НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ

IНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРIОБIОЛОГIЇ I КРIОМЕДИЦИНИ

КОФАНОВА ОЛЬГА ОЛЕКСІЇВНА

УДК 57.043:577.352.3:547.426

МОДИФIКАЦIЯ ФУНКЦІОНАЛЬНОЪ АКТИВНОСТЙ СА2+-АТФАЗИ I МЕМБРАНО-ЦИТОСКЕЛЕТНОГО КОМПЛЕКСУ ЕРИТРОЦИТIВ ПIД ВПЛИВОМ ГЛIЦЕРИНУ ТА КРIОКОНСЕРВУВАННЯ

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків–2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бабійчук Любов Олександрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоцитології та кількісної морфології

Офіційні опоненти|:

Доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії та біохімії

Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Нікітченко Юрій Вікторович, Науково-дослідний інститут біології Харківського Національного Університету ім. В.Н. Каразіна МОН України, завідувач відділу біофізики мембран

Провідна установа:

Харківський державний медичний університет, кафедра біохімії, МОЗ України, м.Харків

Захист відбудеться 03.07.2007р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: вул. Переяславська, 23, м.Харків, 61015

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: вул. Переяславська, 23, м.Харків, 61015

Автореферат розісланий 01.06.2007 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України А.М.Гольцев

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Існуючі на цей час концепції й гіпотези кріопошкоджень по-різному трактують механізм дії фізико-хімічних факторів і процесів у руйнуванні структур біооб'єкта при заморожуванні-відігріванні [Meryman H.T. et al., 1971; Mazur P. et al., 1975; Pegg D.E. et al., 1988]. Дослідження механізмів кріозахисту базуються на уявленні про те, що кріобіологічні системи є надзвичайно складними композиціями, у яких фізико-хімічні процеси тісно пов'язані з біологічними, і закономірності їхньої кореляції вивчені недостатньо. Останнім часом, з'явилася низка робіт, присвячених вивченню біологічної стабілізації конформації білків та мембранних структур різними кріопротекторами в умовах дегідратації при заморожуванні-відігріванні або висушуванні. [Crowe J.H. et al, 1993; Xie G. et al., 1997]. Успішне вирішення проблеми низькотемпературного консервування неможливе без вивчення молекулярних механізмів модифікації різних клітинних структур під впливом низьких температур і кріопротекторів різного типу дії. Аналіз модифікації структурно-функціонального стану плазматичної мембрани і цитоскелета еритроцитів під впливом гліцерину, що є ефективним кріопротектором для даного типу клітин [Аграненко В.А. и др., 1980], може сприяти більш глибокому розумінню ролі цих змін у регуляції стійкості клітин до стресових факторів кріоконсервування. Особливе значення у контролюванні біохімічних процесів у клітині в стресових умовах мають іони кальція, месенджерна функція якого охоплює практично усі фізіологічні системи [Левицкий Д.О., 1990].

В еритроцитах людини єдиним механізмом, що забезпечує підтримку низької концентрації Са2+ у цитоплазмі, є Ca2+-АТФаза [Carafoli E. et al., 1999]. Дослідження змін її функціональної активності в процесі кріоконсервування є важливим моментом у розумінні механізмів виживання клітин і збереженні ними структурної цілісності після заморожування-відігрівання. У вітчизняних і закордонних дослідженнях [Кузьмина Л.Н., 1991; Alves G.G. et al., 2001] приділялась певна увага вивченню модифікації даної іонтранспортуючої системи під впливом кріопротектора й низьких температур, однак, був відсутній системний підхід до рішення даної проблеми. Зокрема регуляторний аспект активності Са2+-АТФази і зміна рівня цитозольного Са2+ в умовах кріоконсервування дотепер практично не вивчені.

Зміна структурних характеристик плазматичної мембрани, зокрема трансмембранної асиметрії ліпідів під впливом кріопротекторів і низьких температур, може бути важливим сигналом метаболічних перебудов, які відбуваються в клітинах. Аналіз модифікуючого впливу фізико-хімічних факторів на асиметрію ліпідного бішару показав, що фліп-флоп може регулюватися зміною параметрів середовища [Cullis P.R. et al., 1986.]. Разом з тим, вплив кріопротекторів і процесів заморожування-відігрівання біологічних об'єктів на розподіл фосфоліпідів у мембрані та динаміку фліп-флоп досліджено недостатньо. У зв'язку із цим, вивчення асиметрії ліпідного бішару й ролі Са2+-залежних процесів у регуляції даного структурного параметра в умовах кріоконсервування може бути актуальним напрямком кріобіологічних досліджень.

Останнім часом усе більше уваги приділяється дослідженню змін структур цитоскелету, індукованих кріопротекторами і різними фізико-хімічними факторами, що супроводжують заморожування-відігрівання клітин [Бабийчук Л.А. и др., 1994; Westh P., 2004]. Модифікація білок-білкових взаємодій у цитоскелетній сітці, а також взаємодій цитоскелета з плазматичною мембраною під впливом кріопротекторів можуть бути вирішальними факторами, які впливають на стабільність клітин у стресових умовах, у тому числі в процесі кріоконсервування [Chang B.S. et al., 1996; Singbartl K. et al., 1998]. Тому, вивчення особливостей змін у мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів під впливом гліцерину і низьких температур, а також визначення ролі Са2+ у цих процесах можуть бути істотним внеском у розуміння механізмів трансформації даних структур при зміні параметрів зовнішнього середовища та сприяти розробці й удосконаленню методів довгострокового зберігання крові.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі кріоцитології і кількісної морфології в рамках теми №2.2.6.14 "Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської і кордової крові людини під впливом температурно-осмотичних ефектів і кріопротекторів різного механізму дії", № держреєстрації 0104UО06436.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – оцінити модифікацію фукціональної активності Ca2+-АТФази і рівень вільного цитозольного Са2+ в еритроцитах людини під впливом гліцерину і низьких температур, а також оцінити Са2+-залежні перебудови трансмембранного розподілу фосфатидилсерину в ліпідному бішарі та білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетному комплексі, що індуковані даним кріопротектором і кріоконсервуванням.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1. Вивчити зміни функціональної активності Са2+-насосу еритроцитів на різних експериментальних моделях (сапонін-перфорованих клітинах та ізольованих мембранних фракціях) під впливом наростаючих концентрацій гліцерину та оцінити роль кальмодуліну в регуляції каталітичної реакції в даних умовах.

2. Дослідити вплив кріоконсервування і розчинів з високою іонною силою на роботу Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих еритроцитах - моделі найбільш близької до нативної клітини.

3. Оцінити зміни рівня вільного цитозольного Са2+ в еритроцитах під впливом гліцерину і низькотемпературного консервування клітин.

4. Дослідити роль позаклітинного Са2+ і АТФ-азних реакцій у модифікації асиметричного розподілу фосфатидилсерину під впливом гліцерину і низьких температур.

5. Вивчити Са2+-залежні перебудови білок-білкових взаємодій мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину і низьких температур.

Об'єкт дослідження. Процеси Са2+-залежної модифікації структурно-функціональних параметрів плазматичної мембрани та цитоскелета еритроцитів людини в умовах кріоконсервування з використанням гліцерину.

Предмет дослідження. Модифікація каталітичної активності Са2+-насоса, білків мембрано-цитоскелетного комплексу і трансмембранного розподілу фосфатидилсерину в еритроцитах під впливом гліцерину і кріоконсервування.

Методи дослідження: біохімічні, спектрофотометричні, а також методи флуоресцентної мікроскопії, проточної цитофлуориметрії та електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше показано, що модифікація активності Са2+-АТФази сапонін-перфорованих еритроцитів під впливом наростаючих концентрацій гліцерину має біфазний характер. Аналіз ролі ендогенних модуляторів з використанням інгібітора кальмодулін-залежних реакцій показав, що активація Са2+-АТФази, яка відмічається в присутності 10%-го гліцерину, реалізується тільки у присутності кальмодуліну. Також уперше було відзначено, що активність даного ферменту в еритроцитах, кріоконсервованих під захистом гліцерину, пригнічується після розморожування, а після дегліцеринізації кріоконсервованих клітин підвищується. Новими є результати, які свідчать, що рівень цитозольного Са2+ в еритроцитах під впливом гліцерину збільшується. У кріоконсервованих клітинах після дегліцеринізації рівень Са2+ ще більш зростає в порівнянні з умовами інкубації в присутності гліцерину. Уперше встановлено факт слабкого впливу гліцерину і низьких температур на зміну асиметричного розподілу фосфатидилсерину в плазматичній мембрані еритроцитів протягом короткого періоду часу. Отримано нові дані про те, що під впливом гліцерину і кріоконсервування можуть відбуватися Са2+-індуковані перебудови в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені в роботі дослідження змін функціональної активності Са2+-АТФази та рівня вільного цитозольного Са2+, що свідчать про можливу роль Са2+- індукованих метаболічних перебудов у зміні стійкості еритроцитів, можуть бути використані при розробці нових технологій кріоконсервування біообґєктів. Встановлені закономірності перебудов плазматичної мембрани та мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину можуть бути використані для порівняльного аналізу змін у даних структурах під впливом різних фізико-хімічних факторів при розробці й удосконаленні способів довгострокового зберігання еритроцитів.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно здійснено аналіз даних літератури, отримано результати експериментальних досліджень, проведено їхню статистичну обробку. Автором особисто проведено первинний аналіз даних і сформульовано попередні висновки. Разом із науковим керівником автором визначені мета, задачі дослідження та засоби їх вирішення, інтерпретовано отримані результати та зроблено остаточні висновки. В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1-3,5-9,14,15,17-19] у проведенні досліджень функціональної активності Са2+-АТФази та аналізі отриманих результатів;

- у роботі [10] у вивченні рівня цитозольного Са2+ в еритроцитах;

- у роботах [11,12,21] у проведенні досліджень асиметричного розподілу фосфатидилсерину та аналізі отриманих результатів;

- у роботах [4,16,20] у проведенні досліджень функціональної активності Са2+-АТФази на сапонін-перфорованих та білих тінях еритроцитів у присутності гліцерину, участі в обговоренні результатів;

- у роботах [13,22] у вивченні Са2+-залежних перебудов білок-білкових взаємодій мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину і низьких температур.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), науково-практичній конференції молодих вчених "Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини" (Харків, 2004), Першій Міжнародній конференції студентів і аспірантів (Львів, 2005), 5й Парнасівській Конференції "Molecular mechanіsms of cellular sіgnalіng" (Київ, 2005), міжнародній науково-практичній конференції "Дни науки 2005" (Дніпропетровськ, 2005), міжнародній конференції "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), міжнародній науково-практичній конференції "Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання" (Київ, 2005), межвузівській конференції молодих вчених "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2006), Другій Міжнародній конференції студентів і аспірантів (Львів, 2006), всеукраїнській науково-технічній конференції "Физика. Биофизика-2006" (Севастополь, 2006), Пущинській школі-конференції "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2006), ІV Міжнародному симпозіумі "Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології" (Київ,2006), конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології–2006” (Київ, 2006), Сьомому з'їзді Білоруського суспільного об'єднання фотобіологів і біофізиків "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Мінськ, 2006), науково-практичній конференції молодих вчених "Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини" (Харків, 2006), ІX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІІ міжнародному симпозіумі "Гемостаз – проблемы и перспективы" (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 статей, з яких 5 - у наукових фахових виданнях і 8 – в збірниках матеріалів наукових конференцій, та 9 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 165 сторінках друкованого тексту, з яких 134 сторінки основного тексту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, переліку використаної літератури (235 першоджерел, розміщено на 23 сторінках) і додатка (на 4 сторінках). Робота ілюстрована 25 рисунками і 3 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМЙСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на еритроцитах ІІ(А) групи донорської крові чоловіків, заготовленої на консерванті "Глюгіцир", з терміном збереження при температурі 2-4 ?С протягом 2-4 діб.

Гліцеринізацію еритроцитів здійснювали додаванням розчину кріоконсерванта (30% гліцерин, 4% манітол, 150 мМ NaCl, 10 мМ тріс-HCl, pН 7,4) у співвідношенні 1:1 за об'ємом [Аграненко В.А. и др., 1980] і в сталевих контейнерах занурювали в рідкий азот (-196 єС). Для експериментів з дослідження активності Са2+-АТФази до складу кріоконсерванта не додавали манітол. Розморожування еритроцитів проводилося у водяній бані з температурою 42 єС. Для видалення кріопротектора проводили триразове відмивання еритроцитів відповідно до стандартних методик [Семенова Н.Ф. и др., 1986; Sumida S. et al., 1999].

Рівень гемолізу в надосадовій рідині визначали спектрофотометрично на довжині хвилі 543 нм [Дервиз Г.В. и др., 1966].

Гематокрит визначали в капілярах на мікроцентрифузі МГЦ-8 (Польща).

Для визначення активності Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих еритроцитах клітини вносили в реакційне середовище, яке містило задані концентрації Са2+, Mg2+, ЕГТА, ATФ та сапоніну. Склад середовища варіювали, додатковим уведенням різних концентрацій гліцерину (5-60%), або NaCl (150-600мМ), або KCl (150-600мМ). Реакцію ферментативного гідролізу АТФ відслідковували, витримуючи клітини при 37 ?С протягом 20 хвилин [Покудин Н.И. и др., 1988]. Зміну активності Са2+-АТФази оцінювали за різницею накопичення фосфору неорганічного Pі в Са2+-утримуючих і Са2+-неутримуючих середовищах. Визначення Pі проводили спектрофотометричним методом (“Ломо СФ-46”, Росія) на довжині хвилі 660 нм [Rathbum W. et al., 1969]. Питому активність Са2+-АТФази еритроцитів розраховували на 109 клітин.

Для оцінки активності Са2+-АТФази в білих тінях виділення мембран еритроцитів проводили гіпотонічним шоком [Fairbanks G. et al., 1971]. Отримані ізольовані мембранні фракції додавали в реакційне середовище та стежили за ферментативною реакцією в умовах аналогічних, описаних для сапонін-перфорованих еритроцитів.

Для оцінки ролі кальмодуліну в активації Са2+-АТФази еритроцитів у присутності 10%-го гліцерину в середовищі застосовували інгібітор кальмодулін-залежних реакцій кальмідозоліум R24571 [Рыбина В.В. и др., 2001]. Зміну активності Са2+-АТФази оцінювали за різницею накопичення Pі, як описано вище.

Концентрацію білка визначали спектрофотометрично за методом Бредфорда [Bradford M.M., 1976] на довжині хвилі 595 нм.

Рівень вільного Са2+ у цитоплазмі еритроцитів оцінювали за допомогою флуоресцентного зонда Fluo-4 [Schnetkamp P.P. et al.,1991; Kaestner L. et al., 2006] на флуоресцентному мікроскопі Nіkon (Японія) при лex=488 нм, лem=516 нм.

Дослідження асиметричного розподілу фосфатидилсерину в мембрані еритроцитів були проведені на проточному цитометрі FACS Calіbur (Becton Dіckіnson, США) з використанням набору Annexіn V-FІTC detectіon KІТ І (Becton Dіckіnson, США).

Для електрофоретичного аналізу білків в ПААГ одержували білі тіні шляхом гіпотонічного лізису [Fairbanks G. et al., 1971] з додаванням інгібітору протеаз (РМSF, 1 мг/моль). В підсумку в склад гіпотонічних середовищ було включено: 1 – 10-3 М MgCl2, 10-3 M CaCl2; 2 – 2 мМ ЕДТА; 3 - 10-3 М MgCl2, 10-3 M CaCl2, 5% гліцерин; 4 – 2 мМ ЕДТА, 5% гліцерин.

Електрофорез тіней еритроцитів виконували у вертикальних пластинах SDS-ПААГ із градієнтом пористості (5-20)Т4С за системою Лемлі [Fairbanks G. et al., 1971; Остерман Л.А., 1981]. Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери фірми Fluka. Відносний вміст білків різних фракцій на доріжці SDS-ПААГ оцінювали на денситометрі DM2120 ("Solar", Білорусь). Результати обробляли за допомогою програми для персонального комп'ютера Scіon Іmage.

Отримані результати статистично обробляли за методом Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їх обговорення

Модифікація середовища і різних клітинних структур під впливом гліцерину створює умови, що забезпечують збереження еритроцитів у процесі кріоконсервування. Аналіз змін структурно-функціональних параметрів мембрано-цитоскелетного комплексу (МЦК) під впливом гліцерину сприяє розумінню більш тонких механізмів виживання клітин за екстремальних впливів зовнішнього середовища. Динаміку насичення клітин гліцерином і зміну активності Са2+-АТФази в ході цього процесу можна змоделювати дослідженням швидкості ферментативної реакції в середовищах з різними концентраціями кріопротектора.

У роботі були вивчені зміни функціональної активності Са2+-АТФази еритроцитів під впливом гліцерину з використанням різних експериментальних моделей - сапонін-перфорованих клітин та ізольованих мембранних фракцій (білих тіней). На моделі сапонін-перфорованих клітин (рис.1А) у присутності ендогенних регуляторів було показано, що невеликі концентрації гліцерину стимулюють ферментативну активність Са2+-насоса, досягаючи максимального ефекту при 10%-му вмісті кріопротектора, після чого його активуюча дія знижується.

Рис.1. Вплив гліцерину на активність Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих (А) та білих тінях еритроцитів (Б); *р<0,05.

Збільшення концентрації гліцерину понад 20% веде до гальмування Са2+-АТФазної активності. У білих тінях (рис.1Б) стимулюючого ефекту гліцерину на Са2+-АТФазу не було виявлено, що може бути пов'язано з відсутністю ендогенних регуляторів, які контролюють функціональну активність даної іонтранспортуючої системи.

Зважаючи на важливість кальмодуліну (КМ) - найбільш вивченого та ефективного модулятора активності Са2+-АТФази - для регуляції ферментативної активності в еритроцитах людини в умовах змін фізико-хімічних параметрів середовища, були проведені експерименти, що виявили роль КМ у зміні швидкості Са2+-залежної АТФазної реакції в присутності 10% гліцерину в середовищі при використанні інгібітора КМ-залежних реакцій - кальмідозоліуму (compound R24571). Результати інгібіторного аналізу показали (рис.2), що повна активація Са2+-АТФази 10%-м гліцерином відзначається у випадку, якщо інгібітор вводять у суспензію після модифікації клітин кріопротектором, а при його додаванні до контакту еритроцитів із гліцерином відбувається лише незначне підвищення фосфатазної активності.

Рис.2. Зміна активності Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих еритроцитах людини в присутності 10%-го гліцерину та інгібітору кальмодулін-залежних реакцій R24571: 1 - у реакційному середовищі; 2 - при додаванні 20 мкМ R24571; 3 - в присутності 20 мкМ R24571 з наступним додаванням гліцерину (10% кінцева концентрація); 4 - в присутності 10%-го гліцерину з наступним додаванням 20 мкМ R24571; 5 - в присутності 10%-го гліцерину; *р<0,05.

Отримані дані свідчать про можливість регуляції активності Са2+-АТФази еритроцитів людини під впливом гліцерину як внаслідок структурних змін у мембрані, так і в результаті включення ендогенного модулятора кальмодуліну в модифікацію каталітичної активності Са2+-насоса.

Дія різних факторів на Са2+-АТФазу еритроцитів в процесі заморожування-відігрівання відбувається не ізольовано, а в складній системі білок-білкових і білок-ліпідних взаємодій у клітині. Дегліцеринізація, що передбачає серійне відмивання клітин від гліцерину із застосуванням розчинів солей для нормалізації осмотичного тиску, також може вплинути на активність Са2+-АТФази. Тому для аналізу впливу модифікуючих факторів кріоконсервування на Са2+-транспортуючу систему були проведені експерименти, які дали змогу оцінити зміни активності Са2+- АТФази еритроцитів людини під впливом високої іонної сили і кріоконсервування в присутності гліцерину. На сапонін-перфорованих клітинах встановлено, що дія низьких температур на еритроцити, що були консервовані в присутності гліцерину, веде до пригнічення роботи Са2+-АТФази, а дегліцеринізація кріоконсервованих клітин супроводжується стимулюванням фосфатазної функції. Розчини з високою іонною силою пригнічують каталітичну активність Са2+-насоса. Однак, активність Са2+-АТФази вірогідно знижується лише при перевищенні 350 мМ концентрації солей і не виявляє істотної специфічної залежності від виду досліджених моновалентних катіонів (Na+, K+). Дані закономірності були продемонстровані як на моделях незамкнутих білих тіней, так і сапонін-перфорованих клітин. В ефективних для кріопротекції клітин концентраціях гліцерин підтримує функцію Са2+-АТФази при підвищенні рівня солей у середовищі в режимі, аналогічному тому, що спостерігається в середовищі, яке не містить кріопротектора. Таким чином, модифікація активності Са2+-АТФази еритроцитів під впливом гліцерину, низьких температур і високої іонної сили може свідчити про залучення іонів Са2+ і систем, що регулюють їхній рівень у клітинах, у процеси стабілізації і дестабілізації клітин в умовах стресових впливів.

Зміна роботи Са2+-АТФази еритроцитів під впливом гліцерину і низької температури може вплинути на концентрацію цитозольного Са2+. Тому були проведені експерименти по оцінці змін рівня вільного Са2+ у цитоплазмі еритроцитів під впливом гліцерину і кріоконсервування. Отримані результати показали (рис.3), що у відповідь на насичення клітин кріопротектором концентрація внутрішньоклітинного Са2+ декілька збільшується, що узгоджується з незначним гальмуванням каталітичної активності Са2+-насоса в цих умовах.

Рис.3. Зміна рівня цитозольного Са2+ в еритроцитах: 1 - нативні клітини; 2 - клітини у середовищі, що містить гліцерин; 3 - клітини у середовищі, що містить гліцерин, у присутності ванадата.

Разом з тим, активний транспорт в умовах інкубації клітин у середовищі, що містить гліцерин, істотно впливає на регуляцію вмісту даного катіона в еритроцитах, оскільки інгібування Са2+-насоса при додаванні аніонів ванадату веде до збільшення його концентрації.

Рівень вільного Са2+ у клітинах після дегліцеринізації кріоконсервованих клітин помітно зростає, як і активність Са2+-АТФази сапонін-перфорованих еритроцитів в даних умовах, що було відзначено раніше. Порівняння встановлених фактів дозволяє припустити, що рівень цитозольного Са2+ може знижуватися з часом, що необхідно для нормалізації фізіологічних процесів у клітині. Підвищення рівня внутрішньоклітинного Са2+ на етапах інкубації з гліцерином, консервування, дегліцеринізації свідчить про те, що даний катіон може включатися в регуляцію функціонального стану низки клітинних структур і впливати на стабільність еритроцитів у цілому при зміні параметрів зовнішнього середовища.

Роль позаклітинного Са2+ і АТФ-азних реакцій у модифікації асиметричного розподілу фосфатидилсерину під впливом гліцерину і низьких температур була проаналізована в експериментах, які методом проточної цитометрії оцінюють зв'язування анексину V-FІTC з мембранами еритроцитів (рис.4).

Рис.4. Зв'язування анексин V-FІTC з клітинами: 1,2,3 – еритроцити в Рінгер-глюкозному середовищі; 4,5,6 – еритроцити у середовищі, що містить гліцерин; 1,4 – еритроцити у середовищі у відсутності Са2+; 2,5 - еритроцити у середовищі у присутності Са2+; 3,6 - еритроцити у середовищі у присутності Са2+ і ванадату; 7 - еритроцити після кріоконсервування під захистом гліцерину; 8 - еритроцити після дегліцеринізації і моделювання трансфузії.

Встановлено, що інкубація клітин у середовищі з гліцерином у присутності або відсутності Са2+ істотно не впливає на характер розподілу фосфатидилсерину в мембрані протягом 3 годин інкубації при 37 °С. Йнгібування АТФ-азних реакцій ванадатом у клітинах, що витримуються у даному середовищі до 3 годин, супроводжується певними змінами в розподілі фосфатидилсерину. Відзначається деяке збільшення кількості клітин, що зв'язують більше анексину V-FІTC, ніж у нормі, у порівнянні з розподілом клітинних популяцій у середовищах, які не містять ванадату. Однак дані зміни не досягають критичного рівня, як при моделюванні в еритроцитах апоптозу шляхом навантаження їх Са2+ за допомогою іонофора [Bratosin D. et al., 2001]. Вплив низьких температур на асиметричний розподіл фосфатидилсерину в клітинах, що зберегли структурну цілісність мембрани після кріоконсервування під захистом гліцерину (після видалення зруйнованих клітин в супернатанті), проявляється у деякому збільшенні кількості клітин, що зв'язують анексин з більшою інтенсивністю, ніж в основній популяції. Проте, не всі клітини в даній популяції є стабільними, оскільки їх частина лізує в процесі відмивання (гемоліз до 15%). Очевидно, причини їхньої загибелі не пов'язані з порушенням асиметрії ліпідного бішару і реалізуються за іншим механізмом. Відмивання від гліцерину кріоконсервованих еритроцитів, з наступним моделюванням трансфузії протягом 1 години при 37 °С, показало, що такі клітини можуть досить ефективно контролювати асиметричний трансбішаровий розподіл фосфатидилсерину, а зв'язування анексину клітинами практично не відрізняється від контролю. Таким чином, вплив гліцерину і низьких температур, хоча і змінює активність Са2+-АТФази і рівень цитозольного Са2+ в еритроцитах, але ці зміни, очевидно, не досягають критичного рівня, який веде до руйнування трансбішарової асиметричної локалізації фосфатидилсерину. Збереження нормальної локалізації даного фосфоліпіду сприяє підтримці білок-ліпідних контактів між цитоскелетними білками та ліпідним бішаром, і отже, збереженню механоеластичних властивостей плазматичної мембрани еритроцитів у стресових умовах.

Структурно-функціональна цілісність клітини багато в чому залежить від збереження напівпроникних властивостей плазматичної мембрани, які обумовлені станом ліпідного бішару [Болдырев А.А. и др., 1990], що створює бар'єр для більшості іонів і водорозчинних молекул. Однак, сам по собі ліпідний бішар не здатний самостійно підтримувати цілісність мембрани. Важливу роль в стабілізації мембрани відіграють білки цитоскелету, дія яких пов'язана з утворенням міцних зв'язків між собою та ліпідами бішару [Williamson P. et al., 1981; Shen B.M. et al., 1984]. Зміна рівня Са2+ в еритроцитах на етапах інкубації з гліцерином, консервування, дегліцеринізації може певним чином вплинути на структурну сіть цитоскелетних білків. Відомо, що двовалентні катіони, особливо кальцій і магній, відіграють істотну роль у структуруванні мембрани і білків цитоскелета [Конев С.В., 1987].У зв'язку з цим до складу середовищ, які використовували для одержання тіней, були введені двовалентні катіони або їхні хелатори як додаткова модифікація. Зафіксовані зміни білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетному комплексі під дією кріопротектора і низьких температур можуть бути обумовлені здатністю білкової сітки неоднаково реагувати на дію розчинів з низькою іонною силою, що містять Са2+, Мg2+ або ЕДТА, у залежності від її початкового структурно-функціонального стану. Характер модифікації білків цитоскелета еритроцитів під впливом кріопротектора і заморожування-відігрівання можна адекватно оцінити методом електрофорезу в ПААГ.

Проведені експерименти показали (рис.5), що вміст білків в зоні смуги 4.9 і 7 вірогідно збільшується після інкубування еритроцитів із гліцерином у порівнянні з нативними клітинами.

Рис.5. Вміст окремих фракцій білків у мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів по відношенню до загального вмісту білка в мембрані: А - у середовищі з ЕДТА; Б - у середовищі з Са2+, Mg2+; - нативні еритроцити, - - еритроцити після інкубації з гліцерином, - еритроцити після інкубації з гліцерином у присутності гліцерину на всіх етапах одержування тіней; *р<0,05.

Ці зміни характеризуються певною залежністю від наявності в середовищі Са2+, Мg2+. Також вираженою Са2+-залежністю характеризується поява білка з молекулярною масою 63-65 кДа, що виявляється в присутності двовалентних катіонів як у нативних клітинах, так і в еритроцитах, інкубованих із гліцерином (рис.5). Відзначене збільшення відносного вмісту білків у присутності кріопротектора може свідчити про зміну білок-білкових взаємодій у вузлових з'єднаннях актинових філаментів і можливості модифікації вертикальних контактів цитоскелета.

Аналіз змін у білковому спектрі МЦК еритроцитів після заморожування-відігрівання показав (рис.6), що низька температура викликає модифікацію білок-білкових взаємодій, яка супроводжується перерозподілом окремих компонентів при їхньому електрофоретичному розподілі в ПААГ. Заморожування в середовищі без кріопротектора веде до збільшення відносного вмісту анкіріну (білка смуги 2.1) і білка смуги 4.2, у порівнянні з нативними клітинами при використанні Са2+ і Mg2+

Рис.6. Вміст окремих фракцій білків у мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів по відношенню до загального вмісту білка в мембрані: А - у середовищі з ЕДТА; Б - у середовищі з Са2+, Mg2+; - нативні еритроцити, - - еритроцити після заморожування-відігрівання без кріопротектора, - еритроцити після заморожування-відігрівання з гліцерином, - еритроцити після 1 години модельної трансфузії; *р<0,05.

для виділення мембрано-цитоскелетного комплексу. В еритроцитах, що зберегли структурну цілісність при заморожуванні під захистом гліцерину, рівень анкіріну в спектрі мембрано-цитоскелетного комплекса еритроцитів не відрізняється від значень для нативних клітин, а також клітин, які просто інкубувались із кріопротектором, але не були заморожені. У кріоконсервованих під захистом гліцерину еритроцитах відносний вміст білка смуги 4.2 не відрізняється від його рівня в нативних клітинах, але при порівнянні з клітинами, які інкубувалися з гліцерином і не зазнавали заморожування, відзначається деяке зростання відносного відсотка даного білка. Інкубація кріоконсервованих клітин у фізіологічному розчині (моделювання трансфузії) показало, що розподіл білків тіней цих клітин в ПААГ не відрізняється від білкового спектру нативних еритроцитів (рис.6).

Таким чином, результати, отримані при вивченні модифікації мембранних і цитоскелетних структур в еритроцитах людини, індукованих ендоцелюлярним кріопротектором гліцерином і низькими температурами, свідчать про можливість структурно-функціональної стабілізації клітин до дії стресових факторів.

ВИСНОВКИ

Успішне вирішення проблеми низькотемпературного консервування неможливе без вивчення механізмів структурно-функціональної модифікації різних клітинних структур під впливом низьких температур і кріопротекторів різного типу дії. У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, щодо вивчення закономірностей змін Са2+-регулюючих систем і Са2+-залежних модифікацій мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину і низьких температур.

1. Активність Са2+-АТФази сапонін-перфорованих еритроцитів у присутності її ендогенних регуляторів змінюється біфазно в залежності від концентрації гліцерину. Низькі концентрації кріопротектора активують роботу ферменту, досягаючи максимального ефекту при 10%-му вмісті гліцерину в середовищі, а високі концентрації викликають інгібування Са2+-АТФази.

2. Порівняння ефектів гліцерину на роботу Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих еритроцитах і білих тінях свідчить про участь ендогенних регуляторів у модуляції її активності. Для реалізації активуючого ефекту гліцерину на Са2+-АТФазу потрібен кальмодулін, що підтверджується результатами інгібіторного аналізу.

3. На моделі сапонін-перфорованих еритроцитів показано, що заморожування-відігрівання клітин в присутності гліцерину супроводжується пригніченням Са2+-АТФазної активності, а їх дегліцеринізація після кріоконсервування веде до стимулювання функції даного ферменту. Високі концентрації солей пригнічують каталітичну активність Са2+-насоса як у сапонін-перфорованих клітинах, так і в білих тінях еритроцитів незалежно від присутності кріопротектора в середовищі.

4. Встановлено, що під впливом інкубації з гліцерином, кріоконсервування, дегліцеринізації відбувається підвищення рівня цитозольного Са2+ в еритроцитах. Са2+-транспортуючі системи істотно впливають на регуляцію його вмісту, оскільки додавання ванадату на всіх етапах супроводжується збільшенням концентрації Са2+.

5. Інкубація з гліцерином, кріоконсервування, дегліцеринізація слабко впливають на трансбішаровий розподіл фосфатидилсерину в мембрані еритроцитів. Регулююча роль Са2+ і АТФ-азних реакцій в даних умовах виражена несуттєво.

6. Під впливом гліцерину і низьких температур відбуваються Са2+-залежні перебудови білок-білкових взаємодій в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів, що виражається в зміні вмісту білків смуг 2.1, 4.2, 4.9, 6, 7. Після моделювання трансфузії білковий спектр деконсервованих еритроцитів не відрізняється від спектру нативних клітин.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Кофанова О.А., Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А. Активность Са2+-АТРазы эритроцитов человека при криоконсервировании под защитой глицерола // Гематологія і переливання крові. - 2004. - Вип.32. - С.72-79.

2. Землянских Н.Г., Кофанова О.А., Бабийчук Л.А. Модификация активности Ca2+-ATPазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой // Пробл. криобиологии. - 2005. – Т.15, №2. - С.173-183.

3. Землянских Н.Г., Кофанова О.А. Ca2+-ATPаза эритроцитов человека модифицируется под действием глицерола и низких температур // Пробл. криобиологии. - 2005. – Т.15, №3. - С.529-532.

4. Землянских Н.Г., Кофанова О.А., Хоменко М.В. Осмотические эффекты модулируют активность Са2+-АТРазы эритроцитов человека // Гематологія і переливання крові. - 2006. -Вип.33. - С.104-108.

5. Землянских Н.Г., Кофанова О.А. Модификация активности Са2+-АТРазы эритроцитов человека под влиянием глицерола: роль кальмодулина // Биохимия. - 2006. - Т.71, №8. - С.1112-1118.

6. Кофанова О.О. Вплив гліцеролу та іонної сили на активність Са2+-АТРази еритроцитів людини // Матеріали наук.-практ. конференції молодих вчених, присвяченої 350-річчю міста Харкова 23 листопада 2004 року. - Харків, 2004. - С.43-44.

7. Кофанова О.А., Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А. Влияние высоких концентраций ионов щелочных металлов на активность Ca2+-ATPазы эритроцитов человека // Матеріали Міжнарод. наук.-практ. конференції “Дні науки 2005”.- Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2005. - Т.2.“Біологія” - С.22-25.

8. Землянских Н.Г., Кофанова О.А. Регуляция активности Ca2+-ATPазы эритроцитов человека в присутствии глицерола // Материалы международ. конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”. - Пущино, 2005. - С.308-311.

9. Землянских Н.Г., Кофанова О.А. Состояние активности Ca2+-ATPазы эритроцитов человека при криоконсервировании в глицерол-содержащих средах / Матер. наук.-практ. конф., м.Київ, 2005р. // Укр. журнал гематології та трансфузіології. Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання. - 2005, №4(додатковий)(5). - С.113-114.

10. Кофанова О.А., Землянских Н.Г. Действие низких температур и глицерола на концентрацию цитозольного Са2+ и активность Ca2+-ATPазы эритроцитов // Материалы Всеукраин. науч.-техн. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых “Физика. Биофизика - 2006”. - Севастополь: Изд-во СевНТУ, 2006. - С.107-112.

11. Землянских Н.Г., Кофанова О.А., Бабийчук Л.А. Асимметричное распределение фосфатидилсерина в мембране эритроцитов при криоконсервировании под защитой глицерола / Матер. V міжнар. наук. симпоз. “Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології”, м.Київ, 2006р. // Новое в гематологии и трансфузиологии. - 2006. - Вип.5 - С.33-37.

12. Землянских Н.Г., Кофанова О.А., Бабийчук Л.А. Влияние глицерола на активность Са2+-АТРазы и асимметричное распределение липидов в мембране эритроцитов человека // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Сб. статей Седьмого съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков; Под ред. И.Д.Волотовского, С.Н. Черенкевича и др. - Мн.: Право и экономика. - Минск, 2006. – Т.1. - С.244-246.

13. Кофанова О., Землянських Н., Бабійчук Л. Стан мембранних білків еритроцитів в умовах кріоконсервування // Матеріали наук.-практ. конференції молодих вчених, присвяченої 145-річчю Харківського медичного товариства 23 листопада 2006 року. - Харків, 2006. - С. 37-38.

14. Кофанова О., Землянських Н., Бабійчук Л. Зміна активності Са2+-АТФази еритроцитів під вплівом гліцерола і низьких температур // Тези доповідей Установчого зґїзду Українського товариства клітинної біології. - Львів, 2004. - С.243.

15. Землянських Н.Г., Кофанова О.О. Вивчення впливу гліцеролу на роботу Са2+-АТРази еритроцитів людини // Тези доповідей Першої Міжнародної конференції студентів та аспірантів. - Львів, 2005. - С.30.

16. Kofanova O.A., Zemlyanskikh N.G., Babijchuk L.A. Influence of cryoprotectants with different effectory mechanisms on human erythrocyte Ca2+-ATPase / Матер. 5 Парнас. конф. // Укр.біохім.журн. – 2005. - Т.77, №2(спеціальний випуск). - С.117.

17. Кофанова О.А., Землянских Н.Г. Изменение активности Ca2+-ATPазы эритроцитов человека при криоконсервировании в присутствии глицерола // Збірник тез міжвузвської конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, 2006. - С.21-22.

18. Kofanova O.A., Zemlyanskikh N.G. Investigation of erythrocytes Ca2+-ATPase activity under ion strength and glycerol effects // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”. - Львів, 2006. - С.78.

19. Кофанова О.А., Землянских Н.Г. Эффект глицерола и низких температур на активность Ca2+-ATPазы эритроцитов человека // Сборник тезисов 10й Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН “Биология – наука XXI века”. - Пущино, 2006. - С.80.

20. Землянських Н.Г., Кофанова О.О., Хоменко М.В., Бабійчук Л.О. Кріоконсервування еритроцитів людини під захистом гліцеролу і ПЕО-1500 для кліничного застосування: зміна активності Са2+-АТРази // Клінічна хірургія. - 2006. - №4-5. - С.93.

21. Кофанова О.А., Землянских Н.Г. Влияние глицерола и низких температур на асимметричное распределение фосфатидилсерина в мембране эритроцитов // Матеріали IX Українського біохімічного з’їзду. - Харків, 2006.- Т.1. - С.47.

22. Кофанова О.О. Гліцерол та низькі температури модифікують мембрано-цитоскелетний комплекс еритроцитів людини / Матер. конф. молод. учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006”, м.Київ, 2006р. // Укр.біохім.журн. - 2006. - Т.78, №6. - С.141.

Анотація

Кофанова О.О. Модифікація функціональної активності Са2+-АТФази і мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину та кріоконсервування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченню змін фукціональної активності Ca2+-АТФази і рівня вільного цитозольного Са2+ в еритроцитах людини, а також оцінці Са2+-залежних перебудов трансмембранного розподілу фосфатидилсерина в ліпідному бішарі та білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетном комплексі, що індуковані гліцерином і кріоконсервуванням. Встановлено, що модифікація активності Са2+-АТФази сапонін-перфорованих еритроцитів під впливом наростаючих концентрацій гліцерину має біфазний характер. Аналіз ролі ендогенних модуляторів з використанням інгібітору кальмодулін-залежних реакцій показав, що активація Са2+-АТФази, яка відмічається в присутності 10%-го гліцерину, реалізується тільки у присутності кальмодуліна. Також відзначено, що активність даного ферменту в еритроцитах, кріоконсервованих під захистом гліцерину, пригнічується після розморожування, а після дегліцеринізації кріоконсервованих клітин підвищується. Показано, що рівень цитозольного Са2+ в еритроцитах під впливом гліцерину збільшується. У кріоконсервованих клітинах після дегліцеринізації рівень Са2+ ще більш зростає в порівнянні з умовами інкубування в присутності гліцерину. Встановлено слабкий вплив гліцерину і низьких температур на зміну асиметричного розподілу фосфатидилсерина в плазматичній мембрані еритроцитів протягом короткого часу. Показано, що під впливом гліцерину і кріоконсервування можуть відбуватися Са2+-індуковані перебудови в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів.

Ключові слова: Са2+-АТФаза, мембрано-цитоскелетний комплекс, еритроцити, гліцерин, кріоконсервування

Аннотация

Кофанова О.А. Модификация функциональной активности Са2+-АТФазы и мембрано-цитоскелетного комплекса эритроцитов под влиянием глицерина и криоконсервирования. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2007.

Диссертационная работа посвящена изучению модификации функциональной активности Са2+-АТФазы и уровня свободного цитозольного Са2+ в эритроцитах человека под влиянием глицерина и низких температур, а также оценке Са2+-зависимых перестроек трансмембранного распределения фосфатидилсерина в липидном бислое и белок-белковых взаимодействий в мембрано-цитоскелетном комплексе, которые индуцированы данным криопротектором и криоконсервированием.

Установлено, что модификация активности Са2+-АТФазы сапонин-перфорированных эритроцитов под влиянием наростающих концентраций глицерина носит бифазный характер. Малые концентрации криопротектора способны стимулировать ферментативную реакцию, большие – ингибировать ее. Анализ роли эндогенных модуляторов с использованием ингибитора кальмодулин-зависимых реакций показал, что активация Са2+-АТФазы, отмечаемая в присутствии 10%-го глицерина реализуется только при участии кальмодулина.

На модели сапонин-перфорированных эритроцитов показано, что действие низких температур на криоконсервированные под защитой глицерина клетки сопровождается угнетением Са2+-АТФазной активности, а деглицеринизация криоконсервованных эритроцитов ведет к стимулированию ее функции. Высокие концентрации солей тормозят каталитическую активность Са2+-насоса как в сапонин-перфорированных клетках, так и в белых тенях эритроцитов независимо от присутствия криопротектора в среде.

Показано, что уровень цитозольного Са2+ в эритроцитах под влиянием глицерина увеличивается, но сохраняется на более низком уровне, по сравнению с клетками, в которых активность Са2+-АТФазы заингибирована ванадатом в аналогичных условиях. В криоконсервированных клетках после деглицеринизации уровень Са2+ еще более возрастает по сравнению с клетками инкубированными в присутствии глицерина.

Установлено слабое влияния глицерина и низких температур на изменение асимметричного распределения фосфатидилсерина в плазматической мембране эритроцитов на протяжении относительно короткого периода времени (до 3 часов). Регулирующая роль Са2+ и АТФ-азных