ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

КАЗАНЦЕВ

Тарас Анатолійович

УДК 58.03+535.346

ВИКОРИСТАННЯ СПЕКТРАЛЬНИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛИСТКІВ РОСЛИН ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЇХ

ФІЗІОЛОГІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімії фотосинтезу Інституту фізіології рослин

і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Кочубей Світлана Михайлівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Шадчина Тамара Михайлівна Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу

доктор біологічних наук, професор Булах Анатолій Андрійович

Міжнародний Соломонів університет, завідувач кафедри

Захист дисертації відбудеться “ 26 ” березня 2008 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ – 22, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ – 22, вул. Васильківська 31/17.

Автореферат розісланий “ 22 ” лютого 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Мордерер Є.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Своєчасний та ефективний контроль стану рослинності є важливою задачею в сільському господарстві та при вирішенні екологічних задач. З цієї точки зору інтерес представляє використання спектрів відбиття рослин у якості джерела інформації щодо їх стану. Вимірювання спектрів відбиття є швидкою процедурою, оскільки не вимагає лабораторних аналізів, а використання дистанційної апаратури дозволяє тестування великих площ рослинності за короткий час. Кілька десятиріч триває розробка методів оцінки різноманітних показників стану рослин за їх спектрами відбиття. В цьому напрямку традиційним підходом є використання спектральних коефіцієнтів яскравості рослинного покриву, на основі яких були розроблені різноманітні вегетаційні індекси. При розробці індексів велику увагу було приділено концентрації хлорофілу – важливому фізіологічному показнику, який, крім того, забезпечує основний внесок у формування спектру відбиття у видимому діапазоні. Відомо понад 40 вегетативних індексів, чутливих до вмісту цього пігменту [Maire et al, 2000]. Розроблені також індекси для тестування вмісту інших пігментів, загального азоту, біомаси, листкового індексу, вмісту води. Всі вони базуються на вимірюванні коефіцієнтів яскравості на різних довжинах хвиль у видимому діапазоні.

Використання коефіцієнтів яскравості забезпечує високий рівень кореляції з відповідними рослинними показниками в лабораторних умовах, однак при застосуванні їх в польових вимірюваннях кореляція знижується або руйнується взагалі, що обумовлено відмінностями оптичних властивостей одиничного листка і фітоценозу а також певними технічними складностями.

Пізніше був застосований альтернативний підхід до оцінки вмісту хлорофілу за спектрами відбиття. Зокрема він був запропонований і детально розроблявся починаючи з 80-тих років у відділі біохімії фотосинтезу Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Він базується на одержанні інформації за кількісними показниками форми спектру, що виключає необхідність визначення чисельних значень коефіцієнтів яскравості та дозволяє усунути деякі фактори, які впливають на спектр відбиття фітоценозу. Був розроблений метод визначення концентрації хлорофілу в листках озимої пшениці, за допомогою використання співвідношення інтенсивності максимумів в графіку першої похідної спектру відбиття в області червоного краю [Кочубей та ін., 1983].

В подальшому такий підхід використовувався іншими вченими. Вони також застосовували співвідношення значень похідної на різних довжинах хвиль, які отримали назву деривативних вегетаційних індексів. В літературі є данні про використання близько 10 деривативних індексів для оцінки вмісту хлорофілу. Вони відрізняються за довжинами хвиль, на яких визначалися значення похідної. Крім того, різні індекси були використані для різних поодиноких видів рослин. Тому виникло питання про те, чи відрізняються ці індекси за ефективністю і який з них найбільш прийнятний для кількісного визначення концентрації хлорофілу в різних видах.

Важливою задачею є також розробка деривативних індексів для тестування інших фізіологічних показників рослин за спектрами відбиття у видимій області, що б дало змогу оцінювати стан рослинності за декількома показниками з використанням одного спектрального приладу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках науково-дослідних проектів відділу біохімії фотосинтезу “Development of the method and the device for remote sensing of vegetation” (проект УНТЦ № 2416), “Вплив теплового та світлового стресів на структурну організацію та функціональну активність хлоропластів та листків” (договір МОН № М/266-2004) та “Розробка нових способів передпосівної обробки насіння для підвищення посухостійкості рослин пшениці і методів дистанційного тестування стану посівів для оперативного контролю у нових технологіях вирощування” (договір МОН № М/272-2004).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи була розробка системи спектральних параметрів листків рослин, які можуть бути застосовані для оцінки їх основних фізіологічних показників за спектрами відбиття у видимому діапазоні.

В зв’язку з цим були поставлені наступні задачі:

1. Провести порівняльний аналіз відомих та оригінальних деривативних індексів для оцінки хлорофілу, розроблених на основі червоної ділянки спектру відбиття для виявлення їх ефективності та прийнятності для рослин різних видів.

2. В області “зеленого” максимуму спектру відбиття виявити ділянки, які є селективно чутливими до вмісту хлорофілу або води. Розробити на їх основі деривативні індекси для оцінки цих складових листка.

3. Дослідити вплив накопичення антоціанів на спектри відбиття листків та розробити деривативні індекси для оцінки вмісту цих пігментів.

4. Із застосуванням фізичних та комп’ютерних моделей дослідити вплив на спектри відбиття факторів, які спричинюють відмінності спектральних характеристик окремого листка та фітоценозу: мультиярусність та неповне проективне покриття ґрунту рослинністю.

5. Перевірити дієздатність розробленого методу оцінки вмісту хлорофілу за деривативним вегетаційним індексом на рівні фітоценозу в натуральних умовах освітлення сонячним світлом при різних рівнях проективного покриття.

Об’єкти дослідження – листки рослин озимої пшениці, кукурудзи, буряку і винограду, рядкові посіви озимої пшениці на дослідній ділянці.

Предмет досліджень – спектри відбиття у видимому діапазоні листків досліджуваних рослин, спектри пропускання у видимому діапазоні листків винограду, спектри відбиття у видимому діапазоні досліджуваних посівів озимої пшениці на різних фазах вегетації, вміст хлорофілу, антоціанів та води в досліджуваних рослинах.

Методи досліджень – вимірювання спектрів відбиття посівів рослин та спектрів відбиття і поглинання листків, вимірювання індукції флуоресценції хлорофілу в листках, визначення вмісту хлорофілу та антоціанів в листках біохімічним методом, комп’ютерне моделювання спектрів відбиття систем ґрунт-рослинність з різним рівнем проективного покриття, визначення площі листків та проективного покриву посівів шляхом комп’ютерної обробки їх цифрових зображень за допомогою програм Square та Photoshop, обробка математичних даних за допомогою комп’ютерної програми Origin 7.5 Pro.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено критерій відбору найбільш ефективного деривативного вегетаційного індексу для оцінки вмісту хлорофілу і показано, що таким є індекс D725/D702. Встановлено його прийнятність для 4-х видів рослин, що дозволяє припустити його застосування і для інших видів.

Розроблено новий деривативний вегетаційний індекс для визначення концентрації хлорофілу за спектрами відбиття в області зеленого максимуму.

Встановлено, що комбінація запропонованих індексів в зеленій та червоній області спектру дозволяє визначати концентрацію хлорофілу в двошарових системах листків окремо в нижньому і верхньому шарі.

Розроблено нові деривативні вегетаційні індекси для визначення концентрації антоціанів за спектрами відбиття, кожен з яких забезпечує найбільшу точність в певному діапазоні концентрацій цього пігменту. Експериментально виявлене поглинання синього світла антоціанами, які містяться в листках в умовах підвищеної освітленості, що доводить їх захисну роль.

Вперше виявлено ділянки спектру відбиття в області зеленого максимуму які є селективно чутливими до вмісту води в листку та розроблено деривативний індекс для оцінки цього показника.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонований алгоритм визначення концентрації хлорофілу за спектром відбиття в червоній області був використаний в програмному забезпеченні WINCHL апаратно-програмного комплексу “Польовий хлорофіломір”, розробленого у відділ біохімії фотосинтезу Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ сумісно з державним підприємством Завод Арсенал та Інститутом космічних досліджень НАНУ і НКАУ. Запропоновані алгоритми оцінки вмісту води та антоціанів також будуть внесені до вказаного програмного забезпечення.

Особистий внесок здобувача. Здобувач опрацював літературу та оволодів необхідними методами дослідження. Приймав участь у плануванні експериментів. Спектральні вимірювання, обробка та аналіз результатів проведені здобувачем особисто. Частка особистої участі дисертанта складає понад 80%.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень були представлені на VIII конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології рослин і генетиці” (Київ, 2002), школі-семінарі для молодих науковців “Наукові космічні дослідження” (Жукін, 2003), IX конференції молодих дослідників (Київ, 2005), першій міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005), конференції молодих вчених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 2005), 15-му конгресі FESPB (Lyon, France, 2006), Міжнародній конференції “Моделювання динамічних систем і дослідження стабільності” (Київ, 2007), конференції “Наука про землю і космос – суспільству” (Київ, 2007), конференції молодих дослідників (Дніпропетровськ, 2007), 12-й Європейській конференції зі спектроскопії біологічних молекул (Paris, France, 2007), Міжнародному симпозіумі SPIE з дистанційного зондування (Florence, Italy, 2007), X конференцій молодих вчених “Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології” (Київ, 2007).

Структура дисертації

Дисертаційна робота викладена на 154 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, трьох розділів, підсумків, висновків і списку використаних джерел, який налічує 174 найменування. Робота містить 58 ілюстрацій і 22 таблиці.

Публікації

За результатами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, в тому числі 4 статті у фахових журналах.

Основний зміст

У першому розділі викладено узагальнену інформацію про відомі підходи використання спектрів відбиття рослин у якості джерела інформації щодо стану рослин.

Другий розділ присвячено об’єктам та методам дослідження. Вимірювали спектри відбиття листків озимої пшениці (Triticum aestivum L.), кукурудзи (Zea mays L.), буряку (Beta vulgaris L.) і двох видів винограду (Vitis vinifera L., Parthenocissus quinquefolia (L.) Planch.) а також спектри відбиття рядкових посівів озимої пшениці. Рослини зростали в натуральних умовах (Vitis vinifera L., Parthenocissus quinquefolia (L.) Planch.) або вирошувалися на дослідних ділянках (Triticum aestivum L., Zea mays L., Beta vulgaris L.) Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.

Спектри відбиття листків в лабораторних умовах вимірювали за допомогою двопроменевого спектрофотометра СФ-10 (ЛОМО), обладнаного інтегруючою сферою для захоплення розсіяного світла та блоком спряження з комп’ютером для реєстрації спектрів в цифровому вигляді. Вимірювання проводили в діапазоні 400-750 нм зі спектральним інтервалом 1 нм.

Спектри відбиття посівів вимірювали за допомогою польового спектрометра, сконструйованого на Державному підприємстві “Завод Арсенал” сумісно з відділом біохімії фотосинтезу [Yatsenko et al, 2005]. Спектрометр встановлювався на тринозі над досліджуваним посівом на висоті 1,15 м від верхівок рослин. При цьому розмір поля зору складав 35Ч35 см. Вимірювання проводили в діапазоні 500-750 нм зі спектральним розділенням 1 нм. Величину проективного покриття ґрунту рослинністю на досліджуваних ділянках визначали, фотографуючи їх цифровою камерою Olympus C310 Zoom, та обробляючи зображення за допомогою комп’ютерної програми Adobe Photoshop 7.0.

Кінетичні криві індукції флуоресценції хлорофілу в листках вимірювали на флуориметричній установці, сконструйованій у відділі біохімії фотосинтезу. Зразок збуджувався світлом в спектральному діапазоні 400-460 нм з максимумом при 430 нм. Флуоресценцію реєстрували при 680 нм з частотою запису сигналу 5000 Гц. Керування вимірюваннями та реєстрація сигналу проводилися через комп’ютер.

Концентрацію хлорофілу в листках визначали розтираючи їх в ступці в 80% ацетоні з подальшим центрифугуванням та спектрофотометруванням екстрактів при 652 нм [Arnon, 1949] або подрібнюючи та поміщаючи в диметилсульфоксид (ДМСО) на 3 год. при температурі +68єС з подальшим спектрофотометруванням екстрактів при 649 та 665 нм [Wellburn, 1994].

Концентрацію антоціанів в листках визначали розтираючи їх в ступці в суміші 3М HCl:H2O:MeOH в об’ємній пропорції 1:3:16 [Gietelson et al, 2001] або подрібнюючи їх і поміщуючи в ту ж саму суміш на 24 год. при температурі +4єС в темноті [Gould et al, 2000]. Після цього в обох випадках екстракти центрифугували для підвищення їх прозорості на 1000 g протягом 5 хв. Вимірювали спектри поглинання екстрактів в діапазоні 400-750 нм за допомогою спектрофотометра Specord 200 (Jena, Germany). Розрахунок концентрації антоціанів проводився за оптичною густиною екстрактів при 530 нм (максимум поглинання антоціанів в екстракті) та 653 нм (для врахування поглинання хлорофілу при 530 нм) [Murray and Hackett, 1991].

Вміст води в листках визначали шляхом зважування зразків під час досліджень та після їх висушування в сухожаровій шафі.

Спектри відбиття, виміряні в лабораторних умовах згладжували методом Савітського-Голая [Savitsky and Gollay, 1969], та розраховували їх перші похідні методом поліномів. Згладжування проводили з використанням поліному 2 ступеня і розміром рухомого вікна 5 точок. Похідні розраховували, використовуючи поліном 3 ступеня та рухоме вікно розміром 9 точок. Розрахунки проводили за допомогою комп’ютерної програми Noise.

В спектрах відбиття, виміряних за допомогою польового спектрометру, був присутній паразитний сигнал, який носив регулярний характер і не міг бути вилучений при згладжуванні методом Савітського-Голая. Тому ці спектри згладжували за допомогою частотного фільтру Фур’є, який був реалізований в комп’ютерній програмі Microcal Origin 7.5 Pro. За допомогою цієї ж програми проводили розрахунок перших похідних спектрів відбиття.

Третій розділ присвячений розробці спектральних параметрів листків рослин для визначення їх фізіологічних показників.

Визначення концентрації хлорофілу за спектрами відбиття в області червоного краю.

Форма спектрів відбиття листків в області червоного краю (680-750 нм) у високій залежала від концентрації хлорофілу (рис.1. А). Детальний аналіз графіків перших похідних спектрів відбиття виявив, що в області червоного краю в них присутні 3 екстремуми, проте зазвичай одночасно спостерігається тільки 2 з них (рис.1. Б). Встановлено, що короткохвильовий екстремум спостерігається при всіх концентраціях хлорофілу, проте є домінуючим при низьких. Середній екстремум спостерігається і домінує при середніх або високих концентраціях, довгохвильовий – виключно при високих. Три екстремуми одночасно спостерігаються при концентрації, яка складає 70-100 % від максимальної концентрації для даного виду.

Рис. 1. Спектри відбиття (А) та графіки їх перших похідних (Б) листків озимої пшениці з різною концентрацією хлорофілу (мг/дм2): 1 – 2,9; 2 – 5,83; 3 – 7,25.

На основі спектральних положень цих екстремумів були розраховані 8 деривативних індексів:

· Dlw/Dsw

· D725/D702

· Dlw/D702

· D725/Dsw

· Dm/Dsw

· D715/D702

· Dm/D702

· D715/Dsw,

де D – значення першої похідної, нижній індекс вказує на довжину хвилі, при якій розраховується значення похідної: sw, m, lw – довжини хвиль короткохвильового, середнього і довгохвильового екстремуму відповідно; 702, 715, 725 – фіксовані довжини хвиль (відповідають середньому положенню короткохвильового, середнього і довгохвильового екстремуму відповідно).

Для кожного з 8-ми індексів у 4-х видах рослин були розраховані параметри регресійної залежності між ними та концентрацією хлорофілу: рівняння лінійної регресії, коефіцієнти кореляції та похибка регресії. Додатковим критерієм ефективності індексу було значення вільного члену (b) регресійної залежності між значенням та концентрацією хлорофілу (ах+b) Величина b відповідає концентрації хлорофілу, при якій індекс набуває нульового значення. Експериментально було встановлено, що всі індекси повинні досягати нульового значення при концентрації хлорофілу, близькій до нуля. Отже, найбільш точним є рівняння регресії, в якому b = 0. Для всіх видів рослин наведені вимоги найкраще задовольняв індекс D725/D702 (табл.1). Невідповідність інших останній вимозі ймовірно пов’язана із нелінійною залежністю від концентрації хлорофілу в області низьких концентрацій.

Таблиця 1

Параметри регресійних залежностей між різними деривативними індексами і концентрацією хлорофілу в листках різних рослин

Вид рослини | Індекс | Параметри регресії ax+b | Коефіцієнт кореляції, R | Похибка регресії,

мг/дм2

a | b

Triticum aestivum L. | Dlw/Dsw | 5,13 | -0,34 | 0,76 | 1,24

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

D715/Dsw | 6,72 | -1,93 | 0,69 | 1,33

Zea mays L. | Dlw/Dsw | 3,13 | 0,06 | 0,95 | 0,45

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

D715/Dsw | 3,85 | -0,69 | 0,95 | 0,43

Beta

vulgaris L. | Dlw/Dsw | 2,84 | 0,30 | 0,97 | 0,20

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

D715/Dsw | 3,17 | -0,43 | 0,94 | 0,31

Vitis

vinifera L. | Dlw/Dsw | 2,91 | 0,17 | 0,98 | 0,23

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

1. |

D715/Dsw | 3,07 | -0,20 | 0,98 | 0,24

Рівняння регресії індексу D725/D702 були близькими для рослин кукурудзи, буряку і винограду, що дозволяє використання для цих видів одного узагальненого рівняння практично без збільшення похибки регресії. Узагальнене рівняння можливо також використовувати для озимої пшениці, проте в цьому випадку похибка регресії збільшується.

Визначення концентрації хлорофілу за спектрами відбиття в області зеленого максимуму.

Область червоного краю являє собою різкий перехід від низьких коефіцієнтів відбиття до високих, що обумовлено наявністю в ній інтенсивної смуги поглинання світла хлорофілом. Внаслідок цього за певних умов, наприклад, при існуванні декількох ярусів листків, відбиття в цій області може потрапляти в зону нелінійної залежності від концентрації хлорофілу, що буде знижувати точність оцінки вмісту цього пігменту. Тому був проведений пошук альтернативних спектральних параметрів в зеленій області спектру, в якій поглинання хлорофілу нижче.

Для цього в діапазоні 500-550 нм були розраховані всі можливі співвідношення значень перших похідних на двох довжинах хвиль з кроком 5 нм. Для отриманих співвідношень – деривативних індексів були обчислені рівняння лінійної регресії, коефіцієнти кореляції та похибка регресії. За цими критеріями найбільш ефективним індексом виявився індекс D505/D530 для озимої пшениці та D510/D530 для кукурудзи, буряку і винограду (таблиця 2).

Таблиця 2

Регресійні параметри деривативних індексів на основі зеленого максимуму, які проявляють найвищу кореляцію з вмістом хлорофілу

Вид рослини | Індекс | Параметри регресії ax+b | Коефіцієнт кореляції, R | Похибка регресії,

мг/дм2

a | b

Triticum aestivum L. | D505/D520 | -7,43 | 7,08 | 0,82 | 0,93

1. |

1. |

1. |

Zea mays L. | D505/D530 | -2,28 | 3,41 | 0,79 | 0,78

1. |

1. |

1. |

Beta

vulgaris L. | D505/D530 | -2,87 | 4,11 | 0,80 | 0,46

1. |

1. |

1. |

Vitis

vinifera L. | D505/D530 | -1,37 | 2,70 | 0,80 | 0,65

1. |

1. |

1. |

Аналогічно індексу D725/D702, для індексу D510/D530 виявилось можливим використання узагальненого рівняння регресії в рослинах кукурудзи, буряку та винограду без значного збільшення похибки регресії.

Дослідження спектральних властивостей антоціанів в листках та розробка спектральних параметрів для визначення їх концентрації

Досліджено спектральні властивості пігментів, які обумовлювали червоний та фіолетовий колір листків Parthenocissus quinquefolia (L.) Planch. в умовах низької температури та яскравого освітлення. Екстракцією цих пігментів з листків та спектрофотометруванням одержаних екстрактів було встановлено, що як червоне так і фіолетове забарвлення листків обумовлюється накопиченням антоціанів, концентрація яких може досягати 12 мг/дм2. Фіолетовий колір листків був обумовлений суперпозицією хлорофілу і антоціанів.

Накопичення антоціанів в листках призводило до специфічних змін в їх спектрах відбиття – часткове або повне зниження зеленого максимуму, і, як наслідок, утворення максимуму при 630 нм (рис. 2. А). Істотні зміни відбуваються також в графіках перших похідних спектрів відбиття (рис. 2. Б).

Рис. 2. Спектри відбиття (А) та графіки їх перших похідних (Б) листків з близькою концентрацією хлорофілу (1,8 – 2,0 мг/дм2) і різною концентрацією антоціанів (мг/дм2): 1 – 0,16; 2 – 0,61.

За допомогою відносного різницевого спектру відбиття двох листків з однаковим вмістом хлорофілу і різним вмістом антоціанів встановлено поглинання нативних антоціанів в синій області спектру, що доводить їх захисну роль, як світлофільтра, що захищає фотосинтетичного апарат від надлишкового світла.

Наведені зміни у формі спектрів дали змогу розробити деривативні індекси для тестування вмісту антоціанів. Виявилось, що для визначення вмісту антоціанів необхідно 3 деривативних індекси, кожен з яких застосовується в різних діапазонах концентрацій: D585/D565 – 0-1,25 мг/дм2; D593/D580 – 0-4 мг/дм2; D597/D584 – 0-12 мг/дм2, де D – значення похідної на відповідній довжині хвилі без врахування знаку похідної (таблиця 3).

Таблиця 3

Регресійні параметри деривативних індексів для визначення концентрації антоціанів

Індекс | Діапазон концентрацій

антоціанів, мг/дм2 | Параметри регресії ax+b | Коефіцієнт кореляції,

R | Похибка регресії,

мг/дм2

a | b

|D|585/|D|565 | 0 – 1,25 | 0,41 | -0,05 | 0,93 | 0,15

|D|593/|D|580 | 0 – 4 | 1,01 | -0,16 | 0,95 | 0,33

|D|597/|D|584 | 0 – 12 | 1,69 | -0,66 | 0,96 | 0,70

Дослідження впливу варіацій вологості листків на їх спектри відбиття у видимому діапазоні

Відомі методи тестування водного статусу рослин за спектрами відбиття базуються переважно на використанні інфрачервоного діапазону [Palmer, Williams, 1974; Gao, 1996; Ceccato, 2002] або працюють опосередковано через вміст хлорофілу [Paltridge, 1988; Ткачев, 1992]. В даних дослідженнях вивчався вплив безпосередньо води на видимий діапазон спектрів відбиття. Для цього вимірювали спектри відбиття листків кукурудзи у фазі 3-го листка та фазі цвітіння, в яких внаслідок штучної посухи або при різних погодних умовах варіював рівень обводненості. Після вимірювань кожен листок додатково зволожували в лабораторних умовах до реалізації його повної вологоємкості і знову проводили вимірювання. Таким чином, для кожного зразка отримували два спектра відбиття, відмінності між якими були обумовлені виключно зміною вмісту води.

Збільшення обводненості листків спричинювало зниження загального рівня відбиття у всьому діапазоні. Величина, на яку знижувалося відбиття була пропорційна кількості поглинутої води (рис. 3).

Рис. 3. Спектри відбиття листків кукурудзи до (суцільна лінія) та після (пунктир) штучного зволоження. dW – збільшення вмісту води після зволоження.

Зволоження листків викликало специфічні зміни в області зеленого максимуму в графіках перших похідних спектрів відбиття (рис. 4. А) Це дозволило розробити деривативний індекс, значення якого корелювали із вмістом води в листках: D525/D570. Кореляція зберігалася при включенні у вибірку даних з обох фаз вегетації а також вимірювань до та після штучного зволоження (рис. 4. Б). Отже, розроблений індекс селективно чутливий до вмісту води в листках і стійкий до варіацій інших параметрів, зокрема – концентрації хлорофілу.

Рис. 4. А – графіки перших похідних спектрів відбиття листку кукурудзи до (суцільна лінія) та після (пунктир) штучного зволоження.

Б – залежність між вмістом води в листках та величиною індексу D525/D570.

Оскільки поглинання води у видимій області практично відсутнє [Jacquemoud, Ustin, 2001], збільшення її вмісту не може напряму впливати на спектр відбиття. Ймовірно, зміна значень індексу при накопичені води пов’язана із зменшенім розсіювання світла всередині листка [Брандт, Тагеева, 1967].

Вивчення особливостей форми спектрів відбиття двошарових листкових систем

Мультияруснітсь є одним з факторів, який може обумовлювати відмінності між спектрами відбиття фітоценозів та окремих листків. Дію цього фактору було досліджено за допомогою моделей двошарових листкових систем, організованих у вигляді двох листків, поміщених один поверх іншого в кюветі спектрофотометра. В спектрах відбиття та графіках перших похідних спектрів відбиття таких моделей присутність нижнього листкового шару викликала збільшення відбиття в червоній ділянці і практично не впливала на інші області спектру (рис. 5).

Рис. 5. Спектри відбиття (А) та графіки їх перших похідних (Б) одного шару листку (1) та двошарової системи (2). У якості одношарового зразку та верхнього шару двошарової системи використаний один і той самий листковий фрагмент.

Перевірена ефективність визначення концентрації хлорофілу в двошарових системах за допомогою деривативних індексів, в яких використовується область зеленого максимуму (D510/D530) та червоного краю (D725/D702). Концентрація хлорофілу, розрахована за “зеленим” індексом, відповідала хімічно визначеній концентрації хлорофілу у верхньому шарі системи (таблиця 4). Величини хлорофілу, розраховані за “червоним” індексом, також корелювали з хлорофілом у верхньому шарі, проте були завищені, причому величина цього відхилення залежала від концентрації хлорофілу у нижньому шарі. Це дає змогу використовувати комбінацію індексів D510/D530 та D725/D702 для оцінки хлорофілу окремо в нижньому шарі системи.

Внески кожного шару в спектр відбиття двошарової системи були проаналізовані за допомогою теоретичної моделі взаємодії світла із компонентами системи. Отримані експериментальні та теоретичні дані дозволили дійти висновку, що істотний внесок відбиття нижнього шару відбувається виключно в червоній ділянці спектру, причому його величина більше залежить від особливостей верхнього шару аніж нижнього. Проведені теоретичні розрахунки свідчать про те, що при концентрації хлорофілу у верхньому шарі вище 6 мг/дм2 вплив нижнього шару відсутній.

Таблиця 4

Концентрація хлорофілу в двошарових системах, визначена хімічним шляхом та за деривативними індексами

Хімічно визначена концентрація хлорофілу, мг/дм2 | Концентрація хлорофілу, розрахована за деривативними індексами, мг/дм2

верхній шар | нижній шар | D510/D530 | D725/D702 | Комбінація

D510/D530 та D725/D702

2,5 | -- | 2,43 | 2,39 | --

4,15 | 2,26 | 3,09 | 3,55

1,96 | 2,47 | 3,03 | 1,38

1,30 | 2,44 | 2,92 | 1,14

1,75 | -- | 1,66 | 1,50 | --

2,97 | 1,66 | 2,44 | 3,37

1,71 | 1,77 | 2,25 | 1,84

0,82 | 1,60 | 2,08 | 2,16

1,06 | -- | 1,37 | 1,19 | --

2,89 | 1,39 | 1,91 | 2,59

1,52 | 1,40 | 1,81 | 1,72

1,24 | 1,35 | 1,68 | 1,25

Дослідження впливу неповного проективного покриття ґрунту на спектр відбиття рослинності

Неповне проективне покриття ґрунту рослинністю може значно впливати на форму спектру відбиття фітоценозу [Шадчина, 1993, 2001]. Для дослідження цього впливу аналізували форму спектрів відбиття фізичних та графічних моделей систем “ґрунт-рослинність”. Фізичні моделі були зімітовані в кюветі спектрофотометра СФ-10 у вигляді листку, поміщеного поверх шару оптично світлого або темного ґрунту. Застосовували частини листків, різних за вмістом хлорофілу, якими перекривали 75, 50 та 25 % площі поля зору спектрофотометру. Спектри графічних моделей розраховували як суму окремих спектральних кривих листка та ґрунту з різними ваговими коефіцієнтами. Спектри фізичних моделей були близькі до відповідних графічних моделей, отже обидва підходи до моделювання однаково дієздатні.

Зменшення рівню проективного покриття у випадку світлого ґрунту викликало збільшення відбиття у всьому спектральному діапазоні, а у випадку темного ґрунту – зменшення відбиття (рис. 6). В графіках перших похідних в обох випадках знижувалася амплітуда, проте відносна форма графіків залишалася без змін.

Рис. 5. Спектри відбиття (А, Б) і графіки їх перших похідних (В, Г) систем “ґрунт-рослинність” з використанням ґрунту із різними відбивальними характеристиками: А, В – оптично світлий; Б, Г – оптично темний. Проективне покриття ґрунту: 1 – повне; 2 – 50 %.

Перевірена ефективність визначення концентрації хлорофілу в системах “ґрунт-рослинність” з неповним проективним покриттям за деривативним індексом D725/D702. Найбільші відхилення від варіанту із повним покриттям спостерігалися в комбінаціях “високий вміст хлорофілу – темний ґрунт”. Для оцінки величин максимальних похибок у визначенні вмісту хлорофілу були створені графічні моделі спектрів, які включали спектр темного ґрунту і листків з концентрацією хлорофілу, яка за нашими даними є максимальною для кожного виду рослини. За умов проективного покриття 25 % відхилення у визначенні хлорофілу коливалися в межах 7-12 %, що не перевищує похибку методу для озимої пшениці та лише незначним чином перевищує її в інших видах (таблиця 5).

Таблиця 5

Відхилення в оцінках хлорофілу для різних видів рослин в системі “високий хлорофіл-темний ґрунт”, 25% покриття.

Вид рослини | похибка регресії, мг/дм2 | конц. хлорофілу, мг/дм2 | відхилення

% | мг/дм2

Triticum aestivum L. | 1,22 | 8,39 | 11 | 0,96

Zea mays L. | 0,35 | 4,75 | 12 | 0,57

Vitis vinifera L. | 0,29 | 4,15 | 9 | 0,36

Beta vulgaris L. | 0,20 | 3,47 | 7 | 0,26

Вимірювання спектрів відбиття посівів

Вимірювали спектри відбиття посівів озимої пшениці впродовж вегетації від фази кущіння до фази цвітіння. В досліджуваних ділянках варіював рівень мінерального живлення та густоти рослин (рис. 7). Вимірювання проводили на ділянках 35х35 см, після чого з них відбирали 9 рослин, рівномірно розташованих по всій площі ділянки. У відібраних рослинах хімічним шляхом визначали концентрацію хлорофілу окремо для кожного ярусу. За спектрами відбиття посівів розраховували значення індексу D725/D702. Обчислювали коефіцієнти кореляції між значенням індексу та хімічно визначеною концентрацією хлорофілу в одному або декількох ярусах. D725/D702 найтісніше корелював з вмістом хлорофілу у верхньому ярусі та середнім вмістом у трьох верхніх ярусах, статистична вага яких була розрахована за допомогою мультифакторного кореляційного аналізу (таблиця 6). Кореляція спостерігалася на фоні різних і досить низьких рівнів проективного покриття ґрунту а також при його різних відбивальних характеристиках. Це є практичним підтвердженням дієздатності методу похідних в умовах розімкнутих посівів.

Рис. 7. Посіви озимої пшениці з різним рівнем проективного покриття ґрунту.

Таблиця 3.19

Коефіцієнти кореляції (R) між індексом D725/D702, розрахованим за спектрами відбиття посівів, та концентрацією хлорофілу в різних листкових ярусах (нумерація ярусів починається з верхнього)

Ярус(и) | R

Верхній ярус | 0,94

Середнє зважене (за площею листків) по декільком ярусам | Яр1, Яр2 | 0,91

Яр1, Яр2, Яр3 | 0,84

Результати мультифакторного кореляційного аналізу | 0,79ЧЯр1+0,17ЧЯр2-1,99 | 0,95

0,78ЧЯр1+0,12ЧЯр2+0,07ЧЯр3-1,99 | 0,95

ВИСНОВКИ

1. Деривативний вегетаційний індекс D725/D702 забезпечує найбільш ефективне визначення концентрації хлорофілу за формою спектрів відбиття в червоній області. Він є дієздатним принаймні для 4-х видів рослин.

2. Застосування індексу D725/D702 як в модельних так і в натуральних системах “ґрунт-рослинність” дозволяє визначати вміст хлорофілу при неповному проективному покритті ґрунту не менше ніж 25% при будь яких комбінаціях відбивальних властивостей листків рослин і ґрунту. При цьому відхилення оцінки хлорофілу від варіанту 100% покриття практично не перевищує похибку рівняння регресії, за яким розраховується вміст пігменту.

3. Деривативний вегетаційний індекс D510/D530 забезпечує найбільш ефективне визначення концентрації хлорофілу за спектрами відбиття в області зеленого максимуму для кукурудзи, буряку і винограду. Для озимої пшениці найбільш ефективним є індекс D505/D530. 4. Комбінація індексів D510/D530 та D725/D702 дозволяє визначати вміст хлорофілу в двошарових системах листків окремо в кожному шарі.

5. Виявлено, що антоціанам, які містяться в рослинних тканинах, притаманне поглинання світла в синій області спектру, що обумовлює їх захисну роль в умовах надлишкового освітлення.

6. Деривативний вегетаційний індекс D597/D584 забезпечує визначення вмісту антоціанів в широкому діапазоні концентрацій (0,7 – 12 мг/дм2). Для більш точного визначення вмісту цих пігментів в діапазоні концентрації 0,3 – 4 мг/дм2 застосовується індекс D593/D580, а в діапазоні 0,1 – 1,25 мг/дм2 – індекс D585/D565.

7. Застосування деривативного індексу D525/D570 дозволяє оцінювати вміст води в листках.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДСЕРТАЦІЇ

1. V. Yatsenko, S. Kochubey, V. Donets, T. Kazantsev. Hardware software complex for chlorophyll estimation in phytocenoses under field conditions // Proc. of SPIE. – 2005. – Vol. 5964, P. 267-270.

2. Казанцев Т.А. Использование первых производных спектров отражения листьев в области зеленого максимума для определения концентрации хлорофилла // Физиология и биохимия культурных растений. – 2007. – 39, №4. – С. 311-318.

3. Казанцев Т.А. Спектральные свойства и бесконтактное определение концентрации антоцианов в листьях Parthenocissus quinquefolia (L.) Planch. // Физиология и биохимия культурных растений. – 2007. – 39, №5. – С. 382-390.

4. S. Kochubey, T. Kazantsev. Changes in the first derivatives of leaf reflectance spectra of various plants induced by variations of chlorophyll content // Journal of Plant Physiology. – 2007. – 164, №12. – P. 1648-1655.

5. Казанцев. Т.А. Зміни у спектрах відбиття листків кукурудзи з різним рівнем наповненості водою. Тези доповідей VIII конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології рослин і генетиці”. – Київ – 2002, ст. 12.

6. Шевченко В.В., Казанцев Т.А., Кочубей С.М. Использование спектров отражения листьев растений для тестирования основных физиологических характеристик. - Матеріали виступів школи-семінару для молодих науковців “Наукові космічні дослідження”. – Київ – Політехніка, 2003, с. 33.

7. Т.А. Казанцев. Особливості тонкої структури спектрів відбиття листків рослин різних видів. – Тези доповідей IX конференції молодих дослідників. Київ – 2005, с. 14.

8. Залежність тонкої структури спектрів відбиття листків рослин різних видів від вмісту хлорофілу в листках. – Тези доповідей першої міжнародної конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. – Львів – “Сполом” – 2005, с. 234.

9. Казанцев Т.А. Вплив вмісту води в листках на їх спектри відбиття у видимому діапазоні. – Тези наукової конференції молодих вчених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології”. – Ужгород – 2005, с. 55.

10. Taras A. Kazantsev and Svetlana M. Kochubey. Original approaches to using of leaf reflectance spectra for assessment of the main physiological characteristics of plants. Abstracts of XV FESPB Congress, 17-21 July 2006, Lyon, France.

11. Т.А. Казанцев. Изучение спектров отражения двухслойных систем листьев растений как моделей для оценки содержания хлорофилла в посевах. Тези Міжнародної наукової конференції “Моделювання динамічних систем і дослідження стабільності”, Київ, 2007.

12. Т.А. Казанцев. Новый подход к проблеме дистанционного зондирования растительного покрова с неполным проективным покрытием. Тези наукової конференції “Наука про землю і космос – суспільству”, Київ, 2007.

13. Казанцев Т.А. Фізіологічна роль, спектральні властивості та метод безконтактного визначення антоціанів в листках Parthenocissus quinquefolia (L.) Planch. Матеріали Всеукраїнської науково-практичної крнференції до 80-річча профессора Л. Г. Долгової “Сучасні проблеми фізіології та інтродукції рослин”, Киев, 2007.

14. T. Kazantsev. Spectral features of two-layer leaf systems provide information on status of each leaf. Abstracts of 12 European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules, Bobigny (Paris region), France, 2007.

15. T. Kazantsev, S. Kochubey, V. Donets. Application of reflectance spectra of two-layer leaf systems to chlorophyll estimation in crops. Abstracts of SPIE Remote Sensing Symposium, Florence, Italy, 2007.

16. Казанцев Т.А. Тестування водного статусу рослин за спектрами відбиття у видимому діапазоні. Матеріали X конференції молодих вчених “Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології”. Київ, 2007.

Анотація

Казанцев Т.А. Використання спектральних характеристик листків рослин для визначення їх фізіологічних показників. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 – фізіологія рослин. – Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена розробці спектральних параметрів листків рослин, придатних для визначення їх фізіологічних показників – концентрації хлорофілу, антоціанів і води.