культури показав, що існують статистично значущі відмінності при порівнянні лінії регресії мікс-культури з усіма

клітинами, що піддаються ізольованій культивації (див. рис.2).

Примітка: * - р<0,05 (групи порівняння ФЗШ/МIX)

** - р<0,001 (групи порівняння ФФ/МIX)

*** - р<0,001 (групи порівняння ФХВД/МIX)

Рис.2 Динаміка росту культур ФФ, ФЗШ, ФХВД та МIX-культури. Залежність оптичної густини розчину після візуалізації формазану ізопропанолом від часу культивування клітин

Так, у групах порівняння MIX/ФФ і MIX/ФЗШ відзначається відставання темпів проліферації мікс-культури, оскільки коефіцієнт нахилу прямої у моделі мікс-культури складає (130±10)х10-4 од.опт.густини/доба, що менше аналогічного показника для культури ФФ ((250±17)х10-4 од.опт.густини/доба, р<0,01) і для культури ФЗШ (190±12)х10-4 од.опт.густини/доба, р<0,05). Однак, відзначене прискорення проліферації мікс-культури в порівнянні з ФХВД, що культивувались ізольовано. Для групи порівняння МIX/ФХВД коефіцієнт нахилу прямої мікс-культури дорівнює (130±10)х10-4 од.опт.густини/доба, що більше аналогічного показника для ізольовано культивованих ФХВД - (21±2)х10-4 од.опт.густини/доба, (р<0,01).

Значення концентрації клітин розраховувалися на основі стандартних МТТ-кривих, побудованих окремо для ФФ, ФЗШ, ФХВД, мікс-культури та експериментально отриманих кривих із застосуванням системи лінійних рівнянь. Аналіз регресійної моделі залежності концентрації клітин від часу культивування показав, що найбільші темпи проліферації характерні для ФФ, розрахункова концентрація яких складає на 5 добу (179±14)х103 клітин, що перевищує аналогічний показник для ФЗШ (140±10)х103 клітин, р<0,05) і для ФХВД (28±2)х103 клітин, р<0,01). Сукупне культивування ФХВД і ФФ приводить до прискорення темпів росту культури, про що свідчить збільшення показника клітинності до (116±8)х103 клітин у порівнянні з ізольовано культивованими ФХВД (р<0,01).

Отже, результати, отримані в ході експерименту відносно сукупного культивування фетальних клітин із ФХВД, демонструють можливість прискорення

проліферації мікс-культури. Збільшення показників оптичної густини та розрахункової концентрації для мікс-культури, імовірно, є результатом як безпосередньої присутності ФФ у культурі, так і позитивного впливу на проліферативні властивості ушкодженого пулу фібробластів хронічних венозних виразок. Сукупне культивування ФФ і ФХВД відбувається в умовах взаємного впливу елементів культури один на одного, що характерно для гетерогенних клітинних культур. Такі умови приводять, з одного боку, до зниження активності ФФ, а з іншого, до стимуляції проліферації ФХВД, але тенденція стимуляції росту культури в цілому зберігається.

У рамках експерименту з мікс-культурою було проведено маркування складових її клітинних елементів специфічними МКА проти CD49b, CD49d і CD49f. Використовувалися ті ж мікс-культури, що й для МТТ-аналізу. Умовою проведення маркування було фарбування тільки ФФ вітальним барвником (РКН Green). При проведенні сукупного культивування ФХВД з ФФ на поверхні ФХВД визначаються ті антигени, які не були знайдені на клітинах культур ізольованого культивування, а саме ?2 і ?4 ланцюги інтегринів.

Підсумовуючи результати, отримані в ході даного експерименту, можна говорити про можливість відновлення деяких елементів рецепторного апарату ФХВД, зокрема ?2 і ?4 ланцюгів інтегринів як складових для життєво важливих рецепторів субстрат-залежних клітин, що є свідченням позитивного впливу ФФ на рецепторний апарат ФХВД у мікс-культурі за даних умов культивування.

Таким чином, в умовах сукупного культивування фібробластів зони хронічного запалення з фетальними фібробластами, можна спостерігати не тільки посилення їх проліферативної активності, але й зміни функціональних властивостей, непрямим доказом чого можна вважати зміни спектру рецепторів клітинної поверхні ФХВД.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі дано теоретичне підґрунтя для вирішення актуальної науково-практичної задачі стосовно доцільності використання культивованих фетальних фібробластів для стимуляції репарації хронічних виразкових дефектів. Показана втрата фібробластами хронічної венозної виразки нижніх кінцівок молекул костимуляції та активації міжклітинних взаємодій (CD58, CDw60, CD141), рецепторів адгезії (СD166, CD56, CD54) і ?2, б4 і б6 ланцюгів інтегринів, а також доведена можливість часткового відновлення рецепторного апарату та проліферативної активності фібробластів хронічного виразкового дефекту при сукупному культивуванні з фетальними фібробластами.

1. Установлено, що загальними мембранними антигенами для фібробластів хронічного виразкового дефекту, фібробластів здорової шкіри й фетальних фібробластів в умовах культивування є: CD44, CD147, CD166, CD141, CD140б, CD29, CD49c, CD49e і CD54. Не ідентифікуються CD51, CD104, CD23, CD40, CD36, CLA, CD24, CLІР, HLA-DR, HLA DQ, ІL-1?-R, ІL-1?-R, CD122, CD126, CDw128, CD106, CD50, CD31, CD62E, CD62P, CD62L, CD41a, CD11a, CD11b, CD11c, CD2, CD22, СD140?, CD49a.

2. Визначені фенотипічні відмінності фібробластів хронічного виразкового дефекту і фібробластів здорової шкіри. На виразкових фібробластах не визначаються, або присутні у слідовій кількості CD60w, CD58, ?2 ланцюг інтегрину (CD49b), ?4 ланцюг інтегрину (CD49d), ?6 ланцюг інтегрину (CD49f), CD56 і молекула HLA-A,B,C (р<0,001). Експресія CD44, CD166, CD54, ?5 ланцюга інтегрину (CD49e), CD141 і CD95 вірогідно знижена (р<0,01 і р<0,001). Більш високий рівень експресії ?3 ланцюга інтегрину (СD49c) на фібробластах хронічного виразкового дефекту (р<0,05) може бути компенсаторною реакцією на втрату інших інтегринових ланцюгів.

3. Виявлено відмінності спектра мембранних маркерів для фетальних фібробластів і фібробластів здорової шкіри. Відсутність ?4 ланцюга інтегрину (CD49d), вірогідно знижений рівень СD141 (р<0,01), підвищений рівень СD58 і СD95 (р<0,05) на мембрані фетальних фібробластів можуть бути наслідком малодиференційованого статусу ембріональних тканин.

4. Проліферативна активність при культивуванні максимальна у фетальних фібробластів (утворення моношару на 1,8±0,1 доби), нижче у фібробластів здорової шкіри (7,5±0,4 доби), мінімальна для фібробластів хронічного виразкового дефекту (16,3±0,4 доби, р<0,001).

5. Морфологія фібробластів хронічного виразкового дефекту і їхньої культури має наступні особливості: змінені форма і розміри клітин, визначається вакуолізація цитоплазми, порушена спрямованість росту і полярність клітинної культури.

6. Сукупне культивування фібробластів хронічного виразкового дефекту і фетальних фібробластів приводить до активації проліферації виразкових фібробластів, про що свідчить збільшення темпів росту культури, коли розрахунковий показник кількості клітин на 5 добу культивування становить (116±8)х103 клітин для мікс-культури в порівнянні з (28±2)х103 клітин для культивованих ізольовано виразкових фібробластів (р<0,01).

7. Показана можливість часткового відновлення за рахунок синтезу de novo втрачених ланцюгів інтегринових рецепторів (?2 і ?4) на мембрані фібробластів хронічного виразкового дефекту при сукупному культивуванні з фетальними фібробластами.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Застосування трансплантатів культивованих фетальних фібробластів у колагеновому гелі з метою стимуляції репарації рани доцільно включити до комплексу лікування трофічних виразок нижніх кінцівок венозної етіології.

2. Розроблена культуральна модель - мікс-культура фетальних фібробластів і фібробластів хронічного виразкового дефекту може використовуватись для вивчення міжклітинних взаємодій в умовах експерименту.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ

ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корчак О.М. Возможность стимуляции пролиферативной активности фибробластов хронических венозных язв нижних конечностей in vitrо // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії МОЗ України. - 2006. - Т.6, № 1-2 (13-14) - С. 172-179 (Дисертантка провела МТТ-аналіз клітинних ліній, що досліджувались, та зробила узагальнення результатів досліджень)

2. Попандопуло А.Г., Корчак О.М., Трунова О.А., Зубов Д.А., Разенкова И.А. К вопросу об обосновании применения культивированных фетальных фибробластов человека в комплексном лечении хронических мезенхимальных дефектов // Архив клинической и экспериментальной медицины.- 2004. - Т.13, № 1-2. – С. 55-61 (Дисертантка проводила фенотипування клітинних ліній і аналіз отриманих результатів, брала участь у написанні статті).

3. Попандопуло А.Г., Корчак О.М, Казаков Г.В., Штутин А.А., Зубов Д.А. Особенности пролиферативной активности культуры фибробластов хронических венозных язв нижних конечностей // Вестник неотложной и восстановительной медицины.- 2003. – Т.4, №4. – С. 585-589 (Дисертантка провела пошук літературних даних і статистичну обробку отриманих результатів, брала участь у написанні статті).

4. Зубов Д.О., Сліпченко І.О., Васильєв Р.Г, Корчак О.М., Чуприна О.Є., Попандопуло А.Г., Гусак В.К. Дія синтетичних полісахаридів на проліферативну активність дермальних фібробластів щурів // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія.- 2003.- №2 (22).- С.18-23 (Дисертантка зібрала літературні дані, у співавторстві написала статтю).

5. Гринь В.К., Попандопуло А.Г., Штутин А.А., Корчак О.М., Казаков Г.В. Биологическая активность фибробластов хронических венозных язв нижних

конечностей // Архів клінічної медицини. - 2004. - №1 (5). - С. 14-18 (Дисертантка провела аналіз особливостей проліферації досліджуваних клітинних ліній при культивуванні, брала участь у написанні статті).

6. Деклараційний патент України на винахід № 68580 А UA, МПК А61К38/39. Спосіб стимуляції проліферативних процесів у рані шляхом внесення до неї колагенового гелю з культивованими фібробластами / Попандопуло А.Г.,

Чуприна О.Є., Зубов Д.О., Сліпченко І.О., Васильєв Р.Г., Корчак О.М. – Заявка №2003087368 від 05.08.2003, опубл. 16.08.2004, Бюл. № 8. -1 с. (Дисертантка провела пошук і аналіз літературних даних, брала участь в оформленні патенту).

7. Деклараційний патент України на корисну модель № 8551 UA, МПК А61В5/00. Спосіб імунофлуоресцентного маркування поверхневих антигенів зафіксованих на скельцях адгерентних клітин в культурі з використанням моноклональних антитіл для флуоресцентної мікроскопії / Корчак О.М., Зубов Д.О., Попандопуло А.Г., Разєнкова І.А., Сліпченко І.О. – Заявка №20041211016 від 31.12.2004, опубл. 15.08.2005, Бюл. № 8. - 2 с.

(Дисертантка розробила запропонований спосіб, провела аналіз літературних джерел, брала участь в оформленні патенту).

8. Деклараційний патент України на винахід № 60185 А UA, МПК В29В13/02 В65В43/00. Пристрій для розкриття культуральних флаконів методом комбінованого фізичного впливу на стінку флакона розпеченою струною / Чуприна О.Є., Попандопуло А.Г., Зубов Д.О., Васильєв Р.Г., Сліпченко І.О., Корчак О.М.- Заявка №2003021736 від 27.02.2003, опубл. 15.09.2003, Бюл. № 9. - 2 с. (Дисертантка провела збір та аналіз літературних джерел за тематикою, брала участь в оформленні патенту).

9. Корчак О.М. К вопросу об изучении фенотипа культивированных фетальных фибробластов // Тез. X междунар. конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации и III Европейского конгресса по астме: Аллергология и иммунология.- Афины (Греция), 2006.- Т. 6, №3.- С.333-334.

10. Корчак О.М. Экспрессия некоторых мембранных маркеров культивированными дермальными и фетальными фибробластами человека // Матеріали VII Укр. науково-практ. конф. з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації: Імунологія та алергологія .- Київ, 2005. - №3 – С.88.

11. Корчак О.М., Попандопуло А.Г., Слипченко И.О., Разенкова И.А., Зубов Д.А. Изучение фенотипа культивированных фетальных фибробластов-стимуляторов репаративных процессов в ране // Тез. науково-практ. конф. „Рани м'яких тканин та ранова інфекція”: Клінічна хірургія.- Київ, 2005. - №11-12. – С. 34.

12. Корчак О.М., Попандопуло А.Г. Возможность функционально-фенотипической модификации фибробластов хронических венозных язв in vitrо // Матеріали VIII Укр. науково-практ. конф. з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації: Імунологія та алергологія.- Київ, 2006. - №2 – С.112.

13. Слипченко И.О., Попандопуло А.Г., Зубов Д.А., Корчак О.М., Разенкова И.А., Чуприна А.Е. Использование аллофибробластов, культивированных in vitro, для лечения ран // Мат. междунар. симпоз. по биологии клетки в культуре ”Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия”: Цитология. - С.-Петербург, 2004. – Т. 46, №10. – С. 941.

14. Попандопуло А.Г., Зубов Д.А., Слипченко И.О., Разенкова И.А., Корчак О.М. Роль pseudomonas aeruginosa в раневом заживлении венозных язв нижних конечностей // Тр. Харьков. науч. конф. Сепсис. Патогенез, диагностика и терапия. – Харьков, 2004. – С. 183.

15. Slipchenko I.O., Popandopulo A.G., Korchak O.M., Chuprina A.E. Use of in vitro cultured human fibroblasts in a